Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Патогенетическое значение острофазовых белков и провоспалительных цитокинов в диагностике предраковых заболеваний и рака гортани

На правах рукописи

Махов Владимир Александрович

ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОСТРОФАЗОВЫХ БЕЛКОВ И ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ В ДИАГНОСТИКЕ ПРЕДРАКОВЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ И РАКА ГОРТАНИ

14.00.16 - патологическая физиология 14.00.04 - болезни уха, горла и носа

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Новосибирск - 2004

Работа выполнена в Новокузнецком государственном институте усовершенствования врачей МЗ РФ

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Антонов Александр Рудольфович доктор медицинских наук, профессор Мингалёв Николай Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Трунов Александр Николаевич доктор медицинских наук, профессор Киселёв Алексей Борисович

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт биохимии СО РАМН

Защита состоится « 2004 года в 10:00 часов на заседании

диссертационного совета Д 208 062.04 при Новосибирской государственной медицинской академии МЗ РФ по адресу: 630091, Россия, г. Новосибирск, Красный проспект, 52

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирской государственной медицинской академии МЗ РФ

Автореферат разослан «_»_2004 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Зубахин А.А.

2005-4 13108

mm

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Рак гортани относится к числу распространенных опухолей органов системы дыхания. Доля рака гортани среди опухолевых заболеваний верхних дыхательных путей составляет 65-70% (Вержбицкий Г.В., 1986; Василевский М.Г. и соавт., 1992; Алферов B.C. и соавт., 1995; Кицманюк З.Д. и соавт., 1998; Leon X. et al., 2000; Edwards B.K. et al., 2002; Lydiatt D.D., 2002). В структуре злокачественных новообразований ЛОР-органов он занимает первое место (Пачес А. И., 2000).

Злокачественные опухоли ЛОР-органов у каждого третьего больного диагностируются в IV стадии (Ольшанский В.О. и соавт., 1990; Волкотруб Л.П. и соавт., 1994). Исключением не является и рак гортани. По данным ряда авторов он выявляется в III-IV стадиях в 65-68% случаев (Огольцова Е.С., 1984; Двойрин В.В., 1989; Пачес А.И., 2000; Rzewnicki I. et al., 2002). Это указывает на недостаточность ранней диагностики рака гортани.

Неудовлетворительное состояние ранней диагностики не может не отразиться на результатах лечения. Несмотря на постоянное совершенствование методов хирургического и лучевого лечения, определенно добиться значительного снижения летальности не удается. При этом существующие успехи в лечении, как правило, достигнуты на ранних стадиях заболевания (Кицманюк З.Д. и соавт., 1998).

Рак гортани, как и рак других локализаций, никогда не развивается внезапно. Его появлению предшествует ряд изменений в гортани, которые принято называть «предраком» (Бородулина М.Г. и соавт., 1980; Cardesa A. et al., 1997; Berman J.J. Henson D.E., 2003). Своевременное выявление и лечение предракового состояния в ряде случаев позволяет предотвратить развитие рака или же диагностировать его в субклинической стадии. Так, по данным A.J. Szewczyk (1992), адекватное лечение предраковых заболеваний гортани предотвращает переход в рак в 97% случаев.

Таким образом, улучшить показатели лечения рака гортани в настоящее время возможно в большей степени за счет разработки более совершенных методов ранней диагностики злокачественных опухолей гортани, опираясь при этом на знание биологических механизмов прогрессии и трансформации предопухолевых заболеваний в рак.

В последнее время большое значение придается роли цитокинов (интер-лейкинов, интерферонов, факторов роста и т.д.) в патогенезе опухолевой прогрессии (Бережная Н.М. и соавт., 2000; Митрейкин В.Ф., 2000), активно разрабатываются и вопросы взаимосвязи баланса системы цитокинов с течением опухолевой прогрессии, дифференциальной диагностикой и прогнозом заболевания (Mantovani G. et. al., 1996; Knoefel В. et al., 1997; Lio I.S. et al., 1997;

Lai J.P. et al., 2001; Chandler S.W. et al., 2002; Lazaris A.Ch. et al., 2002; Chow K.C. et al., 2003; Kuropkat С et al., 2003).

Публикации о содержании цитокинов при злокачественных опухолях гортани малочисленны. При этом отсутствуют данные о динамике изменения цитокинов при трансформации предопухолевых заболеваний гортани в рак.

В формировании взаимоотношений между растущей опухолью и организмом принимают участие белки, обладающие иммунорегуляторными свойствами (Зорин НА и соавт., 1992; Дубровин СМ. и соавт., 2000; Birkenmeier С, 2001). К ним относится, прежде всего, белок острой фазы - альфа-2-макроглобулин. Одной из значимых функций альфа-2-макроглобулина, как белка иммунорегуляции, является его способность быть переносчиком цитокинов в организме (Зорин Н.А. с соавт., 1990). Более того, существует мнение, что большая часть цитокинов реализует свои эффекты только в комплексе с альфа-2-макроглобулином. Это позволяет считать данный белок одним из центральных звеньев регуляции работы иммунной системы (James К. et al., 1990; Birkenmeier G., 2001; Yarovinsky Т.О. et al., 2001).

В настоящее время активно разрабатываются вопросы участия в регуляции системы иммунитета другого острофазового белка - металлопротеина лактоферрина (Britigan B.E. et al., 2001; Caccavo D. et al., 2002; Frydecka I. et al., 2002; Togawa J. et al., 2002).

Комплексное изучение функции альфа-2-макроглобулина и лактоферрина во взаимосвязи с другими факторами иммунной системы, в частности с иммуноглобулинами и цитокинами, перспективно также с точки зрения их возможного использования в качестве неспецифических опухолевых маркеров и прогностических факторов, а также, возможно и сигнальных факторов профессии опухоли.

Все вышеизложенное послужило основой для формулирования цели и задач настоящего исследования.

Цель исследования: выявить клинико-патогенетическое значение белков острой фазы и провоспалительных цитокинов при течении предраковых заболеваний и рака гортани.

