Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Липопротеиды высокой плотности и пероксидация липидов в организме при ишемической болезни сердца

На правах рукописи

7)

и, СЕН га

ПЛАВИНСКИИ Святослав Леонидович

ЛИПОПРОТЕИДЫ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ И ПЕРОКСИДАЦИЯ ЛИПИДОВ В ОРГАНИЗМЕ ПРИ ШПЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ СЕРДЦА

14.00.16 - патофизиология 03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Санкт-Петербург 1999

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины РАМН и Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования

Научные консультанты:

Академик РАМН,

заслуженный деятель науки РФ, профессор А.Н.Климов

Член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель пауки РФ, профессор Н.А.Беляков

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук профессор Н.Н.Петршцев Доктор медицинских наук профессор МЛ.Малахова Доктор медицинских наук профессор В.Ю.Шанин

Ведущее учреждение: ,

Санкт-Петербургский Научно-исследовательский институт кардиологии Министерства Здравоохранения РФ

в «_» часов на заседании диссертационного Совета Д.074.16.02 в

Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования (193015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, 41)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования

Автореферат разослан «_»__.1999 года

Ученый секретарь диссертационного совета

д.м.н., с.н.с. А.И.Тюкавин

Защита диссертации состоится «_»

1999 г.

Список использованных сокращений

Ano Аполипопротеин

Ano В-ЛП Липопротеиды, содержащие аполипопротеин В

БПФЛ Белок, переносящий фосфолгтиды

БПЭХС Белок, переносящий эфиры холестерина

ЖК Жирные кислоты

ИБС Мшемическая болезнь сердца

ИЭТ Изоэлектрическая точка

КД Конъюгированные диены

KT Конъюгированные триены

ЛГП Липидные гидроперекиси

ЛП Липопротеиды

ЛПВП Липопротеиды высокой плотности

ЛПЛ Липопротеидлипаза

ЛПНП Липопротеиды низкой плотности

ЛПОНП Липопротеиды очень низкой плотности

ЛХАТ Лецитин-холестерин ацилтрасфераза

МДА Малоновый диалъдегид

ОШ Отношение шансов

ПОЛ Перекисиое окисление липидов

САД Систолическое артериальное давление

СЖК Свободные жирные кислоты

СПМ Сосудистые поражения мозга

СРБ С-реактивный белок

ССЗ Сердечно-сосудистые заболевания

ТБК-продукты Продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой

ТГ Триглицериды

ТТЛ Триглицеридлипаза

ТМОП TempauemoKcunponan

ФАТ Фактор активации тромбоцитов

ФЛ Фосфолипиды

ФППОЛ Флуоресцирующие продукт ы ПОЛ

ХПН Хроническая почечная недостаточность

ХС Холестерин

ЦЭП Цикличесские эндоперекиси

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Несмотря на значительные успехи в понимании патогенеза ИБС и ее патогенетической основы - атеросклероза, полная картина механизмов развития сосудистых поражений и факторов, способствующих и препятствующих их прогрессированию пока не сформировалась. В последнее время все большее внимание привлекает перекисная концепция патогенеза атеросклероза, согласно которой атерогенными являются не просто нативные лииопротеиды низкой плотности (ЛГТНП), а ЛПНП, подвергшиеся перекисной модификации в результате активации в организме процессов свободно-радикального окисления и/или недостаточности антиоксидантной защиты [Ланкин В.З., 1989, Ланкин В.З., Вихсрт A.M., 1989, Климов А.Н., Никульчева Н.Г., 1995 и др.]. Несмотря на существование специалгоировашшх систем антиоксидантной защиты (ферментные и витаминные), их способность ингибировать перекисные процессы недостаточна и поэтому дополнительное антиоксидантное действие проявляет другой класс липопротеидов - липопротеиды высокой плотности (ЛПВП) и ряд водорастворимых метаболитов [Зборовская И.А., Банникова М.В. 1995, Владимиров Ю.А., 1989 Петрович Ю.А.,Гуткин Д.В. 1986]. Однако о механизмах детоксикации поврежденных процессами ПОЛ липопротеидов, о распределении продуктов ПОЛ между различными субфракциями липопротеидов и влияющих на это факторах известно мало. Недостаточное количество публикаций, посвященных проспективному анализу роли ПОЛ как факторов риска развития ИБС и отсутствие данных о циркадных и годовых ритмах колебаний содержания ПОЛ в плазме, снижают достоверность и убедительность наблюдений, посвященных изучению роли продуктов ПОЛ в развитии атеросклероза и ИБС. Целыо исследования явилось выявление возможных связей между процессами ПОЛ в организме и функционированием ЛПВП, а также оценка значимости продуктов ПОЛ как факторов риска развития ИБС Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Изучить особенности окисления липопротеидов в цельной плазме крови, установив взаимоотношения между различными липопротеидами в процессе индуцированного окисления, роль структуры ЛПВП в регулировании процессов окисления атерогенных липопротеидов и изменение функционирования самих ЛПВП в этом процессе.

2. Выявить источники перекисного повреждения плазменных липопротеидов и роль активированных лейкоцитов в этом процессе.

3. Проанализировать суточную и сезонную динамику колебаний уровня продуктов ПОЛ в плазме крови, установив периоды повышения и снижения концентрации этих соединений, а также факторы, обуславливающие эти колебания.

4. Оценить степень повышения концентрации продуктов ПОЛ в плазме крови лиц с ИБС, установить преимущественное место их накопления, тип продуктов и идентифицировать те продукты ПОЛ, которые могут

использоваться для определепия степени активации процессов ПОЛ в организме в рамках лабораторной диагностики.

5. Провести проспективную оценку значимости повышения уровней продуктов ПОЛ плазмы крови для развития ИБС и смерти от нее.

6. Изучить экскрецию продуктов ПОЛ с мочой и разработать методику неинвазивной оценки активизации процессов ПОЛ у пациентов с ИБС;

7. Исследовать возможные механизмы участия ЛПВП в детоксикации продуктов ПОЛ и оценить изменение содержания ХС ЛПВП за 10 летний период на популяционном уровне.

Научная новизна.

Установлено, что ЛПВП способны защищать атерогенные липопротеиды от окисления при окислении цельной плазмы, а не только липопротеидных смесей.

ЛПВП могут высвобождать из окисленных атерогенных липопротеидов свободные жирные кислоты, устраняя таким образом из их состава поврежденные биомолекулы.

Основным источником образующихся при воздействии активных форм кислорода продуктов ПОЛ в плазме крови человека являются активированные нейтрофильные лейкоциты.

Концентрация продуктов ПОЛ в плазме крови не является постоянной, она нарастает во второй половине дня, увеличивается в зимне-весенний период.

Одним из основных путей элиминации поврежденных соединений является выведение их с мочой.

Показано, что осуществление антиоксидантной функции ЛПВП связано с холестерин-акцепторной функцией этих частиц.

Повышение уровня продуктов ПОЛ является фактором риска развития ИБС, поскольку оно выявляется до появления клинических признаков данного заболевания.

Отмечено снижение концентрации ХС ЛПВП у мужчин и женщин С.Петербурга по данным исследований, проведенных в 1995-1997 в сравнении с 1982-88 годами.

Практическая значимость работы заключается в том, что: на основании обследования большого контингента лиц с ИБС доказана значимость активации процессов ПОЛ при развитии этого заболевания, что позволяет обоснованно подойти к назначению антиоксидантной терапии при ИБС.

Разработан метод оценки активации свободно-радикального окисления в организме и установлены границы нормы для этого метода. Предложен суммарный индекс оценки активности ПОЛ в организме и созданы алгоритмы, позволяющие проводить расчет этого индекса. На основе алгоритмов разработаны диагностические компьютерные программы.

Описаньг алгоритмы оценки повышения уровня продуктов ПОЛ в плазме лиц с Р1БС, что позволяет выделять группы пациентов, которым необходима более активная тактика лечения. Положения, выносимые на защиту:

1. Здоровый организм характеризуется относительно низким уровнем свободно-радикальных процессов, проявляющимся в низком содержании первичных продуктов ПОЛ. При ИБС наблюдается не только активация этих процессов, но и недостаточность систем защиты, приводящая к накоплению вторичных продуктов ПОЛ. Другими признаками недостаточности систем регуляции процессов ПОЛ являются снижение холестерин-акцепторной способности Л1ТВП, появление нестабильных, сильно окисленных частиц ЛПВП, усиление выведения продуктов ПОЛ с мочой.

2. ЛПВП и альбуминовая фракция плазмы крови являются основными переносчиками вторичных продуктов ПОЛ, тогда как первичные продукты ПОЛ локализованы, в основном, в атерогенных липопротеидах.

3. Основными источниками продуктов ПОЛ в плазме крови являются экзогенные продукты, поступающие с пищей и вызывающие послеобеденный и вечерний подъем уровней этих продуктов, а также активированные полиморфноядерные лейкоциты, увеличение количества и степени активации которых ассоциировано с повышением содержания в плазме крови таких продуктов ПОЛ, как общие ЛГП, ЛГП в составе ало В-содержшцих липопротеидов и ТБК-продуктов.

4. Обратная связь между содержанием в плазме крови ХС ЛПВП и первичных продуктов ПОЛ (ЛГП и КД) указывает на протективную роль ЛПВП по защите плазменных липопротеидов от модификации. Осуществление тесно связано со способностью ЛПВП акцептировать холестерин.

5. Повышенный уровень вторичных продуктов ПОЛ является предиктором смертности от ИБС, ССЗ и злокачественных новообразований.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 42 научных работы в отечественной и зарубежной печати.

Апробация работы. Основные материаты диссертации доложены и обсуждены на 3-ей международной конференции по профилактической кардиологии (Осло, 1993), IV, VI, VII, VIII и IX Липидной конференции (Лейпциг, 1993,1995,1996,1997, 1998), 8 и 9 Международном Дрезденском Липидном симпозиумах (Дрезден, 1994, 1997), Конференциях молодых ученых России (Москва, 1994) и С.Петербурга (С.Петербург, 1997), IV конференции нефрологов (Иматра, 1995), VI симпозиуме по биохимии ли-пидов (С.Петербург, 1994), Симпозиуме, посвященном 110-летию со дня рождения академика Н.Н.Аничкова (С.Петербург, 1995), Втором биохимическом съезде (Москва, 1997), Конференции Европейского Оптического Общества (Сан-Ремо, 1997).

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований (восемь глав), заключения, выводов, указателя литературы и приложения. Работа изложена на 356 страницах, содержит 36 таблиц и 30 рисунков. Указатель литературы включает 375 источников.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования. В данную работу включены результаты обследования 3335 человек, пациентов различных стационаров Санкт-Петербурга и Лейпцига (Германия), здоровые родственники пациентов, лица приглашенные на профилактический осмотр и эпидемиологическое обследование.

У всех пациентов забор крови проводился утром, после 12 часового голодания. Плазма или немедленно использовалась для анализа или хранилась при 4 °С, но не более 3-х дней.

Для изучения суточной динамики продуктов ПОЛ кровь бралась из пальца, каждые три часа, а моча собиралась при каждом мочеиспускании (в среднем, также каждые 3 часа, с ночным перерывом). Последний прием пищи осуществлялся не позднее, чем за 12 часов до забора утренней порции крови и мочи.

При оценке выведения продуктов ПОЛ с мочой, последняя собиралась утром, после не менее, чем 12 часового голодания, и использовалась для анализа не позднее, чем через 3 часа.

