Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Белки семейства макроглобулинов как компонент врожденного иммунитета и универсальные регуляторы межклеточных взаимодействий в норме и при патологии

На правах рукописи

0034 Скзи'+и

(1

ЗОРИНА ВЕРОНИКА НИКОЛАЕВНА

БЕЛКИ СЕМЕЙСТВА МАКРОГЛОБУЛИНОВ КАК КОМПОНЕНТ ВРОЖДЕННОГО ИММУНИТЕТА

И УНИВЕРСАЛЬНЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2009

О 3 СЕН 2009

003476046

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» и в Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

Козлов Иван Генрихович

Стенина Марина Александровна Арион Виталий Яковлевич Захарова Людмила Алексеевна

Ведущая организация: ПЩ Институт иммунологии Федерального медико-биологического агентства России

Защита состоится «__»_ 2009г., в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.072.05. при ГОУ ВПО РГМУ Росздрава (117997, Москва, ул. Островитянова, д.1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997, Москва, ул. Островитянова, д.1

Автореферат разослан «_»_2009г.

Ученый секретарь диссертационного совета к.м.н., доцент

Т.Е. Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Белки семейства макроглобулинов представляют собой группу высокомолекулярных гликопротеинов с уникальным «ловушечным» центром, позволяющим данным белкам ко-валентно связывать и транспортировать практически все известные про-теиназы, сохраняя при этом их литическую активность (Petersen С.М., 1993, Birkenmeier G., 2001). Однако помимо ковалентных взаимодействий, позволяющих выводить избыток протеиназ из циркуляции, макроглобулины способны образовывать и довольно прочные гидрофобные связи (Ramos A.M. et al., 2002), а также слабые хслатные и водородные с рядом других лигандов. Полиспецифичность и способность связывать схожие лиганды посредством различных взаимодействий позволяют макроглобулинам участвовать в самых разнообразных реакциях организма на внешние и внутренние воздействия. Так, макроглобулины играют значительную роль, как в гуморальном, так и в клеточном иммунном ответе. Они являются транспортерами регуляторных цитокинов к клеткам, маркируют бактериальные патогены, участвуют в процессинге и презентации антигенов, в передаче сигнала к клетке и в запуске каскада внутриклеточных реакций, влияют на антителогенез (Misra U.K. et al., 1999, Fujisaki S. et al., 2000, Gouin-Charnet A. et al., 2000, Birkenmeier G„ 2001, Shibata M. et al., 2003, Bond J.E. et al., 2007). Кроме того, макроглобулины, в зависимости от конформационного состояния, модулируют деление и апоптоз клеток, процессы свертывания крови, ремоделирования тканей (Sanchez М.С. et al., 1998, Ikari et al., 2001, Birkedal-Hansen H. et al., 2008). В числе прочих факторов, позволяющих белкам семейства реализовывать свои регуля-торные воздействия, ведущую роль играет количество и распространенность их рецепторов на клетках. Макроглобулины имеют наибольший аффинитет к основному рецептору эндоцитоза (J1PI1) и сигнальным рецепторам, присутствующим практически повсеместно (Birkenmeier G., 2001). Широкая распространенность рецепторов, равно как и клеток способных синтезировать макроглобулины, позволяет последним принимать активное участие в развитии воспалительных, аутоиммунных и онкопро-лиферативных заболеваний.

В настоящее время продолжаются активные исследования роли макроглобулинов в патологических процессах. Однако чем дальше продвигаются исследователи, тем больше возникает вопросов. До сих пор нет единого мне-

ния даже в том, являются данные белки позитивными либо негативными ре-актантами воспаления. Неуточненными остаются механизмы взаимодействия макроглобулинов с рецепторами, мало исследованы конкурентные взаимодействия различных представителей семейства за лиганды. Не проводилось сравнительных исследований, позволяющих в сопоставимых условиях оценить роль макроглобулинов при заболеваниях принципиально различного генеза и локализации. В последнее время все чаще высказываются предположения, что различия в воздействии макроглобулинов на клетку определяются и вовсе не изменениями их общего уровня, но количеством и составом комплексов макроглобулинов с биологически активными субстанциями (Iborra А et al., 2005), а также изменениями в структуре самих макроглобулинов, как генетически детерминированными (Welinder С. et al., 2008), так и происходящими при взаимодействии с патологическими метаболитами и продуктами воспалительной реакции (Wu S.M., Pizzo S.V., 1999, Moore A.R. et al., 1999).

Таким образом, целью данной работы было изучение спектра ли-гандов к белкам семейства макроглобулинов, выявление особенностей взаимодействия макроглобулинов с лигандами и с основным рецептором эндоцитоза, а также изучение сывороточных уровней альфа-2-макроглобулина (МГ), его регуляторно-транспортных, иммунных комплексов, и концентраций ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина (АБГ-резервного макроглобулина крови) в сравнении с изменениями цитокинового профиля, содержания иммуноглобулинов и классических белков острой фазы в норме и при патологии различного генеза и распространенности.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить спектр лигандов белков семейства макроглобулинов.

2. Выявить особенности взаимодействия белков семейства макроглобулинов, включая изучите возможности образования взаимосвязей между различными представителями семейства, а также реакций конкуренции за лиганды.

3. Уточнить спектр и природу антител к МГ. Оценить возможность конкуренции ауто- и противоуглеводных антител за связывание с МГ.

4. Изучить особенности взаимодействия макроглобулинов с рецептором эндоцитоза.

5. В сравнимых условиях исследовать изменения общей концентрации МГ, его регуляторно-трапспортпой формы (комплекс МГ-плазмин), и его иммунокомплекса (МГ-^в), а также изменения общего содержания АБГ, некоторых цитокинов и белков острой фазы в норме и при патологии различного генеза и распространенности:

- злокачественном новообразовании яичников (рак яичников Ш-ГУ стадии; РЯ)

- доброкачественной серозной опухоли яичников (цистаденома; ЦА)

- наружном генитальном эндометриозе (эндометриоз яичников Ш-1У стадии; ЭНД)

- системной аутоиммунной патологии (системная красная волчанка 2-3 степени активности; СКВ)

- системной аутоиммунной патологии с активно выраженным воспалительным компонентом (ревматоидный артрит 2-3 степени активности; РА)

- системном воспалении инфекционного генеза с преимущественной локализацией в суставах (реактивный артрит; РеА)

- локальном воспалении придатков матки инфекционного генеза (обострение хронического аднексита; АДН).

Научная новизна. Впервые проанализирован спектр лигандов модифицированного МГ в зависимости от источника сырья и условий его хранения.

Установлено, что возможна конкуренция между различными представителями семейства макроглобулииов при связывании протеиназ, а преимущество в конкуренции зависит не только от свойств макроглобулинов, но и от свойств связываемой протеиназы.

Нами продемонстрировано, что с трансформированным МГ связываются как ауто- так и противоуглеводные антитела. Причем у здоровых доноров в крови преобладают ауто-, тогда как при патологии до 40% антител к МГ - противоуглеводные антитела. Кроме того, противоуглеводные и аутоантитела (ау-тоАТ) могут конкурировать за связывание с МГ, а преимущество в конкуренции зависит от того, к какому классу иммуноглобулинов (1д) они относятся.

Впервые установлено, что при взаимодействии макроглобулинов сначала с протеиназой, а затем с рецептором происходит изменение изо-электрической точки (Р1) сформированного комплекса до 7,4, вне зависимости от исходных Р1 компонентов комплекса. Более того, при взаимодействии трансформированного протеиназой МГ (имеющего большую плот-

ность и электрофоретическую подвгокность по сравнению с нативным МГ) с рецептором эндоцитоза (ЛРП), происходит дополнительное конформаци-онное уплотнение мультикомплекса, приводящее к еще большему увеличению его электрофоретической подвижности.

Показано, что при таком классическом аутоиммунном заболевании, как СКВ, а также при ЭНД, имеющем аутоиммунную составляющую, МГ не является иммуногенным фактором, его транспортные комплексы не принимают активного участия в патогенезе заболеваний, однако уровень АБГ, дублирующего функции МГ и обладающего более выраженной способностью к стимуляции пролиферации, достоверно повышается. Напротив, при РА МГ играет ключевую роль в возникновении и дальнейшем развитии заболевания, является одним из основных иммуногенных факторов, а также причиной разрушения тканей суставов протеиназами за счет сохранения их литической активности в составе комплексов.

Нами выявлено, что при доброкачественной (ЦА) и особенно при распространенной злокачественной (РЯ) опухоли яичников происходит накопление иммунных и особенно регуляторно-транспортных комплексов МГ в циркуляции, на фоне истощения резервов МГ и увеличения содержания АБГ.

Согласно полученным данным, РеА и АДН, имеющие первопричиной своего возникновения сходный бактериальный возбудитель, различаются по общему содержанию МГ в циркуляции, но имеют сопоставимые уровни АБГ и комплексов МГ.

Практическая значимость. Обнаружение в сыворотке крови высокой концентрации комплексов МГ-1^0 и МГ-плазмин (МГ-ПЛ) у больных с острым суставным синдромом неясной этиологии является высокочувствительным дифференциально-диагностическим тестом на наличие РА. Выявленные особенности патогенеза ряда других заболеваний позволяют рекомендовать внести изменения в лечебно-диагностическую тактику. Так выявление дефицита местного иммунитета при ЦА позволяют рекомендовать иммунокоррекцию женщинам с бактериальным воспалением в качестве профилактической меры. Использование в схеме лечения РЯ гемодиализа для удаления из циркуляции поврежденного МГ и особенно стимулирующего пролиферацию АБГ может значительно улучшить эффективность лечения. Антицитокиновая терапия РА, активно применяемая в последние годы, нуждается, согласно нашим результатам, в коррекции, поскольку поврежде-

ние основного носителя цитокинов (МГ), обнаруживаемое при данном заболевании, а также последующие проблемы в своевременной доставке к клеткам-мишеням, за счет изменения сродства МГ к цитокинам и рецепторам, могут провоцировать развитие ряда эффектов, совершенно противоположных предполагаемым при конструировании коммерческих препаратов терапевтических моноклональных антител. Коэффициент, вычисляемый посредством деления концентраций МГ на ЛФ, при воспалительных заболеваниях придатков матки рекомендован нами в качестве дифференциально-диагностического критерия для облегчения выбора способа оперативного вмешательства (патенты РФ №2295134, №2303263). Оценка уровней АБГ может использоваться в качестве дополнительного критерия при определении степени злокачественности обнаруженного новообразования в придатках матки и тактики хирургического лечения (патент РФ №2283499). В целом, выяснение механизмов взаимодействия макроглобулинов с лигандами и, что главное, с рецептором эндоцитоза позволят конструировать лекарственные препараты, где в качестве носителя, доставляющего регуляторные субстанции непосредственно к клеткам-мишеням, будет использоваться какой-либо из макроглобулинов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Белки семейства макроглобулинов (МГ и АБГ) присоединяют ряд лигандов, включая протеиназы, иммуноглобулины, цитокины, липопротеи-ны, циркулирующий рецептор эндоцитоза (ЛРП), альбумин, а также могут взаимодействовать друг с другом. При этом МГ и АБГ конкурируют за связывание с протеиназами, а преимущество в конкуренции зависит как от свойств макроглобулина, так и от свойств протеиназы. Более того, МГ может формировать сложные многокомпонентные комплексы из нескольких транспортируемых лигандов, связанных ковалентно или через гидрофобный сайт, конкурента за лиганды (АБГ) и даже циркулирующего рецептора эндоцитоза.

2. Макроглобулины способны дозозависимо связываться с противоуг-леводными антителами, преимущественно ангиманнозными и антигалактоз-ными; их общее содержание среди циркулирующего пула антител к МГ составляет у здоровых 15-20% и может увеличиваться при патологии до 30%, а у отдельных индивидуумов до 40%. Кроме того, в сыворотке крови всех здоровых и больных обнаруживаются специфические аутоАТ к МГ, в концентрации

0,6-0,7 мкг/мл. Ауго- и противоуглеводные антитела могут связываться с МГ на конкурентной основе либо одновременно. При этом наличие конкуренции или синергического эффекта определяется тем, к какому классу (О, А или М) принадлежит антитело.

3. При реакции нативного МГ сначала с протеиназой (трансформация), а затем с ЛРП рецептором происходит поэтапное изменение Р1 формируемого комплекса до значений, соответствующих рН внутренних сред организма. При этом реакция идет в определенной последовательности (сначала трансформация и нейтрализация, затем реакция с рецептором и повторная нейтрализация), а конечная Р1 не зависит от Р1 исходных компонентов мультикомплекса. Помимо изменения Р1 при реакции транформи-рованного МГ (имеющего уплотненную конформацию и большую элек-трофоретическую подвижность, чем нативный МГ) с ЛРП, происходит дополнительное уплотнение и увеличение электрофоретической подвижности мультикомплекса.