Задачи исследования

1. Оценить концентрацию альфа-2-макроглобулина, лактоферрина, сывороточных иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG) и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови у больных с предраковыми процессами и раком гортани до и после комбинированного лечения.

2. Изучить содержание провоспалительных цитокинов (интерлейкина-1-бета и интерлейкина-6) в сыворотке крови у больных с предраковыми процессами и раком гортани до и после лечения.

3. Определить диагностическую ценность выявленных изменений показателей активности воспалительного процесса у больных с предраковыми заболеваниями и раком гортани.

4. Выявить прогностическую значимость изменений показателей активности воспалительного процесса у больных с предраковыми процессами и раком гортани после комбинированного лечения.

Научная новизна

Впервые получены данные о взаимоотношении острофазовых белков -альфа-2-макроглобулина и лактоферрина, с факторами гуморального иммунитета у больных с предраком и раком гортани.

Установлено, что у больных предраком концентрация альфа-2-макро-глобулина в сыворотке крови достоверно ниже показателей здоровых лиц, напротив при раке гортани концентрация этого белка в сыворотке выше группы здоровых.

Выявлено, что характер изменения концентрации провоспалительных ци-токинов в сыворотке крови при раке и предраке гортани различен: уровень интерлейкина-1-бета повышен при предраке гортани и снижен при раке гортани, тогда как концентрация интерлейкина-6 снижена при предраке и повышена при раке гортани.

На основе клинико-иммунологических сопоставлений доказано, что прогрессия рака гортани сопровождается повышением концентрации интерлей-кина-6 в периферической крови.

Впервые продемонстрирована дифференциально-диагностическая значимость профиля провоспалительных цитокинов (интерлейкина-1-бета и интер-лейкина-6) в сыворотке крови при предраке и раке гортани.

Впервые показана прогностическая значимость лактоферрина : при благоприятном прогнозе для больного в послеоперационном периоде - уровень сывороточного лактоферрина до лечения повышен.

Практическая значимость

Предложенный комплекс изученных показателей гуморального иммунитета и регуляторных белков может быть использован в качестве дополнительного критерия в дифференциальной диагностике рака и предраковых гиперпластических процессов в гортани.

Наибольшей диагностической информативностью обладает комплексное определение уровня интерлейкинов (интерлейкина-1-бета и интерлейкина-6), что позволяет в значительной степени дифференцировать злокачественную природу опухоли. Дополнительное определение концентрации альфа-2-макроглобулина в сыворотке крови может быть использовано для уточнения диагноза.

Полученные данные можно рекомендовать для разработки комплексной иммунотерапии рака гортани, в частности применения цитокинов в лечении рака гортани.

Данные работы используются в лекционном курсе на кафедре оториноларингологии Новокузнецкого ГИУВа, работе отделения клинической лабораторной диагностики Городской клинической больницы № 1 г. Новокузнецка.

Положения, выносимые на защиту:

1. Течение предрака и рака гортани сопровождается изменением в системе регуляции иммунной системы, проявляющимся в дисбалансе цитокинов, регулирующих антителогенез и синтез иммунорегуляторных белков.

2. Изменение концентрации острофазового белка альфа-2-макрогло-булина и провоспалительных интерлейкинов в сыворотке крови может служить дополнительным дифференциально-диагностическим критерием при предраке и раке гортани.

Апробация материалов диссертации

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Авиценна-2003» (Новосибирск, 2003), международной научно-практической конференции «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2003), Всероссийской научно-практической конференции "Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии" (Томск, 2004), Обществе оториноларингологов Новокузнецка и Юга Кузбасса (Новокузнецк, 2004), Ученом Совете Новокузнецкого ГИУВа (Новокузнецк, 2004), Проблемной комиссии «Функциональные основы гомеостаза» НГМА (Новосибирск, 2004)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, характеристики материала и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, практических рекомендаций, выводов и списка литературы.

Материалы диссертации изложены на 125 страницах машинописного текста, содержат 15 таблиц и 11 рисунков. Список литературы включает 54 отечественных и 181 иностранный источник.

Весь материал представленный в диссертации получен и проанализирован автором лично.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В соответствии с целью и задачами было обследовано 92 пациента, находившихся в клинике кафедры оториноларингологии Новокузнецкого ГИУВа на базе оториноларингологического отделения Городской клинической больницы № 1 города Новокузнецка на период 2002-2003 гг. и 36 клинически здоровых доноров, жителей города Новокузнецка.

При первичном осмотре обследование ЛОР-органов проводилось общепринятыми методами. Клинические данные о распространенности процесса дополнялись рентгенологическими методами: больным с опухолями гортани, а в спорных случаях и при предраке гортани, выполнялась боковая рентгенография гортани по Земцову и томография гортани. Диагноз верифицировался при гистологическом исследовании биопсийного материала и в отдельных случаях проведением цитологического исследования мазков-отпечатков с поверхности новообразования.

Изученные наблюдения представлены тремя группами пациентов.

Первую (основную) группу составили 40 больных с клинически достоверным диагнозом рак гортани. Возраст больных данной группы варьировался от 42 до 84 лет, при этом средний возраст обследованных составил 60±2 года (М±т). БОЛЬШИНСТВО больных (39%) составили возрастную группу от 61 до 70 лет.

Подавляющее большинство обследуемого контингента составили мужчины - 38 больных (95%), пациенток женского пола было 2 человека (5%). Соотношение мужчин и женщин -19:1.

Распределение больных по стадиям проводили согласно Международной классификации по системе TNM (UICC). Пациенты поступали в клинику в третьей-четвертой стадии Все пациенты данной группы длитель-

ное время курили. При этом стаж курения варьировался от 10 до 45 лет.

В группу обследования не включались пациенты с сопутствующей патологией в стадии обострения либо декомпенсацией сопутствующего заболевания.

Жалобы, предъявляемые обследуемыми больными, были достаточно разнообразны. Жалобы на изменение голоса отмечали 32 (80%) больных, боли в горле при глотании - 15 (37,5%) больных, чувство инородного тела в глотке -3 (7,5%), затруднение дыхания отмечали 12 (30%) пациентов, сухой кашель с примесью крови в мокроте - 3 (7,5%) больных. Давность фиксации жалоб больными до дня поступления в отделение составила от 4 недель до 36 месяцев. Большая часть больных (60%) фиксировала жалобы в период от 3 до 12 месяцев.