Анализ уровней общего ХС, ХС ЛПВП, ТГ, мочевины, мочевой кислоты, билирубина, глюкозы и креатинияа в плазме крови и моче, альбуминов, железа, показателей свертываемости крови (фибриноген, протромбин, тромбопластиновое время, время по Квику), АЛТ, ACT и С-рсктивного белка проводилось на автоанализаторах фирм Boehringer Mannheim (ФРГ) и Olympus (США).

Концентрации частиц ЛТГОП C-I1I, ЛПВП A-I и аполиполротеина A-I ,уровней общих фосфолипидов и ТГ, адгезивных молекул лейкоцитов (V-САМ, I-CAM и ELAM) определялись при помощи тестовых наборов Boehringer Mannheim (Германия) в лаборатории лилидов Института клинической химии и патобиохимии Университета Лейпцига.

Изучение уровня общего ХС, свободного ХС, эстерифицированного ХС, ХС ЛПВП, свободного ХС ЛПВП, эстерифицированного ХС ЛПВП, ХС ЛПВП i и ЛПВПз, свободного и эстерифицированного ХС ЛПВПг и ЛПВП3> свободных жирных кислот проводилось при помощи ручного эн-зиматического метода

Генетические особенности аполипопротеина Е изучались с помощью полиморфизма длины рестрикционных фрагментов ДНК, амплифициро-ванных при помощи полимеразной цепной реакции [Hixon J.E.,Vernier D.T. 1990].

Каротиноиды измерялись по методу Бессея [Максимов В.Я. 1976], ТБК-продукты в плазме крови определялись двумя вариантами метода, использующего реакцию МДЛ и ненасыщенных альдегидов с тиобарбитуро-вой кислотой при нагревании, продукты ПОЛ в моче изучались с помощью флуоресцентного метода и по концентрации ТБК-продуктов [Плавин-ский С Л., 1998]. Конъюгированные диены и триены плазмы крови определялись после гептан-изопропанольной экстракции по поглощению при 234 и 268 им. В части экспериментов осуществлялось также выделение изопропанольного экстракта, содержащего относительно менее гидрофобные липидные продукты (И.А.Волегорский и соавт.[1989]). Гидроперекиси липидов анализировали иодометрически (El-Saadani и соавт. [1989]) . В ряде экспериментов (исследования связи структуры ЛПВП и активации процессов ПОЛ, генетического полиморфизма апо Е и концентрации продуктов ПОЛ) уровень ЛГП в плазме изучался при помощи ферментативного метода (тестовый набор Lipohydrox, WAK-Chemie, Германия). Циклические эндоперекиси определялись согласно Pryor et al. [1976].

Флуоресцирующие продукты ПОЛ (длина волны возбуждения 365 нм, испускания 430 нм) в плазме крови и мочи измерялись при помощи двухканального флуориметра, специально разработанного для измерения флуоресценции липофусцинового типа (центр СТЕМ, Россия). Калибровка прибора осуществлялась при помощи раствора флуорена в диоксане (0,625 мг/мл).

Для выделения субфракций липокротеидов использовалась методики осаждения и ультрацентрифугирования (Burstein и Scolnik,[1973], Плавин-ский С.Л., Кузнецов А.С. [1997]).

Окисление цельной плазмы проводилось ионами меди (М. Dobreanu и соавторы [1997]). Для определения подвижности липопротеидов использовался электрофорез в агарозе (Microzone Electrophoresis System, Beckman) с последующей окраской на липид и белок.

При изучения акцепции холестерина тени эритроцитов инкубировались с изолированными ЛПВП. Для оценки акцепции использовалось отношение удельных концентраций свободного холестерина до и после инкубации.

Степень активации лейкоцитов оценивалась цитохимическим методом по содержанию в них катионных белков (В.Е.Пигаревский [1988]), для суммарной оценки использовался средний цитохимический коэффициент.

Для статистической обработки материала использовались стандартные методы вариационной статистики (входящие в пакет прикладных программ SPSS), непараметрические статистики, дендрологические и нейросе-тевые модели. Достоверными считались различия при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТА ТЫ ИССЛЕДОВА НИЯ.

ЛПВП и перекисное окисление липидов плазмы крови. Модельное окисление плазмы. Изучение изменений содержания продуктов ПОЛ в различных липопротеидах при индукции окисления плазмы показало, что ТБК-продукты начинали возрастать уже в течении первых 30 мин инкубации (рис.1). При этом увеличивалось содержание этих продуктов во вне-липопротеидной фракции плазмы. В этот же период наблюдался некоторый рост содержания КД в составе апо В-ЛГ1. Однако затем отмечалось прекращение накопления КД в атерогенных липопротеидах, отсутствующее при окислении изолированных ЛПНП. Одновременно со снижением КД в апо В-ЛП стало увеличиваться содержание этих соединений в ЛПВП, указывая на то, что именно эти частицы являются акцепторами поврежденных липидов. За фазой быстрого увеличения содержания КД и ТБК-продуктов в ЛПВП следовала фаза стабилизации. Именно в этот период концентрация КД в атерогенных липопротеидах начинала расти. В тот же период времени и в ЛПВП и в апо В-ЛП появлялись циклические эндопе-рекиси. Вслед за этим наблюдалось увеличение концентрации КД в ano В-ЛП, увеличение содержания ТБК-продуктов в плазме, на сей раз уже с возрастанием концентрации циклических эндоперекисей и достаточно резкий рост содержания ФППОЛ, связанных с липидами в апо В-ЛП. До этого формирования конечных продуктов ПОЛ в этих липопротеидах не наблюдалось. В этот период начинало отмечаться появление модифицированных по заряду ЛПНП, частиц с увеличенной электроподвижностью. Иными словами этот этап характеризовался истощением способности плазмы предотвращать модификацию атерогенных липопротеидов. В среднем ЛПВП задерживали модификацию атерогенных липопротеидов на 41,4±8,3 мин.

Эксперименты с инкубацией окисленных и нативных ЛПВП с окисленными и нативными ЛШШ показали, что одним из механизмов, способствующих предотвращению окисления ЛПНП, является фосфолипазная активность, ассоциированная с неокисленными ЛПВП. В среднем, при инкубации ЛПВП с окисленными ЛПНП высвобождение в окружающую среду СЖК увеличивалось в 4,9 раз (с 13,4±7,2 мМ до 65,5±23,4 мМ).

Эксперименты с разделением плазменных ЛПВП по изоэлектриче-ской точке показали, что субфракции, содержащие большую часть продуктов ПОЛ, характеризовались изоэлектрической точкой (ИЭТ), сдвинутой в кислую область градиента рН. Обычно имелось 3-4 таких субфракции с ИЭТ между 5,1 и 4,4. Наиболее интересной находкой явилось обогащение ЛПВП больных с ИБС субфракцией с низкой изоэлектрической точкой (pl<4,0). На эту субфракцию приходилось менее одного процента ЛПВП (по белку) у здоровых лиц, и 40,2% всех ЛПВП больных с ИБС. Важно отметать, что эта субфракция содержала наибольшие количества ЛГП. Более детальный анализ содержания продуктов ПОЛ в этих "кислых" субфракциях показал, что в них содержатся достаточно большие количества

Время (мин.)

Рис.1 Изменения концентрации продуктов ПОЛ в липопротеидах при окислении

плазмы ионами меди

- li -

ФППОЛ. Тушение флуоресценции щелочью, специфичное для флуорофо-ров, содержащих в своей структуре шиффовы основания, было наиболее выражено в субфракции с ИЭТ в диапазоне 4,8-4,6. В то же время, в ряде субфракций флуоресценция усиливалась после добавления щелочи. Наиболее выраженным данный процесс был у ЛПВП с ИЭТ менее 4,2. Эта же субфракция содержала наибольшую удельную концентрацию ТБК-продуктов. Электрофорез ЛПВП данной субфракции до и после повторного ультрацентрифугирования показал, что ЛПВП с низкой изоэлектриче-ской точкой давали две полосы, одну - в области а i-глобулинов, окрашивающаяся липидным и белковым красителем, а вторую - окрашивавшаяся только белковым красителем - в области аз -глобулннов (пре-Р подвижность), т.е. субфракция с низкой изоэлектрической точкой является нестабильной и способна распадаться на белковый и липид-белковый компоненты.

Структура ЛПВП и продукты ПОЛ плазмы. Одним из показателей структуры липопротеидов, который сильнее других связан с содержанием продуктов ПОЛ в плазме, является ano Е. Поэтому было проанализировано содержание в плазме продуктов ПОЛ и ряда липидных показателей в зависимости от наличия различных аллелей ano Е (табл.1) и фенотипа.

Таблица 1. Содержание липидов и ЛГП в плазме крови в зависимости от наличия аллелей ano Е

е2 s3 е4 Без еЗ

(п=11) (п=35) (п=6) (п=7)

ХС 190±14 197+10 179+23 183±18

СХС 52,6x4,3 58,2+2,4 55,0+бД 53,4±5,6

эхе 137±10 139±8 124±17 130+13

ХС ЛПВП 33,0±2,9 35,5±2,2 31,5+5,0 30,0±3,0

СХС ЛПВП 5,3±0,6 8,0+1,0 6,2+1 Д 6,0+0,6

эхе ЛПВП 27,7+3,2 27,5+0,5 25,3+4,2 24,0±2,8

Общие ЛГП 2,3±0,7 4,8±0,8 3,9±1,2 2,9+1,2

% ЛГП вне ano В-ЛП 48,3±27,3 61,8±8,5 52,8±27,3 47,9±47,1

Ало В-ЛГП 2,1±0,7 3,3+0,9 1,9±0,6 1,7±1,5

Снижение уровня свободного ХС ЛПВП, ассоциированное с наличием аллеля с2, сопровождалось достаточно резким снижением процентного содержания ЛГП вне атерогенных липопротеидов., т.е. в данной группе наблюдалась тенденция к ухудшению удаления ЛГП из ano В-содержащих липопротеидов. Анализ фенотипов ano Е показал, что уровни ЛГП в плазме были ниже всего у лиц с фенотипом 2/3 (1,8 ±0,8 мкМ), несколько выше при фенотипе 2/4 (2,9+1,2 мкМ) и выше всего при фенотипе 3/3 (5,1 ±0,9 мкМ). Для ответа на вопрос о том, что играет наибольшую роль в оиреде-

лении концентрации ЛГП в плазме - наличие определенного типа ano Е или изменение концентрации свободного ХС ЛПВП - была проанализирована связь между концентрацией свободного ХС ЛПВП и уровнем общих ЛГП у лиц, у которых аллель s2 отсутствовала (фенотипы 3/3 и 3/4 ). Коэффициент корреляции между уровнем свободного ХС ЛПВП и концентрацией ЛГП плазмы составил г=0,053 (р=0,826, п=20) - эти два показателя не были связаны друг с другом. Таким образом можно считать, что причиной снижения уровней ЛГП является не изменение структуры ЛПВП, а наличие аполипопротеина Е, кодируемого аллелью s2.