4. Развитие злокачественного новообразования яичников (РЯ) сопровождается снижением уровня МГ в циркуляции, на фоне достоверного повышения концентрации его аналога АБГ, 2-кратным увеличением содержания иммунокомплекса МГ-1й(} и 3-кратным - регуляторно-транспортного комплекса МГ-ПЛ. При доброкачественной опухоли яичников (ЦА) наблюдается снижение содержания МГ, на фоне недостоверного повышения АБГ и менее выраженного увеличения концентраций комплексов МГ-^в и ПЛ-МГ. Полученные результаты, включая выявленные изменения уровней цитокинов, иммуноглобулинов и других белков острой фазы позволяют предположить, что дефицит МГ и АТр, вкупе с накоплением регуляторно-транспортных комплексов ПЛ-МГ в циркуляции может служить пусковым механизмом пролиферации. Кроме того, активация синтеза АБГ и транспорта цитокинов именно этим представителем семейства, способствуют агрессивной пролиферации при РЯ.

5. При наличии воспаления бактериального генеза, сывороточные показатели, включая уровни макроглобулинов и их комплексов, изменяются согласно классическим канонам воспалительной реакции, при которой МГ выступает в качестве негативного реактанта, а АБГ - позитивного. Однако при хроническом АДН уровни МГ неизменны, содержание АБГ, комплексов МГ-^в и ПЛ-МГ - повышено, а при РеА уровень МГ достоверно

снижен, содержание АБГ и обоих типов комплексов, повышено, но в меньшей степени, чем при аднексите. Таким образом, резерв МГ в циркуляции лимитирован и при массированном воспалении может истощаться, особенно при отсутствии адекватного усиления синтеза АБГ.

6. При наружном эндометриозе (ЭНД) концентрация МГ в крови не метается, при этом уровни АБГ и комплексов (МГ-IgG, ПЛ-МГ) повышаются. Аналогичные изменения характерны и для системной аутоиммунной патологии (СКВ), за исключением того, что при СКВ наблюдается увеличение уровней иммуноглобулинов и более выраженное повышение концентрации ИФН-у. Таким образом, патогенез ЭНД имеет выраженный аутоиммунный компонент, но отличается от СКВ менее выраженными изменениями в анти-телогенезе и дисбалансе иммуномодулирующих цитокинов. При этом МГ и его комплексы, накапливающиеся в циркуляции, по всей вероятности, за счет блокирования ЛРП рецептора избытком ИФН-у, не принимают прямого и активного участии в патогенезе СКВ и ЭНД, в то время как повышенные концентрации АБГ способны стимулировать патологическую пролиферацию тканей, наблюдаемую при данных заболеваниях.

7. При системном аутоиммунном воспалении (РА) снижены уровни МГ, увеличены концентрации АБГ, многократно повышено содержание ре-гуляторно-транспортного комплекса МГ-Г1Л и особенно иммунного комплекса МГ- IgG. Данные изменения сопровождаются значительным повышением концентраций провоспалительных цитокинов, иммуноглобулинов и острофазового ЛФ в крови. Выявленные изменения указывают на то, что МГ играет ключевую роль, как в возникновении РА, так и в его дальнейшей прогрессии и не только участвует в разрушении тканей суставов, но и является основным иммуногенным фактором.

Апробация работы: Основные результаты работы доложены на научно-практической конференции «Социально-значимые болезни» (Кемерово, 2004), на Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), на Международном конгрессе «Immune-mediated diseases. From theory to therapy» (Москва, 2005), Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина» (С.-Петербург, 2005), Национальном конгрессе терапевтов «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации» (Москва, 2007).

Работа была апробирована на совместном заседании кафедры фармакологии и отдела иммунологии ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Росздрава» 23 марта 2009г.

Публикации: По теме диссертации опубликовано 34 работы в периодических изданиях, материалах научных конференций и международных форумах, из них 21 публикация в журналах из списка, рекомендованного ВАК РФ для докторских диссертаций; получено 5 патентов РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 190 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, самостоятельных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 32 таблицами и 43 рисунками. Список цитируемой литературы включает 224 источника, из них 205 зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Для изучения уровней МГ, АБГ", МГ-ПЛ, МГ-^в, ИЛ-1Р и его рецеп-торного антагониста, ФНО-а, ИЛ-6, ИЛ-8, ИФН-у, 1§А и лакто-феррина (ЛФ), альфа-1-антитрипсина (АТр), плазмина (ПЛ) и альбумина в норме, а также при верифицированной патологии различного генеза и распространенности исследовали сыворотку крови:

1) 35 практически здоровых женщин, не имевших перечисленной ниже патологии в анамнезе, отобранных по результатам плановой диспансеризации. Средний возраст женщин - 38,20-12,06 лет;

2) 69 женщин больных РА 2-3 степени активности. Средний возраст больных - 49,8±1,4 года;

3) 32 женщин больных СКВ 2-3 степени активности. Средний возраст больных - 32,0±1,5 года;

4) 15 женщин больных РеА. Средний возраст больных - 37,7±3,3 лет;

5) 13 женщин с верифицированным диагнозом: РЯ, распространенный процесс, Ш-ГУ стадия. Средний возраст женщин составил 56,5±3,6 года;

6) 10 женщин больных верифицированной доброкачественной серозной ЦА. Средний возраст больных составил 41,9±6,5 лет;

7) 33 женщин с обострением хронического воспалительного процесса придатков матки (АДН). Средний возраст женщин - 29,07±1,1 лет;

8) 25 женщин с диагнозом наружно-генитальный ЭНД 3-4 стадии. Средний возраст больных - 33,2±1,8 лет.

Забор образцов крови осуществлялся во всех случаях до операции либо консервативного лечения. Образцы были получены при плановом клиническом обследовании и заморожены вплоть до окончательной верификации диагноза соответствующими врачами-специалистами.

В качестве источника препаратов белков использовалась свежая и свежезамороженная плазма или сыворотка крови, полученная на Новокузнецкой станции переливания крови, а также молозиво и, в случае получения ЛРГ1 - плацента. Высокоочищенные препараты МГ, АБГ, ПЛ, ЛФ, АТр, альбумина, ЛРП, 1цС, А и М получали при по мощи комбинирования различных методов осаждения, центрифугирования и применения разных вариантов колоночной хроматографии низкого давления согласно описанным ранее в литературных источниках методикам.

Высокоочищенные препараты белков использовали для получения моноспецифических поликлональных антисывороток путем подкожной иммунизации кроликов с использованием неполного адьюванта Фрейнда. Качество антисывороток оценивали при помощи иммуноэлектрофореза. Моноспецифические антитела выделяли при помощи аффинной хроматографии на ВгС>Т-агарозе с иммобилизованными белками-антигенами.

В качестве источника лнгандов к трансформированному МГ использовали смесь плазмы крови доноров-мужчин, женщин, а также беременных женщин (III триместр беременности). Образец (250 мл плазмы) вносили в режиме рециркуляции на колонку ВгСМ-агарозы с иммобилизованным МГ, модифицированным метиламином. Лиганды элюировали сначала 0,05 М ЭДТА-буфером (рН 7,4), а затем 0,05 М глицин-НС1 буфером (рН 2,8). Фракции, содержащие белок, определяли слитным ракетным иммуноэлек-трофорезом. Полученные образцы хранили при 4°С.

Для выделения лигандов какого-либо отдельного белка к модифицированному МГ через упомянутую выше колонку пропускали образцы вы-сокоочищенных нативных препаратов соответствующих белков и элюировали присоединившиеся лигавды 0,05 М глицин-НС1 буфером, рН 2,8.

В работе были использованы различные варианты низковольтного иммуноэлектрофореза в агарозном геле (слитный, ракетно-линейный, перекрестный, варианты с адсорбцией in situ и с использованием промежуточного геля), а также зональный электрофорез в пластинах полиакриламидно-го геля и юоэлектрическое фокусирование, выполненные по описанным ранее в литературных источниках методикам.

Сывороточные уровни изученных в работе показателей у здоровых доноров и при патологии определялись при помощи стандартных биохимических и иммунотурбидиметрических методов, аналитического ракетно-линейного электрофореза и твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием как коммерческих, так и сконструированных de novo тест систем, а также внутренних контролей и калибраторов.

При проведении методики ИФА с применением сконструированных нами de novo тест-систем для определения концентрации комплексов МГ, использовались первичные аффинно-очищенные антитела к МГ (в случае определения MT-IgG) или к ГШ (в случае определения ПЛ-МГ). Оставшийся после сорбции антител свободным полистирол «забивали» 5% бычьим сывороточным альбумином. Образцы сыворотки разводили в забуференном физиологическом растворе, содержащем Твин-20 (ЗФР-Т) в соотношении 5 мкл буфера на 195 мкл образца. При дифференцированном определении аутоАТ, 5 мкл образца разводили в 195 мкл раствора 0,5 М маннозы и 0,1 М лактозы в ЗФР-Т, для исключения противоуглеводных антител. Для построения калибровки использовали первичные антитела к IgG и сам высокоочшценный IgG (при определении МГ-IgG) или первичные антитела к МГ и, соответственно, высокоочшценный МГ в качестве калибратора (при определении ПЛ-МГ). Использовали 6-точечную калибровку со ступенчатым разведением при оценке уровней МГ-IgG и 8-точечную в случае определения концентрации ПЛ-МГ. Степень разведения коньюгата на основе пероксидазы хрена подбирали в серии предварительных опытов. В качестве источников хромогенов в ИФА был использован ортофенилендиамин. Реакцию останавливали серной кислотой.

Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи программы InStat-II, Instat Biostatistics (GraphPad, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты проведенного нами исследования как подтвердили целый спектр уже описанных в литературных источниках свойств макроглобулинов, так и позволили выявить ряд новых. В частности, нам впервые удалось продемонстрировать, что различные представители семейства макроглобулинов могут активно конкурировать друг с другом не только за рецепторы, но и за связанную протеиназу. Об этом убедительно свидетельствует как обнаружение нами АБГ в составе лигандов к МГ и схожий спектр лигандов к этим двум белкам (рис. 1), так и результаты анализов конкуренции за иммобилизованные протеиназы (рис. 2), в которых макроглобулины, судя по полученным эффектам, либо вытесняют друг друга, либо и вовсе связываются с одной и той же молекулой протеиназы одновременно (к примеру, один белок - ковалентно, другой -через гидрофобный сайт).

Лиганды к трансформированному МГ

Лиганды к трансформированному АБГ

Рис. 1. Перекрестный иммуноэлектрофорез лигандов макроглобулинов, элюированных глицин-НС1 буфером рН2,8 с А \ против всех белков плазмы человека.

1 2 3

Рис. 2. Конкурентное взаимодействие МГ (верх) и АБГ (ню) за иммобилизованный в промежуточном геле трипсин (Тр).

Пояснения: 1) белок без контакта с иммобилизованным Тр; 2) белок при контакте с Тр; 3) белок при контакте сТр + конкурентный макроглобулин

При этом преимущество того или иного макроглобулина в конкуренции определяется, вероятно, молекулярной массой, а возможно и какими-то еще свойствами иммобилизованного фермента. Можно предполагать, что количественное преимущество одного из типов регуляторных комплексов (лигандов с МГ либо с АБГ) в эффекторной зоне может оказывать различное влияние на клетки-мишени. Это особенно важно при аутоиммунных и онкопролиферативных заболеваниях, поскольку трансформированные МГ и АБГ сильно различаются по своему иммуносуппрессивному и пролифе-ративному воздействию на клетки.

Более того, мы показали, что макроглобулины имеют общие лиганды с альбумином и ЛФ (рис. За и б), что позволяет предположить не только конкурентное взаимодействие (к примеру, за металлы), но и возможность «дублирования» ряда регуляторно-транспортных функций.

Рис. За. Перекрестные электрофорезы лигандов к иммобилизованному МГ (верх) и иммобилизованному альбумину (низ). Посередине показан электрофорез смешанных в равных долях лигандов МГ и альбумина.

Рис. 36. Перекрестные электрофорезы лигандов к иммобилизованному МГ (верх) и иммобилизованному ЛФ (низ). Посередине показан электрофорез смешанных в равных долях лигандов МГ и ЛФ.

Пояснения: В гель второго направления иммуноэлектрофореза добавлячась ан-тнсыворотка против всех белков плазмы человека

Необходимо учитывать, что все три белка являются по сути «белками-мусорщиками», а МГ и ЛФ к тому же утилизируются через один и тот же ЛРП-рецептор. Однако альбумин считается классическим негативным реактантом воспаления, ЛФ - позитивным, а по МГ до сих пор нет единого мнения. Можно предположить, что подобное частичное дублирование функций позволяет организму в той или иной степени восполнять временный недостаток одного белка-транспортера за счет другого, а конкуренция этих белков за рецептор позволяет разнообразить их регуляторные свойства, базирующиеся на сравнительно примитивных механизмах, но отличающиеся удивительным разнообразием за счет широкого спектра транспортируемых веществ (особенно это относится к МГ) и вариаций в скорости и способах их доставки, регулируемых изменениями количества рецепторов и вышеупомянутыми конкурентными взаимодействиями.

В целом, к числу «мажорных» лигандов к макроглобулинам в плазме крови относятся ПЛ, альбумин, а- и р-цепи липопротеинов, а также При этом нам впервые удалось внести значительные уточнения в вопрос о структуре и составе присоединяющихся к макроглобулинам. Согласно полученным данным, к МГ могут присоединяться антитела всех трех основных классов (О, М, А), но является доминирующим. При этом с МГ реагируют как тяжелые, так и легкие цепи (рис. 4).