Исходная локализация опухоли была различной. При этом место исходной локализации опухоли определялось путем комплексной оценки ряда факторов: анамнестических данных - последовательность развития симптомов заболевания, данных ларингоскопии, рентгенографии шеи по Земцову, рент-

гентомографии, а также оценки распространенности опухоли по препарату удаленной гортани. Преобладающе локализацией опухоли была надскладоч-ная область - 65% (26/40), реже область голосовых складок - 22,5% (9/40), пациентов с первичной локализацией в подскладочной области не было. Поражение гортаноглотки с распространением на гортань отмечено в 5% (2/40) случаях. Из-за распространенности процесса исходная локализация не установлена у 7,5% (3/40) больных.

По данным гистологического обследования все наблюдения относились к плоскоклеточному раку. Обследование данной группы больных проводили до какого либо лечения.

Вторую группу (первую группу сравнения) включали пациенты с предраковыми заболеваниями гортани (ПРГ) - 31 человек. Возраст больных варьировался в широких пределах - от 23 до 75 лет, при этом средний возраст обследованных составил 47±2 года. Возраст большинства больных (61,2 %) находился в интервале от 37 до 54 лет.

Данную группу составили пациенты с хроническим гиперпластическим ларингитом, лейкокератозом гортани и папилломами гортани. Давность заболевания, по анамнестическим данным, варьировалась от 3 месяцев до 3 лет. При поступлении пациенты данной группы предъявляли жалобы на изменение голоса (31/31), ощущение сухости в горле (10/31), «першение» в горле (11/31) и периодический кашель (4/31).

Диагноз устанавливался по характерной клинической картине заболевания и подтверждался гистологическим заключением - наличием дисплазии эпителия. Обследование больных данной группы так же выполнялось до проведения какого-либо лечения.

Третью группу (вторую группу сравнения) составили больные раком гортани после проведения комбинированного лечения, поступившие в отделение для планового профилактического обследования или же для деканюляции. Группу составил 21 мужчина в возрасте от 40 до 77 лет с гистологически подтвержденным диагнозом рака гортани в 3-4 стадии. Всем больным данной группы было проведено комбинированное лечение по схеме «операция - лучевая терапия». Давность окончания проведенного лечения составила от 4 месяцев до 2 лет.

Контрольную группу составили 36 клинически здоровых доноров, жителей города Новокузнецка.

Определение концентрации интерлейкинов в сыворотке крови выполнялось твердофазным иммуноферментным методом на тест-системах «РгоСоп IL-ip» и «РгоСоп 1L-6» (Протеиновый контур-Тест, Санкт-Петербург, Россия) по инструкции изготовителя. Результаты иммуноферментного анализа регистрировали на микропланшетном фотометре «Multiskan MCC/340» (Labsystems, Финляндия) при длине волны 450 нм.

Определение концентрации лактоферрина в сыворотке крови производилось твердофазным иммуноферментным методом на тест-системах «Лак-тоферрин - стрип» (Вектор-Бест, Новосибирск, Россия) по инструкции изготовителя. Результаты регистрировали на микропланшетном ридере «Bio-Rad Model 3550-UV» (Bio-Rad Lab., США) в двухволновом режиме при длине волны 492 и 630 нм.

Концентрацию альфа-2-макроглобулина в сыворотке крови определяли методом низковольтного ракетного иммуноэлектрофореза с использованием моноспецифической антисыворотки против данного белка (Вееке Б., 1977; Зорин Н.А. исоавт., 1992)

Для проведения иммуноэлектрофореза применяли агарозу для электрофореза (Эстар, Тарту) и агарозу для электрофореза (Serva, Германия). В сформированных на стекле 1% агарозных гелях с добавлением 5-10% соответствующих моноспецифических антисывороток вырезали до 20 лунок диаметром 3 мм - на 4 мкл исследуемой сыворотки.

Иммуноэлектофорез проводили в 0,02 М барбитуратном буфере, рН 8,6 (Вееке Б., 1973) в аппаратах ПЭФ-3 при напряжении 1-3 В/см. В качестве электродных мостиков использовали фильтрованную бумагу. По окончании электрофореза пластины геля отжимали фильтрованной бумагой, отмывали 0,1 М хлористым натрием в течении 24 ч для удаления непреципитирующих белков, удаляли соль промыванием водой, вновь отжимали и высушивали. Иммунопреципитаты окрашивали 1% амидочерным 10В (Renal, Венгрия), 0,25% кумасси бриллиантовым синим R25O (Sigma, США) (Грабар П., Буртэн П., 1963; Дэвени Т., Гергей Я., 1976).

Концентрацию альфа-2-макроглобулина в исследуемых сыворотках вычисляли, сравнивая высоту их преципитатов с высотой преципитатов стандартных препаратов с известной концентрацией белка.

Определение содержания циркулирующих иммунных комплексов в

сыворотке крови проводили методом жидкостной преципитации 4% полиэти-ленгликолем (ПЭГ-6000) (Haskova V. et al., 1978). При этом для приготовления 4% раствора ПЭГ-6000 использовали 0,01 М боратный буфер рН 8,4. В рядом находящиеся лунки параллельных стрипов 96-луночных плоскодонных планшетов вносили по 0,3 мл 0,01 М боратного буфера рН 8,4 (контроль) и 0,3 мл 4% разведения ПЭГ-6000 на 0,01 М боратном буфере рН 8,4 (опыт). В контрольные и опытные лунки добавляли по 0,005 мл исследуемой сыворотки крови. Инкубировали 1 час при комнатной температуре. Величину оптической плотности считали против контроля при длине волны 450 нм на микропланшетном фотометре «Multiskan MCC/340» (Labsystems, Финляндия). Результат выражали в условных единицах.

