Механизмы инициации и реализации апоптотической гибели кардиомиоцитов при артериальной гипертензии различного генеза

Азова, Мадина Мухамедовна

Диссертации по медицине → Патологическая физиология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Механизмы инициации и реализации апоптотической гибели кардиомиоцитов при артериальной гипертензии различного генеза

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Азова, Мадина Мухамедовна Москва 2013 г.

Ученая степень: доктора биологических наук

ВАК РФ: 14.03.03

Автореферат диссертации по медицине на тему Механизмы инициации и реализации апоптотической гибели кардиомиоцитов при артериальной гипертензии различного генеза

На правах рукописи

Азова Мадина Мухамедовна

МЕХАНИЗМЫ ИНИЦИАЦИИ И РЕАЛИЗАЦИИ АПОПТОТИЧЕСКОЙ ГИБЕЛИ КАРДИОМИОЦИТОВ ПРИ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА

14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

18 АПР 2013

Москва - 2013

005052204

Работа выполнена на кафедре общей патологии и патологической физиологии медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»

Научный консультант: Фролов Виктор Алексеевич

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой общей патологии и патологической физиологии ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы пародов»

Официальные оппоненты:

Дементьева Инна Иосифовна

доктор биологических наук, профессор, руководитель лаборатории экспресс-диагностики ФГБУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского» РАМН

Архипенко Юрий Владимирович

доктор биологических наук, профессор, заведующий научно-исследовательской лабораторией

адаптационной медицины ГУНУ ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова

Ведущая организация:

Яглова Наталья Валентиновна

доктор медицинских наук, заведующая лабораторией развития эндокринной системы ФГБУ "НИИ морфологии человека" РАМН

ФГБУ «Научно-исследовательский институт общей патологии и патофизиологии» РАМН

Защита диссертации состоится « * ¿¿¿О*? 2013 года в У^^часов

на заседании диссертационного совета Д 212.203.06 при Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8.

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале УНИБЦ (Научная библиотека) ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6).

Автореферат размещен на сайте www.vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан « » ау 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д 212.203.06 Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор Г. А. Дроздова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Апоптоз представляет собой одну из форм клеточной гибели, свойственную эукариотическим организмам, находящимся на разных ступенях эволюционного развития [А.В. Гордеева и др., 2004]. Это регулируемый процесс, сопровождающийся изменением экспрессии определенных генов и формированием специфического клеточного фенотипа, обеспечивающий тканевый гомеостаз и, главное, постоянство генетического материала [S. Elmore, 2007]. Нарушения в механизмах инициации и реализации апоптотической гибели клеток могут способствовать развитию различных патологических процессов, особенно если это касается клеток с низким пролифсративным потенциалом, к числу которых относятся и кардиомиоциты (КМЦ) [В. Favaloro et al., 1012]. В последние десятилетия интерес ученых во всем мире привлекает исследование роли гибели КМЦ в развитии сердечнососудистых заболеваний. Уже накоплено немало экспериментальных доказательств усиления апоптоза в миокарде при ишемии, острой и хронической перегрузке, миокардитах [N.H. Bishopric et al., 2001; Y. Lee, AB. Gustafsson, 2009; M.JI. Благонравов, 2011].

Артериальная гипертензия (АГ) является одной из наиболее распространенных форм патологии сердечно-сосудистой системы [Ж.Д. Кобалава, Ю.В. Котовская, B.C. Моисеев, 2009]. Будучи органом-мишеныо, поражаемым при стойком повышении артериального давления, сердце подвергается настолько выраженным морфологическим и функциональным изменениям, что в научной литературе прочно закрепился термин «гипертоническое сердце» [В.А. Фролов, Г.А. Дроздова, 1984]. В ремоделировании миокарда и развитии хронической сердечной недостаточности при АГ участвует ряд механизмов, к числу которых относится потеря КМЦ, чем обусловлено существенно возросшее в последнее время внимание к изучению программированной гибели клеток миокарда в условиях повышенного артериального давления [A. Gonzalez et al., 2003; J. Diez, 2009; P. Morillas et al., 2012]. Апоптогенными стимулами при гипертонии могут выступать активные формы кислорода [А.С. Montezano, R.M. Touyz, 2012], ангиотензин II [М. Paul et al., 2006], растяжение КМЦ [М.А. Fortuno et al., 2001] и другие факторы. Возможно также, что существенное влияние на гибель сердечных миоцитов оказывает развивающаяся при АГ гипертрофия миокарда [B.C. Bernardo et al., 2010]. Вместе с тем, несмотря на исследования, проводимые в данной области, многие аспекты, касающиеся инициации и реализации апоптотической программы в КМЦ остаются не до конца изученными. Так, в частности, практически нет сведений о влиянии хронической гемодинамической перегрузки левого желудочка (ЛЖ) на программированную гибель клеток миокарда правого желудочка (ПЖ). В свете результатов экспериментов, проведенных на кафедре общей патологии и патологической физиологии РУДН, показавших, что при перегрузке ЛЖ ПЖ вовлекается в процесс немедленно и в дальнейшем определяет динамику

функции сердца [Т.А. Казанская, В.А. Фролов, 1995], представляется необходимым сравнительный подход к изучению апоптотических процессов в миокарде обоих желудочков сердца.

Известно, что приблизительно 90% случаев повышения артериального давления является результатом эссенциалыгай АГ, а остальные случаи представляют собой следствие заболеваний других органов и систем [Ж.Д. Кобалава и др., 2009]. В этой связи возникает вопрос, не имеющий на сегодняшний день однозначного ответа: отличаются ли механизмы инициации и реализации апоптоза КМЦ при различных формах АГ?

Для разработки новых подходов к лечению заболеваний сердечнососудистой системы требуется более детальное изучение молекулярных механизмов, вовлеченных в программированную гибель клеток миокарда. В настоящее время предлагаются разные способы прямого подавления апоптоза, в том числе ингибирование каспаз и блокада Fas-рецепторов [U. Fischer, К. Schulze-Osthoff, 2005]. Однако неселективная супрессия апоптотической гибели может привести к сохранению в организме генетически дефектных и функционально неполноценных клеток. Следует учитывать и тот факт, что усиление апоптоза указывает на существенные нарушения физиологических внутриклеточных процессов, поэтому представляется более целесообразным исследование возможности подавления не самой гибели клеток, а механизмов, создающих условия для индукции данного процесса.

Цель исследования

Изучить особенности инициации и реализации апоптотической гибели кардиомиоцитов левого и правого желудочков сердца при первичной генетически обусловленной и вторичной вазоренальной артериальной гипертензии; оценить возможности медикаментозной супрессии апоптоза клеток миокарда при артериальной гипертензии различного генеза.

Задачи исследования

1. Определить интенсивность апоптотических и гипертрофических процессов в миокарде желудочков сердца в динамике генетически обусловленной и вазоренальной АГ.

2. Изучить возрастные особенности апоптоза КМЦ нормотензивных и гипертензивных животных.

3. Выявить пути передачи апоптогенного сигнала в сердечных миоцитах ЛЖ и ПЖ в условиях системной гипертензии различного генеза.

4. Определить значимость энергетического дефицита для индукции апоптотической гибели КМЦ при АГ различного генеза.

5. Оценить роль окислительного стресса в инициации и реализации апоптотической программы в сердечных миоцитах.

6. Исследовать влияние эндотелина-1 на апоптотические и гипертрофические процессы в миокарде в условиях повышенного артериального давления.

7. Провести сравнительную оценку эффективности медикаментозной супрессии апоптоза КМЦ с помощью экзогенного фосфокреатина, мексидола, обладающего антигипоксическим и антиоксидантным действием, и В<}-123, относящегося к селективным антагонистам ЕТА-рецепторов.

Научная новизна

В рамках представленной работы впервые проведено сравнительное изучение особенностей апоптоза сердечных миоцитов ПЖ и ЛЖ при генетически обусловленной и вторичной АГ.

Впервые обнаружено, что при АГ различного генеза преобладает митохондриальный путь передачи апоптогенпого сигнала, вместе с тем в ЛЖ спонтанно гипертензивных крыс определенный вклад в инициацию программированной гибели клеток миокарда вносит рецепторно-опосредованная сигнальная трансдукция.

На основании данных, полученных при иммуногистохимической и биохимической оценке интенсивности апоптоза, впервые установлено, что при реализации апоптотической программы в КМЦ в условиях АГ ведущими являются нскаспазные эффекторные механизмы.

Впервые показано, что умеренный энергетический дефицит, возникающий в клетках миокарда при АГ, становится одним из основных индукторов апоптоза КМЦ в ЛЖ, реализующегося с участием белков р53 и Вах. Биохимическое исследование клеток миокарда ЛЖ спонтанно гипертензивных крыс показало, что окислительный стресс выступает наиболее вероятным фактором, стимулирующим рецепторно-опосредованную передачу апоптогенного сигнала, а также принимает участие в индукции гипертрофических процессов. При иммуногистохимическом исследовании КМЦ ПЖ было обнаружено, что в условиях окислительного стресса в них повышается экспрессия проапоптотического белка р53.

При исследовании миокарда крыс линии ЗНК. с генетически обусловленной АГ, леченых селективным антагонистом ЕТА-рецепторов В(3-123, были получены принципиально новые данные, согласно которым эндотелин-1 является одним из основных факторов, стимулирующих в ЛЖ гипертрофические процессы, и создающих условия, при которых в ЛЖ индукторы апоптоза преобладают над его супрессорами. Также полученные результаты позволяют полагать, что экспрессия Вах как при АГ, так и в норме, опосредуется эндотелином-1.

В результате проведенных экспериментов впервые выявлено отличие механизмов инициации и реализации апоптотической программы в миоцитах левого и правого желудочков сердца в условиях повышенного артериального давления.

препаратов в ЛЖ значительно выше, нежели в ПЖ. Величины терапевтического эффекта неотона и ВС)-123 приблизительно равны, хотя эффективность неотона в ЛЖ несколько выше. Лечение мексидолом оказало наименьшее влияние на комплекс исследованных признаков в обоих желудочках сердца.

При исследовании миокарда нормотензивных крыс разного возраста было обнаружено, что старение организма сопровождается повышением интенсивности ПКГ КМЦ в обоих желудочках сердца, причем происходит переключение с каспазоопосредованного на некаспазный механизм реализации апоптотической программы. Потеря сердечных миоцитов с возрастом приводит к компенсаторной гипертрофии миокарда.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты проведенного исследования способствуют детализации представлений о механизмах, лежащих в основе повышения интенсивности апоптотической гибели КМЦ при АГ различного генеза.

Полученные в ходе экспериментов данные ставят новые задачи для дальнейших научных изысканий, заключающиеся в поиске индукторов апоптоза и способов регуляции клеточной гибели в ПЖ сердца, т.к. они оказались отличными от таковых в ЛЖ.

Важное практическое значение имеет установление роли энергетического дефицита, окислительного стресса и эндотелина-1 в инициации апоптотической гибели КМЦ при АГ различного генеза, открывающее новые возможности для медикаментозной регуляции данного процесса. Показана эффективность применения макроэргических препаратов, антиоксидантов и селективных антагонистов ЕТА-рецепторов с целью снижения интенсивности апоптоза и гипертрофических процессов в миокарде ЛЖ.

Предложенный подход к разработке информативного количественного показателя, характеризующего эффективность лечения по комплексу оцениваемых признаков, может быть использован в клинической практике для оценки влияния применяемых препаратов на различные комплексы исследуемых параметров.

Внедрение результатов исследования

Результаты представленной работы внедрены в учебный процесс при изучении дисциплины «Патофизиология» на кафедре общей патологии и патологической физиологии и дисциплины «Биология» на кафедре биологии и общей генетики медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов».

Положения, выносимые на защиту:

1. Артериальная гипертензия различного генеза сопровождается повышением интенсивности апоптоза и развитием гипертрофии КМЦ, причем основные механизмы, лежащие в основе этих процессов, в ЛЖ и ПЖ отличаются.

2. При артериальной гипертензии одним из ключевых индукторов апоптоза КМЦ является энергетический дефицит, активирующий митохондриальный путь передачи апоптогенного сигнала и высвобождение некаспазных эффекторов. Определенный вклад в инициацию апоптотической программы вносит окислительный стресс, стимулирующий рецепторно-опосредованную сигнальную трансдукцию. В миокарде ЛЖ спонтанно гипертензивных крыс в индукции программированной гибели сердечных миоцитов участвует эндотелии-1, повышающий экспрессию в клетках белков р53 и Вах.

3. Гипертрофия миокарда ЛЖ и ПЖ у крыс линии SHR начинает развиваться в первые недели жизни и не зависит от интенсивности апоптоза и величины артериального давления. В ЛЖ спонтанно гипертензивных крыс триггерами гипертрофических процессов выступают окислительный стресс и эндотелин-1.

4. Старение организма сопровождается усилением апоптотической гибели КМЦ в обоих желудочках сердца и развитием компенсаторной гипертрофии миокарда.

5. Количественный анализ комплекса исследуемых показателей у спонтанно гипертензивных крыс методом многомерного шкалирования показал эффективность применения макроэргических препаратов, антиоксидантов и селективных антагонистов ЕТА-рецепторов с целью снижения интенсивности апоптоза и гипертрофических процессов в миокарде ЛЖ.