Рис.4. Ракетно-линейный иммуноэлектрофорез с моноспецифической антисывороткой против МГ в геле и адсорбцией т «Си.

Пояснения: В качестве антигена использован. В лунки со 2 по 8 добавлены моноспецифические кроличьи антисыворотки (Ав) против иммуноглобулинов человека и их отдельных цепей.

1) контроль; 2) Лл против /-цепей /£; 3) Аз против Я цепей 4) Аз против Н-цепей 5) Аз против Н-цепей 6) Аз против Н-цепей М; 7) Аз против секреторного 1§А

Любопытно, что добавление антисыворотки против Н-цепи ^С к МГ при проведении иммуноэлектрофореза, вызывает «классическое» снижение площади преципитата, а добавление антисыворотки против Н-цепи ^А и особенно приводит к «пародоксальному» увеличению площади преципитатов, что, вероятно, объясняется формированием гак называемых «непрещшитируюших» комплексов с моноцетровым связыванием, не позволяющим образовать классическую «решетку» преципитации при проведении электрофореза.

Далее нами показано, что большую часть 1^-лигандов составляют именно аутоАТ, а содержание противоуглеводных антител у здоровых не превышает 15-20%, но при ряде заболеваний процентное соотношение связывающихся с МГ противоуглеводных антител смещается до 30-40%.

При изучении реакций конкуренции ауто- и противоуглеводных антител (ПУАТ) при взаимодействии с МГ, было показано, что при связывании МГ с одними ПУАТ наблюдается дозозависимый эффект, а в реакциях конкуренции - самые разнообразные (рис. 5). Мы полагаем, что столь различные и зачастую парадоксальные реакции МГ с ПУАТ и аутоАТ различных классов в первую очередь связаны с топографией антигенных детерминант в структуре МГ и во вторую - с взаимной конкуренцией антител.

Рис. 5. Конкурентное взаимодействие различных типов антител к иммуноглобулинам с иммуноглобулинами, связанными с МГ.

Пояснения: В верхней части пластины - 5% антисыворотка (Ая) против М/,' в качестве обралр - препарат МГ. В лунки с 1 по 12 добавлены: 1) контроль (МТ'); 2) МГ + противо-углеводные антитела - ПУАТ (анти-глюкозные); 3) МГ + Ая против 4) МГ+Ая против 5) МГ+Ая против 6) МГ+Ах против Х-цепей ^: 1) МГ + Ах против /-цепей 8) МГ + ПУАТ+Ах против 9) МГ+ПУАТ+ Ах против 1ф; 10) МГ+ ПУАТ + Ах против 11) МГ + ПУАТ+Ах против Х-цепей & 12) МГ + ПУАТ + Ах против х-цепей

Из «минорных» лигандов наибольший интерес представляют цито-кины. Согласно полученным результатам, МГ не просто реагирует с цито-кинами как описано ранее, но и способен переносить по несколько их молекул одного типа одновременно. Более того, нам удалось показать, что при патологии количество цитокинов, приходящихся на одну молекулу МГ изменяется. Этот эффект может быть объяснен как описанными ранее изменениями в структуре и аффинности МГ к цитокинам, происходящими при окислении молекулы МГ продуктами воспалительной реакции С\Уи 8.М., й а1. 1998), так и существованием более тонких механизмов иммунной регуляции, поскольку большинство из цитокинов реагируют с клеточными рецепторами только после связывания с макроглобулинами, а их количество в комплексе и, возможно, выраженность эффектов в норме и при патологии, как мы показали, могут различаться.

Однако наиболее важные результаты, наш взгляд, получены при изучении взаимодействия МГ и его комплексов с ЛРП. Нам впервые удалось продемонстрировать, что при взаимодействии МГ (имеющего исходный Р1 4,8) с протеиназой (вне зависимости от ее исходного Р1), происходит смещение Р1 комплекса до 7,4, что соответствует рН внутренних сред организма. При этом, реакция протекает с образованием непродолжительно существующих переходных комплексов, с Р1, отличающейся как от заряда нативного МГ, так и заряда конечного комплекса с присоединенным лигандом (рис. 6). Безусловно, «уравнивание» Р1 комплекса с рН внутренней среды неизбежно должно приводить к практически полной потере его флотирующей способности, и, как следствие, к быстрому осаждению комплексов МГ с протеиназой и другими присоединившимися лигандами на поверхность ближайших клеток, с последующим присоединением к любому доступному на тот момент рецептору. Если учитывать, что, после связывания с протеиназой гид-рофобность трансформированного МГ возрастает в 2-3 раза, ЛРП-рецептор с его мощным гидрофобным участком и значительным представительством практически на всех типах клеток, является самой вероятной кандидатурой для подобного присоединения. Далее, согласно нашим данным, происходит повторная нейтрализация суммарного заряда мультикомплекса лиганды-трансформированный протеиназой МГ-ЛРП, что могло бы способствовать погружению внутрь клетки, если забыть о значительно увеличившейся молекулярной массе мультикомплекса по сравнению с одним ЛРП. И здесь решающую роль играет впервые выявленное нами конформационное уплотне-

ние данного мультикомплекса. Ранее было известно, что при трансформации МГ протеиназой происходит «парадоксальное» увеличение элекгрофорети-ческой подвижности комплекса, что объяснялось его конформационным уплотнением при реакции (Petersen С.М. 1993). Нам удалось показать, что при реакции трансформированного МГ с ЛРП происходит дополнительное кон-формационное уплотнение мультикомплекса (рис. 7), способствующее его эффективной интернализации и погружению внутрь клетки.

Рис. 6. Июэлектрофокусирование смеси препаратов нашивного и трансформированного МГ с ФНО-а.

Пояснения: Р1 шоэлектрическая точка; 1) ФНО-а: 2) смесь трансформированного МГ (МГ-метипамин) с ФНО-а: 3) смесь нашивного МГ'с ФНО-а: 4) нативный К-!Г

Рис. 7. Электрофорез в полиакриюмиде препаратов МГ.

Пояснения: I) ЛРП: 2) нативный МГ; 3) трансформированный МГ: 4) нативный МГ + ЛРП; 5) трансформированный МГ + ЛРП

Таким образом, нам удалось продемонстрировать, что, несмотря на различия в способах взаимодействий МГ с лигандами (включающих реакции конкуренции), а также наличие широкого спектра лигандов (позволяющее предположить существование большого количества сложных

мультикомплексов, обладающих разнообразными и, зачастую, разнонаправленными регуляторными свойствами), механизм взаимодействия МГ с рецептором по сути универсален.

Однако, если механизм связывания и транспорта внутрь клетки универсален, то как объяснить различные эффекты и степень выраженности действия белков-регуляторов при различных патологических процессах? К сожалению, на сегодняшний день существует лишь несколько тест-систем, позволяющих определить концентрацию комплексов МГ с какими-либо лигандами в составе крови человека. В этой связи мы решили изучить общие концентрации МГ, АБГ, уровни комплексов МГ-^в и ПЛ-МГ и сопоставить их с содержанием возможных лигандов в норме и при различных заболеваниях.

Результаты исследования сывороточного содержания МГ и АБГ в норме и при патологии представлены на рисунке 8 и 9.

з 2,5

2 1,5

1

0,5

0 —I

Рис. 8. Уровни МГ (г/л) в норме и при различных заболеваниях.

Примечания: линией отмечен уровень, характерный для здоровых доноров, колонки светлого оттенка ~ обнаружены достоверные отличия от нормы.

В целом, уровень МГ при большинстве изученных заболеваний был стабилен, не демонстрировал чрезмерной индивидуальной вариабельности показателей (минимальное ±ш зафиксировано в норме (±0,07) и при РА (±0,08), максимальное - при ЦА (±0,22) и РеА (±0,23)). В то же время, при

РА, РеА, РЯ и ЦА выявлено статистически достоверное снижение его концентрации, по сравнению с контрольной группой (р=0,0333; 0,0055; 0,0023; 0,0048 соответственно). При анализе индивидуальных показателей нами продемонстрировано, что концентрации МГ ниже, чем 1,5 г/л выявляются у 12% здоровых, у 16% больных РА, у 33% больных с диагнозом РеА и у 12% пациентов с диагнозом СКВ, в 3% случаев при АДН, 31% - при РЯ, 40% - при ЦА и в 20%> при ЭНД. Интересно, что в 6% случаев у здоровых, 16% - при РА, 27% - при РеА и 18% - при СКВ, а также в 19% - при АДН, 8% - при РЯ, 10%) - при ЦА и в 8% - при ЭНД напро тив, были выявлены уровни МГ выше, чем 3,0 г/л.

0,035 0.03 0.025 0,02 0,015 0,01 0,005 0

0.03

0,025

0 018 °-019 °'019 0,015

+

0.012

0,008

РА СКВ РеА АДН ЭНД РЯ ЦА

Рис. 9. Уровни ЛБГ(г/л) в норме и при различных заболеваниях.

Совершенно другая картина наблюдалась при сравнительном анализе сывороточных уровней АБГ. Содержание данного белка в сыворотке больных (за исключением группы ЦА) было достоверно выше, чем в образцах сывороток контрольной группы (±т варьировало в пределах ±0,001 в норме и ±0,005 при РЯ). При этом наибольшая концентрация наблюдалась именно в группах, отличающихся наиболее активной и агрессивной пролиферацией вне зависимости от того, сопровождалась ли данная пролиферация гипер- (РА) либо гипофункцией иммунной системы (РЯ). Анализ индивидуальных показателей позволил установить, что уровень АБГ превышал предельно допустимую норму (0,025 г/л) в 10% случаев у здоровых, в 48% - при РА (р<0,0001), в 9% - у больных РеА (р=0,0129), у 36% больных с

диагнозом СКВ (р = 0,0073), у 35% больных АДН (р=0,0035), 28% - ЭНД (р=0,0031), 20% - ЦА (нет достоверных отличий от нормы) и у 62% больных с диагнозом РЯ (р<0,0001).

Концентрации регуляторно-транспортного (МГ-ПЛ) и иммунного (МГ-^в) комплексов в норме и при патологии представлены на рис. 10. Наибольшая индивидуальная вариабельность результатов зафиксирована при РА (±0,634 и ±2,728 соответственно, при ±0,065 и ±0,043 у здоровых). В остальных случаях ±ш была сопоставимой, и колебалась в пределах 0,166 - 0,306.

В целом, при изучении содержания МГ-^О, достоверное повышение по сравнению с контрольными показателями было зафиксировано во всех группах больных, наиболее выраженное - при аутоиммунных и пролифера-тивных процессах - РЯ, СКВ, ЭНД, ЦА (во всех случаях р<0,0001 по сравнению со здоровыми), и менее значимое - при воспалительных заболеваниях бактериального генеза РеА и АДН (р=0,0139 и 0,0240 соответственно). Концентрации, превышающие 1,2 мкг/мл, выявлялись у 13% здоровых доноров, 88% больных РА, 40% больных РеА, 41% больных СКВ, в 50% случаев при АДН, 40% - при ЭНД. 69% - при РЯ и у 67% паилентов с ЦА.

□ М1-Ы1 0 МГ-ПЛ

Рис. 10. Сывороточные концентрации комплексов Л/Г-/¿'б- и МГ-ПЛ (мкг/мл) в норме и при патологии различного генеза и распространенности.

Содержание в крови МГ-ПЛ при изученных заболеваниях в принципе демонстрировало схожие с МГ-]^0 тенденции: статистически достоверное отличие от контроля зафиксировано во всех группах больных (РА, СКВ,

ЭНД, РЯ, ЦА - р<0,0001; РеА - р = 0,0077; АДН - р~0,0003), однако различия между уровнями ПЛ-МГ при РА и других заболеваниях были не столь значительными как в случае с М1 '-^О.

Концентрации ПЛ-МГ превышали уровень 1,25 мкг/мл у 16% здоровых доноров, 93% больных РА, 50% больных РеА, 78% больных СКВ, 40% пациентов с АДН, 100% больных РЯ и ЦА (в обоих случаях) и у 88% больных с диагнозом - ЭНД.

Таким образом, уровни циркулирующих иммунных и регуляторных комплексов МГ зависели как от типа патологического процесса, так и от степени его распространенности, злокачественности, темпов роста измененных тканей и многих других критериев не влияющих, зачастую, на общие уровни белков, составляющих комплекс.

Как и следовало ожидать, большинство изученных клинических показателей (уровни цитокинов, иммуноглобулинов, ЛФ, АТр, ГШ и альбумина) изменялось подобно классическим позитивным или негативным ре-актантам воспаления (табл. 1 и 2). Отличалась лишь степень выраженности изменений. Поэтому в дальнейшем описании мы сочли необходимым сосредоточиться на общих тенденциях, свойственных той или иной патологии, а также на взаимосвязях уровней изученных показателей с содержанием макроглобулинов и их циркулирующих комплексов.