Концентрацию сывороточного иммуноглобулина в исследуемых образцах сыворотки определяли методом радиальной иммунодиффузии, который основан на изменении диаметра кольца преципитации, образующегося при внесении исследуемой сыворотки в лунки, вырезанные в слое агара с предварительно диспергированной моноспецифической антисывороткой (Mancini G. et al., 1965). Для выполнения этого метода использовали наборы моноспецифических антисывороток против иммуноглобулинов класса G, А, М (НИИ эпидемиологии и микробиологии, Нижний Новгород, Россия). В качестве поддерживающей среды применяли бакто-агар (Ferak, Германия).

Выборочные параметры, приводимые в работе, имеют следующее обозначение: М - среднее, m - ошибка средней, 95% CI - девяносто пяти процентный доверительный интервал для среднего, п - объем анализируемой выбор -ки, р - достигнутый уровень значимости.

Проверка нормальности распределения количественных признаков проводилась с использованием критерия Колмогорова-Смирнова, проверка гомогенности (однородности) дисперсии - с использованием критерия Левена. Общее межгрупповое различие оценивались при помощи критерия Крускала - Уолли-са. Парное межгрупповое сравнение показателей производилось по U-критерию Манна-Уитни. Корреляционный анализ внутри групп проводился с расчетом коэффициентов ранговой корреляции Спирмена. Оценку диагностической и прогностической ценности показателей проводили при помощи метода бинарной логистической регрессии. Для уточнения практической значимости использования показателей строились четырехпольные таблицы и рассчитывались соответствующие статистические показатели - диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность (Флетчер Р. и соавт., 1998).

Критическое значение уровня значимости принималось равным 0,05. Анализ данных проводился при помощи пакета программ SPSS 11.0 (SPSS Lab., США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Механизмы функционирования отдельных звеньев иммунной системы на этапах опухолевой прогрессии окончательно не выяснены. Не существует единой точки зрения, объясняющей регуляторные механизмы работы биологических факторов, которые тормозят и даже блокируют опухолевую трансформацию.

Один из разделов настоящей работы посвящен изучению острофазовых регуляторных белков, альфа-2-макроглобулина (МГ) и лактоферрина (ЛФ), при предраке и раке гортани, биологические свойства которых и возможность практического использования в прогностическом и дифференциально-диагностическом плане при предраковых заболевания и раке гортани в настоящее время до конца не изучены.

Учитывая, что одной из функций МГ является участие в иммунных реакциях, представлялось интересным провести сравнительное изучение его концентрации в сыворотке крови у больных с предраковыми заболеваниями и раком гортани во взаимосвязи с факторами гуморального иммунитета. Результаты исследования представлены в таблице 1.

Таблица 1

Концентрация альфа-2-макроглобулина (МГ) сыворотки крови больных с предраковыми процессами и раком гортани (М±m)

Группа п МГ, г/л р

95% С1 М±т

1 2 3 4 5

Контроль (К) 23 1,54-1,73 1,63±0,04

Предрак гортани (ПРГ) 31 1,36-1,63 1,50±0,06 Р прг-к 0,038 Рпрг-лрг <0,001

Рак гортани до лечения (РГ) 34 1,60-2,03 1,91 ±0,08 Р рг-К 0,005 Р рг-прг < 0,001

Рак гортани после комбинированного лечения (ЛРГ) 21 1,82-2,24 2,03±0,10 Рлрг-к <0,001

Границы допустимых значений группы контроля - «нормативные» значения для практически здоровых лиц - соответствовали значениям от 1,5 до 1,88 г/л. При предраке гортани, в большинстве наблюдений концентрация альфа-2-макроглобулина в сыворотке крови снижалась.

В группе больных РГ «средняя» концентрация альфа-2-макроглобулина была статистически значимо выше значений группы контроля, при этом разница составила более 17%. Анализируя распределение признака относительно стадии заболевания выявлена тенденция к повышению концентрации МГ в сыворотке с нарастанием стадии процесса, а именно - с увеличением области поражения опухолью.

В группе больных ЛРГ значения концентрации альфа-2-макроглобулина сыворотки крови были сходы со значением РГ. Статистически достоверных различий между значениями группы ЛРГ и РГ не выявлено. В то же время значения концентрации МГ в группе ЛРГ статистически значимо отличались от значений группы контроля (К). Можно сделать вывод, что при удовлетворительном результате лечения рака гортани, в послеоперационном периоде до 18 месяцев, концентрация альфа-2-макроглобулина остается повышенной.

При инвазивном росте опухоли происходит не только преобразование клеток, но и их разрушение, что сказывается на уровне протеаз, выходящих в кровяное русло и соответственно их ингибиторов, в частности, альфа-2-макроглобулина (Mignotti P. et al., 1993). При этом нарастание концентрации МГ идет до тех пор, пока идет рост опухоли. В стадии замедления роста, когда новых очагов деструкции клеток нет, или их незначительное количество, количество альфа-2-макроглобулина приходит в рамки значений «нормы».

С этих позиций возможно объяснить отдельные «нормальные» значения концентрации альфа-2-макроглобулина в сыворотке крови при развернутых стадиях опухолевого процесса - около 1/5 всех значений (22,6%). Это подтверждается результатами гистологического исследования - по нашим данным в таких случаях, митотическая активность опухоли значительно снижена - соответственно заторможен рост опухоли.

В настоящем исследовании было выявлено, что концентрация альфа-2-макроглобулина, как правило, увеличивается при нарастании стадии процесса, а именно с увеличением области поражения опухолью (Т-стадия). Статистически значимых связей с локализацией опухоли в том или ином отделе гортани не выявлено, но при локализации в надскладочной области концентрация альфа-2-макроглобулина несколько больше при сравнительно одинаковой массе опухоли, чем при других локализациях.

С другой стороны, альфа-2-макроглобулин, является переносчиком цито-кинов в организме, в частности интерлейкина-6 (Petersen СМ., 1993; Birkenmeier G., 2001). Учитывая возможное продуцирование цитокинов растущей опухолью гортани (Chow K.C. et al., 2003), так же возможно объяснить компенсаторное увеличение концентрации альфа-2-макроглобулина, как белка, необходимого для их эллокации.