Апробация работы

Работа апробирована на VIII Всероссийской конференции по патологии клетки, г. Москва, 2010 г.; на XI Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке. Научные и прикладные аспекты здоровья и здорового образа жизни», г. Москва, 2010 г.; на I Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», г. С.-Петербург, 2010 г.; на научно-практической конференции «Развитие идей академика А.И. Струкова в современной патологической анатомии», г. Москва, 2011 г.; на Международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация», г. Пущино, 2011 г.; на II Международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине», г. С.-Петербург, 2011 г.; на VII Международной научно-практической конференции «Перспективные исследования науки и техники», г. Пшемысль (Польша), 2011 г.; на II Международной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии», г. Казань, 2012 г.; на V региональной научно-практической конференции «Новые технологии в рекреации здоровья населения», г. Владикавказ, 2012 г.; на XIX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», г. Москва, 2012 г.; на XV Всероссийском симпозиуме «Эколого-физиологические проблемы адаптации», г. Москва, 2012 г.; на III Съезде геронтологов и гериатров России, г. Новосибирск, 2012 г.; на II Российском съезде по хронобиологии и

хрономедицине с международным участием, г. Москва, 2012 г; совместном заседании кафедры общей патологии и патологической физиологии РУДН и кафедры биологии и общей генетики РУДН, 2012 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 29 работ, в том числе 15 статей в журналах, входящих в перечень, утвержденный ВАК при Министерстве образования и науки РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материала и методов исследования, 6 глав, в которых изложены результаты собственного исследования, главы, посвященной обсуждению полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация изложена на 209 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и 27 рисунков. Библиография включает 543 источника российской и зарубежной литературы.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на 94 самцах крыс линий SHR и Wistar-Kyoto трех возрастов: 8 недель, 15 недель, 52 недели и 43 самцах кроликов породы «Шиншилла» массой тела 3-3,5 кг.

Эксперимент проводился в двух сериях, каждая из которых включала 2 группы животных: 1. Животные с артериальной гипертензией (опытные группы); 2. Нормотензивные животные (контроль). В I серии эксперимента животные не получали лечения. Во II серии животным из опытных групп в течение 10 дней вводился один из препаратов: неотон (действующее вещество фосфокреатин) в дозе 30 мг/кг, мексидол (действующее вещество этилметилгидроксипиридина сукцинат) в дозе 5 мг/кг или BQ-123 (Sigma, США), разведенный в 0,9% водном растворе хлорида натрия, в дозе 100 нмоль/кг.

Кроликам с экспериментальной вазоренальной АГ вводили соответствующий препарат (неотон или мексидол) с 19-го по 28-й день после моделирования патологического процесса 1 раз в сутки внутримышечно. Крысам линии SHR начинали вводить препарат (неотон, мексидол или BQ-123) внутрибрюшинно 1 раз в сутки за 10 дней до достижения ими 15-недельного возраста.

Распределение животных по группам в основных сериях исследования представлено в таблицах 1 и 2.

Для определения динамики АД нормотензивных крыс линии Wistar-Kyoto и спонтанно гипертензивных крыс была проведена дополнительная серия эксперимента, в ходе которой у 5 животных из каждой линии, начиная с 15-недельного возраста, в течение 8 месяцев методом телеметрического мониторирования осуществлялась непрерывная регистрация кривых АД.

Таблица 1. Распределение кроликов по группам исследования

I серия эксперимента II серия эксперимента

Контроль 1 нед. АГ 2 нед. АГ и <: э я Контроль нохоэн + ЛУ АГ + мексидол

Количество 6 6 6 7 6 6 6

животных

Таблица 2. Распределение крыс по группам исследования

I серия эксперимента II серия эксперимента

л л л Л

Контрой 8 нед. эии. 8 нед. Оч ^ БНЯ 15 нед. е- 9 £ и Я г-) » V» БНЯ 52 нед. о п. н я о * ЭНШ-неотон 8НЯ + мексидс БИШ-В(3-123

Количество 8 11 8 8 8 8 6 9 9 9

животных

Содержание животных и работа с ними осуществлялись в соответствии с приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г. На проведение экспериментов получено разрешение этического комитета медицинского факультета РУДН (протокол № 92 от 15.04.2009 г.).

Моделирование вазоренальной артериальной гипертензни у кроликов выполняли по Я БоШЫаи ег а1. (1938) путем сужения брюшной аорты на 1/3 от ее исходного диаметра над местом отхождения от нее почечных артерий.

Регистрация артериального давления у экспериментальных животных

Артериальное давление (АД) у кроликов определялось в остром эксперименте с помощью аппаратно-программного комплекса «Микард», представляющего собой аналогово-цифровой преобразователь с электроманометрическими датчиками, сигнал от которого поступал на персональный компьютер. Для этого под местной новокаиновой анестезией в со1шую артерию вводился пластиковый зонд, заполненный физиологическим раствором и соединенный с электромагнитным манометром. При помощи специальной программы «Мюат» полученные данные отображались на экране монитора в виде кривых АД в режиме реального времени, а также записывались в память компьютера.

Для оценки уровня АД нормотензивных и спонтанно гипертензивных крыс проводили непрерывную его 24-часовую регистрацию методом телеметрического мониторирования на установке Data Sciences international (США). С этой целью крысам в ходе хирургической операции под общим наркозом имплантировали радиотрансмиттеры - устройства, непрерывно измеряющие АД в просвете брюшной аорты и в беспроводном режиме (в виде радиосигнала) передающие данные на воспринимающие устройства с сохранением кривых АД в памяти компьютера. Обработка полученных данных проводилась с помощью программы DataquestA.R.T.4.2 Gold (США).

Биохимическое исследование апоптоза клеток миокарда

Получение лизатов клеток миокарда. Из стенки ЛЖ и ПЖ сердец кроликов и крыс вырезали образцы миокарда массой 200-250 мг и измельчали их в гомогенизаторе WiseTis серии HG-15 с ротором 8 мм при скорости 4500 об/мин. Для этого использовали среду выделения (20 мМ HEPES, рН 7,5, 10 мМ КС1, 1,5 мМ MgC12, 1 мМ ДТТ), к которой добавляли коктейль ингибиторов протеаз (104 мМ AEBSF, 0,08 мМ апротинин, 1,5 мМ пепстатин А, 2 мМ лейпептин, 4 мМ бестатин, 1,4 мМ Е-64) в соотношении 100:1 (все реактивы были произведены фирмой «Sigma», США). Гомогенаты центрифугировали на микроцентрифуге Heraeus fresco 17 (Thermo Electron LED GMBH, Германия) при 15000 g в течение 30 мин при 4°С и полученные супернатанты (лизаты) использовали для оценки активности каспазы 3 и каспазы 8.

Оценку активности каспазы 3 проводили колориметрическим методом с использованием набора реактивов «Caspase 3 Assay Kit, Colorimetric» («Sigma», США) по скорости расщепления синтетического субстрата Ac-DEVD-pNA (N-ацетил-Асп-Глу-Вал-Асп-нитроанилин). Лизаты клеток миокарда инкубировали в 96-луночных микропланшетах в течение 95 мин при 37°С в реакционном буфере (20 мМ HEPES, рН 7,4, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 0,1% CHAPS) в двух параллельных пробах, одна из которых содержала 20 нмоль Ac-DEVD-pNA, а другая - 20 нмоль Ac-DEVD-pNA и 2 нмоль специфического ингибитора каспазы 3 Ac-DEVD-CHO. Оптическую плотность регистрировали каждые 20 мин в течение 100 мин на ИФА-ридере Sunrise (Тесап) при длине волны 405 нм. Активность каспазы 3 рассчитывали по разнице скоростей расщепления субстрата в пробах без ингибитора и в присутствии ингибитора с учетом калибровочной кривой оптической плотности стандарта pNA.

Оценку активности каспазы 8 производили колориметрическим методом с использованием набора реактивов «Caspase 8 Assay Kit, Colorimetric» («Sigma», США) по скорости расщепления синтетического субстрата Ac-IETD-pNA (N -ацетил-Иле-Глу-Тре-Асп-нитроанилин). Лизаты клеток миокарда инкубировали в 96-луночных микропланшетах при 37°С в реакционном буфере (20 мМ HEPES, рН 7,4, 2 мМ ЭДТА, 5 мМ дитиотреитол, 0,1% CHAPS, 5% сахароза) в двух параллельных пробах, одна из которых содержала 20 нмоль Ac-IETD-pNA, а другая - 20 нмоль Ac-IETD-pNA и 0,05 нмоль специфического ингибитора каспазы 8 Ac-IETD-CHO. Оптическую плотность регистрировали

каждые 10 минут в течение 1 часа на ИФА-ридере Sunrise (Тесап) при длине волны 405 нм. Активность каспазы 8 рассчитывали по разнице скоростей расщепления субстрата в пробах без ингибитора и в присутствии ингибитора с учетом калибровочной кривой оптической плотности стандарта pNA.

Активность каспазы 8 определяли только в те сроки эксперимента, на которых активность каспазы 3 достигала максимального значения.

Биохимическое исследование апоптоза осуществлялось с использованием оборудования Центра коллективного пользования (НОЦ) Российского университета дружбы народов, созданного в рамках Инновационной образовательной программы РУДН.

Иммуногистохимическое исследование апоптоза кардиомиоцитов

Образцы миокарда левого и правого желудочков фиксировали в течение 72 часов в 10% нейтральном забуференном формалине. Далее проводили обработку материала и заливку в парафин по общепринятой методике. Гистологические срезы толщиной 5 мкм наносили на стекла с иоли-L-лизиновым покрытием.

Метод TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transfcrase-mcdiatcd dUTP nickend labeling) применяли для количественной оцепки апоптоза кардиомиоцитов по интенсивности фрагментации ДНК в ядрах. Для постановки реакции использовали набор реактивов «Apo-BrdU-IHC In Situ DNA Fragmentation Assay Kit» (BioVision, США). Препараты докрашивали гематоксилином. Реакция считалась положительной при появлении коричневой окраски в ядрах кардиомиоцитов. В каждом препарате методом световой микроскопии при увеличении 400х с использованием микроскопа Nikon Eclipse Е-400 и видеосистемы на основе камеры Watec 22IS (Япония) анализировали 20 полей зрения и определяли индекс апоптоза, представляющий собой отношение числа TUNEL-позитивных ядер к общему количеству ядер кардиомиоцитов в поле зрения.

Иммуногистохимическое исследование содержания белков Bcl-2, Вах, р53 выполняли с использованием первичных кроличьих поликлональных антител (Santa Cruz Biotechnology, Inc., США). Визуализацию результатов реакции осуществляли с помощью набора реактивов «UltraVision Detection System» (Thermo Scientific), в состав которого входили биотинилированные козьи антикроличьи антитела, стрептавидин, меченый пероксидазой, и в качестве хромогена диаминобензидина тетрахлорид. Препараты докрашивали гематоксилином Майера. Реакция считалась положительной при появлении коричневой окраски. При 400-кратном увеличении микроскопа с использованием описанного выше оборудования и сетки Автандилова исследовали 20 полей зрения в каждом препарате. При этом определяли отношение количества равноудаленных точек, приходящихся на позитивно окрашенную цитоплазму КМЦ, к общему количеству точек, занимаемых цитоплазмой сердечных миоцитов.

Оценка степени гипертрофии миокарда

Срезы миокарда толщиной 5-7 мкм окрашивали по стандартной методике гематоксилином и эозином. Препараты исследовались с помощью описанной выше микроскопической методики, на том же оборудовании. При этом в 15 полях зрения в каждом препарате определяли количество равноудаленных точек на сетке Автандилова, приходящихся на ядра и миофибриллы КМЦ. Затем на основании полученных данных вычисляли ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО), отражающее степень гипертрофии миокарда (чем меньше значение ЯЦО, тем более выражена гипертрофия КМЦ).

Статистическая обработка данных

Статистические расчеты осуществлялись с использованием программ «STATISTICA 6.0» (StatSoft Inc., США) и «Microsoft Excel 2010».

При проведении исследований оценивались количественные параметры и представлялись в виде среднего значения признака и ошибки среднего значения. Для проверки достоверности различий между изучаемыми выборками были использованы U-критерий Манна-Уитни и t-критерий Стьюдента при уровне значимости р<0,05.

Вклад оцениваемых показателей в формирование отличий между исследуемыми группами животных определялся с помощью пошагового дискриминантного анализа.