Анализ структуры ЛПВП у лиц с различными аллелями ano Е показал, что имеются выраженные различия в уровнях трех показателей - концентрации ano A-I (84±6 мг/да при наличии е2 против 98±3 мг/дл при его отсутствии), уровнях ХС ЛПВП2 (6,19±0,39 против 8,5±0,77 мг/дл) и свободного холестерина ЛПВП3 (3,86+0,66 против 6,19±0,39 мг/дл). Подобные изменения структуры могли говорить о том, что наблюдается "сужение" кривой распределения ЛПВП, накапливаются более крупные частицы класса ЛПВП3 (ЛПВП3а и ЛПВП3б) и более мелкие ЛПВП2 (ЛПВП2а). Следует отметить, что, в среднем, пациенты с аллелью е2 имели более крупные ЛПВП (отношение ХС ЛПВП/апо AI составляло 28 моль/моль против 23 моль/моль в.среднем). Наряду с этим у них была снижена концентрация более крупных ЛПВП2. Ранее было показано [Plavinski, Kuznetsov, 1994], что нормальная акцепция холестерина протекает с увеличением концентрации именно ЛПВП2б.

Для получения дополнительной информации о взаимосвязи между концентрацией продуктов ПОЛ в плазме и функционированием системы акцепции холестерина была проведена серия экспериментов (п=19), в которых измерялась эффективность акцепции холестерина ЛПВП в зависимости от уровня ЛГП в плазме крови. Акцепция измерялась как процентное изменение концентрации свободного холестерина в ЛПВП после их инкубации с тенями эритроцитов. При анализе обследованные лица были разделены на две группы - с нормальным и повышенным уровнем ЛГП (более 3 мкМ). Повышение уровня ЛГП в плазме связанно с некоторым снижением эффективности акцепции ХС липопротеидами высокой плотности. Индекс акцепции составил в группе с низкими ЛГП 230±29%, а в группе с высокими - 155+27% (р=0,050). Эти данные поднимают вопрос о роли структуры ЛПВП в целом для определения содержания продуктов ПОЛ в плазме и других классах липопротеидов. Для ответа на этот вопрос был применен следующий подход - собраны данные о различных показателях структуры ЛПВП (уровни ano A-I, общий и свободный ХС ЛПВП, ТГ ЛПВП, общий, свободный и эстерифицированный ХС ЛПВП2, ТГ ЛПВП2, общий, свободный и эстерифицированный ХС ЛПВП3, ТГ ЛПВП3, содержание частиц ЛП A-I и CIII, а также уровни фосфолипидов плазмы, п=94) и подвергнуты факторному анализу, для выявления общих комно-

нент, определяющих структуру ЛПВП. Полученные данные использованы для изучения связей с содержанием продуктов ПОЛ в плазме и атероген-ных ЛГШП.

Проведенный анализ позволил выделить факторы, которые определяют структуру ЛПВП в плазме: первый фактор, объединявший уровни ano А-1, содержание ХС в ЛПВП в целом и в ЛПВП2 и ЛПВПз, а также эс-терифицированного ХС в ЛПВП2 и ЛГ1ВП3, ТГ в ЛПВП2, концентрацию частиц ЛП А-1 и фосфолипидов, можно было назвать фактором холестериновой насыщенности ЛПВП ("ЛХАТ-фактор"); второй фактор определял содержание в ЛПВП триглицеридов; третий фактор - содержание свободного ХС и четвертый - концентрацию части; ЛПВП C-III.

Единственным фактором, который оказывал резко выраженное действие на уровень продуктов ПОЛ в ЛПНП был первый фактор ("ЛХАТ-фактор"). Пациенты с высокой активностью данного фактора имели уровень КД в ЛПНП почти на 30% ниже (0,84+0,12 против 1,22±0,15 мкМ, р<0,05). Этот фактор мог быть охарактеризован как структурный фактор ЛПВП, который in vivo обеспечивает антиоксидантную защиту атероген-иых липопротеидов.

Далее была разработана модель, позволяющая оценить вклад различных ферментных систем, контролирующих структуру ЛПВП, в определение содержания продуктов ПОЛ в плазме. Для создания модели было рассмотрено совместное влияние трех параметров (активность ЛХАТ, БПЭХС и скорость удаления ЭХС печенью) на содержание в плазме ХС ЛПВП, ЭХС, ЭХС ало В-содержащих липопротеидов и ЛПВП. Для простоты модели было принято, что субстрат для ЛХАТ реакции доступен достаточно легко. Если активность печени по удалению ЭХС нормальна, тогда плазменный уровень ЭХС будет определяться активностью ЛХАТ, тогда как распределение ЭХС между ЛПВП и липопротеидами более низких плотностей - активностью БПЭХС. Для анализа были выбраны 93 образца, б которых были измерены уровни общего и эстерифицированного ХС, ХС ЛПВП и ЭХС ЛПВП, а также содержание ЛТП. В результате применения данной модели было установлено, что примерно у половины пациентов (51%) была несколько повышенная эстерифицирующая активность, у трети (28%) - повышенная БПЭХС-подобная и у четверти (24%) -повышенная клиренсная активности.

При анализе уровней продуктов ПОЛ в плазме крови установлено, что при наличии повышенной эстерифицирующеи активности уровень общих ЛТП в плазме был снижен - 3,7±0,6 против 5,3+0,6 мкМ (рЧ),049). При этом повышенная распределительная активность была связана с некоторым повышением содержания в плазме ЛТП (5,4±1,1 против 4,2+0,6 мкМ, р=0,334). Весьма интересные данные получены при учете сразу двух параметров - эстерифицирующеи и клиренсной активности. Оказалось, что наибольший уровень ЛТП в плазме наблюдается при нормальных или

сниженных уровнях обоих показателей. В этой группе он достиг 6,2±1,0 мкМ. Среди тех же, у кого сохранялась нормальная клиренсная активность, но была повышена эстерифицирующая, ЛГП в плазме падали до 3,7±0,6 мкМ (р=0,032). В обследованной группе отсутствовали лица с повышенным уровнем обоих параметров, однако даже при повышенной кли-ренсной активности, при условии нормальной эстерифицирующей, уровни ЛГП были ниже (4,2+0,9 мкМ). Высокая распределяющая активность практически сводила на нет положительный эффект высокой эстерифицирующей активности - содержание ЛГП в плазме составляло 5,5+1,8 при нормальной эстерифицирующей активности и 5,3±1,3 - при высокой.В то же время при нормальной распределяющей активности между пациентами с высокой и низкой эстерифицирующей акгавностью были обнаружены наибольшие различия (5,2±0,7 против 2,9±0,8 мкМ, р-0,030). Роль лейкоцитарного звена в активации процессов перекисного окисления липидов в организме. Понимание процессов ПОЛ в организме вряд ли возможно без понимания основных источников свободно-радикальной модификации липопротеидов. Вместе с тем, еще со времен исследований во Фрамингеме и таких крупных популяционных программ как MRFIT и NHANES известно, что существует связь между содержанием лейкоцитов в крови и риском развития и смерти от ИБС [Kannel, et al. 1992;Grimm, et al., 1985, Gillum, et al., 1993]. С появлением перекисной теории патогенеза атеросклероза стало возможным дать предположительное объяснение этой находке. Экспериментальные (in vitro) работы многих авторов [ см. обзор Панасенко О.М., Сергиенко В.И., 1993], достаточно четко показывают, что лейкоциты, особенно нейтрофильные лейкоциты и моноциты-макрофаги могут приводить к перекисной модификации липопротеидов, особенно липопротеидов низкой плотности. Одтако чтобы доказать, что именно активация процессов ПОЛ, сопровождающая увеличение числа лейкоцитов в крови, может являться связующим звеном между лейкоцитозом и ИБС, необходимо доказать связь между числом лейкоцитов и содержанием продуктов ПОЛ в плазме крови и липопротеидах in vivo, а также степенью активации самих лейкоцитов и образованием производных окисленных липидов. Поэтомувначале были проведены исследования по изучению связи активации нейтрофильных лейкоцитов (по уровню среднего цитохимического коэффициента) с концентрацией продуктов ПОЛ в плазме крови (п=21). Удалось установить, что коэффициент-корреляции для связи цитохимического коэффициента с содержанием ТБК-продуктов составил г=-0,505, р=0,016. Более активировными являются лейкоциты пациентов с низкими значениями цитохимического коэффициента. В группе лиц с повышенной активацией нейтрофилов отмечена тенденция к более высокому уровню ФППОЛ (62,7±5,8 против 55,3±8,5 мкМ в группе с цитохимическим коэффициентом менее и более 1,4, соответственно). Количество палочкоядерных лейкоцитов является достоверно

связано с концентрацией конъюгированных триенов изопропанольной фазы липидного экстракта (г=0,490, р=0,006). Отмечалась тенденция и к повышению уровня экстрагируемых изопропанолом КД у пациентов с более активированными лейкоцитами (6,8±1,7 мкМ против 3,5±0,9 мкМ у лиц со средним цитохимическим коэффициентом ниже 1,4). Степень активации нейтрофильных лейкоцитов по уровню цитохимического коэффициента была четко связана с другим (косвенным) показателем лейкоцитарной активации - индексом сдвига влево. Коэффициент корреляции составлял г=-0,747 р<0,001, т.е. чем выше было содержание более молодых форм лейкоцитов, тем выше была и степень их активации. Между показателем сдвига влево и содержанием МДА наблюдалась четкая корреляционная связь (г=0,48б, р-0,048). Имелась связь между показателем сдвига влево и концентрацией КТ (г=0,469, р=0,050). Измерение содержания ЛГП и количества нейтрофильных лейкоцитов в крови (п=37) показало, что между эгими двумя параметрами имеется достоверная корреляция (г=0,618, р<0,001). Между общей концентрацией лейкоцитов и содержанием нешрофилов в крови имелась почти линейная связь (г= 0,918, р<0,001) и можно было считать, что в основе повышения содержания лейкоцитов в крови наших пациентов лежит увеличение количества нейтрофильных лейкоцитов. Данные о содержании различных продуктов ПОЛ в зависимости от количества лейкоцитов приведены в табл. 2.

Таблица 2. Уровни продуктов ПОЛ в плазме и липопротеидных субфракциях в зависимости от количества лейкоцитов крови.

Лейкоциты менее Лейкоциты более 5,8x10% ■ 5,8x10%

ЛГП плазмы 10,7±2,8 11,7±1,5

ЛГП ano В-ЛП 3,0+0,6 6,8±1,1*

ТБК плазмы 15,8±1,2 22,3±3,1*

ТБК ano В-ЛП 1,9±0,6 2,5±1,1

ТБК ЛПВП 2,5±0,5 3,1±0,8

ТБК альбуминов 10,2+1,6 14,7±1,3*

ФППОЛ плазмы 53,9±6,8 53,9±6,2

ФППОЛ ano В-ЛП 17,2+3,8 , 11,5+2,4

ФППОЛ ЛПВП 8,0+1,7 11,5+2,4

ФППОЛ альбуми- 26,7±3,0 28,1 ±4,3

нов __

* - достоверные (р<0,05) различия с группой, имеющей низкое содержание лейкоцитов крови

Как видно из этой таблицы, достоверные различия обнаружены для трех типов ПОЛ - ЛГП в составе апо-В содержащих, ТБК-продукгов плазмы и ТБК-продуктов в составе альбуминов. Поскольку наибольшие различия

были обнаружены именно для первичных продуктов ПОЛ, следующая серия экспериментов была посвящена более детальному анализу связей содержания лейкоцитов с концентрацией ЛГП. В ходе этого исследования было установлено, что между содержанием гидроперекисей в апо-В липо-протеидах и количеством лейкоцитов крови существует достоверная корреляционная связь (г=0,377, р=0,001). Другие параметры измеренные в нашем исследовании - такие как содержание липидов, уровни креатинши и мочевины - не влияли на концентрацию ЛГП в апо-В липопротеидах. Данные многомерного регрессионного анализа показывают, что после учета значимости СРБ (маркера воспаления) между содержанием ЛГП в ало-В липопротеидах и количеством лейкоцитов сохраняется достоверная связь. Более того, анализ дополнительных биохимических показателей (железо, глюкоза) свидетельствует о том, что прочие причины, которые могут активизировать процессы ПОЛ в плазме крови не оказывали существенного влияния на связь содержания лейкоцитов в крови и концентрации ЛГП в апо-В липопротеидах.