Подтверждение этому факту мы находим в результатах наших исследований. При раке гортани имеет место статистически значимая положительная коррелятивная связь (r= +0,396, р = 0,041) между уровнем альфа-2-макрогло-булина и концентрацией ИЛ-6 в сыворотке, т.е. при нарастании концентрации ИЛ-6 происходит соответственное увеличение уровня альфа-2-макрогло-булина в сыворотке крови. У больных раком гортани после проведенного лечения и в группе больных предраком гортани такой связи не выявлено.

При предраке гортани концентрация альфа-2-макроглобулина сыворотке крови ниже относительно показателей практически здоровых лиц- 1,50±0,06 против 1,63±0,04 г/л (р-О,О38).

Биосинтез альфа-2-макроглобулина непосредственно регулируется цито-кинами. Ген альфа-2-макроглобулина входит в локус генов белков «острой фазы» воспалительной реакции, которая запускается провоспалительными цитокинами ИЛ-lß, ИЛ-6, ФНОа (Ikari Y. et al., 2001). При этом промотор ге-

на альфа-2-макроглобулина запускается непосредственно ИЛ-6, тогда как два других цитокина выступают в роли его ингибиторов. В частности ИЛ-фпо каскадному механизму через блокаду STAT-3 блокирует транскрипцию гена ИЛ-6. Поэтому концентрация альфа-2-макроглобулина в плазме крови снижается, а не растет, подобно концентрации «острофазовых» белков (Hibbets К. et al., 1999; Petersen СМ., 1993). Ген ИЛ-6 подавляется так же и ИЛ-10 и ИНФу. концентрация которых регулируется МГ. Если рассматривать предраковые процессы как место развития хронической воспалительной реакции, в связи с вышеизложенным, понятно снижение концентрации альфа-2-макроглобулина в качестве «отрицательного реактанта острой фазы»,

С другой стороны, можно дать следующую интерпретацию изменения альфа-2-макроглобулина при предраке гортани.

Альфа-2-макроглобулин в организме существует не только в свободной, но и в связанной форме в виде комплексов, в том числе и с иммуноглобулинами и цитокинами (Zorina V.N. et al., 2001). Отсюда при предраке гортани исходно сниженный уровень альфа-2-макроглобулина можно объяснить образованием комплексов данного белка с разными биологическими факторами, продуцирующимися в течение патологического процесса, а именно при воспалительной реакции.

Одним из представителей таких факторов могут быть иммуноглобулины разных классов. В данном случае, это более всего касается иммуноглобулинов класса G. В настоящей работе комплексообразование альфа-2-макроглобу-лина и IgG при течении предраковых заболеваний можно подтвердить тремя составляющими:

а) общим повышением концентрации циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови, куда соответственно входят и комплексы макроглобулинов с IgG;

б) снижением концентрации иммуноглобулина класса G при предраке гортани;

в) наличием статистически значимой корреляционной связи (i=0,434, р—0,017) между уровнем МГ и IgG. Отметим, что таковых статистически значимых связей в группах больных РГ и ПРГ не выявлено.

Возможно, что при данных соотношениях концентрации иммуноглобулинов проходит одна из биологических «границ» воспалительной реакции и процесса малигнизации. На данном примере отражается именно изменение в кооперации отдельных элементов системы иммунитета, как пример, это совершенно различная связь альфа-2-макроглобулина с IgG при раке гортани и при предраковых процессах в гортани.

Кроме изучения альфа-2-макроглобулина при предраке и раке гортани определенный интерес представляет изучение других протеинов, обладающих иммунорегуляторными свойствами. В первую очередь это касается ост-

рофазового металлопротеина - лактоферрина (Frydecka I. et al., 2002; Togawa J. et al., 2002). О роли данного белка в регуляции иммунологических реакций как in vitro, так и in vivo, стало известно только в последние 2-3 года. В связи с чем значительный интерес представляет изучение его содержания в крови и роль при злокачественной трансформации.

Таблица 2

Концентрация лактоферрина (ЛФ) сыворотки крови больных с предраковыми процессами и раком гортани (М±т)

Группа п ЛФ, нг/мл Р

95% CI М±ш

1 2 3 4 5

Контроль (К) 23 1234- 1477 1350±50

Предрак гортани (ПРГ) 32 1525 - 1944 . 1730±100 Р прг-к 0,002 Рпрг-лрг 0,024

Рак гортани до лечения (РГ) 34 1515-2065 1790±130 Ррг-к 0,018

Рак гортани после комбинированного лечения (ЛРГ) 21 1169- 1669 1410±110

При анализе данных группы контроля установлены границы значений для практически здоровых лиц. Содержание ЛФ в сыворотке у практически здоровых лиц находится в интервале от 1020 до 1570 нг/мл.

В группах больных РГ и ПРГ значение концентрации статистически значимо отличались от значений группы контроля (р < 0,05). Концентрация лактоферрина в сыворотке крови в группе больных предраком была в своем большинстве выше значений группы контроля. Среднее (М) выборки группы ПРГ в 1,3 больше среднего группы контроля.

В группе РГ «средняя» концентрация была также достоверно выше значений группы контроля.

Каких либо достоверных коррелятивных связей при РГ между уровнем лактоферрина и другими изучаемыми в данной работе параметрами гомеоста-за не выявлено.

Оценивая группы в целом, можно отметить, что «средняя» концентрация групп РГ и ПРГ была достоверно выше значений группы контроля, а при удачном результате лечения (ЛРГ) значения концентрации лактоферрина в сыворотке крови практически не отличились от «нормативных».

При предраке гортани содержание лактоферрина в сыворотке было выше значений группы здоровых лиц - 1730±100 нг/мл против 1350±50 в группе контроля (р=0,002). При качественном анализе установлено, что абсолютное повышение концентрации наблюдалось более чем у 75% лиц. Возможно, это объясняется свойствами лактоферрина как «острофазового» белка, повышающегося при развитии воспалительной реакции. Участие лактоферрина в развитии воспалительной реакции может быть в роли именно «противоспали-тельного» агента. Так, согласно Amati Ь et а1. (2003) лактоферрин ингибирует продукцию провоспалительных цитокинов, за счет поверхностной блокады рецепторов ответственных за каскадный механизм их производства, в частности, это касается продукции ИЛ-6, ИЛ-8 и ФНОа.