Таблица 1

Уровни исследованных цитокинов (пкг/мл) в норме и при патологии

Диагноз ИЛ-8 11Л-6 шыр ФНО-а НФН-у 1

АДН X 25,97+3,68* X 4,51+1,27* 0,98+0,18*

ЭНД 31,86+8,65* 8,21+2,45* 1,84+0,29* 0,73+0.32* 1,48+0,58

РЯ 167,53+30,01* 54,49+16,26* 10,33+5,37* 12,81+7,81* 0,84+0,81

ЦА 7,74+1,32* 1,30+0,34 1,62+0,82* 0,13+0,05 1,08+0,66

РА 34,34+10,32* 36,83+5,49* 6,84+2,31* 8,43+2,82* 1,04+0,59*

СКВ 26,73+6,25* 18,04+3,40* 4,71+2,00* 0,88+0,14* 2,20+0,64

РеА X 23,45+4,90* 3,47+1,76* 1,54+0,32* X

Здоровые 2,51+1,09 2,47+0,43 0,23+0,04* 0,11+0,04* 0,02+0,02

Пояснения: звездочками отмечена достоверность различий по сравнению с контролем (р<0,05); «X» -уровни показателей не изучались при данной патологии.

Таблица 2

Уровни изученных острофазовыхреактантов в норме и при патологии

Диагноз ЛФ (м кг/мл) ПЛ (мг/л) Ат-Тр (г/л) 1§С (г/л) ИЛ-1р-антаг. (пкг/мл)

АДН 1,62+0,16* X 2,70+0,16 11,04+0,59* X

энд 0,74+0,10 76,14+28,05 2,27+0,18* 13,55+0,34* 618,15+164,44*

РЯ 1,63+0,21* 55,04+28,20* 2,20+0,23* 13,53+0,50 611,71+155,84*

ЦА 0,89+0,09 92,28+33,30 2,34+0,39 12,70+0,21 320,26+67,75*

РА 1,46+0,10* 73,63+26,32 2,58+0,09 15,20+0,52* 1495,99+265,38*

СКВ 0,95+0,10* 75,81+22,93 2,54+0,17 15,40+0,97* 960,87+308,06*

РеА 0,97+0,12* 82,91+9,74 2,50+0,38 15,55+1,03* X

Здоровые 0,78+0,04 74,37+13,25 2,85+0,12 12,53+0,27* 138,66+27,96

Пояснения: звездочками отмечена достоверность различий по сравнению с контролем (р<0,05); «X»-уровни показателей не изучались при данной патологии.

Нами показано, что, при РеА самые заметные изменения происходили с уровнями провоспалительных цитокинов ИЛ-6, ИЛ-1(3, ФНО-а (достоверное повышение по сравнению со здоровыми в среднем в 23, 15 и 14 раз соответственно). Содержание ^ и ЛФ тоже статистически значимо повышалось в 1,2-1,4 раза. Уровни ПЛ и АТр не отличались от контроля.

При АДН наиболее выраженным было повышение концентрации ИФН-у (в 49 раз), достоверно увеличено содержание ФНО-а и ИЛ-6 (в 41 и 11 раз соответственно), а также ЛФ и - в 2,1 и 1,5 раза соответственно. Концентрация была снижена на 12%, уровни и АТр статистически не отличались от нормы.

Несмотря на значительные различия в локализации процесса такие инфекционно-воспалительные заболевания как АДН и РеА имеют много общего. Большинство изученных показателей были сопоставимы по уровню. Коррелятивный анализ тоже выявил ряд моментов, характерных именно для них (позитивная взаимосвязь между ПЛ-МГ и (табл. 3-4) общими уровнями МГ и ^О, концентрациями ПЛ-МГ и ФНО-а). Установлена достоверная негативная корреляция уровней МГ и АБГ в норме, при РеА и АДН на фоне прямой при РА и СКВ, что вероятно, отражает функционирование последнего в качестве резервного ингибитора протеиназ только при отсутствии аутоиммунного процесса. Взаимосвязь между уровнями регуляторного и транспортного комплексов МГ позволяет предполо-

жить, что при данных заболеваниях значительная часть ПЛ-МГ и МГ-^в это по сути один мультикомплекс из поврежденного МГ-ПЛ (отличающегося повышенным сродством к ФНО-а) и аутоантител к нему.

Таблица 3

Коррелятивные взаимосвязи между сывороточными уровнями МГ и других изученных показателей в норме и при патологии различного генеза

и локализации

АДН РеА РЯ НА ЭНД СКВ РА Здоровые

МТ-ДО Й>*С<29 ; г=-0,463 р=0,022 Г-ОЖ р-0.053 | Г>™0,0.12 г=-0,358 р=0,027

ПЛ-МГ г= 0,873 р-0,023 г= 0.601 р=0,039 г= 0,600 р=0,030 С--0Д56 рт=0,<М7

АБГ г=-0,520 р=0,018 г=-0,664 р=0,050 г» 0.503 НУШ , м-Ч! }>—0,044 1^0,388 р=0,021

ИЛ-6 г=-0,732 р=0,010 г=-0,425 р=0,043 г^0,293 р=0.048

ФНО-а г-0,642 р=0,024 1--0 -ЮЛ р-0.050 р= 0,458 р=0.025

ИЛ-1Р X Г- О.Ш г=-0,407 р=0,050 X г=-0,288 р=0,050

ИЛ-1- ант. X X г=-0,617 р=0,043

ИЛ-8 X X г=-0,455 р-0,033 г=-0.664 р-0,019

ИФН-у X г=-0,681 13=0,044 г—0.443 р=0,050 г--0,689 р-О.СКЗ

ЛФ г=-0,406 р=0,019 г- 0.723 р-МО* г=-0,487 р=0,009 г=-0,264 р=0,039

АТр 1= 0,367 р=0,050 г= 0,905 р<0.001 г= 0,793 р=0,0 1 г= 0,540 р=0,007 г= 0,377 р=0,031 г= 0,258 р=0,041 ■ . Т ¡>-0,042

ПЛ X г=-0,488 р=0,029 г—0,256 р=0.047

г- 0,478 р=0,018 г= 0,590 р=0.026 1=0.687 р=0,050 Г--0Л8Х И-«« г= 0,304 р=0,013 г= 0,321 р=0,050

1ёА г-0,503 р=0,023 г=-0,471 р=0,031 г=-0,469 р=0,008 г=-0,459 р=0,028

Ш т= 0.566 р=0,009 г= 0,807 р=0,016 г= 0,498 р=0,016 ¡г=Л023 I—-О.40Э р?ЧЦК)5

Примечания: г - коэффициент корреляции, р - статистическая достоверность различий (р>0,05), маркером выделены коррелятивные взаимосвязи, отличающиеся по направленности от доминирующих в большинстве групп, Х- анализ не проводился.

В то же время общий уровень МГ и ЛФ при РеА и АДН значительно различался (р=0,011 и р=0,019 соответственно), хотя концентрации комплексов и АТр были примерно сопоставимы. Возможно, причина различий

кроется в степени «остроты» процесса, большей при АДН, либо все же имеет значение то, что РеА - забарьерный процесс и не все его «продукты» выбрасываются в общую циркуляцию.

Таблица 4

Коррелятивные взаимосвязи между сывороточными уровнями ПЛ-МГ и других изученных показателей в норме и при патологии различного генеза

и локализации

АДН РеА РЯ ЦА эвд СКВ РА Здоровые

МГ-1в<л г= 0,841 р=0,008 г= 0,573 р=0,041 г= 0,697 р<0,001 г= 0,609 р<0,001 т= 0,456 р=0,001

АБГ г= 0,422 р=0,045 вЩ г= 0.409 р=0,009

ИЛ-6 ■ - 594 Н},О50 г= 0,723 р=0,028 г- 0,574 р=0,004 г--о т

ФНО-а г- 0,788 р=0,020 г= 0,817 р=0,002 г= 0,635 р=0,048 1= 0,610 р=0,003

ИЛ-10 X 1= 0,696 р=0,001 ЩШИ! р-ож^ г= 0,691 р=0,013

ИЛ-1- ант. X X г-0,874 р=0,023 г-0,647 р=0,002 г= 0,593 р=0,050 г= 0,538 р=0,050

ИЛ-8 X X г= 0,806 р=0,016 г= 0,809 р=0,015

ИФН-у X г= 0,724 р=0,012 г= 0,596 р-0,041

ЛФ г^'-и.ббХ г= 0,487 р=0,005 г= 0,308 р=0,0П

АТр г= 0,675 р=0.023 г= 0,580 р=0,038 {: р~СШ2б г= 0,385 р=0,030

ПЛ X г- 0,706 р=0,050 х= 0,358 р=0,027 г= 0,751 р=0,031

ДО г= 0,431 р=0,045 1=0,395 р=0,041

ы г- 0,639 р=0,019 г= 0,393 р=0,003 1= 0,766 р=0,006

1ёМ г-0,470 р-0,032 0,694 _рИ),009

Примечания: см. табл. 3

Агрессивный и злокачественный РЯ, значительно отличался по выявленным изменениям как от сходных по локализации, но доброкачественных заболеваний, так и от системных аутоиммунных. Именно при данной патологии более чем при других заболеваниях снижен уровень не только МГ (в 1,3 раза), но и ГШ (в 0,7 раз). В два и более раз, по сравнению с любым другим заболеванием, увеличено содержание ФНО-а, ИЛ-8, ИЛ-1|3,

ИЛ-6 (при сравнении со здоровыми увеличение в 116, 67, 45 и 22 раза соответственно). При РЯ наиболее выражено повышение уровня АБГ по сравнению с другими заболеваниями (в 3,8 раза от контрольных значений). В 1,5-2 раза были увеличены концентрации ЛФ и ^А, при этом статистически неизменными оставались уровни ИФН-у, и М, на 18% снижено содержание АТр.

Мы предполагаем, что все выявленные изменения не только являются последствиями агрессивной пролиферации, но и создают идеальные условия для активного роста опухоли. Так, повышение уровня АБГ (который частично синтезируется самой опухолью), увеличивает транспортный потенциал в зоне инвазии, не говоря уже о его значительно больших, по сравнению МГ, способностях к иммуносуппрессии и стимуляции пролиферации опухолевой ткани. Значительно повышенные уровни ИЛ-6 и коррелирующее с ними увеличение содержания ИЛ-8, а также ИЛ-1Р (г=0,838, р=0,005 и г=0,860, р=0,001 соответственно), вполне способны прямо или косвенно стимулировать рост опухоли. Более того, известно, что избыток ИЛ-8 и ИЛ-1(3 провоцирует активную генерацию супероксид-радикалов, способных, во-первых, повредить большую часть находящегося в микроокружении опухоли МГ (что вероятно объясняет увеличение содержания неутили-зирующихся комплексов МГ-ПЛ на фоне истощения резервов МГ и ПЛ) и, во-вторых, усилить сродство МГ к ФНО-а (что выражается в выявленном нами при РЯ накоплении ФНО-а в циркуляции и достоверной позитивной корреляции уровней этих белков (габл.З)). При этом усиление синтеза АБГ, менее подверженного повреждающему воздействию супероксидных радикалов, позволяет опухоли в необходимых объемах получать факторы роста и другие вещества, транспортируемые при помощи АБГ к клеткам (примечательно, что только при РЯ уровни АБГ позитивно коррелировали и с ИЛ-6 (табл.6)), но избегать цитоксических эффектов благодаря тому, что поврежденный МГ теряет способность к взаимодействию с рецепторами. Кроме того, вполне возможно, что выявленные нами низкие уровни МГ являются не последствием данного заболевания, а врожденной недостаточностью синтеза, что может быть одной из причин возникновения РЯ.