При сравнении влияния введенных экспериментальным животным препаратов на изучаемые показатели применялось многомерное шкалирование. В настоящей работе данный метод обеспечил количественную оценку отклонений изучаемых показателей от нормы без лечения и после применения препаратов и, как следствие, возможность измерения величины терапевтического эффекта каждого препарата. Матрица парных расстояний для проведения многомерного шкалирования была получена в кластерном анализе по методу Уорда, где в качестве меры расстояния между объектами использовалось Евклидово расстояние.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности реализации апоптотической гибели кардиомиоцитов при артериальной гипертензии различного генеза

В табл. 3 представлены результаты оценки апоптотических процессов в миокарде желудочков сердца при вазореналыюй АГ. При исследовании миокарда кроликов с вазоренальной АГ было выявлено статистически значимое повышение индекса апоптоза КМЦ ЛЖ уже через неделю после моделирования АГ и его дальнейшее увеличение вплоть до четырех недель. В ПЖ интенсивность апоптотической гибели КМЦ у кроликов с однонедельной АГ возрастала еще более существенно, нежели в ЛЖ, но оставалась на том же уровне на остальных сроках исследования с выраженной тенденцией к увеличению через 4 недели после моделирования АГ. Исследование активности каспазы 3 показало достоверное ее повышение в ЛЖ лишь к

четырехнедельному, а в ПЖ — к двухнедельному сроку. Таким образом, АГ почечного генеза сопровождается усилением апоптоза КМЦ в обоих желудочках, причем в ПЖ на начальных стадиях процесса активация апоптоза происходит более стремительно, чем в ЛЖ, что можно объяснить различиями в ультраструктуре и метаболических процессах в левом и правом желудочках сердца [Т.А. Казанская, В.А. Фролов, 1995].

Таблица 3. Показатели, характеризующие апоптоз КМЦ в желудочках сердца кроликов (М±т)___

Группа Индекс апоптоза, % Каспаза 3, нмольхмпн*1хмл"1 Каспаза 8, нмольхмин'1хмл"1

ЛЖ Контроль 4,74±0,46 0,27±0,03 0,99±0,16

АГ 1 нед. 7,84±0,76* 0,27±0,03 не определяли

АГ 2 нед. 14,36±1,27* 0,27±0,03 не определяли

АГ 4 нед. 31,97±1,04* 0,36±0,02* 1,39±0,11

ПЖ Контроль 2,17±0,53 0,16±0,02 0,73±0,07

АГ 1 нед. 8,33±0,85* 0,18±0,03 не определяли

АГ 2 нед. 7,31±0,60* 0,21±0,01* не определяли

АГ 4 нед. 11,15±1,08* 0,26±0,04* 0,90±0,07

Примечание: * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05; активность каспазы 8 определяли только в тот срок эксперимента, когда активность каспазы 3 достигала максимального значения.

Полученные результаты позволяют предполагать существенную роль в реализации программированной гибели КМЦ некаспазных механизмов, активирующихся раньше каспазного каскада. Как известно, независимыми от каспаз факторами, вызывающими фрагментацию ДНК, являются высвобождающиеся из митохондрий AIF (apoptosis-inducing factor) и эндонуклеаза G [L.Y. Li et al., 2001; G.T. Kim et al., 2003].

Несмотря на явную тенденцию к повышению активности каспазы 8 в миокарде обоих желудочков сердца кроликов с вазоренальной АГ, отличия оказались недостоверными, что указывает на формирование внутриклеточного апоптогенного сигнала. Вероятно, фактором, создающим условия для усиления ПКГ, в данном случае выступает возникающая в результате АГ хроническая перегрузка ЛЖ. В проведенных ранее на кафедре общей патологии и патологической физиологии РУДН исследованиях на самцах кроликов с острой перегрузкой левого желудочка, вызванной сужением восходящей аорты, также было обнаружено достоверное увеличение активности каспазы 3 в миокарде ЛЖ, однако, индукция каспазного каскада осуществлялась по рецепторно-опосредованному пути [МЛ. Благонравов и др., 2010]. Это позволяет предположить, что апоптоз выступает в качестве неспецифической реакции миокарда на развивающуюся перегрузку, и отличия касаются лишь способов инициации процесса. Острая перегрузка приводит к повреждению структурных элементов сердечной мышцы, что сопровождается развитием воспалительной реакции и, как следствие, активацией каспазы 8. При медленно развивающейся

перегрузке, обусловленной АГ, воспаление отсутствует, и рецепторный механизм не участвует в индукции ПКГ. В этой связи интересны результаты, полученные при изучении активности каспаз в миокарде ПЖ при острой перегрузке ЛЖ [М.Л. Благонравов и др., 2010]. В данном случае нагрузка на миокард ПЖ развивается не столь резко и вызывается застоем крови в малом круге кровообращения. Как оказалось, активация апоптоза при этом происходит по митохондриальному пути, т.е. так же, как и при хронической перегрузке, обусловленной повышением артериального давления.

При АГ почечного генеза на клетки миокарда действует комплекс апоптогенных стимулов. Ишемия почек сопровождается активацией ренин-ангиотензиновой системы, что приводит к увеличению выработки ATII, который, как известно, наряду с выраженным прессорным эффектом, обладает способностью индуцировать апоптоз КМЦ [S. Ravassa et al., 2000]. Также индукторами программированной гибели клеток миокарда могут выступать механический стресс, вызванный хронической перегрузкой ЛЖ сердца, и энергодефицит, обусловленный возрастанием потребления клетками АТФ вследствие увеличившейся нагрузки на сердечную мышцу и развивающейся гипертрофии миокарда [М.А. Fortuno et al., 2001; Y. Kushnareva, D.D. Newmeyer, 2010].

Гипертрофические процессы в сердце имеют мультифакториальную природу и инициируются перегрузкой миокарда, а также ATII, оказывающим на КМЦ как прямое ростовое действие, так и опосредованное через стимуляцию секреции эндотелина-1 [В.С. Bernardo et al., 2010]. В данной работе было определено ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) в КМЦ в динамике вазоренальной АГ, отражающее степень гипертрофии миокарда (табл.4).

Таблица 4. Ядерно-цитоплазматическое отношение в кардиомиоцитах желудочков сердца кроликов (М±т)__

Контроль АГ 1 нед. АГ 2 нед. АГ 4 нед.

ЛЖ 0,15±0,01 0,12±0,01* 0,09±0,01* 0,09±0,01*

ПЖ 0,15±0,01 0,15±0,01 0,12±0,01* 0,10±0,01*

Примечание: * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05

В ЛЖ уже через неделю после моделирования АГ статистически значимо по сравнению с контролем снижается ЯЦО, что указывает на наличие гипертрофии, к двухнедельному сроку данный показатель достигает минимума и выходит на плато. В ПЖ гипертрофические процессы инициируются позже, и ЯЦО достоверно снижается у кроликов с двухнедельной АГ. У животных с четырехнедельной АГ в ПЖ ЯЦО статистически значимо не отличается от аналогичного показателя на предыдущем сроке исследования, хотя и наблюдается тенденция к его снижению. Из полученных результатов следует, что при вазоренальной АГ гипертрофия представляет собой реакцию миокарда на хроническую перегрузку, обусловленную повышением артериального давления. Несмотря на то, что КМЦ относятся к клеткам с ограниченным

пролиферативным потенциалом, ростовые факторы могут не только активировать гипертрофические процессы, но и стимулировать вступление некоторых сердечных миоцитов в митотический цикл, который может, не завершаясь цитокинезом, приводить к появлению многоядерных клеток или полиплоидизации ядра [А.Я. Гудкова, Е.В. Шляхто, 2008]. Вполне возможно, что в этом случае может наблюдаться альтернативный механизм апоптотической гибели КМЦ, сопровождающийся элиминацией некоторых ядер путем их экструзии в межклеточное пространство и выживанием клетки в целом [В.А. Фролов и др., 2009; М.Л. Благонравов, 2011]. Сравнение динамики интенсивности апоптоза КМЦ и степени гипертрофии миокарда позволяет предполагать, что развивающаяся гипертрофия вносит вклад в индукцию апоптотических процессов в ЛЖ, но не оказывает значимого влияния на программированную гибель клеток миокарда ПЖ, т.к. усиление программированной гибели КМЦ в ПЖ при вазоренальной АГ предшествует формированию гипертрофии.

У спонтанно гипертензивных крыс в первые недели жизни интенсивность апоптоза КМЦ левого и правого желудочков сердца значимо ниже, чем у нормотензивных животных, затем по мере развития АГ индекс апоптоза возрастает и у 15-недельных животных становится достоверно выше контроля (табл.5). Однако далее динамика процесса в ЛЖ и ПЖ отличается. В ЛЖ у годовалых крыс линии БНЯ индекс апоптоза снижается до контрольных значений, в то время как в ПЖ продолжает увеличиваться. Отсутствие отличий по исследуемому показателю в ЛЖ у годовалых крыс опытной и контрольной групп свидетельствует о том, что длительно существующая хроническая перегрузка сердца перестает оказывать апоптогенное действие, что, возможно, обусловлено формированием определенных адаптационных механизмов, причем более эффективных, чем в ПЖ.

Таблица 5. Индекс апоптоза кардиомиоцитов в желудочках сердца крыс, % (М±т)___

Возраст крыс, педели Группа ЛЖ ПЖ

8 контроль 7,50±0,73 3,81±0,55

ЯНЯ 4,95±0,41* 2,05±0,36*

15 контроль 10,12±0,86 4,49±0,85

25,98±0,94* 11,37±0,85*

52 контроль 11,53±0,90 7,44±0,77

БНИ. 10,23±0,73 18,96±1,14*

Примечание: * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05

Анализ отечественной и зарубежной литературы показал, что на протяжении последних двух десятилетий активно проводятся исследования, доказывающие повышение интенсивности апоптоза в миокарде спонтанно гипертензивных крыс, но следует отметить, что среди них крайне мало работ,

посвященных динамике этого процесса. Более того, имеющиеся немногочисленные данные весьма противоречивы. Так, согласно одним из них, интенсивность апоптоза начинает достоверно повышаться с четырехнедельного возраста, выходит на плато к 16 неделям и сохраняется на столь же высоком уровне вплоть до 64 недель [J.J. Liu et al., 2000]. Согласно другим сведениям, интенсивность апоптотической гибели КМЦ у 30-недельных крыс SHR значимо выше, чем у 16-недельных [J. Diez et al., 1997]. Наиболее близки к нашим результатам данные Р. Harnet et al. (1996), показывающие, что у новорожденных крыс SHR в течение первых недель жизни интенсивность апоптоза клеток миокарда ниже, чем у нормотензивных животных, затем, по мере развития гипертензии, она резко возрастает, а после 24-х недель падает до контрольных значений. Но, в любом случае, выраженная корреляция между уровнем апоптоза и значением артериального давления у спонтанно гипертензивных животных отсутствует.

При оценке активности каспазы 3 в JDK у крыс линии SHR было обнаружено достоверное повышение показателя по сравнению с нормотензивными животными (табл. 6), однако, в ПЖ отличий от контроля ни на одном из сроков исследования установлено не было. В ЛЖ 15-недельных крыс линии SHR также было выявлено статистически значимое увеличение активности каспазы 8, указывающее на активацию рецепторно-опосредованного пути индукции апоптоза.

Таблица б. Активность каспаз в миокарде левого желудочка крыс (М±т)

Возраст крыс, недели Группа Каспаза 3, нмольхмшГ'хмл'1 Каспаза 8, нмольхмин"1хмл"1

8 контроль 0,22±0,03 не определяли

SHR 0,19±0,02 не определяли

15 контроль 0,18±0,02 1,06±0,13

SHR 0,27±0,03* 1,61±0,0б*

52 контроль 0,13±0,02 не определяли

SHR 0,13±0,03 не определяли

Полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что у спонтанно гипертензивных крыс к моменту выхода артериального давления на плато, что происходит к 15-16-недельному возрасту, усиливается апоптоз клеток миокарда обоих желудочков. При этом в инициации программированной клеточной гибели в ЛЖ участвует рецепторный путь, на что указывает достоверное повышение активности каспазы 8. Однако нельзя полностью исключать возможность участия в процессе и митохондриального (внутреннего) механизма запуска апоптоза. Исходя из результатов, полученных при исследовании активности каспазы 3 в миокарде ПЖ спонтанно гипертензивных крыс, можно предположить, что апоптотическая гибель КМЦ в ПЖ крыс SHR

реализуется без участия каспазного каскада. Таким образом, данные исследования миокарда спонтанно гипертензнвных крыс подтверждают предположение о значительной роли при АГ некаспазных механизмов гибели КМЦ.

Для выяснения внутриклеточных механизмов, участвующих в реализации апоптотической программы в КМЦ 15-недельных спонтанно гипертензнвных крыс было определено содержание белков Bcl-2, Вах и р53 (рис. 1).

50 ■■!

40 1

{

30 |

20 -I

10 i

1 ____ *

о -inamuMS^SB Bcl-2

60 n

50 -40 i 30 -20 1 10 -I

0 •я&шявг J

Bcl-2 Bax p53

Рис. í. Содержание белков Bcl-2, Bax, р53в КМЦ левого (А) и правого (Б) желудочков сердца крыс (%). * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05.