Содержание продуктов ПОЛ в различных субфракциях липопротеи-дов. Было изучено содержание КД, ТБК-продукгов, циклических эндоле-рекисей (ЦЭП), ЛГП и ФППОЛ в плазме крови 6 пациентов с ИБС. Продукты ПОЛ определялись как в более гидрофобной (гептановой), так и менее гидрофобной (изопропаноловой) фазах. Содержание ЛГП в плазме составило 7,2+0,8 а КД - 4,4±0,4 мкМ. Анализ изопропаноловых экстрактов в данной группе показал, что в них содержится еще 2,5+0,6 мкМ КД. В сумме же в гептановом и изопропаноловом экстрактах определялось 6,94±0,6 мкМ КД. Таким образом содержание ЛГП и КД было практически одинаковым. Содержание гидроперекисей с наличием циклической эндоперок-сидной группировки в плазме крайне мало (0,04±0,01 мкМ в гептановой фазе и 0,02±0,01 мкМ - в изопропаноловой), составляя примерно один процент общего числа молекул с гидроперекисной группировкой. Содержание ФППОЛ в плазме крови составило 28,1±1,3 мкМ флуореновых эквивалентов. На долю гидрофобных (гептановых) продуктов приходилось 11,6+1,0 мкМ, а на долю экстрагируемых изопропанолом -15,1±2,6 мкМ. Практически все ФППОЛ были относительно гидрофобны - в водной фазе их оставалось лишь незначительное количество (1,3±1,5 мкМ). Половина ФППОЛ находилась в гидрофобном ядре липопротеидов. После добавления к плазме щелочи наблюдалось тушение флуоресценции в среднем на 32,6+0,05%. Подобное снижение интенсивцости флуоресценции характерно для продуктов, имеющих в своей структуре коньюгированные шиффовы основания [МаЫге! и соавт., 1974]. Базируясь на данных об эффективности тушения флуоресценции шиффовых оснований щелочью (70%), можно было оценить содержание шиффовых оснований среди всех ФППОЛ в 13,4±2,5 мкМ флуореновых эквивалентов. Соответственно, 14,6±1,2 мкМ приходились на счет ФППОЛ с другой структурой. В целом можно было отметить,

что 1 мкМ флуореновых эквивалентов был примерно равен 0,5 мкМ шиф-фовых оснований.

Изучение содержания продуктов ПОЛ в липопротеидных субфракциях показало, что основные количества первичных продуктов ПОЛ содержались в атерогенных липопотеидах. Эти липопротеиды содержали почти 57% всех ЛГП плазмы крови (5,08±0,60 мкМ против 2,19+0,24 мкМ в ЛПВП и 1,62+0,16 мкМ в альбуминовой фракции) и до 80% всех КД. Однако когда речь заходила о вторичных продуктах ПОЛ, картина радикально менялась. Наибольшие количества ТБК-продуктов определялись именно в альбуминах (6,15±1,01 мкМ) и значительные - в ЛПВП (2,07+0,25 мкМ). Для сравнения, атерогенные липопротеиды имели в своем составе немногим более 3 мкМ (3,24+0,55 мкМ) ТБК-продуктов. Из ФППОЛ плазмы примерно половина находилась в альбуминовой фракции (27,6±2,3 мкМ), шестая часть в ЛПВП (9,2+1,2 мкМ) и треть - в атерогенных липо-протеидах (18,0±2,1 мкМ).

Чтобы получить дополнительную информацию о распределении продуктов ПОЛ между атерогенными и антиатерогенными липопротеида-ми было рассчитано их содержание в одной частице. Установлено, что на одну частицу ano В-ЛП приходилось 18Д±0,97 молекул КД, 2,8±0,3 молекул ЛГП, 1,4±0,3 молекула ТБК-продуктов и 7,2±0,8 - ФППОЛ. Можно отметить, что 7,2 моля флуореновых эквивалентов соответствует содержанию примерно полутора молекул шиффовых оснований. Данная цифра практически равнялась количеству молекул ТБК-продуктов, что означает, что в атерогенных липопротеид&х за счет этих соединений повреждено не менее 3 аминокислотных остатков атерогенных липопротеидов в каждой частице.

Таблица 3 Содержание (М±т) продуктов ПОЛ (моль/моль) в апо-В содержащих липопротеидах и ЛПВП в расчете на частицу Продукт апоВ-ЛП ЛПВП ПОЛ

КД.....~......................18.1+0,97.........0,33.' 0,03.....

ЛГП 2,8±0,3 0,10±0,01

ТБКП 1,4±0,3 0,29±0,05

ФППОЛ 7,2±0,8 0,23 ±0,04

Степень повреждения ЛПВП оказалась значительно меньшей, чем ЛПНП и ЛПОНП. Одна молекула, содержащая систему сопряженных двойных связей, приходилась на 3 частицы ЛПВП. ЛГП встречались лишь в одной из 10 частиц ЛПВП, а ТБК-продукгы - в каждой 3-4 частице анти-атерогенных липопротеидов. Судя по значительно более высокому содержанию ЛГП и КД в атерогенных липопротеидах процесс перекисного по-

вреждения начинается именно в этих частицах. Однако процентное содержание поврежденных молекул крайне мало. Даже если поврежденными являются только фосфолипиды, это означает, что в атерогенных ЛП изменена лишь одна из 330 молекул фосфолипидов (рассчитано по Shen и со-авт.,1977). Вероятность ее переноса на частицы более высоких плотностей без участия специальной системы очень мала. Если бы популяция ЛПВП была бы представлена только ЛПВПг, то 10 частиц ЛПВП содержали бы 1370 молекул фосфолипидов, а вероятность переноса поврежденной частицы составила бы 1,2%.

Изучение факторов, влияющих на содержание продуктов ПОЛ в различных липопротеидных фракциях показало, что содержание ТБК в альбуминовой фракции плазмы крови слабо негативно связано с концентрацией альбумина (коэффициент регрессии = -0,326, р=0,064). А в случае ЛПВП-ТБК коэффициент регрессии достигал достоверного значения (0,129, р=0,026). Данные корреляционного анализа указывают на наличие отрицательной связи между содержанием ЛТП вне липопротеидов плазмы и концентрацией альбумина (г=-0,312, р=0,025). Кроме того, установлена обратная корреляция (г=-0,392, р=0,05) между содержанием ЛТП в ano В-липопротеидах и уровнем альбумина.

Интересной находкой явилось обнаружение значимой отрицательной корреляции между содержанием ЛТП в составе ano В- липопротеидов и уровнем ХС ЛПВП (г=-0,246, р=0,038). Эта корреляция свидетельствовала о том, что чем выше уровень ХС ЛПВП в плазме крови, тем ниже содержание токсичных липидных гидроперекисей в составе атерогенных липопротеидов. В проведенном ранее исследовании [Klimov et al., 1994] коэффициент корреляции для связи КД и ХС ЛПВП составлял г=-0,250 (р=0,010), т.е. был по абсолютному значению близок к только что описанному. Анализ нескольких подгрупп больных с ИБС, получавших медикаментозную и немедикаментозную терапию показал, что у всех них степень связи между содержанием ХС ЛПВП и ало В-ЛГТ1 была одинаковой. Единственно, где отсутствовала связь между уровнем ХС ЛПВП и содержанием липидных гидроперекисей в атерогенных липопротеидах была группа больных с почечной патологией. Коэффициент корреляции составил -0,050 (р=0,759). При этом корреляционная связь с уровнем общего хо- -лестерина и триглицеридов сохранялась (г=0,327, р=0,039 и г=0,767, р<0,001, соответственно). Результаты, полученные в этой группе являются важными по двум причинам. Во-первых, они однозначно показывают, что связь между ХС ЛПВП и уровнем ЛТП в ano В-ЛП является причинной, а не просто отражением положительной корреляционной связи между ЛТП и 'ГГ, с одной стороны, и отрицательной корреляционной связи между ТГ и ХС ЛПВП, с другой. Степень связи между уровнем ТГ и ano В-ЛГП была такой же, как и в других группах, и корреляция между ХС ЛПВП и ТГ сохранялась на прежнем уровне (г=-0,450, р=0,004), однако корреляционный коэффициент для ХС ЛПВП и ало В-ЛГП упал практически до нуля. Во-

вторых, данная находка заставляет обратить внимание на особую роль в детоксикационной функции ЛПВП энзиматической активности, связашгой с этими липопротеидами.

Содержание продуктов ПОЛ при ИБС. Для лиц с ИБС было характерным увеличение содержания ряда продуктов ПОЛ в составе атероген-ных липопротеидов. Так, концентрация ano В-ЛГП (п=213) составляла 6,9+0,5 мкМ при ИБС и 5,2+0,4 мкМ в контрольной группе. Соответствующие значения для ФППОЛ (п=87) составили 20,2±2,8 и 13,6±2,1 мкМ флуореновых эквивалентов. Увеличивалось содержание продуктов ПОЛ в плазме крови в целом. У пациентов с коронарной патологией на миллилитр плазмы приходилось на 3,9 нмоль конъюгированных диенов больше, чем у здоровых лиц, а для конъюгированных триенов различия составили 0,4 нмоль. Плазма пациентов с ИБС содержала значительно большие количества ТБК-продуктов в сравнении с плазмой пациентов контрольной группы (20,9+0,6 мкМ против16,6±0,6 мкМ). Интересные результаты были получены при анализе группы пациентов, у которых в плазме крови присутствовали относительно небольшие количества ТБК-продуктов (около 12 мкМ). Эта группа включала пациентов с ИБС и здоровых лиц с одинаковыми уровнями этих продуктов в плазме. ТБК-продукты были единственными го проанализированных продуктов ПОЛ (для ФППОЛ подбор таких пар был невозможен), для которых была отмечена тенденция к более высокому уровню продуктов ПОЛ в атсрогенных липопротеидах при ИБС (разность составила 1 мкМ).

Таблица 4. Содержание продуктов ПОЛ в плазме крови и ano В-содержащих липопротеидах больных с ИБС и в контрольной группе

(М+пт).

Плазма (мкМ) ano В-ЛП (чкМ) ИБС контроль ИБС Кон_троль

ЛГП (п=213)

ТБК-продукты

(п=137)

ФППОЛ (п=87)

13,4+0,9* 20,9±0,6*

61.015.6*

10,3±1,0 16,6±0,6

6,9+0,5* 3,8±0,8S

5,2±0,4 2,8±0,7

43,9+4,1 20,2±2,8* 13,6+2,1

11 - достоверные (р<0,05) различия с контрольной группой ' - подгруппа с одинаковым уровнем ТБК-продуктов в плазме крови

Чрезвычайно важным представлялось проанализировать не просто изменение концентрации продуктов ПОЛ у лиц с ИБС, а выявить те подгруппы, для которых активация свободно-радикальных процессов является наиболее значимой. В ходе этого анализа было установлено, что повышение уровня ЛГП в составе атерогенных липопротеидов является наиболее

значимым для молодых мужчин с относительно низким (менее 99 мг/дл) уровнем ТГ и нормальным уровнем ХС ЛПВП. В этой группе среди пациентов с апо В-ДПТ более 6,7 мкМ частота ИБС достигала 76%, тогда как у лиц с меньшей степенью повреждения атерогенных липопротиедов частота этого заболевания была всего лишь 12%. Следует также отметить, что ги-поальфа-холестеринемия, которая также была ассоциирована со значительным повышением частоты ИБС (до 82%) сопровождалась и повышением уровней апо В-ЛГП (8,5±0,5 мкМ против 5,8±0,2 мкМ в группе с ХС ЛПВП более 36 мг/дл, р<0,001>.