Таблица 5

Коррелятивные взаимосвязи между сывороточными уровнями М1'-1«С и других изученных показателей в норме и при патологии различного генеза

и локализации

АДН РеА РЯ ЦА Э11Д СКВ РА Здоровые

АБГ 1-0,810 р=0,008 Г--ОД86 {НШЙ г= 0.354 р=0.032

ИЛ-6 г= 0.591 р-0,034 г= 0,425 р=0,030 г= 0.477 р=0,039

ФНО-а

ИЛ-10 X г— 0,850 р-0,001 г= 0,445 р-0,026

ИЛ-1-ант. X X г= 0,470 р=0,027 г— 0,654 р=0,029 г= 0,613 р=0.034

ИЛ-8 X X г= 0,815 р=0,026 г" 0,530 р=0.03 9

ИФН-у X г- 0,964 р=0,001

ЛФ 1= 0,742 р=0,022 I- 0.394 Р-0СН4 г= 0,279 _£=0Д22

А'Гр р= 0,648 р=0.017

пд X Р-Ш2 НЙ г=-0,718 р=0,030

г= 0,392 р=Ю.048 1= 0,400 р=0.029

1§А г= 0.682 р-0,010 г-0,831 р~0,041 0,444 р=0,044 г= 0,396 р=0,007

1ВМ г=-0,376 р=0,048 п=-0,588 р=0,044

Примечания: см. табл. 3

По сравнению с РЯ, при доброкачественной ЦА развитие заболевания не оказывает значительного влияния на уровни большинства изученных показателей в циркуляции. Выявлено достоверное повышение сывороточного содержания ИЛ-10 и ИЛ-8 (в 7 и 3 раза соответственно), снижение уровней ^А на 45%. В принципе, одной из причин может быть определенная локализованность процесса, которая, вкупе с доброкачественностью изменений и относительно медленным ростом просто не вызывает сколько-нибудь заметной системной реакции организма на свое развитие. Однако обращает на себя внимание, что ЦА - это единственное из изученных нами заболевание, при котором обнаружен сниженный уровень 1§А, а среди всех цитокинов наиболее заметно повышена концентрация ИЛ-1 р, синтез кото-

poro довольно часто активируется именно бактериальными либо вирусными агентами. В данном контексте интересен и ряд выявленных коррелятивных взаимосвязей - позитивная корреляция МГ с уровнями АТр (табл.3); IgA - с ИЛ-8 (r=0,786, р=0,021) и АТр (г=0,757, р=0,049); негативная зависимость IgM от концентрации ЛФ (г= -0,739, р=0,036) и позитивная - от содержания ГШ (г=0,835, р=0,020). Все перечисленное позволяет предположить, что одна из причин возникновения данной патологии - бактериальная инфекция на фоне врожденного либо функционального дефекта иммунной системы слизистых оболочек. Известно, что ЛФ, АТр и IgA являются первыми и основными барьерами на пути подобных патогенов и играют ведущие роли в региональном иммунном ответе. Однако при ЦА уровень IgA снижен (отличие от нормы с р=0,0251), и чем больше - тем ниже коррелирующие с ним уровни АТр и ИЛ-8, стимулирующего синтез ЛФ. Обобщая эти факты, можно предположить, что, хотя ЦА, согласно общепринятому мнению, также является последствием недостаточности или врожденного генетического дефекта иммунной системы, как и РЯ (причем не последнюю роль в этом играет, вероятно, врожденный, а не приобретенный дефицит МГ), пусковые механизмы этих двух заболеваний различны. При РЯ имеет место полное злокачественное перерождение клеток, формирующих в определенной мере автономное, активно воздействующее на организм и паразитирующее на нем новообразование. При ЦА, вполне вероятно, причиной развития пролиферации может стать метаболический срыв вследствие неадекватного регионального иммунного ответа на бактериальную инвазию или и вовсе повреждение генома клеток вирусными агентами, которые в норме просто элиминируются иммунной системой слизистых оболочек. Не исключено, что врожденный дефицит МГ и в этом случае может играть решающую роль, так как данный белок отвечает, помимо прочего, и за «маркирование» чужеродных патогенов.

Наши исследования убедительно продемонстрировали, что ЭНД (который все чаще рассматривается как аутоиммунная патология) по направленности и выраженности изменений изученных показателей имеет много общего с СКВ - классическим аутоиммунным заболеванием. Большинство показателей были удивительно сходными по уровню, за исключением концентраций ИЛ-6, IgA и М, которые были выше при СКВ, отличающемся большей «системностью» (при сравнении их уровней при ЭНД и СКВ р=0,0266; <0,0001; =0,0158 соответственно). В целом, при ЭНД были дос-

товерно повышены уровни ИЛ-8, ИЛ-10, ФНО-а, ИЛ-1|3-РА, ИЛ-6 в 13, 8, 7, 4 и 3 раза соответственно. Содержание увеличено на 10%, АТр -снижено на 15%, уровни ИФН-у, 1§А, 1§М, ПЛ и ЛФ достоверно не отличались от показателей, характерных для контрольной группы. При СКВ были увеличены концентрации ИФН-у, ИЛ-1р, ИЛ-8, ФНО-а, ИЛ-6 и ИЛ-1Р-РА в 110, 20, 11, 8, 7 и 7 раз соответственно. Содержание трех основных классов увеличено в 1,3-1,6 раза, уровни ЛФ, ПЛ и АТр достоверно не отличались от контрольной группы.

Таблица 6

Коррелятивные взаимосвязи между сывороточными уровнями АЬГ и других изученных показателей в норме и при патологии различного генеза

и локализации

а да РеА РЯ ЦА ЭНД СКВ РА Здоровые

ИЛ-6 г= 0,691 Г-МХ325

ФНО-а г=-0,564 р=0,018 р-иуШ

ИЛ-1Р X т= 0,476 р=0,030 г=0,391 р=0.()09 7= 0,727 р=0.001

ИЛ-1- ант X X г~ 0,730 р=0,050 г= 0.821 р=0.046 г- 0.501 р=0,025

ИЛ-8 X X г= 0,652 р=0,041 7= 0,800 р=0,006

ИФН-у X 0,697 р=0,050 г= 0,534 р=0,007 7- 0,545 р=0.036

ЛФ р= 0,808 р-0,015 г= 0,659 р=0.020 Г-СШ2 г= 0,341 р=0,036

АТр 7—0,736 р—0,01 1^-0,348 р=0,041

ПЛ X г-0,415 р=0.044 рЧХ-001

1§С г— 0,959 р~0,001 г= 0,472 р=0,048 г=0,327 р-0,009

1ВА г= 0,709 р=0,022 г= 0,790 р=0.004

1ёМ 7=0,319 р=0,025

Примечания: см. табл. 3

Многие коррелятивные взаимосвязи были характерны только для этих двух заболеваний. В частности только при СКВ и ЭНД выявлена негативная корреляция между содержанием МГ и ИЛ-8, позитивная - между МГ-ПЛ и ^С(табл.З-5), ИЛ-6 и ПЛ (г=0,463, р=0,046 и г-0,469, р-0,021) ИЛ-1Р-РА и

^М (г=0,659 р—0,038 и г-0,506, р=0,027), ИЛ-8 и ^М (г-0,582, р-0,023 и г=0,473, р-0,035). Обращает на себя внимание, что именно при СКВ и ЭНД наблюдались наиболее высокие средние уровни ИФН-у. При этом, уровень транспортных комплексов ПЛ-МГ при обоих заболеваниях превышал содержание комплексов МГ-^С, значительная часть которых состоит именно из аутоантител к МГ. Полученные результаты позволяют предполагать, что в целом МГ не является иммуногенным фактором и не играет существенной роли ни в патогенезе СКВ, ни в развитии ЭНД, хотя только при данных заболеваниях, чем выше был уровень общего ^О, тем ниже негативно коррелирующее с ним содержание МГ. В определенной степени это можно отнести и к уровню АБГ - структурного и функционального аналога МГ. Однако при СКВ и ЭНД его содержание повышено (хотя и не так сильно, как при РЯ и РА), что, видимо, и позволяет данному белку умеренно стимулировать пролиферативные процессы, сопутствующие данным заболеваниям.

Наиболее штересные результаты, по нашему мнению, получены при изучении РА. При данном заболевании зафиксировано снижение уровней МГ, на фоне значительного увеличения содержания АБГ. При этом уровни регуляторно-транспортного комплекса ПЛ-МГ и иммунного комплекса МГ-превышали нормативные показатели в среднем у 90% больных, в 6 раз в случае ПЛ-МГ ив 16 раз в случае МГ-^в (на фоне не более чем 3-кратного увеличения при всех других заболеваниях). Необходимо отметить, что повышение уровней всех изученных цитокинов было значительно менее выраженным, чем, к примеру, при РЯ, уровни 1« - сопоставимы с их содержанием при аутоиммунной СКВ и бактериальном РеА, концентрации острофазового ЛФ ниже, чем при РЯ и АДН, а уровни других острофазовых белков были также сопоставимы с другими изученными заболеваниями. В целом, концентрации ФНО-а, ИЛ-1р, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-ф-РА были повышены в 77, 30, 15, 14, 11 раз соответственно. Содержание ^ и ЛФ повышалось в среднем в 1,21,9 раза. Концентрации ИФН-у, АТр и ПЛ достоверно не изменялись.

При этом, нами показано, что чем ниже уровень МГ, тем выше концентрации ФНО-а и (табл.3). Только при РА и СКВ уровни МГ и АБГ демонстрировали прямую взаимосвязь - у здоровых, при РеА и АДН она была обратной (табл. 3).

Выявлена негативная коррелятивная взаимосвязь между содержанием ПЛ-МГ и концентрациями АБГ (табл.4), ИЛ-1Р при том, что в норме она позитивная. С ИФНу связь прямая, что может быть связано с блокадой рецепторов МГ.

Все вышеперечисленное может свидетельствовать о срыве утилизации, регуляции и, как следствие, об отсутствии адекватного ответа на воспаление, а также об истощении способностей организма к синтезу МГ при тяжелых формах РА.

Примерно те же тенденции демонстрировали коррелятивные взаимосвязи уровня комплексов МГ-1§0 с другими показателями при РА - повышение в десятки раз, позитивно коррелирующее с содержанием ЛФ и ПЛ (табл.5) чего не наблюдается ни в норме ни при РеА. При этом сопутствующее высоким уровням комплекса относительное увеличение концентрации ПЛ свидетельствует, скорее всего, об активном разрушении тканей, а ЛФ - о росте окислительного потенциала крови, который сам по себе может быть допол-пигельным повреждающим агентом при особо тяжелых формах РА. Необходимо отметить, что способный стимулировать репарацию тканей ИЛ-6 коррелирует с МГ-1§С в норме (табл,5), при СКВ, РеА, но не при РА. Только при РА оба типа комплексов МГ негативно коррелируют с АБГ (табл.45) , что может свидетельствовать о том, что недостаток резервных ингибиторов на фоне повреждения основного (МГ) является критическим.

Выявленные нами закономерности позволяют предполагать, что патогенез РА идет не от локального механического повреждения к системному, а наоборот - от острого неспецифического воспаления к забарьерному процессу, и ключевым фактором является критическое повреждение молекул регуляторного белка - МГ. По нашему мнению механизм развития данной патологии реализуется следующим образом: при остром воспалении любой локализации происходит «закисление» биожидкостей, особенно в его очаге, за счет синтеза активированными фагоцитами большого количества оксидантов НОС1 и хлораминового типа (которые высвобождают синглентный кислород) и синтеза ЛФ нейтрофилами. Известно, что данное «закисление» оказывает крайне негативное влияние на МГ - резко снижается его способность транспортировать белки и сродство к рецепторам, кроме того он может «терять» связанные ранее протеиназы (\Уи Б.М., е1 а1. 1998, БйеГ ТДУ., й а1. 2000). Повреждение подобного универсального белка может иметь два серьезных последствия. Во-первых, нарушается механизм межклеточных взаимодействий, основанный на своевременной передаче

сигналов и регуляторных соединений от клетки к клетке, а также изменяется контроль за синтезом ряда соединений по типу обратной связи. Во-вторых, окисленная молекула МГ имеет неправильное конформационное строение и может быть расценена как частично чужеродная клетками иммунной системы, с последующим синтезом аутоАТ не только к МГ, но и к транспортируемым лигандам.

Очевидно, что описанный процесс чаще всего не является ни локальным, ни специфическим - и поврежденный МГ и аутоАТ могут разноситься током крови из очага воспаления по всему организму, причем большая часть поврежденного МГ своевременно выводится из циркуляции печенью, а особо дефектные формы маркируются аутоАТ и удаляются клетками иммунной системы. Параллельно активируется синтез белков дублеров МГ, в первую очередь АБГ. Однако при РА часто наблюдаются врожденные дефекты генов белков транспортеров и Т-клеточного звена иммунной системы (Gutierrez-Roelens I., Lauwerys B.R. 2008). Кроме того, своевременная элиминация дефектных форм неизбежно замедляется в забарьерных органах и тканях. При этом именно суставные жидкость и ткани (вследствие слабой циркуляции жидкости на фоне достаточно большого количества различных регуляторных белков и клеток, способных их синтезировать) наиболее уязвимы с точки зрения повреждения МГ и последствий этого повреждения.

Ранее установлено, что при РА в синовиальной жидкости наблюдается высокая концентрация окисленного МГ (Tchetverikov I., et al. 2004). Более того, в условиях закрытого межсуставного пространства, комплексы МГ с про-теиназами, равно как и освободившиеся из комплекса с окисленным МГ про-теиназы, способны осаждаться на ткани сустава и активно их разрушать (Moore A.R., et al. 1999). Если допустить, что именно МГ является основным иммуногенным фактором при РА, то становится понятным, почему данная патология локализуется именно в суставах и протекает циклами - в то время как окисленный МГ своевременно выводится из циркуляции при воспалении, в суставной жидкости он задерживается и накапливается. При этом про-теиназы в составе его комплекса активно разрушают ткани сустава, а аутоан-титела формируются сначала на сам окисленный МГ, затем, вероятно, и на его лиганды, накапливающиеся в составе подобного дефектного комплекса, а затем и на «обнажившиеся» после опосредованного протеиназами лизиса тканей антигены. Все вышеперечисленное неизбежно должно приводить к

повторному пику воспаления, но не системного, а уже локализованного в суставах и к дальнейшему повреждению МГ суставной жидкости, провоцирующему циклическую прогрессию заболевания.

Безусловно, вышеописанная теория нуждается в дополнительных подтверждениях, однако даже на этом этапе она хорошо объясняет целый ряд общеизвестных проявлений РА. Например, наличие целого ряда ауто-АТ у различных индивидуумов (их спектр, вероятно, определяется теми веществами, с которыми взаимодействовал МГ на момент развития процесса), контингент заболевающих - либо дети (ювенильный РА), либо женщины в возрасте 40-50 лет (группы, отличающиеся нестабильным уровнем эстрогенов, контролирующих синтез макроглобулинов), вторичное системное поражение других органов и тканей при тяжелых формах РА, сложности в лечении заболевания (повреждение основных транспортеров регуляторных веществ - макроглобулинов, да еще в забарьерной системе зачастую сводит на нет все попытки лекарственной терапии) и тот факт, что, несмотря на большое количество микротравм суставов, РА развивается только в небольшом проценте случаев.