Обнаружено, что Bcl-2 в КМЦ обоих желудочков сердца экспрессируется на низком уровне. Но, тем не менее, у спонтанно гипертензнвных крыс его содержание в миокарде ЛЖ ниже, чем в контроле, в то время как в ПЖ отличий между группами не наблюдается. Исследования, проведенные М.А. Fortuno et al. (1998) также продемонстрировали невысокий уровень экспрессии данного белка в миокарде крыс линий SHR и Wistar-Kyoto, но отличий не выявили. Большее внимание обращают на себя проапоптотические белки Вах и

Вах р53

I контроль ! SHR

р53, содержание которых в миокарде обоих желудочков крыс линии SHR значительно превышает соответствующие показатели нормотензивных животных. Усиление экспрессии Вах служит еще одним доказательством преобладания митохондриального пути в реализации ПКГ КМЦ у гипертензивных животных, т.к. данный белок, внедряясь в наружную митохондриальную мембрану, формирует гигантские поры, через которые высвобождаются цитохром С, эндонуклеаза G, AIF и другие проапоптотические факторы [D. Westphal et al., 2011]. В условиях АГ повышение экспрессии Вах в сердечных миоцитах может быть вызвано различными факторами. ATII и механический стресс могут стимулировать синтез данного белка через активацию МАР-киназы р38 (A. Porras et al., 2004), а р53, активирующийся в ответ на различные стрессовые воздействия, усиливает транскрипцию гена Вах [Thornborrow Е.С. et al., 2002]. Участие р53 в процессе гибели КМЦ подтверждается его повышенным содержанием в миокарде спонтанно гипертензивных крыс. Более того, обладая плейотропным действием, данный белок усиливает апоптоз КМЦ, стимулируя экспрессию Fas-рецептора [К. Kuribayashi et al., 2011], ВНЗ-белков, ингибирующих антиапоптотические белки семейства Bcl-2 [M.D. Kaeser et al., 2002; Е.М. Michalak et al., 2008] и, возможно, через прямое белок-белковое взаимодействие с Вс1-2 и Bid [G. Song et al., 2009; A.V. Vaseva, U.M. Moll, 2009].

В связи с бытующим мнением о том, что ПКГ первоначально является защитным механизмом, направленным на ограничение гиперплазии и гипертрофии миокарда [P. Hamet, 2001], нами определялось ЯЦО в миокарде у гипертензивных и контрольных животных (табл. 7).

Таблица 7. Ядерно-цитоплазматическое отношение в кардиомиоцитах желудочков сердца крыс (М±т)__

Возраст крыс, недели Группа лж ПЖ

8 контроль 0,28±0,01 0,23±0,01

SHR 0,17±0,01* 0,16±0,01*

15 контроль 0,27±0,01 0,26±0,01

SHR 0,11±0,01* 0,21±0,01*

52 контроль 0Д5±0,01 0,12±0,01

SI1R 0,11±0,01* 0,14±0,01

Примечание: * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05

В ЛЯС спонтанно гипертензивных крыс ЯЦО на всех сроках исследования было достоверно ниже контрольных значений, что подтверждает наличие гипертрофии миокарда, причем у 15-недельных животных с АГ данный показатель достигает минимума и выходит на плато. В ПЖ 8- и 15-недельных крыс линии ЭНН ЯЦО статистически значимо ниже контроля, однако, у годовалых гипертензивных и нормотензивных животных отличий не обнаружено. Исходя из полученных результатов, можно предположить, что влияние гипертрофии миокарда на апоптотическую гибель КМЦ более значимо

в ЛЖ, т.к. прекращение ее нарастания в ЛЖ сопровождается падением индекса апоптоза до контрольных значений. В ПЖ корреляции между интенсивностью апоптоза и степенью гипертрофии миокарда не наблюдается. Таким образом, у крыс с АГ гипертрофические процессы в миокарде начинаются в первые недели жизни на фоне снижения апоптотической гибели КМЦ. Существуют литературные данные, показывающие, что гипертрофия миокарда у крыс линии SHR развивается раньше, чем формируется артериальная гипертензия [Р. Harriet, 2001]. Более того, проведенные в ходе ряда исследований скрещивания спонтанно гипертензивных и нормотензивных крыс показали независимость генетических детерминант, определяющих артериальное давление и гипертрофию миокарда [В.А. Innés et al., 1998; А.Ю. Постнов и др., 2003]. В этом существенное отличие данной модели от рассмотренной ранее вазореиалыюй гипертензии у кроликов, при которой гипертрофия миокарда является результатом вызванной АГ гемодинамической перегрузки сердца. Опираясь на полученные нами результаты и данные других исследователей, показывающие, что ростовые стимулы, активируя разные киназы, оказывают на апоптотическую гибель КМЦ противоположный эффект [N.H. Bishopric et al., 2001; B.C. Bernardo et al., 2010], можно предположить, что сигнальные пути, опосредующие развитие гипертрофии миокарда у крыс линии SHR, по крайней мере, на начальных этапах ее развития, также подавляют программированную клеточную гибель. Однако по мере дальнейшего развития гипертрофии и повышения артериального давления, индукторы апоптоза начинают преобладать над его супрессорами, стимулируя гибель КМЦ, причем в ЛЖ и ПЖ апоптогенные сигналы, видимо, отличаются.

Возрастные особенности апоптоза кардиомиоцитов

Известно, что старение обычно сопровождается прогрессирующим снижением сердечной функции [EG. Lakatta, 1998], однако, конкретные молекулярные механизмы, вовлеченные в этот процесс, еще недостаточно изучены. Вполне вероятно, что немаловажную роль в старении сердца играет обусловленная апоптозом потеря КМЦ. Сроки, в которые проводились исследования миокарда крыс, позволили изучить возрастную динамику интенсивности апоптоза и степени гипертрофии КМЦ в обоих желудочках сердца в норме и при генетически обусловленной АГ.

Исследование ПКГ сердечных миоцитов нормотензивных крыс линии Wistar-Kyoto показало, что индекс апоптоза с возрастом увеличивается и у годовалых крыс статистически значимо выше соответствующего показателя у 8-недельных животных как в ЛЖ, так и в ПЖ (рис. 2).

Если придерживаться свободнорадикальной гипотезы старения, предложенной Д. Харманом [D. Harman, 1956], индуцирующим гибель клеток миокарда фактором может выступать окислительный стресс, что подтверждается исследованиями, выявившими повышение при старении экспрессии маркеров окислительного стресса в КМЦ крыс [S. Asano et al., 2007]. Активные формы кислорода повреждают клеточные структуры, в том числе и митохондриальную ДНК [В.П. Скулачев, 2005; P.S. Rabinovitch et al.,

2010], что приводит, с одной стороны, к активации «стража генома» - белка р53 [П.М. Чумаков, 2007; D. Liu, Y. Xu, 2011], а с другой стороны - к нарушению энергетического баланса клетки. Результатом обоих событий становится индукция клеточной гибели. Таким образом, окислительный стресс и энергетический дефицит являются наиболее вероятными триггерами ПКГ сердечных миоцитов при старении организма.

30 -25 i 20 -15 Н 10 |

8 нед. 15 нед. 52 нед.

20 18 16 14 12 10 • 8 • 6 -4 -2 -

8 нед. 15 нед. 52 нед.

Рис.2. Возрастная динамика индекса апоптоза (%) в левом (А) и правом (Б) желудочках сердца крыс. * - показатель достоверно отличается от такового на предыдущем сроке исследования при р<0,05; ** - показатель достоверно отличается от исходного уровня (8 недель) при р<0,05.

Исследование активности каспазы 3 показало, что в ЛЖ нормотензивных крыс активность данного фермента с возрастом постепенно снижается и становится у годовалых крыс достоверно ниже соответствующего показателя у 8-недельных животных. В ПЖ 15-недельных крыс линии \\%1аг-Куо1о наблюдается достоверное повышение активности каспазы 3 по сравнению с соответствующим показателем у 8-недельных животных и последующее ее снижение к годовалому возрасту. Несмотря на несколько отличающуюся динамику в ЛЖ и ПЖ, старение организма сопровождается подавлением

-•♦-•Контроль -•-SHR

каспазного каскада, что вполне согласуется с данными N. ВаЫ й а1. (2006) обнаружившими, что наибольшая каспазиая активность характерна для эмбриональных КМЦ. Следовательно, в постнатальный период в клетках миокарда происходит переключение с каспазоопосредованной на каспазонезависимую клеточную гибель, осуществляющуюся, вероятно, с участием А1Р и эндонуклеазы О.

При изучении динамики ЯЦО КМЦ выявлено, что в обоих желудочках сердца после 15-недслыюго возраста его значение начинает снижаться, и у годовалых крыс достоверно отличается от предыдущих сроков исследования, указывая на развитие гипертрофии миокарда (рис. 3). Увеличение размеров сердечных миоцитов в данном случае, скорее всего, обусловлено апоптотической гибелью клеток и носит компенсаторный характер [Б Б (ЗоШзртк & а!., 2003].

0,3 0,3

0,25 0,25

0,2 0,2

0,15 0,15 * "•"Контроль

0,1 -■ * ОД * -«-БНИ

0,05 0,05 ■

0 0 - ------—р-------------,

8 нед. 15 нед. 52 нед. 8нед. 15нед. 52нед.

А Б

Рис. 3. Возрастная динамика ЯЦО в левом (А) и правом (Б) желудочках сердца крыс. * - показатель достоверно отличается от такового на предыдущем сроке исследования при р<0,05.

Наличие генетически обусловленной АГ существенно изменяет возрастную динамику апоптотических процессов в ЛЖ. Так, пик интенсивности апоптоза (рис. 2), также как и активности каспазы 3, приходится на момент выхода АД на плато - 15 недель, к годовалому возрасту миокард, по всей вероятности, либо адаптируется к гипертонии, либо происходит истощение соответствующих ферментных систем, в связи с чем показатели выходят на контрольный уровень. ЯЦО КМЦ спонтанно гипертензивных крыс достигает минимума в возрасте 15 недель, и далее не меняется (рис. 3).

Таким образом, при старении организма за счет усиления апоптотических и гипертрофических процессов в миокарде нормотензивных организмов с одной стороны, и адаптации ЛЖ к АГ, с другой стороны, интенсивность апоптоза в исследуемых группах уже достоверно не отличается, а отличия по показателю ЯЦО, хотя и статистически значимы, но уже не столь выражены, как в 15-недельном возрасте.

Энергетический дефицит как возможный фактор индукции апоптоза клеток миокарда при артериальной гипертензии

В результате повышения артериального давления развивается хроническая перегрузка сердца, при которой в КМЦ возможен умеренный дефицит энергии, обусловленный как возрастанием потребления клетками АТФ вследствие увеличившейся нагрузки на сердечную мышцу и развивающейся гипертрофии миокарда, так и некоторой гипоксией ткани, вызванной изменением коронарного кровотока [E.D. Fröhlich, 2001]. Недостаток восполнения энергии в клетках может также стать результатом кальциевой перегрузки митохондрий, приводящей к разобщению дыхательной цепи и окислительного фосфорилирования [IO.B. Постнов, 2004]. Дефицит АТФ, в свою очередь, нарушает работу ионных насосов и, наряду с кальциевой перегрузкой, способствует снижению мембранного потенциала митохондрий и, как следствие, открытию пор и высвобождению проапоптотических факторов [X. Chen et al., 2005; A.B. Gustafsson, R.A. Gottlieb, 2008; J.J. Lemasters et al., 2009]. Таким образом, гипоксия и последующее изменение энергетического баланса клетки могут играть существенную роль в нарушении равновесия между выживанием и гибелью сердечных миоцитов [С. Depre, Н. Taegtmeyer, 2000]. При этом способ клеточной гибели зависит от степени несоответствия энергетических потребностей клетки и продукции энергии при митохондриальном окислительном фосфорилировании [Y. Kushnareva, D. Newmeyer, 2010]. Так, было обнаружено, что временное и обратимое снижение содержания АТФ в клетках стимулирует их апоптотическую гибель, реализующуюся через активацию белка р53, формирование апоптосомы и индукцию каспазного каскада [А. Samali et al., 2007; G.Y. Li et al., 2009], в то время как значительное уменьшение клеточных запасов АТФ вызывает некроз. Данное явление может быть объяснено тем, что сами апоптотические процессы являются энергозависимыми, и их осуществление затрудняется в условиях выраженного энергетического дефицита.

Для выявления возможной вовлеченности энергетического дефицита в индукцию апоптоза КМЦ нами было исследовано влияние неотона, действующим веществом которого является макроэргическое соединение фосфокреатин, на апоптотические процессы в сердечных миоцитах животных с АГ различного генеза.

Было обнаружено, что данный препарат предотвращает активацию каспазы 3 как при вазоренальной АГ у кроликов, так и у спонтанно гипертензивных крыс, но не влияет на активность каспазы 8, повышение которой наблюдается в ЛЖ 15-недельных крыс линии SHR (табл.8 и табл.9).

Таблица 8. Активность каспазы 3 в миокарде желудочков сердца кроликов (М±т) ______

Показатель ЛЖ ПЖ

Контроль АГ 4 недели + неотон Контроль АГ 4 недели + неотон

Каспаза 3, НМОЛЬХМНП"1ХМЛ"1 0,23±0,02 0,23±0,02 0,20±0,02 0,21±0,02

Таблица 9. Активность каспазы 3 и каспазы 8 в миокарде желудочков

сердца крыс (М±т)

Показатель ЛЖ ПЖ

Контроль SHR15 недель + неотон Контроль SHR15 недель + неотон

Каспаза 3, нмольхмин"1хмл"1 0,20±0,03 0,23±0,03 0,16±0,02 0,17±0,02

Каспаза 8, нмольхмин"1хмл"1 0,51±0,10 0,95±0,10* не определяли не определяли

Примечание: * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05

Исходя из полученных результатов, можно сделать следующие предположения: возможно, что при восстановлении энергетического баланса клетки подавляется активность каспазы 3 без изменения активности каспазы 8 либо, что более вероятно, эффекторная каспаза у крыс линии SHR активируется как внешним, так и внутриклеточным апоптогенными сигналами, причем в условиях повышенного артериального давления именно внутриклеточный сигнал является преобладающим и индуцируется энергетическим дефицитом. Последнее предположение подтверждается и результатами, полученными при исследовании миокарда кроликов с вазореналыюй АГ, в котором активация каспазы 3 ответ па повышение артериального давления осуществляется только по митохондриалыюму пути, и применение фосфокреатина снижает ее активность до контрольных значений.