Суммарный анализ влияния вторичных продуктов ПОЛ и таких факторов риска, как возраст и уровень липидов на частоту ИБС показал, что резкое повышение ФППОЛ является важным риск-фактором ИБС. Так, все пациенты с ФППОЛ более 90,2 мкМ фяуореновых эквивалентов имели ИБС. Среди лиц с более низким уровнем ФППОЛ важное значение играло содержание ФППОЛ в составе ЛПВП, особенно у лиц моложе 60 лет, имеющих уровень ХС ЛПВП меньше 54 мг/дл. В этой группе частота ИБС среди лиц с ЛПВП-ФППОЛ более 2,2 мкМ составляла 80% против 20% у лиц с ЛПВП-ФППОЛ менее 2,2 мкМ.

Использование многомерной логистической регрессии (которая включала в себя уровень общего ХС, ХС ЛПВП, ТГ, КД, КТ и ТБК-лродуктов) показало, что основными предикторами наличия ИБС являются уровень ТБК-продуктов, общего ХС и КД или КТ. Причем ИБС практически не встречалась, если в плазме крови имелся низкий уровень КД (ниже 2,17 мкМ). При более высоком уровне КД в плазме высокую значимость приобретало содержание ТБК-продуктов. В группе лиц с относительно высоким их содержанием (более 20 мкМ), ИБС встречалась довольно часто (91%). При наличии относительно невысоких значений концентрации ТБК-продуктов следовало опять обратиться к уровню КД. При повышении' уровня этих продуктов ПОЛ (более 13,2 мкМ), несмотря на относительно небольшую концентрацию вторичных продуктов, можно было говорить о высокой вероятности обнаружения ИБС. Если же пациент имел средний уровень и КД и ТБК-продуктов, то следовало обратить внимание на концентрацию в плазме общего ХС. При очень низком уровне общего ХС (менее 164 мг/дл) пациент, скорее всего, относился к контрольной группе. В случае нормохолестеринемии решающее значение вновь приобретал уровень вторичных продуктов ПОЛ. Уровень, превышавший 16 мкМ, свидетельствовал о повышенном риске ИБС.

После того, как было установлено, что продукты ПОЛ являются значимыми маркерами риска ИБС следовало проанализировать адекватность их использования в клинико-лабораторной практике. Для отбора наилучшего теста было решено применить одну из методик поддержки принятия решений, именуемую "аналитический иерархический процесс" [Е)о1ап, 1990]. В анализ бьши включены тесты на следующие продукты ПОЛ - КД, КТ, ТБК-продукты, ЛТП, ФППОЛ. В качестве параметров, которые долж-

ны быть оценены при принятии решения об адекватности теста, было решено использовать следующие показатели: чувствительность метода, его специфичность, стоимость реактивов для проведения анализов, требования к наличию специализированного оборудования и время, затрачиваемое на проведение теста. В результате анализа данных о содержании продуктов ПОЛ у лиц с ИБС и здоровых лиц были получены следующие значения чувствительности и специфичности: КД - (100,29), КТ - (100,41), ЛГП -(29, 89), ТБК-продукты - (64, 89), ФППОЛ - (25,100)

После внесения всех параметров в модель было установлено, что наиболее адекватным тестом определения продуктов ПОЛ для использования в рамках популяционного исследования является определение ФППОЛ. Этот тест был значительно эффективнее, чем все остальные, включенные в анализ (критерий эффективности 0,36). Анализ чувствительности показал, что при небольших изменениях значимости анализируемых параметров уровень ФППОЛ все равно оставался наиболее эффективным показателем ПОЛ. Если требования к времени, затрачиваемому на проведение анализа были снижены, то на первое место по эффективности выходил тест на определение уровня ТБК продуктов (коэффициент эффективности 0,27).

Уровни продуктов ПОЛ в популяции и их связь с факторами риска ИБС. ФППОЛ плазмы не имели закономерно выраженной возрастной динамики. Наименьший уровень этих показателей был найден среди обследованных в возрастной группе 20-29 лет (39,5+1,5 мкМ). Затем уровень ФППОЛ резко повышался, достигая в возрастной группе 30-39 летних максимальных значений (47,6+1,9 мкМ), а затем медленно снижался и достигал в группе 50-59 летних уровня в 40,9 мкМ. В исследованной группе 293 человека (54,4%) были курильщиками, 100 человек (18,6%) бросили курить и 141 человек (26,2%) не курили никогда. Содержание ФППОЛ было наименьшим у никогда не куривших пациентов (41,2±1,9 мкМ). Несколько выше было оно у бросивших курить пациентов (43,2±2,1 мкМ) и еще выше - у курильщиков (45,5+2,2 мкМ). Высокие уровни ФППОЛ (четвертый квартиль распределения, более 49,9 мкМ) были ассоциированы с менее благоприятным липидным профилем. Чем выше уровень ФППОЛ, тем выше был и средний уровень общего ХС. Если в первом квартиле распределения ФППОЛ средняя концентрация ХС составляла всего лишь 204,6 мг/дл, то в четвертом она повышалась практически на 15 мг/дл - до 220 мг/дл, и была достоверно выше, чем у пациентов с низкими ФППОЛ. Отношение содержания общего ХС к концентрации ano В - отражающее размеры частиц атерогенных липопротеидов - было наибольшим у лиц с низким уровнем ФППОЛ (2,21±0,06 мг/мг и 2,24±0,08 мг/мг в первом и втором квартилях). Отношение холестерина ЯПНП к концентрации самого ano В было также наибольшим при ФППОЛ, не превышающих 30,5 мкМ (1,41±0,05 мг/мг). При более высоких значениях ФППОЛ оба отношения

снижались. Так, отношение общего ХС к концентрации ало В уменьшалось до 1,99±0,05 мг/мг в четвертом квартиле распределения ФППОЛ, а отношение ХС ЛПНП/апо В составляло у обследованных с ФППОЛ более 50 мкМ 1,27±0,04 мг/мг (р=0,040 для различий с первым квартилем ФППОЛ). Эти данные свидетельствовали о том, что средние размеры частиц ЛПНП меньше, если в плазме содержится достаточно большое количество ФППОЛ. Более мелкие частицы апо В-содержащих липопротеидов являются более атерогешшми. Связано это с тем, что более мелкие частицы легче проникают в сосудистую стенку, а также с тем, что они легче окисляются [И^тал а!., 1994]. Весьма интересные данные были получе-

Рис. 2 Сезонная динамика содержания ФППОЛ в плазме (п=545) . По осям отложена средняя концентрация ФППОЛ в мкМ

Как видно из рисунка, в зимне-весенние месяцы отмечалось значительное увеличение содержания продуктов ПОЛ, и довольно резкое снижение летом и ранней осенью. Зимой средние уровни ФППОЛ достигали своего максимума в 49,2±3,3 мкМ. Весной отмечалось незначительное снижение до 45,6±1,5 мкМ. Летом ФППОЛ падали до 37,4+1,5 мкМ и своего минимума они достигали осенью - 34,8+1,3 мкМ. Общая амплитуда изменений средних значений составляла 14,4 мкМ или почти 30%. Среднее значение

для ФППОЛ зимой практически совпадало с отрезной границей верхнего квартиля для всей группы обследованных в целом. Значительно более высокие концентрации продуктов ПОЛ зимой были отмечены и для других изученных параметров. Так, уровень общих ЛТП зимой достигал 13,5+0,65 мкМ. В то же время весной он опускался уже до 6,7+0,35 мкМ, т.е. снижение весной ЛГП более выражено, чем ФППОЛ.

Следует отметить, что сезонные колебания уровней ФППОЛ отражались и на их связях с рядом гормональных показателей. В зимне-весенний период самые низкие значения отношения тестостерон/кортизол отмечались в группе пациентов с максимальным уровнем ФППОЛ (зимой в группе лиц с ФППОЛ менее 30,5 мкМ это отношение составило 36±5 мг/г против 25+2 мг/г в группе лиц с ФППОЛ более 50 мкМ). Весной отношение этого показателя в группе с ФППОЛ более 50 мкМ составило 44±8 против 69±10 среди тех, кто имел более низкие ФППОЛ. Уровень инсулина также оказался под сочетанным влиянием сезонных изменений и содержания ФППОЛ. Самая низкая концентрация инсулина была у пациентов с уровнем ФППОЛ ниже 30,5 мкМ. Так, зимой она составила 6,6+0,5 мМЕ/л против 8,9+0,9 мМЕ/л у пациентов с ФППОЛ в границах четвертого квартиля. Весной уровень инсулина увеличилися до 8,0+1,0 мМЕ/л у пациентов с низкими ФППОЛ, но еще больше возрос он у лиц с ФППОЛ более 50 мкМ (12,5+2,0 мМЕ/л). Осенью резко выраженных различий между группами не наблюдалось.

Интересные данные были получены при изучении средних уровней ФППОЛ у лиц с ИБС. Колебания максимальных и минимальных значений ФППОЛ в группе здоровых лиц составляли 15,8 мкМ, а вот в группе пациентов с ИБС - только 10,8 мкМ, что может отражать активацию утилизации продуктов ПОЛ, связанную с более активной продукцией этих соединений в течете всего года. Вместе с тем основной задачей данной части исследования было обнаружение возможного влияния повышенного содержания ФППОЛ на смертность от ИБС при проспективном наблюдении. Всего за время наблюдения (10 лет) смертность составила 7,4% от общей численности группы. Основной причиной смерти обследованных являлись сердечно-сосудистые заболевания (41%), причем на первом месте находилась ИБС (79%). Второе и третье места в структуре смертности разделили между собой злокачественные новообразования и случаи насильственной смерти (по 17,6%). Т.о. заболевания, в патогенезе которых активация процессов свободно-радикального окисления занимает одно из ведущих мест (ССЗ, злокачественные новообразования, сахарный диабет), охватывали почти две трети всех случаев смерти (62%).

При проведении анализа смертности по квартилям распределения ФППОЛ выяснилось, что наибольшее количество умерших находилось среди пациентов с ФППОЛ в г раницах четвертого квартиля распределения этого параметра. Отмечалось достоверно большее количество умерших в

этом квартиле в сравнении с теми пациентами, чей уровень ФППОЛ не превышал 30,5 мкМ (р=0,049). Кумулятивная смертность, корректированная по уровню других факторов риска, составила 8,2% среди 40 пациентов с резко повышенными ФППОЛ (97,6 ±5,3 мкМ) и была достоверно выше, чем 5,7% смертность у 494 пациентов с нормальными ФППОЛ (38,4±0,6 мкМ).

Учитывая довольно сильные сезонные колебания продуктов ПОЛ в плазме для изучения вопроса о влиянии повышения концентрации ФППОЛ в плазме на смертность от отдельных причин был проведен парный анализ (табл. 5.)