Таким образом, проведенные нами исследования продемонстрировали, что белки семейства обладают еще более широким спектром воздействий на клетки, чем предполагалось ранее. Прежде всего, это многообразие обеспечивается за счет наличия различных способов связывания лигандов, конкурентного взаимодействия с АБГ и другими аналогами за лиганды, а также за счет формирования больших мультикомплексов сразу с несколькими лигандами, каждый из которых обладает своими регуляторными характеристиками.

При этом механизм взаимодействия с рецептором прост и универсален -потеря свойств к флотации сначала «осаждает» макроглобулин с регуляторными субстанциями именно там, где это необходимо, поскольку именно в зоне активного разрушения или наоборот роста и наблюдается наибольшая концентрация протеиназ, способных трансформировать и таким образом «посадить» МГ на клетку-мишень. Затем происходит повторная нейтрализация с последующим «механическим» погружением рецептора со связавшимся МГ в клетку, без каких-либо дополнительных энергозатрат.

Учитывая универсальность механизма, в развитии различных заболеваний ведущую роль играет резерв самих макроглобулинов, либо конкретный состав и концентрация транспортируемых ими лигандов. Так, в случае

РЯ и ЦА пусковым механизмом, вполне вероятно, является врожденный дефицит МГ, а при РА - одновременно врожденный дефект иммунной системы, дефицит МГ, эстрогенов и присоединившееся воспаление, являющееся пусковым механизмом процесса. Любопытно, что при СКВ и ЭНД, МГ не оказывает значительного влияния на патогенез заболевания, а АБГ напротив, если и не является одним из пусковых механизмов, то, по крайней мере, способен в значительной степени стимулировать сопутствующую этим заболеваниям пролиферацию тканей. Все вышеперечисленное позволяет утверждать, что макроглобулины являются универсальными регуляторами межклеточных взаимодействий в норме и при патологии, а также важной составляющей врожденного гуморального иммунитета.

ВЫВОДЫ

1. Макроглобулины присоединяют ряд лигандов, включая протеи-назы, иммуноглобулины, цитокины, липопротеины, циркулирующий рецептор эндоцитоза (ЛРП) и альбумин. Кроме того, они могут формировать сложные многокомпонентные комплексы из нескольких транспортируемых лигандов, конкурентов за лиганды и ЛРП.

2. Белки семейства макроглобулинов (альфа-2-макроглобулин - МГ, ассоциированный с беременностью альфа-2-гликопротеин - АБГ) конкурируют друг с другом за связывание с протеиназами. При этом преимущество в конкурентных взаимодействиях зависит как от свойств макроглобулина, первым связавшего протеиназу, так и от свойств самого фермента.

3. МГ способен дозозависимо связываться с противоуглеводными антителами (ПУАТ), направленными преимущественно против маннозных и галактозных остатков, а также со специфическими аутоантителами, которые обнаруживаются в крови, как здоровых доноров, так и больных. ПУАТ и аутоантитела могут конкурировать за связывание с МГ или синергично взаимодействовать с ним в зависимости от того, к какому классу иммуноглобулинов (в, А, М) они принадлежат.

4. При связывании нативного МГ сначала с протеиназой, а затем с ЛРП происходит поэтапная нейтрализация заряда комплекса до значений, соответствующих рН внутренних сред организма, вне зависимости от исход-

ных И компонентов, формирующих его. Параллельно происходит уплотнение конформации комплекса, которое проявляется увеличением электрофо-ретической подвижности по сравнению с нативным МГ.

5. При раке яичников (РЯ) наблюдается дефицит МГ на фоне достоверного повышения уровней АБГ, иммунного комплекса МГ-^в, регу-ляторно-транспортного комплекса МГ-ПЛ, а также снижения уровней ПЛ и АТр. Одновременно в 45-116 раз увеличиваются уровни провоспалитель-ных цитокинов ФНО-а, №1-1(3, ИЛ-8 и в 20 раз - иммунорегуляторного и стимулирующего пролиферацию ИЛ-б. Изменение этих параметров и выявленные коррелятивные взаимосвязи могут свидетельствовать как о массированном повреждении тканей и значительном искажении синтеза регу-ляторных цитокинов, так и о том, что дефицит МГ, его окисление и задержка комплексов в циркуляции на фоне активного синтеза АБГ играют значительную роль в патогенезе РЯ.

6. Доброкачественная пролиферация при цистоаденоме (ЦА) сопровождается снижением уровней МГ и 1цА, а также увеличением содержания комплексов \ir-IgG и ГО1-МГ. При этом выявляется 3-7-кратное возрастание уровней провоспашггельных цитокинов. Можно предположить, что комбинированный дефицит МГ и 1^А, играет определенную роль в патогенезе ЦА.

7. Наружный эндометриоз яичников (ЭНД) сопровождается отсутствием изменений в содержании МГ, ЛФ, 1оА и IgM, достоверным повышением уровней АБГ, МГ-1§0 и ПЛ-МГ и снижением АТр. Одновременно в 13 раз повышается концентрация ИЛ-8 и, в меньшей степени, ФНО-а, ИЛ-1р. Обнаруженные изменения и взаимосвязи свидетельствует о том, что МГ и его пассивно накапливающиеся комплексы не имеют существенного значения в патогенезе ЭНД, тогда как повышенные уровни АБГ могут способствовать прогрессии данного заболевания.

8. При системной красной волчанке (СКВ) наблюдаются аналогичные ЭНД изменения оцениваемых параметров, что может свидетельствовать о сходных патогенетических механизмах при развитии данных заболеваний. Отличительной чертой СКВ является увеличение уровней иммуноглобулинов, более выраженное повышение содержания ИФН-у и неизмененный уровень АТр. Отсутствие выраженных изменений в содержании МГ, несмотря на задержку его комплексов в циркуляции, свидетельствует о том, что данный белок не задействован напрямую в патогенезе и не является иммуногенным фактором при СКВ.

9. Хронический аднексит бактериального генеза в стадии обострения (АДН) сопровождается отсутствием изменений в уровне МГ, повышением содержания его комплексов (менее значимым по сравнению с другими заболеваниями), а также АБГ, ЛФ, провоспалительных цитокинов и им-мунорегуляторного ИФН-у. Большинство изученных показателей ведут себя как типичные реактанты воспаления, без истощения резервов МГ, но при наличии адекватной активации синтеза его дублера (АБГ).

10. Развитие реактивного артрита (РеА) характеризуется достоверным снижением уровней МГ, на фоне повышения содержания обоих его комплексов, АБГ и иммуноглобулинов, особенно Данные изменения сопровождаются 10-20-кратным увеличением концентрации провоспалительных цитокинов. Это может свидетельствовать о том, что при РеА наблюдается частичное истощение резерва МГ, не наблюдаемое при АДН, не компенсируемое своевременной активацией синтеза АБГ.

11. Ревматоидный артрит (РА) отличается сниженным уровнем МГ и многократным увеличением содержания его комплексов МГ-ГШ (в 6 раз) и МГ-1§0 (в 16 раз). Параллельно наблюдается значительное повышение концентраций АБГ, иммуноглобулинов, ЛФ и провоспалительных цитокинов (последние увеличены в 14-76 раз) при неизменном уровне АТр. Подобные изменения и выявленные коррелятивные взаимосвязи позволяют предположить, что МГ является иммуногенным фактором при возникновении РА, и что его комплексы играют значительную роль в дальнейшей прогрессии РА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные новые данные по свойствам белков семейства макроглобулинов и особенностям их взаимодействия с рецептором эндоцитоза, а также с цитокинами и другими лигандами, рекомендуется использовать в качестве лекционного материала для студентов медицинских и биологических специальностей.

Разработанный метод определения циркулирующих в крови комплексов МГ-1«(} и МГ-ПЛ может быть использован в качестве основы для разработки новых тест-систем позволяющих определять уровни других специфических комплексов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зорин H.A., Зорина P.M., Зорина В.Н. Получение препаратов а-макро-глобулина с заданными свойствами // Гематология и трансфузиология. -2000. - №5. - С.20-21.

2. Зорина В.Н., Зорина P.M., Зорин H.A., Левченко В.Г., Горлина Н.К., Архипова С.В Антиген-специфический способ определения иммунных комплексов белков семейства макроглобулинов с иммуноглобулином класса G в биологических жидкостях. // Патент РФ №2209435, зарегистрирован 27.08.03.

3. Зорин H.A., Зорина В.Н. Роль белков семейства макроглобулинов в механизмах инфицирования. // ЖМЭИ. - 2004. - №3. - С.105-112.

4. Трофименко H.A., Зорина В.Н., Архипова C.B., Горбатовский Я.А., Зорина P.M. Особенности воспалительной реакции при коллагенозах // Бюллетень сибирской медицины. - 2004. - №4. - С.21-25.

5. Зорин H.A., Зорина В.Н., Зорина P.M. Роль альфа-2-макроглобу-лина при онкологических заболеваниях. // Вопросы онкологии. - 2004. -Т.50. — №5. - С.515-519.

6. Зорин H.A., Зорина В.Н., Зорина P.M. Универсальный модулятор цитокинов а2-макроглобулин. // Иммунология - 2004. - Т.25. - №5. -С.302-304.

7. Трофименко H.A., Зорина В.Н., Архипова C.B., Зорина P.M. Про-воспалительные цитокины и альфа-2-макроглобулин при коллагенозах. // Материалы Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты». - Новосибирск, 5-7 октября 2004. - С.75-76.

8. Зорин H.A., Зорина В.Н., Зорина P.M., Левченко В.Г. Универсальный регулятор - а2-макроглобулин. // Клиническая и лабораторная диагностика. - 2004. -№11. - С. 18-22.

9. Трофименко H.A., Зорина В.Н., Сырнева Л.Г., Челпанова Л.И., Зорина P.M. Новые лабораторные методы в оценке степени активности ревматоидного артрита. // «Социально-значимые болезни». Сборник материалов научно-практической конференции. - Кемерово, 2004. - С.8-9.

10. Баженова Л.Г., Зорина В.Н., Промзелева Н.В., Покачалова М.В., Зорин H.A. Концентрация альфа-2-макроглобулина, иммуноглобулина G и их комплексов в крови, кистозном содержимом и перитонеалыюй жидкости при опухолях яичников у женщин. // Российский вестник акушера-гинеколога - 2005. - №3. - С.10-13.

11. Баженова Л.Г., Зорина В.Н., Покачалова М.В., Белов В.Н., Грачева Л.М., Головкина И.В., Промзелева Н.В., Роткина И.Е. Белки семейства мак-роглобулшюв (МГ, АБГ), иммуноглобулш1 G и комплексы МГ-IgG в крови больных с опухолями и опухолевидными образованиями яичников. // Российский вестник акушера-гинеколога - 2005. - №4. - С.11-15.

12. Зорин H.A., Зорина В.Н., Зорина P.M. Участие белков семейства макроглобулинов в регуляции кроветворения. // Гематология и трансфу-зиология - 2005. - №4. - С.32-37.

13. Зорина В.Н., Предеина Е.М., Левченко В.Г., Зорина P.M. Макроглобулины и гормональный фон в крови женщин репродуктивного и пре-менопаузального периода. // Сборник материалов Всероссийской конференции молодых исследователей «Физиология и медицина». - С-Петербург, 14-16 апреля 2005 (Вестник молодых ученых. Приложение к серии Науки о жизни). - С.44.

14. Zorina V.N., Trofimenko N.A. Zorina R.M. Alpha-2-macroglobulin and its complexes with IgG in serum at autoimmune diseases. // Abstracts of the Congress «Immune-mediated diseases. From theory to therapy» in journal «Allergology and immunology in pediatrics». - Moscow, 3-8 Oct. 2005. - P.80,211.

15. Зорин H.A., Зорина B.H., Зорина P.M., Трофименко H.A., Горба-товский Я.А. Молекулярные механизмы иммунопатогенеза и терапии при ревматоидном артрите. // Терапевтический архив - 2005. - №12. - Т.77. -С.88-91.

16. Зорина В.Н., Трофименко H.A., Архипова C.B., Зорина P.M., Зорин H.A. Комплексы альфа-2-макроглобулина с антителами класса G, плазмином и их взаимосвязь с другими факторами гуморального иммунитета при развитии ревматоидного артрита. // Медицинская иммунология -2005. - Т.7. -№5-6. - С.557-562.

17. Зорин H.A., Зорина В.Н., Зорина P.M. Роль белков семейства макроглобулинов в регуляции опухолевого роста. // Онтогенез. - 2006. - Т.37. — №1. - С.12-19.

18. Зорина В.Н., Трофименко H.A., Архипова C.B., Зорин H.A., Зорина P.M. Альфа-2-макроглобулин, его комплексы с IgG и некоторые факторы гуморального иммунитета при ревматоидном артрите. // Научно-практическая ревматология. - 2006. - №1. - С.22-27.