Кроме того, лактоферрин может блокировать Сз - конвертазу, что приводит к ингибированию классического пути активации комплемента, чем так же возможно объясняются его противовоспалительные свойства (Дранник Г.Н., 2003).

По нашим данным, сниженная или «нормальная» концентрация ЛФ в сыворотке при предраке гортани определялась как правило у больных обратившихся повторно (6/32) т.е. с рецидивирующим течением заболевания. Снижение концентрации сывороточного лактоферрина в данных случаях может указывать на недостаточную его секрецию полиморфно-ядерными лейкоцитами за счет слабой активности воспалительной реакции. Отметим, что сниженное содержание лактоферрина сопровождалось и самыми низкими в данной группе концентрациями циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке.

Таким образом, изменение концентрации лактоферрина в сыворотке крови у больных предраком гортани вписывается в картину течения хронического воспаления.

В группе больных раком гортани концентрация лактоферрина сыворотки крови была выше значений группы контроля - 1790±130 нг/мл против 135О±5О нг/мл (р = 0,018). Статистически значимых связей изменения концентрации ЛФ со стадией и локализацией опухоли не выявлено.

Не исключено, что относительное повышение содержания ЛФ в периферической крови может быть обусловлено антигенной стимуляцией клеток костного мозга, т.к. имеются данные, что кроме полиморфно-ядерных лейкоцитов в синтезе ЛФ участвуют клетки костного мозга (Дюгеев А.Н. и соавт., 1991). Кроме того, источники лактоферрина сыворотки при предраковых заболеваниях и раке гортани могут различаться.

Исследуя катамнез пациентов данной группы можно отметить, что плохой прогноз имели пациенты со сниженным или «нормальным» уровнем лактофер-рина в сыворотке крови. У пациентов со значениями концентрации лактофер-

рина выше значений группы контроля отмечено более гладкое протекание послеоперационного периода, а также более благоприятный прогноз для жизни в послеоперационном периоде, особенно это касается Ш-стадии процесса (19/34).

После успешного лечения рака гортани содержание лактоферрина в сыворотке достаточно близко к значениям группы контроля (1410± 110 нг/мл против 1350±50 при р = 0,991), то есть ниже, чем в группе РГ. Это, возможно, объясняется отсутствием опухолевых клеток и соответственно отсутствием антигенного стимула.

В группе больных раком гортани после комбинированного лечения снижение концентрации лактоферрина в сыворотке крови сопровождалось отчетливым повышением концентрации циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), что подтверждает наличие сильной отрицательной коррелятивной связи внутри данной группы (г = -0,785, р = 0,004).

В продолжении этого отметим, что повышение ЦИК в этой же группе больных связано с повышение IgA. Это подтверждается а) общим повышением в группе ЛРГ, при соответствующем распределении внутри группы (более 66% абсолютных значений IgA в группе ЛРГ выше значений группы контроля); б) наличием статистически незначимой, но все же присутствующей коррелятивной связи между уровнем IgA и концентрацией ЦИК (г = 0,538, р = 0,088).

Выявлено, что у больных с предраковыми процессами в гортани общий .уровень IgG ниже, чем у здоровых лиц (9,67±0,77 г/л против 11,04±0,39 г/л в контроле, при р = 0,001). Это можно объяснить развитием картины хронической воспалительной реакции, где наряду со снижением IgG, повышается относительное содержание IgA и IgM.

Опираясь на вышеизложенное можно заключить, что изменение основных факторов гуморального иммунитета - иммуноглобулинов при предраке гортани сходно с картиной развития хронической воспалительной реакции.

У больных раком гортани до лечения концентрация IgG в сыворотке крови статистически значимо не различалась от данных группы контроля -11,64±0,80 г/л против 11,04±0,39 г/л в контроле при р > 0,05. Внутригруппо-вое распределение показателя у больных раком гортани показало достаточную однородность показателей.

Стабильный уровень иммуноглобулинов при раке возможно объяснить с нескольких позиций: I) постоянной антигенной стимуляцией Т-клеточного звена лимфоцитов, что приводит к их «рефрактерности», и в конечном итоге толерантности гуморального звена иммунитета (Дранник Г.Н., 2003); 2) токсичностью действия опухолевых антигенов на лимфоциты; 3) малой антиген-ностью опухоли.

Известно, что очень важное место в реализации функции иммунокомпе-тентных клеток принадлежит особенностям микроокружения, важным компонентом которого является баланс продукции цитокинов (Бережная Н.М. и со-авт., 2000).

Учитывая огромную роль цитокинов в кооперации функции иммунной системы как в норме, так и в патологии, а также имеющиеся сведения относительно практического применения определения концентрации цитокинов в диагностическом и прогностическом плане было проведено изучение сывороточной концентрации провоспалительных цитокинов, ИЛ-1(3 и ИЛ-6, при предраковых заболеваниях и раке гортани.

При предраке гортани в большинстве случаев концентрация ИЛ-1Р была выше значений группы контроля - в 83,3% (25/30), в 3,3% (1/30) в рамках значений группы контроля, и в 13,4% (4/30) ниже значений контрольной группы.

В группе РГ в подавляющем большинстве случаев, в 97% (32/33), концентрация ИЛ-]р в сыворотке были ниже значений группы контроля, и только в 3% (1/33) концентрация ИЛ-1(1 была выше значений группы контроля. Аналогичное соотношение сохранялось и в группе ЛРГ, когда в 91,7% концентрация ИЛ-1(3 была ниже и в 8,3% была выше «нормативных» значений группы контроля. Данные о концентрации ИЛ-1(3 в сыворотке крови у пациентов исследуемых групп представлены в таблице 3.