Таблица 5. Влияние продуктов ПОЛ на смертность в проспективном исследовании _________

Причина смерти Отношение р

шансов

ФППОЛ

ССЗ 2Д1 6,51 0,011

ИБС 2,67 7,10 0,008

СПМ 1,00 0,04 0,841

Злокачественные новообразования 5,00 3,52 0,061

Патология легких 2,00 1,04 0,308

Нейропсихические заболевания - 3,38 0.068

Насильственная смерть 0,71 0,02 0.888

ТБК-продукты

ССЗ 4,50 12,38 <0,001

ИБС 3,50 8,68 0,003

СПМ - 1,56 0,212

Злокачественные новообразования 3,00 2,53 0,112

Патология легких 5,00 2,04 0,153

Нейропсихические заболевания - 1,56 0,212

Насильственная смерть 0,67 0,23 0,632

Причиной смерти, на которую высокая концентрация ФППОЛ оказывала наибольшее значение, была ИБС. Отношение шансов (ОШ) для смерти от этого заболевания составило 2,67 (х2=7Д, р-0,008). Достаточно высоким оказалось и влияние повышенного уровня ФППОЛ на смертность от злокачественных новообразований (ОШ=5,0, х2=3,52, р=0,061), хотя значимость критерия и не доходила до принятого уровня достоверности. Как видно из табл. 3, наибольшую значимость повышение уровней ТБК-продуктов имело для смертности от ИБС. Отношение шансов смерти для пациентов с более высокими уровнями этих продуктов составляло 3,50 (%2=8,68, р=0,003). Если сравнить эти результаты с данными для ФППОЛ, то можно отметить, что оба показателя обладали примерно одинаковой

предиктивной силой, хотя уровень ТБК-продукгов бьш ассоциирован со смертностью немного сильнее. Общая смертность была достоверно связана с уровнями ТБК-продуктов в плазме крови (ОШ=2,47, х2=21,31, р<0,001).

Таким образом, приведенные данные показывают, что повышение продуктов ПОЛ значимо ассоциировано не только с частотой ИБС, но и с последующей смертностью от этого заболевания. Данные о проспективной роли ЛТП показывают, что за 3,5 года наблюдения у пациентов с ИБС повышенный уровень этих продуктов в составе ano В-содержащих липопро-теидов был ассоциирован с более высокой смертностью от ИБС (ОШ=3,0 Х2=4,69, р=0,030), тогда как уровень ЛГП в плазме в целом - нет (ОШ=1,4, Х2=2,52,р=0,112).

Популяциоиное изучение уровней ХС и ХС ЛПВП. В 1995-97 годах нами было проведено популяционное исследование, которое охватило 1753 здоровых мужчин и женщин 20-69 лет (по охвату возрастных групп и методике оно было аналогично исследованию, проведенному в НИИЭМ РАМН 1982-88 годах) и было направлено на выявление возможной попу-ляционной динамики уровней ХС и ХС ЛПВП.

Выявлено, что в середине 90-х годов уровни ХС в плазме мужчин и их динамика были практически такими же, как и в середине 80-х. В то же время, значительно изменились средние концентрации уровней ХС ЛПВП. В 1995-97 годах они составляли у 20-29 летних 38,4±0,7 мг/да или на 13,1 мг/дл ниже, чем за 10 лет до этого. У 30-39 летних средние уровни ХС ЛПВП были в 90-х годах также на 12,3 мг/дл ниже, чем в 1995-97 и составляли 41,2+0,9 мг/дл. В возрасте 40-49 лет больших изменений не произошло и уровень ХС ЛПВП составил 40,5+0,9 мг/дл. Некоторое снижение значений этого показателя в 50-59 лет (40,0+1,5 мг/дл) исчезало уже в следующем десятилетии (43,0±1,3 мг/дл в возрастной группе 60-69 лет).

Таблица 6. Общий холестерин, ХС ЛПВП и процент лиц с гипоальфахоле-стеринемией среди мужчин, обследованных в 1995-1997 годах в сравнении с данными, полученными в 1986-1988 (Плавинская С.И., [1993])

ХС ХСЛПВП ХС ЛПВП менее 35 мг/дл

Возраст 1986-88 1995-97 1986-88 1995-97 1986-88 1995-97

20-29 191+2 168+3* 51.5±0.62 38.4±0.7* 5.45 40.6*

30-39 210±1 205±3 53.5±0.54 41.210.9* 4.87 33.8*

40-49 234±2 219±4* 53.8±0.58 40.5±0.9* 6.00 36.4*

50-59 225±1 223+5 52.1±0.57 40.0+1.5* 7.11 34.7*

60-69 238±1 220±5* 54.1+4.7 43.0+1.3* 0.0 24.2*

* - достоверные отличия от средних уровней 1986-1988 годов

У женщин уровень ХС ЛПВП в середине 90-х был не очень высокий. Так, в возрастной группе 20-29 лет он составил 46,9±1,3 мг/да, в возрастной группе 30-39 - 46,0±1,1 мг/дл, в 40-49 лет - 43,7±1,1 мг/дл, в 50-59 -46,3±1Д и в 60-69 - 45,1±1,6 мг/дл. Хотя уровень ХС ЛПВП у женщин во всех возрастных группах был выше, чем у мужчин, обследованных в одно с ними время, он был ниже, чем у мужчин, обследованных в середине 80-х. Если же сравнить данные, полученные при популяционном обследовании женщин в начале 80-х (колебания от 62,3±0,74 в 20-29 лет до 57,6±0,72 мг/дл в 60-69 лет [Плавинская, 1993]) с только что приведенными, то становится понятным, что за прошедшее десятилетие у женщин также отмечалось падение уровня ХС ЛПВП. Данные изменения могут являться следствием перемен в структуре питания [Ок^сг, 1996] и усиления социального стресса и они не могут не отразиться на степени антиоксидантной и анти-атерогенной активности ЛПВП.

Содержание продуктов перекисного окисления липидов в моче. Вначале была проведена серия экспериментов по изучению суточной динамики содержания продуктов ПОЛ в моче и ее корреляции с содержанием липидов крови. Среди липидных параметров наиболее выраженная динамика наблюдалась у триглицеридов (ТГ) плазмы крови. Отмечено повышение их уровня после любого приема пищи, с максимальным подъемом через 6 часов после приема наибольших количеств пищи (обед). Затем их уровень постепенно снижался и достигал к утру исходных значений. Общие колебания содержания ТГ составляли 170-300% от исходного уровня натощак. Другие липидные показатели изменялись значительно слабее (около 10% для общего ХС и ХС ЛПВП) и без столь выраженной связи с приемом пищи. Динамика уровней ФППОЛ в плазме практически точно повторяла таковую для ТГ, указывая на то, что практически все экзогенные продукты этого класса переносятся в составе хиломикронов или ЛПОНП. Интересно отметить, что МДА в плазме практически не обладал выраженной динамикой, его уровень был постоянным на протяжении суток, хотя колебания содержания в моче были достаточно сильно выражены. Из сравнения динамики ТГ в плазме крови и продуктов ПОЛ в моче следует, что содержание последних зависело от концентрации ТГ в плазме крови. Пик повышения продуктов ПОЛ в моче немного запаздывал по отношению к плазме, что свидетельствует о выведении из организма полученных извне соединений. Послеобеденный подъем содержания продуктов ПОЛ мочи составлял примерно 112% от содержания их в утренней порции мочи.

Определение уровня продуктов ПОЛ в утренней порции мочи показал, что у здоровых лиц с мочой выделяются достаточно большие количества флуоресцентных продуктов ПОЛ и МДА (табл.7). Лица с ИБС имели значительно повышенное содержание продуктов ПОЛ в моче. Флуоресцентные продукты были выше на 75% а МДА - на 35%. Оба типа продуктов ПОЛ были достоверно выше в моче лиц с ИБС, чем в моче здоро-

вых (р=0,016 и р=0,013 для флуоресцентных продуктов и МДА, соответственно).

Таблица 7. Содержание продуктов ПОЛ в моче лиц с ИБС и контрольной

jrpjgnnbl ^ __ ^ _„,„„„

Больные Контрольная группа ИБС

ФППОЛ(ммоль!/моль крса гиннна)..............0,34; 0,06* 0,20; 0,04 ................................

МДА(ммоль/моль креатаиина)____________0,27*0,02* 0,20*0,022______________

1 - флуореновых эквивалентов

* - р<0,05 для различий с группой больных (после логарифмирования исходных данных)

Анализ данных по выведению с мочой ФППОЛ показывает, что у пациентов с ИБС активизируется система утилизации продуктов ПОЛ. За сутки с мочой нормальных людей выводится около 2,3 мкмоль ФППОЛ против 3,9 мкмоль у пациентов с ИБС. Если сравнить эти данные с содержанием ФППОЛ в плазме, то можно сделать вывод, что ежедневно у здоровых лиц выводится около 5% общего количества ФППОЛ плазмы. У пациентов с ИБС с мочой выводилось до 9% плазменных ФППОЛ, что является следствием активации системы детоксикации этих продуктов.

Между содержанием в моче МДА и флуоресцентных продуктов ПОЛ наблюдается высокозначимая корреляционная связь (г=0,450, р<0,001, п=92). Однако коэффициент корреляции недостаточно высок для того, чтобы признать, что все ФППОЛ в моче представляют собой продукты взаимодействия МДА с биомолекулами. Добавление щелочи к моче вызывало почти 50% тушение флуоресценции, что немного ниже, чем 60-67% тушение флуоресценции, отмеченное Malshet и соавт.[1974] для продуктов реакции перекисно - модифицированной арахидоновой кислоты с лецитином и экстрактов жировой ткани животных с искусственно вызванным авитаминозом Е. Базируясь на вышеприведенных данных, молено рассчитать, что примерно 70% флуоресцентных продуктов имеют в своей структуре конъюгированные шиффовы основания и около двух третей из них являются результатом взаимодействия различных биомолекул с МДА. С другой стороны, это означает, что немногим меньше половины всего МДА мочи находится в составе нефлуоресцируюпщх соединений. Ряд соединений МДА, обнаруживаемых в моче (типа N-2 (-пропеиаль)-этаноламина) не флуоресцируют, несмотря на наличие в структуре шиффовых оснований [Hadely, Draper, 1989]. Связано это с тем, что данные продукты содержат не конъюгированные, а енольные формы шиффовых оснований. Базируясь на приведенных данных, можно оценить, что в сутки с мочой здоровых людей выводится около 1,1 мкмоль флуоресцирующих продуктов, образовавшихся в результате взаимодействия МДА с биомолекулами. Соот-

ветственно, примерно 1,2 мкмоль/сутки будут составлять нефлуоресци-рующие продукты реакции МДА с аминогруппами белков и фосфолипи-дов.

Заключение. Если суммировать все полученные данные, то можно отметить, что активация лейкоцитарного звена системы иммунитета является одним из важнейших механизмов повреждения липопротеидов и, в частности, атерогенных апо-В содержащих липопротеидов. При этом наиболее уязвимым для атаки свободными радикалами, генерируемыми этими клетками, являются поверхностные структуры липопротеидов. Молено предположить, что система ЛПВП в этом случае направлена на репарацию поврежденных поверхностных структур (рис.3).