19. Зорин H.A., Зорина В.Н., Зорина P.M. Роль белков семейства макроглобулинов в регуляции воспалительных реакций. // Биомедицинская химия,- 2006. - №3. - С.229-238.

20. Зорин H.A., Архипова C.B., Зорина В.Н. Роль белков семейства макроглобулинов при сепсисе. // Клиническая медицина. - 2006. - № 1. - С.17-21.

21. Зорин H.A., Зорина В.Н., Зорина P.M. Эволюция белков семейства макроглобулинов. // ЖЭБФ. - 2006. - Т.42. - №1. - С.91-94.

22. Баженова Л.Г., Зорина В.Н., Промзелева Н.В. Зорин H.A. Способ выбора доступа оперативного вмешательства при опухолях яичников. // Патент № 2283499, зарегистрирован 10.09.06.

23. Зорина В.Н., Зорин H.A., Лыкова О.Ф., Конышева Т.В., Зорина P.M. Лиганды а2-макроглобулина и механизмы их биотранспорта. // Биомедицинская химия. - 2007. - Т.53. - №2. - С.164-172.

24. Зорина В.Н., Шрамко C.B., Зорина P.M., Краюшкина H.A., Чири-кова Т.С. Некоторые аспекты изменений гуморального иммунитета, уровней классических белков острой фазы и полифункциональных белков семейства макроглобулинов при различных вариантах воспалительных процессов придатков матки. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинато-логии. - 2007. - Т.6. - №3. - С.32-36.

25. Zorina V.N., Zorin N.A., Lykova O.F., Konysheva T.V., Zorina R.M. Alpha-2macroglobulin ligands and mechanisms of their biotransport. // Biochemistry (Moskow) Supplement Series B: Biomedical chemistry - 2007. -Vol.1.-№3.-P.216-219.

26. Шрамко C.B, Зорина B.H., Баженова Л.Г., Архипова C.B., Бело-горлова Т.И Чирикова Т.С. Способ диагностики гнойно-некротической деструкции тканей и распространенности процесса при воспалительных заболеваниях придатков матки. // Патент РФ № 2295134, зарегистрирован 10.03.07.

27. Зорина В.Н., Маркина Л.А., Архипова C.B., Зорина P.M., Зорин H.A., Рябичева Т.Г. Уровни цитокинов, альфа-2-макроглобулина и его активной транспортной формы у женщин с бесплодием трубного генеза при экстракорпоральном оплодотворении. // Медицинская иммунология. - 2007. -№4-5. - С.389-397.

28. Зорина В.Н., Предеина Е.М., Зорина P.M., Левченко В.Г., Баженова Л.Г., Зорин H.A. Уровень ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина и гормональный фон при разных типах заместительной гормональной терапии. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2007. -№7. — С.24-27.

29. Шрамко С.В, Зорина В.Н., Баженова Л.Г., Архипова C.B., Зорина P.M., Панченко В.А., Краюшкина H.A. Способ выбора метода лечения и оперативного доступа при гнойных воспалительных заболеваниях придатков матки. // Патент РФ № 2303263, зарегистрирован 20.07.07.

30. Трофименко H.A., Зорина В.Н., Зорина P.M., Горбатовский Я.А. Коэффициент лакгоферрин х антитромбин-3 при дифференциальной диагностике ревматоидного артрита. // Материалы II Национального конгресса терапевтов «Новый курс: консолидация усилий по охране здоровья нации». -Москва, 7-9 ноября 2007. -С.214-215.

31. Зорина В.Н., Трофименко H.A., Горбатовский Я.А., Зорина P.M., Белогорлова ТИ, Панченко В.А. Способ дифференциальной диагностики ревматоидного артрита. // Патент РФ № 2313096, зарегистрирован 20.12.07.

32. Маркина Л.Л., Зорина В.Н., Шрамко C.B., Зорина P.M., Архи-пова C.B., Баженова Л.Г. Содержание реактантов воспаления в сыворотке крови женщин при воспалительных заболеваниях придатков матки и участвующих в програм ме экстракорпорального оплодотворения. // Клиническая лабораторная диагностика. - 2008. -№2. - С.15-17.

33. Зорина В.Н., Зорина P.M., Трофименко H.A., Чирикова Т.С., Ар-хипова C.B., Зорин H.A. Некоторые белки острой фазы воспаления в дифференциальной диагностике ревматоидного артрита. // Клиническая медицина. - 2008. - №6. - С.58-61.

34. Зорина В.Н., Зорин H.A., Архипова C.B., Конышева Т.В., Трофименко H.A., Шрамко C.B. Взаимодействие a-2-макроглобулина с некоторыми цитокинами и рецептором эндоцитоза: возможный механизм связывания, транспорта и доставки в клетку в норме и при воспалении. // Молекулярная медицина. - 2009. - №1. - С.30-35.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБГ - ассоциированный с беременностью альфа-2-гликопротеин

АДН - аднексит

АТ - антитела

АТр - альфа-1-антитрипсин

ЗФР - забуференный физиологический раствор

ИЛ - интерлейкин

ИФА - твердофазный иммуноферментный анализ ИФН-у - интерферон-гамма

ЛРП - низкоплотностный липопротеин рецептор-ассоциированный

протеин или основной рецегггор эндоцитоза

ЛФ - лактоферрин

МГ - альфа-2-макроглобулин

ПЛ - плазмин

РА - ревматоидный артрит

РеА - реактивный артрит

РЯ - рак яичника

СКВ - системная красная волчанка ФПО-а - фактор некроза опухоли-альфа

ЦА - цистаденома

ЭНД - эндометриоз

Ав - антисыворотка

^ - иммуноглобулины

Р1 - изоэлектрическая точка

Подписано в печать 25.05.2009 г. Гарнитура Тайме. Бумага ксероксная. Печать на ризографе К/,-300 ЕР. Тираж 100. Заказ №1284.

Отпечатано в типографии ГОУ ДПО «Новокузнецкий государственный институт усовершенствования врачей Министерства здравоохранения и социального развития РФ». 654005, г. Новокузнецк, пр. Строителей, 5.

Белки семейства макроглобулинов представляют собой группу высокомолекулярных гликопротеинов с уникальным «ловушечным» центром, позволяющим данным белкам ковалентно связывать и транспортировать практически все известные протеиназы, сохраняя при этом их ли-тическую активность [37, 176]. Однако помимо ковалентных взаимодействий, позволяющих выводить избыток протеиназ из циркуляции, макроглобулины способны образовывать и довольно прочные гидрофобные связи [182], а также слабые хелатные и водородные с рядом других ли-гандов. Полиспецифичность, и способность связывать схожие лиганды посредством различных взаимодействий, позволяют макроглобулинам участвовать в самых разнообразных реакциях организма на внешние и внутренние воздействия. Так, макроглобулины играют значительную роль, как в гуморальном, так и в клеточном иммунном ответе. Они являются транспортерами регуляторных цитокинов к клеткам, маркируют бактериальные патогены, участвуют в процессинге и презентации антигенов, в передаче сигнала к клетке и в запуске каскада внутриклеточных реакций, влияют на антителогенез [37, 41, 70, 78, 154, 194]. Кроме того, макроглобулины, в зависимости от конформационного состояния, модулируют деление и апоптоз клеток, процессы свертывания крови, ремоде-лирования тканей [35, 100, 188]. В числе прочих факторов, позволяющих белкам семейства реализовывать свои регуляторные воздействия, ведущую роль играет количество и распространенность их рецепторов на клетках. Макроглобулины имеют наибольший аффинитет к основному рецептору эндоцитоза (ЛРП) и сигнальным рецепторам, присутствующим практически повсеместно [37]. Широкая распространенность рецепторов, равно как и клеток способных синтезировать макроглобулины, позволяет последним принимать активное участие в развитии воспалительных, аутоиммунных и онкопролиферативных заболеваний.

В настоящее время продолжаются активные исследования роли макроглобулинов в патологических процессах. Однако чем дальше продвигаются исследователи, тем больше возникает вопросов. До сих пор нет единого мнения даже в том, являются данные белки позитивными либо негативными реактантами воспаления. Неуточненными остаются механизмы взаимодействия макроглобулинов с рецепторами, мало исследованы конкурентные взаимодействия различных представителей семейства за лиганды. Не проводилось сравнительных исследований, позволяющих в сопоставимых условиях оценить роль макроглобулинов в патогенезе заболеваний принципиально различного генеза и локализации. В последнее время все чаще высказываются предположения, что различия в воздействии макроглобулинов на клетку определяются и вовсе не изменениями их общего уровня, но количеством и составом комплексов макроглобулинов с биологически активными субстанциями [99], а также изменениями в структуре самих макроглобулинов, как генетически детерминированными [212], так и происходящими при взаимодействии с патологическими метаболитами и продуктами воспалительной реакции [161, 215].

Таким образом, целью данной работы было изучение спектра ли-гандов к белкам семейства макроглобулинов, выявление особенностей взаимодействия макроглобулинов с лигандами и с основным рецептором эндоцитоза, а также изучение сывороточных уровней альфа-2-макроглобулина (МГ), его регуляторно-транспортных, иммунных комплексов, и концентраций ассоциированного с беременностью альфа-2-гликопротеина (АБГ - резервного макроглобулина крови) в сравнении с изменениями цитокинового профиля, содержания иммуноглобулинов и классических белков острой фазы в норме и при патологии различного генеза и распространенности.

Задачи работы:

1. Изучить спектр лигандов белков семейства макроглобулинов.

2. Выявить особенности взаимодействия белков семейства макроглобулинов, включая изучение возможности образования взаимосвязей между различными представителями семейства, а также реакций конкуренции за лиганды.

3. Уточнить спектр и природу антител к МГ. Оценить возможность конкуренции ауто- и противоуглеводных антител за связывание с МГ.

4. Изучить особенности взаимодействия макроглобулинов с рецептором эндоцитоза.

5. В сравнимых условиях изучить изменения общей концентрации МГ, его регуляторно-транспортной формы (комплекс МГ-ПЛ), и его имму-нокомплекса (МГ-IgG), а также изменения общего содержания АБГ, некоторых цитокинов и белков острой фазы в норме и при патологии различного генеза и распространенности:

- злокачественном новообразовании яичников (рак яичников III-IV стадии; РЯ)

- доброкачественной серозной опухоли яичников (цистаденома; ЦА)

- наружном генитальном эндометриозе (эндометриоз яичников III-IV стадии; ЭНД)

- системной аутоиммунной патологии (системная красная волчанка 23 степени активности; СКВ)

- системной аутоиммунной патологии с активно выраженным воспалительным компонентом (ревматоидный артрит 2-3 степени активности; РА)

- системном воспалении инфекционного генеза с преимущественной локализацией в суставах (реактивный артрит; РеА)

- локальном воспалении придатков матки инфекционного генеза (обострение хронического аднексита; АДН)

Научная новизна

Впервые проанализирован спектр лигандов модифицированного МГ в зависимости от источника сырья и условий его хранения.

Установлено, что возможна конкуренция между различными представителями семейства макроглобулинов при связывании протеиназ, а преимущество в конкуренции зависит не только от свойств макроглобулинов, но и от свойств связываемой протеиназы.

Нами продемонстрировано, что с трансформированным МГ связываются как ауто- так и противоуглеводные антитела. Причем у здоровых доноров в крови преобладают ауто-, тогда как при патотогии, до 40% антител к МГ - противоуглеводные антитела. Кроме того, противоуглеводные и аутоантитела могут конкурировать за связывание с МГ, а преимущество в конкуренции зависит от того, к какому классу иммуноглобулинов (Ig) они относятся.

Впервые установлено, что при взаимодействии макроглобулинов сначала с протеиназой, а затем с рецептором происходит изменение изо-электрической точки (PI) сформированного комплекса до 7,4, вне зависимости от исходных PI компонентов комплекса. Более того, при взаимодействии трансформированного протеиназой МГ (имеющего большую плотность и электрофоретическую подвижность по сравнению с нативным МГ) с рецептором эндоцитоза (ЛРП), происходит дополнительное конформа-ционное уплотнение мультикомплекса, приводящее к еще большему увеличению его электрофоретической подвижности.

Показано, что при таком классическом аутоиммунном заболевании, как системная красная волчанка (СКВ), а также при эндометриозе (ЭНД), имеющем аутоиммунную составляющую, МГ не является иммуногенным фактором, его транспортные комплексы не принимают активного участия в патогенезе заболеваний, однако уровень АБГ, дублирующего функции МГ и обладающего более выраженной способностью к стимуляции пролиферации, достоверно повышается. Напротив, при ревматоидном артрите (РА) МГ играет ключевую роль в возникновении и дальнейшем развитии заболевания, является одним из основных иммуногенных факторов, а также причиной разрушения тканей суставов протеиназами за счет сохранения их литической активности в составе комплексов.

Нами выявлено, что при доброкачественной (ЦА) и особенно при распространенной злокачественной опухоли яичников (РЯ) происходит накопление иммунных и особенно регуляторно-транспортных комплексов МГ в циркуляции, на фоне истощения резервов МГ и увеличения содержания АБГ.

Согласно полученным данным, реактивный артрит (РеА) и аднексит (АДН), имеющие первопричиной своего возникновения сходный бактериальный возбудитель, различаются по общему содержанию МГ в циркуляции, но имеют сопоставимые уровни АБГ и комплексов МГ.