На рис. 4 представлены результаты исследования методом TUNEL интенсивности апоптоза КМЦ животных контрольных и опытных групп.

Индекс апоптоза в ЛЖ и ПЖ кроликов опытной группы при введении неотона значимо снижался, но был достоверно выше контрольных значений (рис. 4А), что указывает на существенную роль энергетического дефицита при индукции ПКГ КМЦ у животных с вазореналыюй АГ, но - при этом в инициацию процесса вовлечены и другие триггеры клеточной гибели.

В ЛЖ крыс линии SHR неотон снижал индекс апоптоза до контрольного уровня, но не влиял на соответствующий показатель в ПЖ (рис. 4Б). Следовательно, механизмы инициации апоптотической гибели КМЦ в ПЖ и ЛЖ спонтанно гипертензивных крыс отличаются, и нарушение энергетического

баланса индуцирует ПКГ сердечных миоцитов только в ЛЖ. Вероятно, это обусловлено большей васкуляризацией и лучшим кровоснабжением миокарда ПЖ [Т.А. Казанская, В.А. Фролов, 1995], вследствие чего в нем не развивается столь выраженный энергодефицит, как в ЛЖ.

Контроль

ОПЫТ1 Опыт 2

■ ЛЖ

т пж

30 25 20 15 10 5 О

Контроль

Опыт! Опыт2

Рис. 4. Индекс апоптоза КМЦ в желудочках сердца экспериментальных животных, %. * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05; **- показатель достоверно отличается от контроля и опыта 1 при р<0,05. А -кролики (опыт 1 - животные с четырехнедельной АГ, не получавшие лечения (данные I серии эксперимента), опыт 2 — кролики с вазоренальной АГ, леченые неотоном). Б - крысы (опыт 1 - 15-недельные крысы линии БНЯ, не получавшие лечения (данные I серии эксперимента), опыт 2 - 15-недельные крысы линии ЯНИ, леченые неотоном).

При изучении внутриклеточных механизмов, вовлеченных в изучаемое явление, было обнаружено, что экзогенный фосфокреатин у крыс линии ЭНЯ в ЛЖ снижает до контрольных значений экспрессию р53 и значимо уменьшает содержание Вах, но оно остается достоверно более высоким, чем у нормотензивных животных. При этом уровень Вс1-2 существенно не изменяется, оставаясь ниже контрольных значений (табл.10).

Полученные результаты подтверждают выдвинутое ранее предположение о мультифакториальной природе повышения экспрессии Вах. Видимо, в ответ

на энергетический дефицит синтезируется и активируется р53, который, в свою очередь, вносит вклад в усиление транскрипции гена Вах. Именно за счет предотвращения активации этого сигнального пути при применении неотона и наблюдается достоверное уменьшение содержания белка Вах. Однако при этом сохраняется стимулирующее влияние АТИ, ЕТ-1 и гемодинамической перегрузки, в связи с чем содержание данного белка остается выше контрольного уровня. Но следует отметить, что, несмотря на повышенное содержание Вах, индекс апоптоза в ЛЖ снижается до контрольных значений. Возможно, компенсация энергодефицита сопровождается активацией в ЛЖ супрессоров апоптоза.

Таблица 10. Содержание белков Вс1-2, Вах, р53 (%) в КМЦ желудочков

Белок ЛЖ ПЖ

Контроль Опыт 1 Опыт 2 Контроль Опыт 1 Опыт 2

Вс1-2 2,27±0,24 0,72±0,13* 1,34±0,26* 0.86±0,17 0,88±0,15 2,80±0,43**

Вах 14,32±0,72 42Д8±1,61* 22,27±1,46** 27,30±0,93 48,30*1,54* 42,78±1,74**

р53 19,26±1,00 48,60±1,76* 18,76±1,0б 21,73±1,21 50,37±2,2б* 47,30±1,92*

А ---------------т—>--» — " »J^ v 1MV1V» V A. 1XV11IJJUJ Ш ирп p^VjUJj •

** - показатель достоверно отличается от контроля и опыта 1 при р<0,05. Опыт 1 - 15-неделыгые крысы линии SUR, не получавшие лечения (данные I серии эксперимента), опыт 2 - 15-недельные крысы линии SHR, леченые неотоном.

В ПЖ в ответ на введение неотона содержание Вах также достоверно снижается, хотя и не столь резко, как в ЛЖ, и значительно увеличивается содержание Вс1-2, превышая в 3 раза контрольный уровень. Однако экспрессия р53 в ПЖ, также как и индекс апоптоза, в отличие от ЛЖ, при лечении неотоном не изменяется. Исходя из данных результатов, можно предположить, что в КМЦ спонтанно гипертензивных крыс одним из ключевых факторов в индукции апоптоза является белок р53, и механизм его активации в ПЖ отличается от такового в ЛЖ и не определяется энергетическим дефицитом.

В рамках настоящего исследования также было изучено влияние неотона на степень гипертрофии КМЦ желудочков сердца спонтанно гипертензивных крыс и кроликов с вазоренальной АГ. Согласно полученным результатам, ЯЦО в КМЦ ЛЖ и ПЖ в обеих экспериментальных моделях при введении неотона остается достоверно ниже контрольных значений, указывая на развивающуюся гипертрофию, в то время как интенсивность апоптоза в ЛЖ под действием того же препарата значимо снижается. Таким образом, можно предположить, что гипертрофия, наряду с сопутствующей АГ перегрузкой сердечной мышцы, может вносить определенный вклад в формирование энергодефицита в КМЦ ЛЖ, но при введении экзогенных источников энергии перестает оказывать апоптогенное действие. Вопрос относительно влияния гипертрофии на апоптоз КМЦ в ПЖ остается открытым, т.к. у крыс линии SHR значения ЯЦО и индекса апоптоза под влиянием неотона не изменяются, а у кроликов с вазоренальной АГ, хотя и наблюдается снижение индекса апоптоза, эффект препарата не столь выражен, как в ЛЖ.

Роль окислительного стресса в инициации апоптотической гибели кардпомиоцитов при артериальной гипертензии

Формирование окислительного стресса при гипертонии связано как с деятельностью дыхательной цепи митохондрий [Q. Chen et al., 2003; J.F. Turrens, 2003], так и активируемой ATII НАДФ-оксидазы [D.M. Pollock, 2005]. В связи со способностью активных форм кислорода (АФК) индуцировать апоптоз [В .П. Скулачев, 2001] можно предполагать их участие в инициации наблюдаемой при АГ программированной гибели сердечных миоцитов.

Для проверки данной гипотезы животным опытных групп вводился препарат мексидол, действующим веществом которого является этилметилгидроксипиридина сукцинат. Данный препарат, являясь производным 3-оксипиридина, обладает выраженными антиоксидантнтными свойствами, а сукцинат, входящий в его состав, будучи субстратом цикла Кребса, стимулирует синтез АТФ. Таким образом, он может способствовать уменьшению как энергетического дефицита, так и интенсивности окислительного стресса.

Оказалось, что в миокарде кроликов с вазоренальной АГ мексидол, так же как и неотон, предотвращает активацию каспазы 3 (табл. 11), а также значимо снижает индекс апоптоза в ЛЖ, хотя данный показатель продолжает оставаться выше контроля (рис. 5А). Однако при этом препарат не влияет на интенсивность апоптоза в ПЖ.

Индекс апоптоза в ЛЖ крыс линии SHR также снижается под влиянием мексидола, но остается значимо выше контроля. В ПЖ гипертензивных крыс, как и в предыдущем эксперименте, лечение эффекта не оказало (рис. 5Б). Следовательно, сукцинат, в отличие от фосфокреатина, не может полностью компенсировать энергодефицит, формирующийся в КМЦ ЛЖ спонтанно гипертензивных крыс и ПЖ кроликов с вазоренальной АГ, что, возможно, обусловлено нарушением функций митохондрий на уровне дыхательной цепи. Безусловный интерес вызывает тот факт, что при введении мексидола спонтанно гипертензивным крысам предотвращается активация не только каспазы 3, но и каспазы 8 (табл. 12), что указывает на окислительный стресс как возможный индуктор рецепторно-опосредованной передачи апоптогенного сигнала.

Таблица 11. Активность каспазы 3 в миокарде желудочков сердца кроликов (М±т) _____

Показатель ЛЖ ПЖ

Контроль АГ 4 недели + мексидол Контроль АГ 4 недели + мексидол

Каспаза 3, нмольхмин"1 *мл"1 0,23±0,02 0,23 ±0,02 0,20±0,02 0,16±0,03

Рис. 5. Индекс апоптоза КМЦ в желудочках сердца экспериментальных животных, %. * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05; **- показатель достоверно отличается от контроля и опыта 1 при р<0,05. А — кролики (опыт 1 - животные с четырехнедельной АГ, не получавшие лечения (данные I серии эксперимента), опыт 3 - кролики с вазореналыюй АГ, леченые мексидолом). Б - крысы (опыт 1 - 15-недельные крысы линии SHR, не получавшие лечения (данные I серии эксперимента), опыт 3 - 15-недельные крысы линии SIIR, леченые мексидолом)

Таблица 12. Активность каспазы 3 и каспазы 8 в миокарде желудочков

сердца крыс (М±т)

Показатель лж пж

Контроль SHR15 недель + мексидол Контроль SHR15 недель + мексидол

Каспаза 3, нмольхмин"1 хмл"1 0,20±0,03 0,23±0,03 0,16±0,02 0,15±0,02

Каспаза 8, НМОЛЬХМИН"1 Хмл"1 0,51±0,10 0,76±0,09 не определяли не определяли

Примечание: * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05

При исследовании влияния мексидола на внутриклеточные белки в ЛЖ крыс линии ЭНК полученные результаты были подобны наблюдаемым при лечении неотоном, т.е. экспрессия Вс1-2 не изменялась, снижался до контрольных значений уровень р53, и достоверно уменьшалось содержание Вах, оставаясь при этом значимо выше контроля (табл. 13). Обращает на себя внимание тот факт, что влияние мексидола на экспрессию Вах достоверно слабее влияния неотона. Этим можно объяснить и менее выраженное снижение индекса апоптоза после антиоксидантной терапии по сравнению с эффектом после применения макроэргического соединения.

Таблица 13. Содержание белков Вс1-2, Вах, р53 (%) в КМЦ желудочков сердца крыс (M=fcm)____

Белок ЛЖ ПЖ

Контроль Опыт 1 Опыт 3 Контроль Опыт 1 Опыт 3

Вс1-2 2,27±0,24 0,72±0,13* 0,75±0,13* 0,86±0,17 0,88±0,15 3,03±0,29**

Вах 14,32±0,72 42,18±1,61* 32,02±1,30** 27,30±0,93 48,30±1,54* 55,67±1,58**

р53 19,26±1,00 48,60±1,76* 19,93±0,84 21,73±1,21 50,37±2,26* 38,87±1,77+*

Примечание: * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05, ** — показатель достоверно отличается от контроля и опыта 1 при р<0,05. Опыт 1 - 15-недельные крысы линии SUR, не получавшие лечения (данные I серии эксперимента), опыт 3 - 15-недельные крысы лиши SHR, леченые мексидолом.

В ПЖ данный препарат, в отличие от фосфокреатина, снижал содержание р53, хотя и не до контрольного уровня, что позволяет выдвинуть предположение об активации р53 в ПЖ под действием окислительного стресса. Этот эффект, вероятно, обусловлен тем, что АФК в КМЦ при АГ синтезируются не только в результате изменения деятельности дыхательной цепи митохондрий, спровоцированной снижением содержания АТФ в клетке, но и под влиянием других факторов, к числу которых относится ATII [D.M. Pollock, 2005]. После лечения мексидолом достоверно возросла экспрессия Bcl-2, но при этом увеличилось и содержание Вах. Результатом такого неоднозначного воздействия препарата на миокард ПЖ стало отсутствие влияния на интенсивность апоптоза в целом.

Исследование ЯЦО после применения мексидола показало, что при вазоренальной АГ препарат в обоих желудочках сердца не влияет па степень гипертрофии миокарда. Таким образом, мексидол, так же как и неотон, снижая интенсивность апоптоза, не оказывают влияния на гипертрофические процессы в миокарде при АГ почечного генеза. Следовательно, можно говорить о том, что при компенсации энергетического дефицита и ослаблении окислительного стресса в КМЦ, гипертрофия миокарда перестает оказывать апоптогенное действие.