В результате атаки свободно-радикальных соединений, в поверхностных структурах ano B-содержащих ЛП образуются окисленные формы фосфолипидов. После этого, в под действием липопротеидлипазы (ЛПЛ), происходит расщепление триглицеридов ядра этих липопротеидов и, как следствие, формируется некоторый избыток поверхностных структур. Акцептором поверхностных структур могут быть ЛПВП, однако это возможно лишь в том случае, если сами ЛПВП имеют дефицит фосфолипидов, который создается под действием системы акцепции холестерина. Первоначальный ее этап - захват свободного холестерина - мало сказывается на свойствах частицы, поскольку ХС встраивается в поверхностный слой ЛПВПзс и формируются лишь несколько увеличенные частицы ЛПВПзь и ЛПВПза- Однако в дальнейшем, под действием ЛХАТ, формируются эфи-ры холестерина, которые уходят с поверхности частицы, создавая нехватку поверхностных структур. Ранее нами было установлено, что у здоровых людей в результате акцепции холестерина средний радиус ЛПВП увеличивается на 1,8 Á [Plavinski, Kuznetsov, 1994]. Учитывая, что средний диаметр ЛПВП составляет 45,5 Á [Плавинский, Кузнецов, 1997], площадь поверхности ЛПВП при акцепции холестерина увеличивается на 524,8 Ä. Это потребует переноса около 8 молекул нормальных фосфолипидов (исходя из поверхностной площади фосфолипидов в 62,7 Á [Edelstein, et al., 1979]) или в полтора раза меньших количеств окисленных (площадь поверхности окисленных ФЛ на 50% больше, чем нормальных [van den Berg, et al., 1993]). Большая поверхностная площадь окисленных ФЛ будет являться залогом того, что на ЛПВП в первую очередь будут переноситься именно они.

Результатом удаления окисленных ФЛ с ano В-ЛП является восстановление баланса между гидрофобным ядром и поверхностью частицы, однако сами частицы при этом становятся меньше, чем обычно.

Окисленный фосфолипид, находящийся на ЛПВП, подвергается воздействию фосфолипазы А2 (или ферментов со сходным механизмом действия) и расщепляется до окисленной свободной жирной кислоты и ли

золецитина. После воздействия фосфолипаз, окисленная СЖК может быть связана альбумином и транспортировала им в печень для утилизации.

Лизолецитин является токсичным соединением и поэтому он быстро подвергается воздействию соответствующей липазы [Shamir, 1996] и расщепляется до глицерина и СЖК, также захватываемых печенью или периферическими тканями. Результатом является формирование ЛПВП с дефицитом поверхностных структур, которые могут принять дополнительные количества фосфолипидов. Однако эфиры холестерина могут быть захвачены печенью и тогда результатом действия всей системы будет являться регенерация акцепторных частиц ЛПВП - ЛПВПзс.

Неблагоприятная ситуация может произойти при повышенной активности БПЭХС. В этом случае в обмен на IT эфиры холестерина будут активно переноситься на липопротеиды более низких плотностей. Данная реакция может оказаться неблагоприятной по двум причинам. Во-первых, на ЛПНП и ЛПОНП могут быть перенесены окисленные эфиры холестерина, а во-вторых замена ТГ на ЭХС уменьшает возможности ЛПЛ по генерации избытка поверхностных структур. Для того, чтобы предотвратить такую возможность организм использует два механизма. Во-первых, частицы ЛПВП, переносящие этот белок, наиболее чувствительны к окислению и первыми "страдают" при активизации процесса окисления [Zawadzki, et al., 1991], снижая тем самым вероятность переноса окисленных ЭХС на ЛПНП. Во-вторых окисленные формы эфиров ХС очень быстро удаляются печенью [Sattler, Stocker, 1993; Fluiter, van Berkel, 1997; Hinter, et al., 1996]. Подтверждением этих данных явилась обнаруженная в настоящем исследовании связь распределительной способности плазмы (перенос ЭХС на липопротеиды низких плотностей) и повышенного уровня продуктов ПОЛ в плазме и атерогенных липопротеидах, которая исчезала при активизации клиренсной активности (скорости удаления ЭХС печенью).

Возникает вопрос, почему ферменты утилизации ПОЛ ассоциированы с ЛПВП, а не ЛПНП, которые являются наиболее подходящим объектом для свободно-радикальной атаки? Ответ на этот вопрос может заключаться в более простой регуляции процессов ПОЛ, которые являются составной частью воспалительной реакции. При воспалении происходит ряд серьезных изменений ЛПВП - наиболее значительным из которых является, наверное, замена апо A-I на сывороточный амилоид [van Lenten, et al., 1995]. Как результат этого ЛПВП теряют способность акцептировать холестерин (оставляя больше холестерина клеткам для деления) и одновременно утрачивают способность захватывать и детоксифицировать гидропери-киси. Именно такие ЛПВП и были выявлены в аортальной стенке [Плавин-ский, 1993]. Более того, активированные гранулоциты достаточно быстро повреждают апобелковую часть ЛПВП, необходимую как для акцепции холестерина, так и для устранения токсичных продуктов ПОЛ. Аналогичная система с блокированием ингибиторов протеолиза за счет окисления

используется организмом и для активации эластазы в очаге воспаления. Поскольку свободно-радикальные процессы обычно достаточно локальны, то наибольшая блокада будет наблюдаться у ЛПВП, находящихся вблизи очага воспаления. Это имеет достаточно серьезное биологическое обоснование - нет никакой необходимости блокировать свободно-радикальные процессы там, где они нужны для защиты организма. Таким образом, изменение структуры одного типа частиц приводит к выключению сразу двух процессов - акцепции ХС и антиоксидантной защиты. С другой стороны, небольшие размеры ЛПВП позволяют им обновляться в тканевой жидкости значительно быстрее, чем более крупным липопротевдам и после прекращения первоначальной реакции воспаления они способны быстро проникнуть в очаг и акцептировать продукты ПОЛ и детоксицировать их.

Предположение о том, что детоксикационная система служит для удаления продуктов ПОЛ, формгфующихся при воспалении, обосновывает и тот факт, что данная система предполагает, в основном, транспортировку для катаболизма продуктов ПОЛ в печень, а не их утилизацию на месте (пара-оксоназа дезактивируется в числе первых при развитии воспаления). В самом очаге эти системы ие работают и не мешают, таким образом, цепным свободно-радикальным реакциям, направленным на уничтожение чужеродного материала. Более того, свободные жирные кислоты, высвобождение которых может являться благоприятным в кровотоке, в условиях очага воспаления, при недостаточной концентрации акцептора (альбумина) будут являться цитотоксичными для окружающих клеток. ,

ВЫВОДЫ

1. Основным источником образующихся при воздействии активных форм кислорода продуктов ПОЛ в плазме являются активированные поли-морфноядерные лейкоциты, увеличение количества и степень активации которых ассоциированы с повышением содержания в плазме таких продуктов ПОЛ, как ЛТП, ЛТП в составе ano В-содержащих липопро-теидов и ТБК-продукты.

2. У здоровых людей наблюдается суточная и сезонная динамика содержания продуктов ПОЛ в плазме крови. Уровни этих соединений увеличиваются во второй половине дня и вечером, после приема пищи. Кроме того, отмечается повышение содержания продуктов ПОЛ в зимне-весенниЙ период.

3. Отсутствие соответствующей сезонной динамики у пациентов с ИБС в сочетании с высоким уровнем этих продуктов ПОЛ в плазме крови в летне-осенний период указывает на сочетание при этой патологии активации свободно-радикального окисления липидов с повышенной утилизацией образующихся при этом продуктов за счет усиления их выведе-

ния с мочой, что можно рассматривать как компенсаторно-приспособительную реакцию.

4. Обратная связь между содержанием в плазме крови ХС ЛПВП и первичных продуктов ПОЛ (ЛТП и КД) указывает на протективную роль ЛПВП по защите плазменных липопротеидов. Для осуществления этой функции у ЛПВП должна сохраняться способность акцептировать холестерин.

5. ЛПВП являются комплексной системой, которая, забирая излишки холестерина и поврежденные яипиды для дальнейшей утилизации, обеспечивает защиту сосудистой стенки. Основными компонентами этого процесса являются эстерификация частицами ЛПВП свободного ХС и создание дефицита поверхностных структур, акцепция поврежденных поверхностных структур (фосфолипидов) и активация ферментов с фосфолипазным действием, высвобождающих окисленную ЖК.

6. Здоровый организм характеризуется относительно невысокой степенью активности свободно-радикальных процессов, проявляющейся в низком содержании первичных продуктов ПОЛ.

7. При ИБС наблюдается не только активация процессов свободно-радикального окисления липидов, но и недостаточность утилизации поврежденных соединений, приводящая к накоплению вторичных продуктов ПОЛ. Важными признаками недостаточности систем регуляции процессов ПОЛ при ИБС являются снижение холестерин-акцепторной способности ЛПВП, появление нестабильных, сильно окисленных частиц ЛПВП, усиление выведения продуктов ПОЛ с мочой.

8. В течение 90-х годов в популяции С.Петербурга произошло выраженное снижение концентрации ХС ЛПВП при неизменном уровне атеро-генных липопротеидов (ЛПНП и ЛПОНП), что не может не отразиться на степени антиатерогенной и антиоксидантной активности ЛПВП.

9. Повышение содержания в плазме крови продуктов ПОЛ, особенно ФППОЛ связано с увеличением риска смерти от сердечно-сосудистых заболеваний, включая ИБС, при проспективном наблюдении

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты проведенного исследования позволили разработать новые подходы к диагностике состояний, связанных с активизацией процессов ПОЛ в организме. Разработаны диагностические алгоритмы, облегчающие использование этих походов в лечебных учреждениях.

2. При определении риска развития ИБС следует учитывать, что повышенное содержание ЛГП в составе атерогенных липопротеидов (более 6,7 мкМ) является выраженным фактором риска у молодых мужчин с нормальным уровнем триглицеридов.

3. Повышение уровня ФППОЛ более 90 мкМ флуореновых эквивалентов указывает на неблагоприятную ситуацию с состоянием процессов ПОЛ

в организме, сопровождающемся значительным увеличением риска развития ЖС.

4. При проведении терапии, направленной на коррекцию уровня липидов в крови, следует добиваться увеличения содержания ЛПВП, особенно у пациентов с повышенной концентрацией продуктов ПОЛ в плазме крови.

5. Мониторирование антиоксидантной терапии можно осуществлять измерением выведения продуктов ПОЛ с мочой. В качестве пограничных значений можно использовать уровень ФППОЛ мочи 0,12 ммоль ф.э./моль креатинина в сочетании с МДА более 0,20 ммоль/моль креа-тинина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Плавинский С.Л., Кузнецов A.C. Распределение по заряду липопротеидов высокой плотности аорты.//Укр.Биох.Журн.-1993 - N6,-с. 29-33

2. Plavinskaya S.I.,ShestovD.B., StracovE.L., Plavinsky S.L. Correlation between IHD and risk factors including hormones//Abstr.of the 3rd Int. Conf. Prev. Card., Oslo, 27 June - 3 My 1993.-p.136

3. Климов A.H., Гуревич B.C., Никифорова A.A., Шаталина Л.В., Кузьмин A.A., Плавинский С.Л., Терюкова Н.П. Об антиоксидантной активности ЛПВП in vivo.// Бюлл. эксп. биол. мед.- 1992.-t.XCIX.-N 7.-С.40-42

4. Плавинская С.И., Шестов Д.Б., Плавинский С.Л., Хоптяр В.П. Роль факторов риска в прогнозе ИБС // Материалы конф. "Актуальные вопросы профилактики неинфекционных заболеваний", Москва.- 1993.-с.48.