Практическая значимость

Обнаружение в сыворотке крови высокой концентрации комплексов MT-IgG и МГ-плазмин (МГ-ПЛ) у больных с острым суставным синдромом неясной этиологии является высокочувствительным дифференциально-диагностическим тестом на наличие РА. Выявленные особенности патогенеза ряда других заболеваний позволяют рекомендовать внести изменения в лечебно-диагностическую тактику. Так выявление дефицита местного иммунитета при серозной цистаденоме (ЦА) позволяют рекомендовать иммуно-коррекцию женщинам с бактериальным воспалением в качестве профилактической меры. Использование в схеме лечения рака яичников (РЯ) гемодиализа для удаления из циркуляции поврежденного МГ и особенно стимулирующего пролиферацию АБГ может значительно улучшить эффективность лечения. Антицитокиновая терапия РА активно применяемая в последние годы нуждается, согласно нашим результатам, в коррекции, поскольку повреждение основного носителя цитокинов (МГ), обнаруживаемое при данном заболевании, а также последующие проблемы в своевременной доставке к клеткам-мишеням, за счет изменения сродства МГ к цитокинам и рецепторам, могут провоцировать развитие ряда эффектов, совершенно противоположных предполагаемым при конструировании коммерческих препаратов терапевтических моноклональных антител. Коэффициент, вычисляемый посредством деления концентраций МГ на ЛФ, при воспалительных заболеваниях придатков матки рекомендован нами в качестве дифференциально-диагностического критерия для облегчения выбора способа оперативного вмешательства (патенты РФ № 2295134, № 2303263). Оценка уровней АБГ может использоваться в качестве дополнительного критерия при определении степени злокачественности обнаруженного новообразования в придатках матки и тактики хирургического лечения (патент РФ № 2283499). В целом, выяснение механизмов взаимодействия макроглобулинов с лигандами и, что главное, с рецептором эндоцитоза позволят конструировать лекарственные препараты, где в качестве носителя, доставляющего регуляторные субстанции непосредственно к клеткам-мишеням, будет использоваться какой-либо из макроглобулинов.

Положения, выносимые на защиту

1. Белки семейства макроглобулинов (МГ и АБГ) присоединяют ряд лигандов, включая протеиназы, иммуноглобулины, цитокины, липопро-теины, циркулирующий рецептор эндоцитоза (ЛРП), альбумин, а также могут взаимодействовать друг с другом. При этом МГ и АБГ конкурируют за связывание с протеиназами, а преимущество в конкуренции зависит как от свойств макроглобулина, так и от свойств протеиназы. Более того, МГ может формировать сложные многокомпонентные комплексы из нескольких транспортируемых лигандов, связанных ковалентно или через гидрофобный сайт, конкурента за лиганды (АБГ) и даже циркулирующего рецептора эндоцитоза.

2. Макроглобулины способны дозозависимо связываться с противоуг-леводными антителами, преимущественно антиманнозными и антигалактоз-ными; их общее содержание среди циркулирующего пула антител к МГ составляет у здоровых 15-20% и может увеличиваться при патологии до 30%, а у отдельных индивидуумов до 40%. Кроме того, в сыворотке крови всех здоровых и больных обнаруживаются специфические аутоАТ к МГ, в концентрации 0,6-0,7 мкг/мл. Ауто- и противоуглеводные антитела могут связываться с МГ на конкурентной основе либо одновременно. При этом наличие конкуренции или синергического эффекта определяется тем, к какому классу (G, А или М) принадлежит антитело.

3. При реакции нативного МГ сначала с протеиназой (трансформация), а затем с ЛРП рецептором происходит поэтапное изменение PI формируемого комплекса до значений, соответствующих рН внутренних сред организма. При этом реакция идет в определенной последовательности (сначала трансформация и нейтрализация, затем реакция с рецептором и повторная нейтрализация), а конечная PI не зависит от PI исходных компонентов мультикомплекса. Помимо изменения PI при реакции транфор-мированного МГ (имеющего уплотненную конформацию и большую элек-трофоретическую подвижность, чем нативный МГ) с ЛРП, происходит дополнительное уплотнение и увеличение электрофоретической подвижности мультикомплекса.

4. Развитие злокачественного новообразования яичников (РЯ) сопровождается снижением уровня МГ в циркуляции, на фоне достоверного повышения концентрации его аналога АБГ, 2-кратным увеличением содержания иммунокомплекса МГ-IgG и 3-кратным - регуляторно-транспорт-ного комплекса МГ-ПЛ. При доброкачественной опухоли яичников (ЦА) наблюдается снижение содержания МГ, на фоне недостоверного повышения АБГ и менее выраженного увеличения концентраций комплексов МГ-IgG и ПЛ-МГ. Полученные результаты, включая выявленные изменения уровней цитокинов, иммуноглобулинов и других белков острой фазы позволяют предположить, что дефицит МГ и АТр, вкупе с накоплением ре-гуляторно-транспортных комплексов ПЛ-МГ в циркуляции может служить пусковым механизмом пролиферации. Кроме того, активация синтеза АБГ и транспорта цитокинов именно этим представителем семейства, способствуют агрессивной пролиферации при РЯ.

5. При наличии воспаления бактериального генеза, сывороточные показатели, включая уровни макроглобулинов и их комплексов, изменяются согласно классическим канонам воспалительной реакции, при которой МГ выступает в качестве негативного реактанта, а АБГ - позитивного. Однако при хроническом АДН уровни МГ неизменны, содержание АБГ, комплексов МГ-IgG и ПЛ-МГ — повышено, а при РеА уровень МГ достоверно снижен, содержание АБГ и обоих типов комплексов, повышено, но в меньшей степени, чем при аднексите. Таким образом, резерв МГ в циркуляции лимитирован и при массированном воспалении может истощаться, особенно при отсутствии адекватного усиления синтеза АБГ.

6. При наружном эндометриозе (ЭНД) концентрация МГ в крови не меняется, при этом уровни АБГ и комплексов (МГ-IgG, ПЛ-МГ) повышаются. Аналогичные изменения характерны и для системной аутоиммунной патологии (СКВ), за исключением того, что при СКВ наблюдается увеличение уровней иммуноглобулинов, более выраженное повышение концентрации ИФН-у. Таким образом, патогенез ЭНД имеет выраженный аутоиммунный компонент, но отличается от СКВ менее выраженными изменениями в антителогенезе и дисбалансе иммуномодулирующих цитокинов. При этом МГ и его комплексы, накапливающиеся в циркуляции, по всей вероятности, за счет блокирования рецепторов избытком ИФН-у, не принимают прямого и активного участия в патогенезе СКВ и ЭНД, в то время как повышенные концентрации АБГ способны стимулировать патологическую пролиферацию тканей, наблюдаемую при данных заболеваниях.

7. При системном аутоиммунном воспалении (РА) снижены уровни МГ, увеличены концентрации АБГ, многократно повышено содержание регуляторно-транспортного комплекса МГ-ПЛ и особенно иммунного комплекса МГ- IgG. Данные изменения сопровождаются значительным повышением концентраций провоспалительных цитокинов, иммуноглобулинов и острофазового ЛФ в крови. Выявленные изменения указывают на то, что МГ играет ключевую роль, как в возникновении РА, так и в его дальнейшей прогрессии и не только участвует в разрушении тканей суставов, но и является основным иммуногенным фактором.

выводы

1. Макроглобулины присоединяют ряд лигандов, включая протеина-зы, иммуноглобулины, цитокины, липопротеины, циркулирующий рецептор эндоцитоза (ЛРП) и альбумин. Кроме того, они могут формировать сложные многокомпонентные комплексы из нескольких транспортируемых лигандов, конкурентов за лиганды и ЛРП.

2. Белки семейства макроглобулинов (альфа-2-макроглобулин — МГ, ассоциированный с беременностью альфа-2-гликопротеин — АБГ) конкурируют друг с другом за связывание с протеиназами. При этом преимущество в конкурентных взаимодействиях зависит как от свойств макроглобулина, первым связавшего протеиназу, так и от свойств самого фермента.

3. МГ способен дозозависимо связываться с противоуглвводными антителами (ПУАТ), направленными преимущественно против маннозных и галактозных остатков, а также со специфическими аутоантителами, которые обнаруживаются в крови, как здоровых доноров, так и больных. ПУАТ и аутоантитела могут конкурировать за связывание с МГ или синер-гично взаимодействовать с ним в зависимости от того, к какому классу иммуноглобулинов (G, А, М) они принадлежат.

4. При связывании нативного МГ сначала с протеиназой, а затем с ЛРП происходит поэтапная нейтрализация комплекса до значений, соответствующих рН внутренних сред организма, вне зависимости от исходных PI компонентов, формирующих его. Параллельно происходит уплотнение конформации комплекса, которое проявляется увеличением электрофорети-ческой подвижности по сравнению с нативным МГ.

5. При раке яичников (РЯ) наблюдается дефицит МГ на фоне достоверного повышения уровней АБГ, иммунного комплекса МГ-IgG, регуля-торно-транспортного комплекса МГ-ПЛ, а также снижения уровней ПЛ и АТр. Одновременно в 45-116 раз увеличиваются уровни провоспалитель-ных цитокинов ФНО-а, ИЛ-ip, ИЛ-8 и в 20 раз - иммунорегуляторного и стимулирующего пролиферацию ИЛ-6. Изменение этих параметров и выявленные коррелятивные взаимосвязи могут свидетельствовать как о массированном повреждении тканей и значительном искажении синтеза регу-ляторных цитокинов, так и о том, что дефицит МГ, его окисление и задержка комплексов в циркуляции на фоне активного синтеза АБГ играют значительную роль в патогенезе РЯ.

6. Доброкачественная пролиферация при цистоаденоме (ЦА) сопровождается снижением уровней МГ и IgA, а также увеличением содержания комплексов МГ-IgG и ПЛ-МГ. При этом выявляется 3-7-кратное возрастание уровней провоспалительных цитокинов. Можно предположить, что комбинированный дефицит МГ и IgA, играет определенную роль в патогенезе ЦА.

7. Наружный эндометриоз яичников (ЭНД) сопровождается отсутствием изменений в содержании МГ, ЛФ, IgA и IgM, достоверным повышением уровней АБГ, IgG, МГ-IgG и ПЛ-МГ и снижением АТр. Одновременно в 13 раз повышается концентрация ИЛ-8 и, в меньшей степени, ФНО-а, ИЛ-ip. Обнаруженные изменения и взаимосвязи свидетельствует о том, что МГ и его пассивно накапливающиеся комплексы не имеют существенного значения в патогенезе ЭНД, тогда как повышенные уровни АБГ могут способствовать прогрессии данного заболевания.

8. При системной красной волчанке (СКВ) наблюдаются аналогичные ЭНД изменения оцениваемых параметров, что может свидетельствовать о сходных патогенетических механизмах при развитии данных заболеваний. Отличительной чертой СКВ является увеличение уровней иммуноглобулинов, более выраженное повышение содержания ИФН-у и неизмененный уровень АТр. Отсутствие выраженных изменений в содержании МГ, несмотря на задержку его комплексов в циркуляции, свидетельствует о том, что данный белок не задействован напрямую в патогенезе и не является иммуноген-ным фактором при СКВ.

9. Хронический аднексит бактериального генеза в стадии обострения (АДН) сопровождается отсутствием изменений в уровне МГ, повышением содержания его комплексов (менее значимым по сравнению с другими заболеваниями), а также АБГ, ЛФ, провоспалительных цитокинов и иммуно-регуляторного ИФН-у. Большинство изученных показателей ведут себя как типичные реактанты воспаления, без истощения резервов МГ, но при наличии адекватной активации синтеза его дублера (АБГ).

10. Развитие реактивного артрита (РеА) характеризуется достоверным снижением уровней МГ, на фоне повышения содержания обоих его комплексов, АБГ и иммуноглобулинов, особенно IgA. Данные изменения сопровождаются 10-20-кратным увеличением концентрации провоспалительных цитокинов. Это может свидетельствовать о том, что при РеА наблюдается частичное истощение резерва МГ, не наблюдаемое при АДН, не компенсируемое своевременной активацией синтеза АБГ.

11. Ревматоидный артрит (РА) отличается сниженным уровнем МГ и многократным увеличением содержания его комплексов МГ-ПЛ (в 6 раз) и МГ-IgG (в 16 раз). Параллельно наблюдается значительное повышение концентраций АБГ, иммуноглобулинов, ЛФ и провоспалительных цитокинов (последние увеличены в 14-76 раз) при неизменном уровне АТр. Подобные изменения и выявленные коррелятивные взаимосвязи позволяют предположить, что МГ является иммуногенным фактором при возникновении РА и его комплексы играют значительную роль в дальнейшей прогрессии РА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные новые данные по свойствам белков семейства макроглобулинов и особенностям их взаимодействия с рецептором эндоцитоза, а также с цитокинами и другими лигандами, рекомендуется использовать в качестве лекционного материала для студентов медицинских и биологических специальностей.

Разработанный метод определения циркулирующих в крови комплексов МГ-IgG и МГ-ПЛ может быть использован в качестве основы для разработки новых тест-систем позволяющих определять уровни других специфических комплексов.