Лечение спонтанно гипертензивных крыс мексидолом приводит к статистически значимому повышению ЯЦО в КМЦ ЛЖ, но при этом оно остается достоверно ниже контроля (табл. 14), что указывает на наличие умеренного антигипертрофического эффекта данного препарата. Это, в свою

очередь, свидетельствует об участии окислительного стресса в развитии гипертрофии ЛЖ у спонтанно гипертензивных крыс, причем, как было отмечено выше, причиной окислительного стресса является не только энергетический дефицит. В ПЖ введение мсксидола не предупреждает развитие гипертрофии, на что указывает значимое снижение ЯЦО. Полученные данные еще раз подтверждают тот факт, что индукторы гипертрофических процессов, также как и апоптоза, в ПЖ и ЛЖ спонтанно гипертензивных крыс отличаются.

Таблица 14. Ядерно-цитоплазматическое отношение в кардиомиоцитах

Контроль Опыт 1 ОпытЗ

ЛЖ 0,27±0,01 0,11±0,01* 0,15±0,01**

ПЖ 0,26±0,01 0,21±0,01* 0,18±0,01**

Примечание: * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05, ** -показатель достоверно отличается от контроля и опыта 1 при р<0,05. Опыт 1 -15-недельные крысы линии SHR, не получавшие лечения (данные I серии эксперимента), опыт 3 - 15-недельные крысы линии SHR, леченые мексидолом.

Влияние эндотелина-1 на апоптоз кардиомиоцитов при генетически обусловленной артериальной гнпертензии

Эндотелины представляют собой группу биологически активных веществ пептидной природы, являющихся важнейшими регуляторами деятельности сердечно-сосудистой системы. Из соединений этой группы наибольший интерес на сегодняшний день представляет эндотелин-1 (ЕТ-1). Активировать его синтез в организме могут гипоксия, АТИ, адреналин, TNF-a, некоторые ростовые факторы и др. [К.Е. Willey, А.Р. Davenport, 2001; L.R. Stow et al., 2011]. ЕТ-1, взаимодействуя с ЕТА-рецепторами, приводит к сужению кровеносных сосудов и развитию гипертрофии миокарда [F. Brunner et al, 2006], что может опосредованно стимулировать ПКГ КМЦ. Также известно, что данный пептид способен активировать НАДФ-оксидазу, внося, таким образом, вклад в продукцию АФК и усиление апоптотических процессов [D.D. Chen et al., 2012]. В этой связи было исследовано влияние BQ-123, относящегося к селективным антагонистам ЕТА-рецепторов, на апоптоз КМЦ 15-недельных спонтанно гипертензивных крыс.

Обнаружено, что в миокарде ЛЖ введение BQ-123 предупреждает повышение индекса апоптоза (рис. 6) и активацию инициаторной каспазы 8 и эффекторной каспазы 3 (табл. 15).

Контроль

Опыт 1

ІЛЖ ЗПЖ

Опыт 4

Рис. 6. Индекс апоптоза кардиомиоцитов в желудочках сердца крыс, %. * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05. Опыт 1-15-недельные крысы линии вНЯ, не получавшие лечения (данные I серии эксперимента), опыт 4 - 15-недельные крысы линии БШ, леченые ВО-123.

Таблица 15. Активность каспазы 3 и каспазы 8 в миокарде желудочков сердца крыс (М±т)

Показатель

ЛЖ

Контроль

SHR 15 недель + BQ-123 ___

ггж

Контроль

SHR 15 недель + BQ-123

Каспаза 3,

нмольхмин *МЛ

0,22±0,03

0,18±0,02

0,11±0,01

0,10±0,01

Каспаза 8,

0,59±0,07

0,52±0Д0

не определяли

При этом отсутствует влияние на внутриклеточную продукцию Вс1-2, и наблюдается достоверное снижение экспрессии р53, хотя его уровень остается выше контрольного. Но наиболее важным эффектом данного препарата является настолько резкое снижение содержания Вах в КМЦ ЛЖ, что показатель становится в 2 раза ниже контрольных значений (табл. 16). Следовательно, ЕТ-1 выступает основным индуктором экспрессии Вах как при АГ, так и в физиологических условиях. Вероятно, вызываемое AT1I повышение синтеза Вах носит эндотелин-опосредованный характер. Таким образом, селективная блокада ЕТА-рецепторов в ЛЖ сопровождается подавлением митохондриального сигнального пути, что подтверждается снижением содержания Вах, а также уменьшением продукции АФК и экспрессии р53, способствующим инактивации рецепторно-опосредованной апоптогенной сигнальной трансдукции.

Таблица 16. Содержание белков Вс1-2, Вах, р53 (%) в КМЦ желудочков сердца крыс (М±т)_

Белок ЛЖ ПЖ

Контроль Опыт 1 Опыт 4 Контроль Опыт 1 Опыт 4

Вс1-2 2,27±0,24 0,72±0,13* 0,63±0,14* 0,86±0,17 0,88±0,15 0,68±0,21

Вах 14,32±0,72 42,18±1,61* 7,85±0,62** 27,30±0,93 48,30±1,54* 33,90±1,69**

р53 19,26±1,00 48,60±1,76* 27,82±1,65** 21,73±1,21 50,37±2,26* 41,30±2,65**

Примечание: * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05, ** - показатель достоверно отличается от контроля и опыта 1 при р<0,05. Опыт 1 - 15-недельные крысы линии SHR, не получавшие лечения (данные I серии эксперимента), опыт 4 - 15-недельные крысы линии SHR, леченые BQ-123.

При исследовании миокарда ГОК (рис. 6., табл. 15, табл. 16) изменений в интенсивности апоптоза под влиянием блокады ЕТА-рецепторов выявлено не было, несмотря на значимое снижение содержания Вах и р53.

Отличия результатов, полученных при исследовании левого и правого желудочков сердца, могут быть обусловлены существенной ролью паракринного и аутокринного действия ЕТ-1, вырабатываемого КМЦ ЛЖ. Это предположение подтверждается литературными данными, показывающими, что содержание ЕТ-1 в крови у крыс линии SHR незначительно отличается от нормы [J.S. Li, E.L. Schiffrin, 1995], в то время как при перегрузке миокарда повышается интенсивность синтеза ЕТ-1 в КМЦ ЛЖ, а в ПЖ данный показатель остается неизменным [F. Brunner et al., 2006].

Полученные результаты позволяют полагать, что ЕТ-1 способствует индукции программированной гибели клеток миокарда ЛЖ при АГ. Нельзя исключить, что апоптогенное действие данного пептида обусловлено, в том числе, и его вазоконстрикторными свойствами, а также участием в развитии гипертрофии миокарда. При введении крысам линии SHR препарата BQ-123 ЯЦО в ЛЖ значимо повышается, но остается достоверно ниже контрольных значений (табл. 17), что, по-видимому, связано с влиянием других факторов, способствующих развитию гипертрофии, ведущим из которых, является ATII [М. Paul et al., 2006; D.E. Kohan et al., 2011].

Таблица 17. Ддерно-цитоплазматическое отношение в кардиомиоцитах желудочков сердца крыс (М±т)__

Контроль Опыт 1 Опыт 4

ЛЖ 0,27±0,01 0,11±0,01* 0,17±0,01**

ПЖ 0,26±0,01 0,21±0,01* 0,22±0,01*

Примечание: * - показатель достоверно отличается от контроля при р<0,05, ** -показатель достоверно отличается от контроля и опыта 1 при р<0,05. Опыт 1 -15-недельные крысы линии SHR, не получавшие лечения (данные I серии эксперимента), опыт 4 - 15-недельные крысы линии SHR, леченые BQ-123.

Следует отметить, что блокада ЕТА-рецепторов не влияет на формирование гипертрофии ПЖ. Таким образом, еще раз подтверждается гипотеза об отличии механизмов, инициирующих апоптоз и гипертрофию КМЦ в левом и правом желудочках сердца при АГ.

Эффективность медикаментозной регуляции апоптотических процессов в кардиомиоцитах при генетически обусловленной артериальной гипертензии

Поиск новых методов профилактики и лечения патологии сосудов и сердца по-прежнему входит в число важнейших задач современного здравоохранения как в РФ, так и во всем мире. При этом значительные усилия экспериментальной и клинической медицины направлены на совершенствование фармакотерапии АГ, которая в настоящее время остается одной из основных причин заболеваемости и смертности от сердечнососудистых заболеваний.

Опираясь на полученные в настоящем исследовании результаты, а также литературные данные, можно говорить о значительном усилении апоптотических процессов в КМЦ в условиях АГ. Следовательно, применение препаратов, снижающих интенсивность ПКГ сердечных миоцитов, может стать важным слагаемым профилактики и лечения хронической сердечной недостаточности при АГ различного генеза.

Проведенные эксперименты показали, что макроэргические препараты, антиоксиданты и селективные антагонисты ЕТА-рецепторов оказывают определенный ингибирующий эффект на различные звенья апоптотической программы. Дискриминантный анализ данных, полученных при гистологическом и иммуногистохимических исследованиях у спонтанно гипертензивных крыс, выявил, что применяемые препараты оказали наибольший эффект на общую интенсивность апоптоза, выраженную в виде показателя «индекс апоптоза» и, в частности, на содержание белков Вах и р53, причем неотон и мексидол обладали сходным действием на исследуемые признаки. В то же время наименьшее влияние со стороны проводимой терапии испытал параметр ЯЦО, отражающий степень гипертрофии миокарда.

В связи с неодинаковой степенью воздействия препаратов на оцениваемые показатели и неоднозначностью их влияния, затрудняющими сравнительную оценку эффективности лечения, в рамках настоящей работы предлагается интегративный показатель, названный «величина терапевтического эффекта», для вычисления которого исследуемые параметры с использованием метода многомерного шкалирования объединялись в линейные комбинации, называемые измерениями. Цель данного метода состоит в построении такого ортогонального пространства линейных комбинаций, в котором расстояния между объектами максимально точно воспроизводят их расстояния в исходном пространстве показателей. В представленном исследовании для каждой группы были взяты по одному объекту, характеризующемуся средними для соответствующей группы значениями оцениваемых показателей. Необходимо было измерить расстояния каждого

опытного объекта до контроля. Если после лечения это расстояние сократилось, терапевтический эффект присутствует и тем более велик, чем значительнее сокращение расстояния. Оставалось, таким образом, измерить расстояние между контролем и опытной группой 1 (крысы Я НИ. не получавшие лечения), а затем между контролем и опытными группами 2, 3, 4 (крысы 8НЯ, леченые неотоном, мексидолом и ВСН23, соответственно). Величина разности этих расстояний и была нами названа величиной терапевтического эффекта. Чем ближе оказывалась группа к контролю после лечения, тем выше величина терапевтического эффекта соответствующего препарата (табл. 18). Достоинством этого способа оценки эффективности проводимой терапии является то, что он позволяет учитывать весь комплекс исследуемых признаков, более того при необходимости в этот комплекс можно вводить дополнительные показатели. Предложенный подход может быть использован для оценки влияния любых препаратов на любые комплексы признаков, а интегративный показатель можно вычислять для одного и того же объекта (больного) на основании данных, полученных до лечения и после лечения.

Таблица 14. Величина терапевтического эффекта препаратов, усл. ед.

неотон мексидол ВО-123

ЛЖ 2,07 1,5 1,91

пж 0,24 0,14 0,29

Сравнение полученных данных показало, что использованные препараты большее влияние оказывают на миокард ЛЖ. Величины терапевтического эффекта неотона и ВС>-123 приблизительно равны, хотя эффективность неотона несколько выше. Следует отметить, что, несмотря на сходное действие неотона и мексидола, последний наименее эффективен по влиянию на комплекс исследованных признаков.

Таким образом, артериальная гипертензия различного генеза сопровождается усилением апоптоза кардиомиоцитов обоих желудочков сердца, реализующегося с участием митохондриального сигнального пути и некаспазных эффекторов. Факторами, способствующими индукции ПКГ клеток миокарда, являются энергетический дефицит, окислительный стресс и эндотелин-1. Следовательно, испытания и внедрение в клиническую практику макроэргических препаратов, компенсирующих развивающийся при АГ в миокарде ЛЖ энергетический дефицит, причем желательно в комбинации с антиоксидантами, либо соединений, блокирующих действие ЕТ-1, могут стать основой нового подхода к лечению сердечно-сосудистых заболеваний и профилактике их последствий, направленного на ограничение апоптотической гибели и гипертрофии КМЦ.

выводы

1. При артериальной гипертензии различного генеза достоверно повышается интенсивность апоптоза КМЦ левого и правого желудочков сердца, в реализации которого преобладают митохондриальный путь передачи апоптогенного сигнала и некаспазные эффекторы.

2. При вазоренальной артериальной гипертензии значимым, но не единственным индуктором апоптотической гибели КМЦ является энергетический дефицит в клетках миокарда.

3. В миокарде ЛЖ спонтанно гипертензивных крыс основным триггером апоптоза, вероятно, выступает формирующийся в нем умеренный энергетический дефицит, повышающий экспрессию в клетках белков р53 и Вах. Определенный вклад в инициацию апоптотической программы вносит окислительный стресс, активирующий рецепторно-опосредованный путь передачи апоптогенного сигнала.

4. К факторам, способствующим преобладанию индукторов апоптоза КМЦ над его супрессорами, у спонтанно гипертензивных крыс относится эндотелии-1. Данный пептид предположительно стимулирует экспрессию проапоптозного белка Вах в сердечных миоцитах не только при артериальной гипертензии, но и в физиологических условиях.