Таблица 3

Концентрация интерлейкина-1Р (ИЛ-1Р) в сыворотке крови больных с предраковыми процессами и опухолями гортани (М±т)

Группа п ИЛ-1 3, пг/мл Р

95% С1 М±ш

1 2 3 4 5

Контроль (К) 30 20-40 30±5

Предрак гортани (ПРГ) 30 24-46 35±5 Рпрг-к <0,001 Рпрг-лрг 0,042

Рак гортани до лечения (РГ) 33 13-23 18±2 Ррг-К <0,001 Р рг-прг 0,003

Рак гортани после комбинированного лечения (ЛРГ) 12 8-35 22±6 Рлрг-к <0,001

Уменьшение продукции у больных раком гортани ведет к сниже-

нию активности Т-киллеров, а также снижению активности антигенпрезенти-руюших клеток - все это приводит к снижению ответа иммунной системы на

развивающуюся опухоль. Т.е. по нашему мнению, несмотря на наличие самого антигена (опухоли), реакция на него резко снижена, т.к. отмечается дисбаланс в факторах кооперации иммунной системы - сети цитокинов.

Напротив, повышение ИЛ-ip у больных предраковыми заболеваниями гортани возможно объяснить достаточной реактивностью организма на при течении воспаления (Дранник Г.Н., 2003). Увеличение концентрации ИЛ-1р также может быть связано с реакцией организма на образующиеся в процессе проопухолевые агенты - дисплазированные в разной степени клетки эпителия (ShiraishiJ.etal.,2001).

Средняя концентрация (М) ИЛ-6 при предраке гортани была в 1,5 раза ниже значений группы контроля. Причем, в 13 % (4/31) значения концентрации данного интерлейкина укладывались в значения группы контроля, а в 87% (27/31) были ниже значений группы контроля. В данной группе выявлена отрицательная коррелятивная связь между уровнем и концентраций ИЛ-6 (г = - 0,399, р = 0,029). Также обозначается наличие связи между уровнем ИЛ-6 и концентрацией IgG (г = 0,390, р = 0,060).

Статистическое среднее (М) концентрации ИЛ-6 группы РГ было практически вдвое выше значений группы контроля. При этом при сравнении получены данные о различии «средних» групп РГ и ПРГ. Концентрация ИЛ-6 при раке гортани в 94% (31/33) была выше, в 3% (1/33) случаев в рамках значений группы контроля, и в 3% (1/33) - ниже значений контрольной группы. В рамках анализа настоящей группы выявлена положительная коррелятивная связь между ИЛ-6 и альфа-2-макроглобулином (г= 0,396, р = 0,041).

В группе ЛРГ у всех больных содержание ИЛ-6 в сыворотке крови было больше значений группы контроля. В данной группе выявлена статистически значимая сильная отрицательная коррелятивная связь между уровнем ИЛ-6 и концентрацией IgM (г =-0,979, р < 0,001).

В настоящем исследовании показано, что опухолевая профессия в гортани сопровождается увеличением концентрации ИЛ-6 в сыворотке (66±4 пг/мл), при этом при предраке гортани отмечается выраженное снижение концентрации данного цитокина в крови (р = 0,006).

При предраке гортани секреция ИЛ-6 происходит за счет иммунокомпе-тентных клеток и сопровождает физиологическое течение воспалительного процесса, при этом значительная его часть может связываться в виде комплексов с альфа-2-макроглобулином.

При развитии опухоли дополнительно в пул ИЛ-6, секретируемый имму-нокомпетентыми клетками, добавляется доза, продуцируемая самими клетками опухоли. Положение о секреции ИЛ-6 опухолевыми клетками согласуется с мнением авторов (Chow K.C. et al., 2003), изучавших продукцию ИЛ-6 клетками плоскоклеточного рака.

Рис. 1. Концентрация провоспалительных цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-1(3 в сыворотке крови у пациентов исследуемых групп (пг/мл). Отмечено среднее (М), границы интервала соответствуют 95% доверительному интервалу для среднего (95% а).

Таким образом, принимая за основу вышесказанное об изменении цито-кинового статуса при раке и предраковых поражениях гортани, отмечу, что, учитывая различные источники и разную направленность изменения концентрации интерлейкинов ИЛ-1Р и ИЛ-6, можно предполагать возможность практического применения данного факта для дифференциальной диагностики этих патологических состояний.

В настоящей работе было проведено исследование на предмет использования определения концентрации ИЛ-1(3 и ИЛ-6 в сыворотке крови в качестве дополнительного иммунологического критерия дифференциальной диагностики предрака и рака гортани.

При анализе наблюдений выявлено, что использование данного метода дает достаточно значимый результат. Так, диагностическая чувствительность критерия оценки (ИЛ-1р + ИЛ-6) для рака гортани составляет 81%, а диагностическая специфичность 78%. Причем оптимальное соотношение чувствительности и специфичности определяется при точках раздела для ИЛ-6 в 40 пг/мл, а для 18 пг/мл.

Таким образом, определение концентрации провоспалительных цитоки-нов и ИЛ-6 в сыворотке крови может служить дополнительным диф-

ференциально-диагностическим критерием для разграничения предрака и рака гортани.

Учитывая доказанные взаимосвязи интерлейкинов с представителем регу-ляторных острофазовых белков, альфа-2-макроглобулином (Birkenmeier G., 2001), представлялось перспективным включение определения концентрации альфа-2-макроглобулина в дифференциально-диагностический комплекс.

При этом также были получены достаточно значимые результаты. Диагностическая чувствительность критерия оценки ИЛ6 + МГ для рака гортани составляет 68%, а диагностическая специфичность 69%. Оптимальное соотношение чувствительности и специфичности определяется при точках раздела для ИЛ-6 в 40 пг/мл, а для МГ в 1,9 г/л.

Данный раздел исследования на примере изучения ИЛ-1 ß, ИЛ-6 при раке и предраке гортани показывает, что возможно именно в изменении цитокино-вого баланса усмотреть одну из «границ», которая разделяет предрак и развившуюся злокачественную опухоль.

Возможно, что это является ключом к разработке новых способов воздействия на опухоль - прицельном изменении баланса регуляторной цитокино-вой сети организма при лечении рака (цитокинотерапии), а также в способах профилактики перехода предраковых состояний в рак. Все это требует дальнейшего исследования.