5. Klimov A.N., Gurevich V.S., Nikiforova A.A., Shatilina L.V., Kuzmin A.A., Plavinsky S.L., Teryukova N.P. Antioxidative activity of high density lipoproteins in vivo//Atherosclerosis.-1993 .- v.100.-N4,-P.13-18

6. Plavinsky S.L., Kuznetsov A.S. Accepting of cholesterol by high density lipoproteins estimated by simple test and factor analysis.// Phys. Chem. Biol. & Med.- 1994,-v.l.-N 2,-P.lll-l 17

7. Константинов B.O., Липовецкий Б.М., Кузнецов A.C., Лозовский B.T., Васильева Л.Е., Кузьмин A.A., Плавинский С.Л., Климов А.Н. Результаты длительного применения липостабила и никотиновой кислоты для .течения больных с гиперлипидемией и ишемической болезнью сердца./ В кн.: Липостабил (под ред. В.Кухарчука).- Москва, Контимед,- 1993,- с.19-28

8. Klimov A.N., Gurevich V.S., Nikiforova A.A., Shatilina L.V., Kuzmin A.A., Plavinsky S.L. Antioxidative activity of high density lipoproteins in vivo.//IV Lipid-Meeting. Leipzig.-December, 1993.-p.15

9. Константинов В.О., Липовецкий Б.М., Лозовский В.Т., Кузнецов A.C., Васильева Л.Е., Кузьмин A.A., Плавинский СЛ., Климов А.Н. Роль эссенциальных фосфолипидов в лечении больных с атеросклерозом и ишемической болезнью сердца// Конференция кардиологов России. С.Петербург.- 1993,- с. 94-96

10.Плавинский СЛ., Кузьмин A.A. Об антиатерогенной функции липопротеидов высокой плотности.// Научная конференция молодых ученых России посвященная 50-летию академии медицинских наук./под ред. В.Н.Покровского.- Москва, Квартет. - 1994,- с.120-121

11 .Plavinskaya S.I., Shestov D.B., Nikulcheva N.G., Plavinsky S.L., Klimov A.N.The influence of dyslipoproteinemias on the 15-year mortality in the follow-up study// Abstr. of the 8th int.Dresden Synip. on Lipoproteins and Atherosclerosis.- Dresden, 1994,- p.44

12.Плавинский СЛ., Кузнецов A.C., Сминов A.B., Сазонец Г.И. Гидоперекиси липидов в составе апо-В содержащих липопротеидов у больных с хронической почечной недостаточностью// Проблемы XIXH. Материалы IV конференции нефрологов Северо-Запада России с участием ведущих специалистов из западно-европейских стран. 27-28 апреля 1995 г. Иматра (Финляндия).-с.Ю9

13.Плавинский СЛ., Смирнов A.B., Сазонец Г.И. Нарушение холестерин-акцепторной способности у липопротеидов высокой плотности выделен ных от больных с хронической почечной недостаточностью получающих лечение гемодиализом.// Проблемы ХПН. Материалы IV конференции нефрологов Северо-Запада России с участием ведущих специалисте из западно-европейских стран. 27-28 апреля 1995 г. Иматра (Финляндия).-с. 109

14.Klimov A.N., Gurevich V.S., Nikiforova A.A., Denisenko A.D., Kuznetsov

A.S., Shatilina L.V., Plavinsky S.L. High density lipoproteins have antioxidative activity in vivo// Atherosclerosis X,- -v.109.- N 1-2.- 1994,- p. 37-38

15.Куренкова Т.Ю., Плавинский СЛ. Характеристика субфракции липопро- теидов высокой плотности, обогащенной продуктами пероксдащш липидов.// VI симпозиум по биохимии липидов, Санкт-Петербург, 3-6 октября 1994 г. тезисы докладов./ под ред. член.-корр РАМН В.И.Швеца,- Пущинский научный центр, Москва.- 1995,- с.55

16.Плавинский СЛ., Куренкова Т.Ю., Васильева Л.Е., Константинов В.О. Характеристика степени повреждения липопротеидов продуктами перекисного окисления липидов при различных формах

дислилидсмий.// VI симпозиум по биохимии липидов, Санкт-Петербург, 3-6 октября 1994 г. тезисы докладов/, под ред. член.-корр РАМН

B.И.Швеца,- Пущинский научный центр, Москва. -1995,- с.85

17.Klimov A.N., Konstantinov V.O., Lipovetsky B.M., Kuznetsov A.S., Lozovsky V.T., Kuzmin A.A., Trufanov V.F., Plavinsky S.L., Schumacher H., Gundermann K.-J. "Essential" phospholipids versus nicotinic acid in the

treatment of patients with type lib hyperlipideraia and ischemic heart disease// Cardiovascular Drugs and Therapy.- 1995.- v.9.- p.71-74

18.Плавинская С.И.„Шестов Д.Б., Струков ЕЛ., Плавинский СЛ., Парфенова Н.С., Бобров Ю.Ф., Гамаюнова В.Б., Дипьман В.М. Связь ряда гормональных показателей с факторами риска ИБС и ее распространенностью в крупном популяционном исследовании.// Тер. архив .-1995,- 67,- N 9,- с. 17-21

19.Плавинский С.Л. Перекисное повреждение липопротеидов высокой плотности и их холестерин-акцепторная функция// Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций. -С.Петербург, 1995.-c.150

20.Богданов В.Л., Викторова E.H., Веселова Т.В., Кузнецов A.C., Плавинский С.Л. Флуоресцентная регистрация продуктов пероксидации в плазме крови и липопротеидах низкой плотности.// Оптический журнал.- 1995 - N 11,- с. 89-90

21 .Плавинский С.Л. Продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ) в липопротеидах высокой плотности (ЛПВП) и альбуминах плазмы крови. // Тезисы докладов симпозиума, посвященного 110-летию со дня рождения академика Н.Н.Аничкова.- С.Петербург, 1995.- с.82

22.Плавинский С.Л., Макеева Т.И., Белова Е.В., Галлиулина Р.Х., Константинов В.О., Кузнецов A.C. Взаимосвязь ряда липидных параметров с показателями перекисного повреждения липидов у здоровых лиц и пациентов с ИБС// Тезисы докладов симпозиума, посвященного 110-летию со дня рождения академика H.H. Аничкова.-СЛетербург, 1995.-c.83

23.Bogdanov V.L., Viktorova E.N., Veselova Т. V., Kuznetsov A.S., Plavinskii S.L. Fluorescence method of recording peroxidation products in human blood plasma and low-density lipoproteins.// J.Opt.Technol. - 1996,- v.63 .N 1 .- 100-101

24.Кузнецов A.C., Плавинский С.Л., Покровский C.H., Константинов В.О., Куренкова Т.Ю., Миссюль Б.В., Климов А.Н. Гидроперекиси апо-В-липопротендов, изолированные путем иммуно-афинной хроматографии.//БЭБМ,- 1996.-t.122,- N 8,- С.160-163

25.Денисенко А.Д., Савельева И.Н., Никульчева Н.Г., Плавинский С.Л., Трюфанов В.Ф., Олейникова Г.Н. Состояние липидного обмена у кроликов, родившихся от самок умеренной алиментарной гиперхолестеринемией// Биохимия,- 1996.-61.- N 9.-1324-1328

26.Plavinski S.L. The content of lipid peroxide products in human HDL//. Abstr. of the VII Lipid-Meeting Leipzig, Leipzig, 1996,- p.18

27.Плавинская С.И., Шестов Д.Б., Плавинский С.Л., Хоптяр В.П. Роль общего холестерина плазмы крови и холестерина ЛПВП в прогнозе ИБС. // Кардиология.- 1997,- N 2 .- с. 58-65

28.Климов А.Н., Плавинский С.Л. О причинах высокого уровня холестерина (ХС) ЛПВП в российской популяции//. Кадиология,-1997.-N3.- с. 22-25 ■

29.Плавинский СЛ., Кузнецов А.С. Перекисное повреждение липопротеидов высокой плотности и их холестерин-акцепторная функция.// Физиология человека.- 1997,- N 1,- 103-107

30.Plavinskaya S.I., Klimov A.N., Plavinski S.L. Is the impact of risk factors in coronary mortality independent of cholesterol level?// Can. J. Cardiol. 1997.-vol. 13, Suppl В.- P.210B-211B

31.Плавинский СЛ., Кузнецов А.С., Копелевич Ю.И., Светлых А.А. Содержание продуктов перекисного оксиления липидов в субфракциях ЛПВП, изолированных хроматофокусированием// Тезисы второго биохимического съезда, Пущино, 1997.- с.462-463

32.Plavinskaya S.I., Plavinski S.L., Shestov D.B., Parfenova N.S. Unconventional IHD risk factors. Role of the uric acid.// 9th International Dresden Symposium on Lipoproteins and Atherosclerosis, Dresden, 1997,- P. 38

33.Plavinski S.L., Kuznetsov A.S Fluorescent products in HDL measured by a new specialized fluorimeter and their correlation with the content of other lipid peroxide products.// Abstr. of the European Biomedical Optics Week '97 .-1997,-p. 3196-34

34.Plavinski S.L., Kuznetsov A.S., Kopilevich Y.I., Svetlykh A.A., Melnikov N.O. Fluorescent products in high density lipoproteins and their association with other lipid peroxide products.// Proc. SPIE .-1998,- vol. 3196 (Optical and Imaging Techniques for Biomonitoring III), ed.:H.-J. Foth; R. Marchesini; H. Podbielska.- P. 224-229

35.Plavinski S.L. Excretion of lipid peroxide products with human urine. Abstr. of the VIII Lipid-Meeting Leipzig, Leipzig, 1997, p.3-4

36.Плавинский СЛ., Пигаревский П.В., Загольская В.Н. Связь продуктов перекисного окисления липидов со степенью активации лейкоцитов in vivo/Материалы 1-ой медико-биологической конференции молодых ученых С.Петербурга, .-1997,- с.60-61

37.Плавинский СЛ. Продукты перекисного окисления липидов в моче лиц с ишемической болезнью сердца/ Материалы 1-ой медико-биологической конференции молодых ученых С.Петербурга.- 1997.-

с.59-60

38.Klimov A.N., Nikiforova A.A., Kuzmin A.A., Kuznetsov A.S., Plavinski S.L. On the capacity of high density lipoproteins to protect low density lipoproteins from oxidation and to remove from circulation some oxidized low density lipoprotein products.// Atherogenic LDL: Physiopathology and new therapeutic approaches. .-Royamont, 1997,- P.18

39.Парфенева H.C., Плавинская С.И., Плавинский СЛ., Хоптяр В.П., Мухина Н.А., Дэвис К.Э., Шестов Д.Б. Дислипидемическая гипертензия в сочетании с гиперинсулинемией, как риск фактор ишемической

болезни сердца. Российский кардиологический журнал.- 1997,- N 6.- с. 35-40

40.Плавинский С.Я. Содержание продуктов перекисного окисления липидов в моче лиц с ишемической болезнью сердца// Физиология человека.-1998.-N3,-121-125.

41.Plavinski S. V. Richter, F.Rassoul, W.Schilow, P.Pigarevski, V.Zagolskaya In vivo con-elation between white blood cells count and activity and the content of plasma lipid peroxidation products// Aktuelle Ernahnmgsmedizin.-1998.-23.-N4,- S. 196-197

42.Plavinski S. Content of lipid peroxidation products in the urine of patients with ischemic heart disease.// Human Physiology.- 1998,- v. 24,- p.365-369