5. При вазоренальной артериальной гипертензии гипертрофия представляет собой реакцию миокарда на хроническую перегрузку, обусловленную повышением артериального давления. У крыс линии ЭНЯ гипертрофия миокарда ЛЖ и ПЖ начинает развиваться в первые недели жизни на фоне сниженного апоптоза и не зависит величины артериального давления. В ЛЖ спонтанно гипертензивных крыс триггерами гипертрофических процессов выступают окислительный стресс и эндотелин-1.

6. Гипертрофия миокарда при артериальной гипертензии различного генеза может вносить определенный вклад в индукцию программированной гибели КМЦ ЛЖ, но при применении экзогенных макроэргических соединений перестает оказывать апоптогенное действие.

7. В инициации апоптотической гибели КМЦ ПЖ при вазоренальной артериальной гипертензии участвует энергетический дефицит, при генетически обусловленной артериальной гипертонии - окислительный стресс. Однако основные индукторы апоптоза КМЦ в ПЖ отличаются от таковых в ЛЖ и требуют дальнейшего изучения.

8. При старении организма в норме наблюдается повышение интенсивности апоптотической гибели КМЦ в обоих желудочках сердца, причем происходит переключение с каспазоопосредованного на некаспазный механизм реализации апоптотической программы. Потеря сердечных миоцитов с возрастом сопровождается развитием компенсаторной гипертрофии миокарда.

9. Применение макроэргических соединений, антиоксидантов и селективных антагонистов ЕТА-рецепторов может стать важным слагаемым

профилактики и лечения хронической сердечной недостаточности при артериальной гипертензии различного генеза.

10. Артериальная гипертензия различного генеза создает в организме условия, способствующие усилению апоптоза КМЦ в обоих желудочках сердца. Развивающиеся при АГ хроническая гемодинамическая перегрузка и гипертрофия миокарда, наряду с гуморальными факторами, к числу которых относятся ангиотензин II и эндотелии-1, участвуют в формировании в сердечных миоцитах ЛЖ умеренного энергетического дефицита и окислительного стресса, выступающих непосредственными триггерами апоптотической программы в клетках.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. На основании полученных в рамках представленной работы данных о механизмах индукции апоптотических и гипертрофических процессов в миокарде при артериальной гипертензии целесообразно провести клинические исследования эффективности дополнения антигипертензивной терапии препаратами, содержащими макроэргические соединения, антиоксиданты или селективные антагонисты ЕТА-рецепторов.

2. Эффект терапии может быть оценен количественно на основе объединения комплекса исследуемых показателей в линейную комбинацию методом многомерного шкалирования. В качестве оценки при таком подходе выступает разность расстояний до нормы, вычисленная для каждого больного по итогам обследования до и после лечения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Благоиравов М.Л., Азова М.М., Фролов В.А. Биохимическое исследование апоптоза клеток миокарда при острой перегрузке левого желудочка в эксперименте // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2010. - №8. - С. 49-53.

2. Благоиравов М.Л., Онуфриев М.В., Азова М.М., Фролов В.А. Активность некоторых ферментов каспазного каскада и сократительная функция миокарда при экспериментальной очаговой ишемии левого желудочка // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. ISO. - №12. - С.612-615.

3. Азова М.М. Гибель кардиомиоцитов при артериальной гипертензии // Сборник научных трудов VIII Всероссийской конференции по патологии клетки. - М., 2010. - С. 3-4.

4. Азова М.М. Методы изучения апоптотической гибели клеток миокарда // Научные труды XI международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» «Научные и прикладные аспекты здоровья и здорового образа жизни». -Москва, 2010,-С.17.

5. Азова М.М., Благонравов МЛ., Фролов В.А. Исследование апоптоза клеток миокарда левого желудочка при экспериментальной артериальной гипертензии // Сборник трудов I международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». — Санкт-Петербург, 2010. — Т.З. - С. 16-17.

6. Благонравов M.JL, Азова М.М., Фролов В.А. Влияние экспериментальной очаговой ишемии на активность апоптотических процессов в миокарде левого желудочка // Сборник трудов I международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». — Санкт-Петербург, 2010. -Т.З.-С. 57-58.

7. Благонравов MJL, Азова М.М., Фролов В.А. Активность каспазы 3 и каспазы 8 в миокарде желудочков сердца при экспериментальной дифтерийной интоксикации // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. — 2011. - №2. — С. 28-31.

8. Азова М.М., Благонравов М.Л., Фролов В.А. Активность каспазы 3 и каспазы 8 в клетках миокарда правого желудочка при экспериментальной артериальной гипертензии // Вестпик РУДН. Серия «Медицина». - 2011. - №4. - С.44-47.

9. Благонравов МЛ., Ковязин В.А., Бабиченко И.И., Азова М.М., Фролов В.А. Иммуногистохимическая оценка апоптоза кардиомиоцитов при экспериментальной дифтерийной интоксикации // Сборник тезисов научно-практической конференции «Развитие идей академика А.И. Струкова в современной патологической анатомии». — Москва, 2011.-С.14-15.

10. Азова М.М., Благонравов МЛ., Фролов В.А. Исследование активности каспаз в миокарде левого желудочка спонтанно-гипертензивных крыс // Сборник статей международной конференции «Рецепторы и внутриклеточная сигнализация». - Пущино, 2011. - Т.2. — С.562-564.

11. Азова М.М., Благонравов M.JL, Фролов В.А. Влияние фосфокреатина на активность каспазы 3 в клетках миокарда желудочков сердца при экспериментальной артериальной гипертензии И Сборник трудов II международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине». — Санкт-Петербург, 2011.-Т.1.-С. 9-10.

12. Благонравов МЛ., Азова М.М., Фролов В.А. Влияние острой и хронической перегрузки сердца на активность каспаз в миокарде левого желудочка // Materialy VII Mi^dzynarodovvej naukowi-praktycznej konferencji «Perspektywiczne opracowania s^ naukq i technikami». - Przemysl, 2011. - Vol. 42. -P. 26-28.

13. Азова M.M., Благонравов МЛ., Фролов В.А. Апоптоз клеток миокарда крыс при генетически обусловленной артериальной гипертензии // Биологические мембраны. - 2012. - Т. 29. - № 4. - С.227-230.

14. Азова М.М., Благонравов М.Л., Демуров Е.А., Фролов В.А. Энергетический дефицит как возможный фактор индукции

каспазозависимого апоптоза клеток миокарда левого желудочка при генетически обусловленной н вторичной артериальной гипертензин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. — 2012. — Т. 153. -№6. — С.800-802.

15. Азова М.М., Благоправов M.JL, Фролов В.А. Биохимическое исследование апоптотической гибели клеток миокарда левого желудочка при экспериментальной артериальной гипертензии // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2012. - №5. — С. 27-30.

16. Азова М.М., Благонравов МЛ., Гигани О.Б., Гигани О.О., Фролов В.А. Мекспдол как регулятор каспазозависимой апоптотической гибели клеток миокарда при артериальпой гипертензии различного генеза // Курский научно-практический вестник «Человек и его здоровье». - 2012. - №2.-С. 10-13.

17. Благоправов М.Л., Азова М.М., Ковязин В.А., Бабиченко И.И., Фролов В.А. Апоптоз кардиомиоцитов при диффузном токсическом поражении миокарда в эксперименте // Фундаментальные исследования. — 2012. - №5. - Ч. 2. - С. 252-255.

18. Азова М.М., Благонравов M.JL, Фролов В.А. Влияние мексидола на активность каспазы 3 в миокарде желудочков сердца кроликов с вазоренальной артериальной гипертензией // Сборник трудов II Международной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии». -Казань,2012.-Т. 1.-С.14-16.

19. Азова М.М., Блапжравов М.Л., Фролов В.А. Влияние блокады ЕТА-рецепторов на каспазозависимую апоптотическую гибель клеток миокарда левого желудочка сердца у спонтанно-гипертензивных крыс // Материалы V региональной научно-практической конференции «Новые технологии в рекреации здоровья населения». - Владикавказ, 2012. — С. 149-152.

20. Азова М.М., Благонравов МЛ., Гигани О.Б., Гигани О.О., Фролов В.А. Влияние неотона на каспазозависимый апоптоз клеток миокарда при генетически обусловленной артериальной гипертензии // Сборник материалов XIX Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (тезисы докладов). - Москва, 2012. - С. 460.

21. Азова М.М., Благонравов М.Л., Гигани О.Б., Гигани О.О., Сафронова Е.Ю., Тарбаева Е.А, Фролов В.А. Апоптоз кардиомиоцитов — реакция миокарда на хроническую перегрузку // Материалы XV всероссийского симпозиума «Эколого-физиологические проблемы адаптации». - Москва, 2012. - С. 22-23.

22. Азова М.М., Благонравов М.Л., Фролов В.А., Гигани О.О., Гигани О.Б. Возрастная динамика апоптоза кардиомиоцитов и гипертрофии миокарда// Сборник тезисов докладов III Съезда геронтологов и гериатров России. -Новосибирск, 2012. - С. 8-9.

23. Благонравов М.Л., Азова М.М., Фролов В.А., Горячев В.А. Особенности циркадианной динамики АД и ЧСС у спонтанно-гипертензивных крыс // Вестник РУДН. Серия «Медицина». - 2012. - №7. - С. 47-49.

24. Азова М.М., Благонравов М.Л., Фролов В.А. «Влияние блокады ETA-рецепторов на аиоптоз кардиомиоцитов и развитие гипертрофии миокарда при генетически обусловленной артериальпой гипертснзии» // Экспериментальная и клиническая фармакология. — 2012. - Т.75. — №12. — С. 22-24.

25. Азова М.М, Благонравов M.JL, Фролов В.А., Гигани О.Б., Гигаии О.О. Аиоптоз кардиомиоцитов и гипертрофия миокарда в динамике вазоренальной артериальной гипертензии // Кубанский научный медицинский вестник. — 2012. - №3. — С. 17-19.

26. Азова М.М, Благонравов M.JL, Фролов В.А., Гигани О.Б., Гигани О.О. Апоптоз кардиомиоцитов и гипертрофия миокарда в динамике генетически обусловленной артериальной гипертензии у крыс // Вестник Российского государственного медицинского университета. — 2012. - №6. -С. 63-65.

27. Азова М.М, Благонравов М.Л., Фролов В.А. Влияние энергетического дефицита и окислительного стресса на апоптоз кардиомиоцитов и гипертрофию миокарда у спонтанно гипертензивных крыс // Кубанский научный медицинский вестник. - 2012. - №4. — С. 158161.

28. Азова М.М. Особенности апоптотической гибели кардиомиоцитов при артериальной гипертензии различного генеза // Фундаментальные исследования. — 2012. - № 11. - Ч. 4. — С. 823-826.

29. Азова М.М, Благонравов М.Л., Фролов В.А. Апоптоз кардиомиоцитов при вазоренальной артериальной гипертензии как следствие нарушения энергетического баланса клеток // Казанский медицинский журнал. — 2013. - Т. 94. - №1. - С. 68-70.

Работа выполнена при поддержке Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 20092013 гг (государственный контракт №111302 от 9 июня 2010 г.).

РЕЗЮМЕ докторской диссертации М.М. Азовой «Механизмы инициации и реализации апоптотической гибели кардиомиоцитов при артериальной гипертензии различного генеза»

В представленной работе исследованы механизмы инициации и реализации апоптоза кардиомиоцитов при вазоренальной и генетически обусловленной артериальной гипертензии (АГ). Установлено, что АГ различного генеза сопровождается повышением интенсивности апоптотической гибели и развитием гипертрофии сердечных миоцитов, причем механизмы, лежащие в основе этих процессов, в левом (ЛЖ) и правом желудочках сердца отличаются. Одним из ключевых индукторов апоптоза клеток миокарда ЛЖ в условиях АГ является энергетический дефицит, активирующий митохондриальный путь передачи апоптогенного сигнала и высвобождение некаспазных эффекторов. Определенный вклад в инициацию апоптотической программы вносит окислительный стресс, стимулирующий рецепторно-опосредованную сигнальную транедукцию. В миокарде ЛЖ спонтанно гипертеизивных крыс в индукции программированной гибели сердечных миоцитов участвует эндотелин-1, повышающий экспрессию в клетках белков р53 и Вах. Полученные результаты позволяют полагать, что применение макроэргических соединений, антиоксидантов и селективных антагонистов ЕТА-рецепторов может стать важным слагаемым профилактики и лечения хронической сердечной недостаточности при АГ различного генеза.

SUMMARY

of the dissertation «Mechanisms of initiation and realization of cardiomyocyte apoptosis in hypertension of various genesis» by M.M. Azova

Mechanisms of initiation and realization of cardiomyocyte apoptosis in renovascular and genetically determined arterial hypertension (AH) were investigated in this work. It was found that AH was accompanied by the enhancement of cardiomyocyte apoptosis and hypertrophy. Basic mechanisms of these processes in the left and right ventricles are different. Energy deficiency is one of the key inducers of the left ventricular myocardial cell death. It activates intrinsic pathway and caspase-independent effectors. Oxidative stress participates in the initiation of apoptotic program by activating of extrinsic pathway too. Endothelin-1 stimulates programmed cell death and expression of Bax and p53 in left ventricular myocardium. Thus administration of macroergic agents, antioxidants and selective ETA-receptor antagonists may become the important component of prophylaxis and treatment of heart failure in AH of various genesis.