Таким образом, полученные в процессе работы данные позволяют нам заключить, что характер изменений иммунорегуляторных белков и факторов гуморального иммунитета при гиперпластических процессах и раке гортани различен. Для гиперпластического процесса в гортани характерно повышение в крови острофазового белка лактоферрина и снижение отрицательного реак-танта острой фазы — альфа-2-макроглобулина, а так же снижение концентрации IgG и ИЛ-6 с увеличением IgA, IgM и ИЛ-Iß. Поскольку ген ИЛ-6 управляет биосинтезом МГ, то снижение ИЛ-6 и МГ является проявлением запрограммированной биологической реакции. Характерные изменения иммуноглобулинов т.е. снижение концентрации IgG, с повышением IgA и IgM -являются признаками ответа иммунной системы в процессе антигенной стимуляции.

По нашему мнению при предраке гортани качественные изменения острофазовых регуляторных белков и гуморального звена иммунной системы соответствуют общепринятым представлениям о течении хронического воспаления.

Рак гортани характеризуется не только повышением лактоферрина, но и альфа-2-макроглобулина и ИЛ-6, при неизменных концентрациях иммуноглобулинов и снижении ИЛ-1 ß. Учитывая, что альфа-2-макроглобулин обладает иммунносупрессивной активностью, ареактивность гуморального звена иммунитета может быть объяснена именно этим свойством. Повышение концентрации ИЛ-6 в сыворотке крови возможно объяснить также секрецией

данного цитокина клетками плоскоклеточного рака гортани. Это свидетельствует на наш взгляд как о срыве механизмов регуляции, так и об отсутствии иммунного ответа на опухоль.

Оценивая результаты настоящего исследования в целом можно заключить, что выполненная работа может считаться только начальным этапом изучения гуморальных факторов регуляции иммунитета при злокачественной трансформации предрака гортани в рак, но актуальность и перспективность продолжения такой работы несомненны.

выводы

1. У больных предраком концентрация альфа-2-макроглобулина в сыворотке крови достоверно ниже показателей здоровых лиц, напротив, при раке гортани концентрация этого белка в сыворотке крови выше группы здоровых лиц.

2. Концентрация лактоферрина в сыворотке крови у больных предраком и раком гортани достоверно превышает его концентрацию в группе практически здоровых. Высокий уровень лактоферрина сыворотки крови у больных раком гортани до проведения лечения является благоприятным прогностическим признаком в послеоперационном периоде.

3. Содержание сывороточных иммуноглобулинов (IgA, ^М) и циркулирующих иммунных комплексов в сыворотке крови у больных предраком и раком гортани повышено относительно значений практически здоровых лиц, в то время как концентрация IgG в сыворотке крови у больных предраком статистически значимо снижена.

4. Характер изменения концентрации провоспалительных цитокинов в сыворотке крови при раке и предраке гортани различен: уровень интерлейки-на- 1р повышен при предраке гортани и снижен при раке гортани, тогда как концентрация интерлейкина-6 снижена при предраке и повышена при раке гортани.

5. Определение концентрации провоспалительных цитокинов - интер-лейкина- и интерлейкина-6 в сыворотке крови может служить дополнительным дифференциально-диагностическим критерием для разграничения предрака и рака гортани. Диагностическая чувствительность и диагностическая специфичность метода составляет 81% и 78% соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Определение концентрации интерлейкина-1{3 и интерлейкина-6 в сыворотке крови у больных раком и предраком гортани позволяет качественно улучшить диагностику и уточнить тактику лечебных мероприятий.

2. Определение содержания лактоферрина в сыворотке крови больных предраком и раком гортани возможно использовать в качестве прогностического критерия течения и исхода заболевания.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Махов ВА, Толченицин ИА, Чиркова Т.С., Зорина В.Н., Мингалёв Н.В., Антонов А.Р. Комплексное определение концентрации лактоферрина и интерлейкина 6 в дифференциальной диагностике новообразований гортани // Медицинская иммунология. - 2003. - Т, 5, № 3-4. - С. 358-359.

2. Аппельганс Т.В., Махов ВА, Панёв Н.И., Новикова Т.А., Орлова Г.И., Кре-четова О.Н. Интерлейкин-6 у различных групп населения крупного промышленного города // Медицинская иммунология. — 2003. — Т. 5, № 3-4. — С. 431.

3. Махов ВА, Антонов А.Р. Альфа-2-макроглобулин и интерлейкины сыворотки крови у больных с опухолевыми и предраковыми заболеваниями гортани // Медико-биологические проблемы. — Вып. 11. — Кемерово-Москва, 2003. — С. 22-25.

4. Махов ВА, Сугатова Т.П., Антонов А.Р., Мингалёв Н.В., Архипова СВ. Уровень сывороточного лактоферрина и интерлейкина-6 при новообразованиях гортани // Медико-биологические проблемы. - Вып. 11. — Кемерово-Москва, 2003. — С. 26-27.

5. Махов ВА Концентрация лактоферрина и интерлейкина-6 в сыворотке крови у больных с новообразованиями гортани // Авиценна — 2003: Матер, конф.— Новосибирск, 2003. - С. 107-108.

6. Махов ВА, Мингалёв Н.В., Антонов А.Р. Определение концентрации интер-лейкина-6 (ИЛ-6) и интерлейкина-1-бета (ИЛ-1-бета) в дифференциальной диагностике новообразований гортани // Современное состояние и перспективы развития экспериментальной и клинической онкологии: Матер, конф. посвященной 25-летию ГУ НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН. - Томск, 2004. - С . 130-131.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ИЛ - интерлейкин

ИНФ - интерферон

ЛФ -лактоферрин

МГ - альфа-2-макроглобулин

ПРГ - предрак гортани

РГ - рак гортани

ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы

№ 18М, 1ёА - иммуноглобулины класса О, М, А

Подписано в печать 28.06.2004. Формат 60x84/16. Заказ №620.

Гарнитура Тайма Тираж 100. Отпечатано в типографии ГОУ ДПО Ново кузнецкого ГИУВа 654005. г. Новокузнецк, ул. Строителей. 5

»1 3 4 1 i

РНБ Русский фонд

2005-4 13108