Подписано в печать:

26.03.2013

Заказ № 8281 Тираж - 150 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работы по медицине, диссертация 2013 года, Азова, Мадина Мухамедовна

РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ

05201350 769 На Правах рукописи

Азова Мадина Мухамедовна

МЕХАНИЗМЫ ИНИЦИАЦИИ И РЕАЛИЗАЦИИ АПОПТОТИЧЕСКОИ ГИБЕЛИ КАРДИОМИОЦИТОВ ПРИ АРТЕРИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИИ

РАЗЛИЧНОГО ГЕНЕЗА

14.03.03 — патологическая физиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор В.А. Фролов

Москва-2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений................................................................ 5

Введение............................................................................... 7

Глава 1. Апоптотическая гибель клеток и ее роль в патологии сердечно-сосудистой системы (обзор литературы)........................ 16

1.1. Механизмы инициации и реализации апоптотической программы

в клетках............................................................................... 16

1.2. Современные методы исследования апоптоза........................ 27

1.3. Апоптотическая гибель кардиомиоцитов................................ 31

1.4. Современные подходы к медикаментозной супрессии апоптоза............................................................................... 50

Глава 2. Материал и методы исследования ................................ 62

Глава 3. Апоптотические и гипертрофические процессы в миокарде в динамике вазоренальной артериальной гипертензии........................................................................... 72

3.1. Артериальное давление у кроликов в динамике вазоренальной артериальной гипертензии......................................................... 72

3.2. Апоптоз кардиомиоцитов в динамике вазоренальной артериальной гипертензии............................................................................ 73

3.3. Гипертрофия миокарда в динамике вазоренальной артериальной

гипертензии............................................................................ 77

Глава 4. Апоптотические и гипертрофические процессы в миокарде в динамике генетически обусловленной артериальной гипертензии.......................................................................... 81

4.1. Артериальное давление у спонтанно гипертензивных крыс на разных сроках исследования..................................................... 82

4.2. Апоптоз кардиомиоцитов в динамике генетически обусловленной артериальной гипертензии.......................................................... 83

4.3. Гипертрофия миокарда в динамике генетически обусловленной артериальной гипертензии.......................................................... 89

4.4. Возрастная динамика апоптоза и гипертрофии кардиомиоцитов у

нормотензивных и гипертензивных крыс....................................... 92

Глава 5. Влияние экзогенного фосфокреатина на апоптоз и гипертрофию кардиомиоцитов при артериальной гипертензии различного генеза.................................................................... 97

5.1. Влияние экзогенного фосфокреатина на апоптоз и гипертрофию кардиомиоцитов при вазоренальной артериальной гипертензии............. 98

5.2. Влияние экзогенного фосфокреатина на апоптоз и гипертрофию кардиомиоцитов при генетически обусловленной артериальной

гипертензии........................................................................... 101

Глава 6. Влияние мексидола на апоптоз и гипертрофию кардиомиоцитов при артериальной гипертензии различного генеза................................................................................... 105

6.1. Влияние мексидола на апоптоз и гипертрофию кардиомиоцитов

при вазоренальной артериальной гипертензии............................... 106

6.2. Влияние мексидола на апоптоз и гипертрофию кардиомиоцитов

при генетически обусловленной артериальной гипертензии.............. 108

Глава 7. Влияние блокады ETA-рецепторов на апоптоз и гипертрофию кардиомиоцитов при генетически обусловленной

артериальной гипертензии ...................................................... 113

Глава 8. Сравнительный анализ влияния использованных препаратов на исследованные показатели при генетически

обусловленной артериальной гипертензии ................................. 118

Глава 9. О возможных механизмах инициации и реализации апоптоза кардиомиоцитов при артериальной гипертензии различного генеза (обсуждение результатов)............................. 126

9.1. Особенности реализации апоптотической гибели кардиомиоцитов при артериальной гипертензии различного генеза........................... 127

9.2. Возрастные особенности апоптоза кардиомиоцитов................... 135

9.3. Энергетический дефицит как возможный фактор индукции апоптоза клеток миокарда при артериальной гипертензии............... 137

9.4. Роль окислительного стресса в инициации апоптотической гибели кардиомиоцитов при артериальной гипертензии............................ 141

9.5. Об особенностях влияния эндотелина-1 на апоптоз кардиомиоцитов при генетически обусловленной артериальной гипертензии............................................................................ 143

9.6. Эффективность медикаментозной регуляции апоптотических процессов в кардиомиоцитах при генетически обусловленной

артериальной гипертензии......................................................... 145

Выводы................................................................................. 148

Практические рекомендации ................................................... 150

Список литературы ................................................................ 151

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AIF - apoptosis-inducing factor ANT - adenine nucleotide translocator Apaf-1 - apoptotic protease activating factor-1 AT - ангиотензин

Bak - Bcl-2 homologous antagonist/killer

Bax - Bcl-2-associated X protein

Bcl-2 - B-cell lymphoma 2

Bid - BH3 interacting-domain death agonist

BH — Bcl-2 homology domain

CAD - caspase-activated DNase

ERK - extracellular-signal-regulated kinases

ET - эндотелии

ETA - рецептор типа А к эндотелину-1 ETB - рецептор типа В к эндотелину-1 FLIP - FLICE-like inhibitory protein IAP - inhibitors of apoptosis proteins MAP - mitogen-activated. protein MPT — mitochondrial permeability transition PKC - protein kinase С

PUMA - p53 upregulated modulator of apoptosis

Smac/DIABLO - Second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-

binding protein with low pi

SHR - spontaneously hypertensive rat

TNF - tumor necrosis factor

TUNEL - terminal deoxynucleotide nick-end labeling VDAC — voltage-dependent anion channel АГ - артериальная гипертензия АД — артериальное давление

АПФ - ангиотензинпревращающий фермент

АФК - активные формы кислорода

ГМК - гладкомышечные клетки

КМЦ - кардиомиоциты

ПКГ - программированная клеточная гибель

РАС - ренин-ангиотензиновая система

ХСН - хроническая сердечная недостаточность

ЭПФ - эндотелинпревращающий фермент

ЭПС - эндоплазматическая сеть

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Апоптоз представляет собой одну из форм клеточной гибели, свойственную эукариотическим организмам, находящимся на разных ступенях эволюционного развития [Гордеева А.В. и др., 2004]. Это регулируемый процесс, сопровождающийся изменением экспрессии определенных генов и формированием специфического клеточного фенотипа, обеспечивающий тканевый гомеостаз и, главное, постоянство генетического материала [Elmore S., 2007]. Нарушения в механизмах инициации и реализации апоптотической гибели клеток могут способствовать развитию различных патологических процессов, особенно если это касается клеток с низким пролиферативным потенциалом, к числу которых относятся и кардиомиоциты (КМЦ) [Favaloro В. et al., 1012]. В последние десятилетия интерес ученых во всем мире привлекает исследование роли гибели КМЦ в развитии сердечно-сосудистых заболеваний. Уже накоплено немало экспериментальных доказательств усиления апоптоза в миокарде при ишемии, острой и хронической перегрузке, миокардитах [Bishopric N.H. et al., 2001; Lee Y, Gustafsson AB., 2009; Благонравов М.Л., 2011].

Артериальная гипертензия (АГ) является одной из наиболее

распространенных форм патологии сердечно-сосудистой системы [Кобалава

Ж.Д., Котовская Ю.В., Моисеев B.C., 2009]. Будучи органом-мишенью,

поражаемым при стойком повышении артериального давления, сердце

подвергается настолько выраженным морфологическим и функциональным

изменениям, что в научной литературе прочно закрепился термин

«гипертоническое сердце» [Фролов В. А., Дроздова Г. А., 1984]. В

ремоделировании миокарда и развитии хронической сердечной

недостаточности при АГ участвует ряд механизмов, к числу которых

относится потеря КМЦ, чем обусловлено существенно возросшее в

последнее время внимание к изучению программированной гибели клеток миокарда в условиях повышенного артериального давления [Gonzalez A. et al., 2003; Diez J., 2009; Morillas P. et al., 2012]. Апоптогенными стимулами при гипертонии могут выступать активные формы кислорода [Montezano А. С., Touyz R. M., 2012], ангиотензин II [Paul, M. et al., 2006], растяжение КМЦ [Fortuno M.A. et al., 2001] и другие факторы. Возможно также, что существенное влияние на гибель сердечных миоцитов оказывает развивающаяся при АГ гипертрофия миокарда [Bernardo B.C. et al., 2010]. Вместе с тем, несмотря на исследования, проводимые в данной области, многие аспекты, касающиеся инициации и реализации апоптотической программы в КМЦ остаются не до конца изученными. Так, в частности, практически нет сведений о влиянии хронической гемодинамической перегрузки левого желудочка (ЛЖ) на программированную гибель клеток миокарда правого желудочка (ПЖ). В свете результатов экспериментов, проведенных на кафедре общей патологии и патологической физиологии РУДН, показавших, что при перегрузке ЛЖ ПЖ вовлекается в процесс немедленно и в дальнейшем определяет динамику функции сердца [Казанская Т. А., Фролов В. А., 1995], представляется необходимым сравнительный подход к изучению апоптотических процессов в миокарде обоих желудочков сердца.

Известно, что приблизительно 90% случаев повышения артериального давления является результатом эссенциальной АГ, а остальные случаи представляют собой следствие заболеваний других органов и систем [Кобалава Ж.Д. и др., 2009]. В этой связи возникает вопрос, не имеющий на сегодняшний день однозначного ответа: отличаются ли механизмы инициации и реализации апоптоза КМЦ при различных формах АГ?

настоящее время предлагаются разные способы прямого подавления

апоптоза, в том числе ингибирование каспаз и блокада Fas-рецепторов [Fischer U., Schulze-Osthoff К., 2005]. Однако неселективная супрессия апоптотической гибели может привести к сохранению в организме генетически дефектных и функционально неполноценных клеток. Следует учитывать и тот факт, что усиление апоптоза указывает на существенные нарушения физиологических внутриклеточных процессов, поэтому представляется более целесообразным исследование возможности подавления не самой гибели клеток, а механизмов, создающих условия для индукции данного процесса.

Цель исследования

Задачи исследования

2. Изучить возрастные особенности апоптоза КМЦ нормотензивных и гипертензивных животных.

7. Провести сравнительную оценку эффективности медикаментозной супрессии апоптоза КМЦ с помощью экзогенного фосфокреатина, мексидола, обладающего антигипоксическим и антиоксидантным действием, и ВС)-123, относящегося к селективным антагонистам ЕТА-рецепторов.

Научная новизна

Впервые обнаружено, что при АГ различного генеза преобладает митохондриальный путь передачи апоптогенного сигнала, вместе с тем в ЛЖ спонтанно гипертензивных крыс определенный вклад в инициацию программированной гибели клеток миокарда вносит рецепторно-опосредованная сигнальная трансдукция.

На основании данных, полученных при иммуногистохимической и биохимической оценке интенсивности апоптоза, впервые установлено, что при реализации апоптотической программы в КМЦ в условиях АГ ведущими являются некаспазные эффекторные механизмы.

Биохимическое исследование клеток миокарда ЛЖ спонтанно

гипертензивных крыс показало, что окислительный стресс выступает

наиболее вероятным фактором, стимулирующим рецепторно-

опосредованную передачу апоптогенного сигнала, а также принимает

участие в индукции гипертрофических процессов. При

иммуногистохимическом исследовании КМЦ ПЖ было обнаружено, что в условиях окислительного стресса в них повышается экспрессия проапоптотического белка р53.

При исследовании миокарда крыс линии 8НЯ с генетически обусловленной АГ, леченых селективным антагонистом ЕТА-рецепторов В(^-123, были получены принципиально новые данные, согласно которым эндотелии-1 является одним из основных факторов, стимулирующих в ЛЖ гипертрофические процессы, и создающих условия, при которых в ЛЖ индукторы апоптоза преобладают над его супрессорами. Также полученные результаты позволяют полагать, что экспрессия Вах как при АГ, так и в норме, опосредуется эндотелином-1.

На основании полученных данных с применением метода многомерного шкалирования разработан новый интегративный показатель, характеризующий величину терапевтического эффекта каждого из использованных препаратов (неотона, мексидола и В(^)-123) по комплексу изучаемых признаков. Исходя из значений данного показателя, установлено, что эффективность данных препаратов в ЛЖ значительно выше, нежели в ПЖ. Величины терапевтического эффекта неотона и ВС>-123 приблизительно равны, хотя эффективность неотона в ЛЖ несколько выше. Лечение мексидолом оказало наименьшее влияние на комплекс исследованных признаков в обоих желудочках сердца.

реализации апоптотической программы. Потеря сердечных миоцитов с возрастом приводит к компенсаторной гипертрофии миокарда.

Теоретическая и практическая значимость работы

Внедрение результатов исследования

и общей генетики медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов».

Положения, выносимые на защиту:

Текст научной работы по медицине, диссертация 2013 года, Азова, Мадина Мухамедовна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций