Автореферат и диссертация по медицине (14.00.25) на тему:Коррекция цереброваскулярных, метаболических и функциональных нарушений произодными бета-аланина

На правах рукописи

Слюнькова Нина Евгеньевна

КОРРЕКЦИЯ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ, МЕТАБОЛИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ ПРОИЗВОДНЫМИ БЕТА-АЛАНИНА

14.00.25 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск - 2004

Работа выполнена в Пятигорской государственной фармацевтической академии

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Погорелый Василий Ефимович

Официальные аппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Гаевый Михаил Дмитриевич кандидат фармацевических наук Кожевников Сергей Александрович

Ведущая организация: ГУ НИИ фармакологии им. В.В Закусова РАМН, г. Москва

Защита состоится « 29 » ИЮНЯ 2004 г. в $ а с . на заседании дис-

сертационного совета Д 208.069.01 при Пятигорской государственной фармацевтической академии по адресу: 357532, г. Пятигорск, пр-т Калинина, 11.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорской государственной фармацевтической академии.

Автореферат разослан " 29 " НРй 2004 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор фармацевтических наук, профессор

Е.В. Компанцева

Актуальность. В настоящее время острые нарушения мозгового кровообращения являются наиболее распространенными заболеваниями головного мозга. Инсульт является третьей по частоте причиной смертности в большинстве стран и ведущей причиной инвалидности. В последние десять лет в России ежегодно регистрируется около 400 тыс. инсультов, из них чаще (70-80%) встречаются ишемические инсульты. Высокая летальность и инвалидизация больных с сосудистыми заболеваниями головного мозга обусловливают особую актуальность данной проблемы неврологии (Ворлоу Ч.П., 1998; Трошин В.Д., 1999; Гусев Е.И., 2001; Виленский Б.С., 2002, Гарибова Т.Л. и др., 2003). Терапия и предупреждение цереброваскулярных поражений представляет важнейшую проблему современной медицины, а распространенность заболеваний, сопровождающихся кислородным голоданием мозга, заставляет искать новые, патогенетически обоснованные методы терапии (Мирзоян Р.С. и др., 1995; Мартынов Ю.С., 1996; Гусев Е.И., 2001). Поиск новых эффективных средств ведется среди различных классов химических соединений. Особый интерес представляют соединения, синтезированные на основе нейромедиаторных аминокислот (Петров В.И., 1995; Погорелый В.Е. и др., 1998; Гаевый М.Д. и др., 2003; Островская Р.У., 2003). Поэтому в НИИ фармакологии при Волгоградском государственном медицинском университете профессором А.А. Озеровым была проведена работа по целенаправленному синтезу производных нейромедиатор-ной аминокислоты |3-аланина: ацилированного - N-ацетил- Р-аланин и фосфо-рилированного - АКФ 89-4 (3-(3-диметоксифосфорилпропокси-2-окси-1-пропиловый эфир N-ацетил-Р-аланина)), обладающих выраженным ноотроп-ным действием (Петров В.И., 1997).

Учитывая высокую церебропротекторную активность аминокислот и препаратов, созданных на их основе (Петров В.И., 1997), а также то, что аланин является структурным компонентом кальция пантотената (кальциевая соль D (+) а,у-диокси- Р,Р--диметилбутирил-Р~аланина), представляется перспективным изучение Р-аланина и его производных т N-ацетгоН:

fUC НАЦИОНАЛЬНА

89-4 и кальция пантотената в качестве

I апе ' « о» по*

Цель работы: экспериментальное изучение нейропротекторной активности р-аланина и его производных - ^ацетил-Р-аланина и АКФ 89-4 в сравнении с кальция пантотенатом.

Задачи исследования:

1. Провести изучение антигипоксической активности Р-аланина и его производных.

2. Исследовать эффективность применения Р-аланина, ^ацетил-Р-аланина, АКФ 89-4 в условиях экспериментальной нормы и острых нарушений мозгового кровообращения при профилактическом и терапевтическом применении.

3. На основании противогипоксической активности и результатов исследования воздействия церебральную гемодинамику выявить дозы, оказывающие наиболее выраженное нейротропное действие.

4. Изучить влияние терапевтического применения Р-аланина, ^ацетил-Р-аланина, АКФ 89-4 на метаболизм мозга при его ишемическом повреждении.

5. Провести сравнение нейропротекторной активности р-аланина и его производных с кальция пантотенатом.

Научная новизна.

Впервые выявлена противогипоксическая активность у Р-аланина, N ацетил- Р-аланина, АКФ 89-4 и кальция пантотената на различных моделях гипоксии. Экспериментально показано, что наиболее выраженное антигипоксиче-ское действие из изучаемых производных Р-аланина оказывает АКФ 89-4.

Установлено дозозависимое действие Р-аланина, ^ацетил- Р-аланина, АКФ 89-4 и кальция пантотената на параметры церебральной гемодинамики в условиях экспериментальной нормы и при реперфузионных повреждениях мозга. Экспериментально показано, что в постишемическом периоде Р-аланин, N ацетил- Р-аланин, АКФ 89-4 и кальция пантотенат угнетают развитие постише-мических феноменов - гиперемии и гипоперфузии и способствуют поддержа-

нию ауторегуляторных реакций сосудов мозга.

Получены новые данные о механизме нейропротекторного действия р-аланина, его производных и кальция пантотената. Показано, что эффективность в качестве корректоров ишемических повреждений мозга связана с поддержанием мозгового кровотока, активацией потребления глюкозы мозгом, угнетением гипопротеинемии, гиперкальциемии, эндогенной интоксикации, развития отека-набухания головного мозга и процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.

Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР кафедры фармакологии Пятигорской государственной фармацевтической академии в рамках темы «Поиск и изучение новых церебропротекторов среди агонистов и антагонистов рецепторов нейромедиаторных аминокислот» (номер государственной регистрации 0.1.200.112152).

Практическая значимость.

Выявленная антигипоксическая и противоишемическая активность кальция пантотената расширяет представления о его механизме действия при церебральных патологиях ишемического генеза.

Полученные данные о наличии антигипоксической и нейропротекторной активности р-аланина, М-ацетил- Р-аланина и АКФ 89-4 свидетельствуют о перспективности поиска новых нейропротекторов в ряду производных Р-аланина.

Экспериментально обоснована целесообразность дальнейшего проведения исследований АКФ 89-4 в качестве нейропротектора при острых и хронических ишемических нарушениях в мозге в объеме требований Фармакологического государственного комитета.

Внедрения результатов исследования.

На основании полученных данных составлен отчеты по исследованию

противогипоксической и нейропротекторной активности Р-аланина и его производных, которые были представлены в НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета и используются в научно -исследовательской работе по целенаправленному синтезу нейропротекторов среди новых производных нейромедиаторных аминокислот, что подтверждено 2 актами внедрения.

Апробация работы.

Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на 57-й, 58-й, 59-й Региональных конференциях «Проблемы фармации, фармакологии и подготовки кадров» (Пятигорск, 2002; 2003; 2004), 68-й Республиканской итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых Республики Башкортостан с международным участием, посвященной Году Спорта и здорового образа жизни (Уфа, 2003), I Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003), Всероссийской конференции «Молодые ученые - медицине. Аспирантские чтения» (Самара, 2003), III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Р-Алании, ^ацетил- Р-аланин, АКФ 89-4 и кальция пантотенат способствуют увеличению резистентности организма к дефициту кислорода.

2. Р-Аланин, ^ацетил£аланин, АКФ 89-4 и кальция пантотенат угнетают развитие постишемических феноменов и способствуют сохранению ауторегуля-ции сосудов мозга в период реперфузии.

3. Нейропротекторный эффект Р-аланина, ^ацетил- Р-аланина, АКФ 89-4 обусловлен противогипоксическим, сосудистым, метаболическим действием.

4. АКФ 89-4 превосходит по нейропротекторной активности Р-аланин, N ацетил- -аланин и кальция пантотенат.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 12 работ, в том числе 3 статьи и 9 тезисов.

Объём и структура диссертации. Работа изложена на 143 страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав экспериментальных исследований и выводов, содержит 6 таблиц, 34 рисунка.

Список литературы включает 195 источника, в том числе 54 на иностранных языках.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Противогипоксическую активность изучали на моделях гемической, гис-тотоксической, гиперкапнической гипоксии. Критерием противогипоксическо-го действия являлось увеличение времени жизни животных (% по отношению к контролю) (Новиков B.C. и др., 2000). Устойчивость к гипобарической гипоксии исследовали путем подъема животных на высоту 11 000 м со скоростью 100 м/с в специальной барокамере (Дергунов А.В., Дергунов А.А., 2000).

Для создания ишемии головного мозга использовали следующие модели: пережатие обеих сонных артерий у крыс на 10-15 мин. с последующим снижением САД до 40 мм рт.ст. (Мирзоян Р.С. и др., 1998) и окклюзия левой сонной артерии в течение 3 суток (Погорелый В.Е., 2001).

Объемную скорость мозгового кровотока (МК) у крыс регистрировали методом водородного клиренса с помощью платинового электрода, расположенного на поверхности сагиттального синуса в области стока синусов (Демченко И.Т., 1981; Митагвардия Н.П., 1983). Для изучения регуляторных реакций сосудов мозга моделировали острые сдвиги системного артериального давления (САД) методом кровопускания. О характере цереброваскулярных изменений судили по показателям - объемная скорость мозгового кровотока и сопротивление сосудов мозга (ССМ) при различных уровнях САД. Оценку регу-ляторных возможностей системы внутричерепного кровообращения производили путем определения ауторегуляторных реакций сосудов мозга (Погорелый В.Е., Гаевый М.Д. и др., 1998).

При исследовании метаболизма мозга в качестве биологического материала использовали кровь и мозг животных. Забор артериальной крови осуществляли из сонной артерии, венозной - из стока венозных синусов. Содержание глюкозы в крови определяли с помощью набора фирмы «Агат», молочной ки- . слоты (МоК) - по методу Балаховского-Наточина (Меньшиков В.В. и др., 1987), пировиноградной кислоты - модифицированным методом Умбрайта (Камышников B.C., 2003). Энергетический обмен мозга оценивали также по показателям: «потребление глюкозы мозгом», «потребление лактата мозгом», «потребление пирувата мозгом» (Чернышева Г.А. и др., 1989).

Общий белок определяли биуретовым методом с помощью набора фирмы «Агат». Концентрацию ионов кальция в сыворотке крови определяли колориметрически по цветной реакции с металлохромогенным «арсеназо Ш» с помощью набором фирмы «Диакон Диагностика». Средние молекулы определяли по реакции осаждения хлорной кислотой (Камышников B.C., 2003). Диеновую конъюгацию (ДК) ненасыщенных жирных кислот определяли в слое «гептан-бутанол» (Костюк В.А. и др., 1984). Концентрацию вторичных продуктов ПОЛ в пересчете на малоновый диальдегид (МДА) проводили по тесту с тиобарби-туровой кислотой (Гаврилов В.Б. и др., 1987). Определяли также активность ферментов антиоксидантной защиты - каталазы (Королюк М.А. и др., 1988) и супероксиддисмутазы (СОД) (Сирота Т.В., 1999).

Опыты проведены на 640 мышах массой 18-20 г и 384 белых беспородных крысах массой 220-250 г. В острых опытах для наркоза использовали уре-тан 500 мг/кг). Коагуляцию крови • предотвращали введением гепарина (500 ед/кг). Водные растворы изучаемых соединений вводили внутрибрюшинно профилактически (мышам за 30 мин. до моделирования гипоксии, крысам — за 60 минут до моделирования ишемии) и терапевтически (в постишемическом периоде, на 1-й мин. реперфузии). При исследовании соединений в контрольных опытах животным вводили физиологический раствор в эквивалентных объемах. Оценку нейропротекторного действия р-аланина, N-ацетил- р-аланина и АКФ 89-4 проводили в сравнении с кальция пантотенатом. Объекты исследо-

вания вводили в дозах 1, 10, 50 и 100 мг/кг. Выбор доз обусловлен ранее проведенными исследованиями (Петров В.И., 1997).

Для обработки результатов экспериментов внутри серий использовали статистические методы с нахождением средней арифметической (М), средней ошибки средней арифметической (т) и вероятности ошибки по таблицам Стьюдента, между сериями — по критерию инверсий Вилкоксона — Манна-Уитни. (Поляков И.В., Соколова Н.С., 1975; Гланц С, 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучениепротивогипоксическойактивности р-аланина и его производных

Первым этапом исследования явилась оценка противогипоксической активности -аланина и его производных в сравнении с кальция пантотенатом (табл. 1).

Выявлено, что -аланин оказывает выраженный противогипоксический эффект на трех моделях гипоксии: гемической, гистотоксической и гиперкап-нической. Отмечены наиболее эффективные дозы -аланина при моделировании гемической гипоксии — 1 и 100 мг/кг, гистотоксической — 10 мг/кг, гипер-капнической — 1 и 100 мг/кг.

Установлено, что введение ^ацетил-р-аланина эффективно на моделях гемической, гистотоксической и гипобарической гипоксии в дозе 100 мг/кг.

Экспериментально показано, что среди всех исследуемых соединений лишь АКФ 89-4 проявляет антигипоксическую активность на всех моделях гипоксии - гемической, гистотоксической, гипобарической и гиперкапнической. Показано, что эффективными противогипоксическими дозами АКФ 89-4 являются 100 мг/кг для гемической, 1 мг/кг для гистотоксической, 50 мг/кг для ги-побарической и 10 мг/кг для гиперкапнической гипоксии.

При введении кальция пантотената антигипоксическое действие установлено только в условиях гистотоксической и гипобарической гипоксии в дозах 1, 10 мг/кг и 50, 100 мг/кг соответственно.

Таблица 1 - Антигипоксическая активность бета-аланина и его производпых

Доза Время жизни животных, % по отношению к контролю

Гемическая. гипоксия Гистотокси-ческая гипоксия ~ Гипобариче-ская гипоксия Гиперкапниче-ская гипоксия

Бета-ал ании»

1 мг/кг +36,0±1,9** +47,8±1,7* +10,3±0,6* +37,0±1,5**

10 мг/кг -8,8±1,2* +53,9±2,1* -22,4±1,6** +27,2±2,3**

50 мг/кг +4,8+1,9* +1,8±0,8 -17,0+0,7*" 0±0,4

100 мг/кг +11,2+3,1* +6,2+1,1' -4,5±1,1# +39,5±2,0**

1Ч-ацетил-бета-аланин

1 мг/кг +2,5±0,6* +80,9+3,5** +38,7±2,2* -20,2+1,7*

10 мг/кг +13,6±1,3* +51,3 ±2,9* +60,0+1,8** -20,8±1,2*

50 мг/кг +19,8±1,8** +65,2±1,5*" +48,0±1,4** -13,1±1,1

100 мг/кг +40,7+2,6*" +80,9±1,8*1' +93,3±1,3** -13,1+0,8

АКФ 89-4

1 мг/кг -7,4±3,2* +66,9+2,3*" +47,9±2,6* -9,5+1,4

10 мг/кг -9,9±1,7* +39,1±1Д*' +15,2±1,8* +33,5±2,2**

50 мг/кг +18,5±1,3*# +63,5±1,4** +54,5±1,2*# +6,2±1,9

100 мг/кг +43,2±2,0** +44,3±1,7** -4,2±2,0# 0+1,1

Кальция пантотенат

1 мг/кг -43,8±1,9* +40,8+3,1* +43,3 ±1,9* -13,7±1,3*

10 мг/кг -49,3±2,0* +54,2±1,6* +21,3±1,4* -7,1 ±3,0

50 мг/кг -52,0±1,4* -3,3+1,2 +77,5±3,0* -2,5±2,1

100 мг/кг -42,9±1,9* +26,6+0,9 +75,8±2,2* -10,5+0,5*

Обозначены статистически значимые отклонения (р<0,05): * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с кальция пантотенатом

Таким образом, экспериментально установлено, что Р-аланин, ^ацетил-Р-аланин и АКФ 89-4 превосходят антигипоксический эффект кальция панто-тената.

Изучение влияния @-аланина и его производных на показатели церебральной-

гемодинамики,

В условиях экспериментальной нормы выявлено, что введение -аланина, ^ацетил-Р-аланина, АКФ 89-4 и кальция пантотената в дозе 1 мг/кг вызывает фазные изменения показателей церебральной гемодинамики. Отмечено, что исследуемые соединения, кроме ^ацетил- р-аланина, повышают МК на 5-и и

60-й минуте и снижают его на 30-й минуте эксперимента, что обусловлено их влиянием на сосудистый тонус. Следует отметить, что к концу эксперимента при введении всех изучаемых соединений наблюдается гипотензивная реакция (снижение САД происходит на 15-27%). Наиболее выраженные изменения в условиях экспериментальной нормы вызывает -аланин, который увеличивает МК на 66,6+3,4% и одновременно снижает САД на 27,0+1,3% на 60-й минуте опыта.

В группе контрольных животных с ишемией мозга в период реперфузии наблюдалось чередование характерных фаз ишемического повреждения мозга: короткая фаза реактивной гиперемии (повышение МК на 30,4+3,1%) и следующая за ней фаза гипоперфузии - феномен «по-гейо'№» (снижение МК на 34,5+2,1%). Также отмечено, что ишемия мозга приводит к срыву ауторегуля-торных реакций церебральных сосудов уже при снижении САД до 80 мм рт.ст.

При профилактическом введении р-аланина, АКФ 89-4 и кальция пантоте-ната наблюдается купирование как реактивной гиперемии, так и гипоперфузии. Применение К-ацетил-Р-аланина не оказывает влияния на выраженность фазы гиперемии, но препятствует развитию фазы гипоперфузии (рис. 1).

200 150 100 * 50 0 -50 -100

--^-чг—

* . -У- и ......■••/"«

, +# ,

*

Исход

15

30

45

60 мин.

бета-ал анин 1 мг/кг ^ АКФ 89-4 1 мг/кг

■ - И-ацетил-бета-аланин 1 мг/кг: »—Кальция пантотенат 1 мг/кг I

Обозначены статистически значимые (р<0,05) отклонения:

* - по сравнению с контролем, # - по сравнению с кальция пантотенатом. По оси абсцисс - время наблюдения (мин.), по оси ординат - изменения МК в % Рисунок 1 Влияние профилактического введения бета-аланина

и его производных на объемную скорость мозгового кровотока в постишемическом периоде (% относительно контроля)

При анализе эффективности терапевтического введения объектов исследования установлено (рис. 2), что К-ацетил-р-аланин и кальция пантотенат существенным образом препятствуют развитию постишемической гиперемии, р-аланин и АКФ 89-4 не влияют на ее выраженность, и лишь К-ацетил-Р-аланин лимитирует развитие также и постишемической гипоперфузии (рис. 2).

Обозначены статистически значимые (р<0,05) отклонения: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с кальция пантотенатом.

По оси абсцисс - время наблюдения (мин.), по оси ординат - изменения МК в % Рисунок 2 - Влияние терапевтического введения бета-аланина и его производных на объемную скорость мозгового кровотока (% относительно контроля)

Профилактическое введение -аланина и АКФ 89-4 в постишемическом периоде эффективно способствуют поддержанию ауторегуляторных реакций церебральных сосудов даже при снижении САД до 40 мм рт.ст. (рис. ЗА).

Установлено, что АКФ 89-4 и кальция пантотенат при терапевтическом введении при ишемии мозга способствуют сохранению феномена ауторегуля-ции в физиологических пределах, а кальция пантотенат поддерживает ауторе-гуляторные реакции сосудов мозга даже при снижении САД до 40 мм рт.ст. (рис. ЗБ).

Таким образом, выявлено, что в условиях экспериментальной нормы введение объектов исследования в дозе 1 мг/кг приводит к увеличению МК на фоне гипотензивной реакции, а их профилактическое в дозе 1 мг/кг и лечебное введение в дозе 50 мг/кг для Р-аланина, 1 мг/кг для К-ацетил- р-аланина, 100

Л - профилактическое введение, Б - терапевтическое введение Обозначены статистически значимые (р<0,05) отклонения: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с кальция пантотенатом. По оси абсцисс - САД, мм рт.ст., по оси ординат - изменения МК в %

Рисунок 3 - Ауторегуляторные реакции сосудов мозга в постишемическом периоде при введении бета-аланина и его производных (% относительно контроля)

мг/кг для АКФ 89-4 и 10 мг/кг для кальция пантотената в постишемическом периоде угнетает развитие гиперемии и гипоперфузии и способствует поддержанию ауторегуляторных реакций сосудов мозга.

Изучение влияния Р—аланина и его производных на основные показателиметаболизмамозга

При изучении влияния (З-аланина и его производных на метаболизм мозга в качестве модели ишемии мозга использовали одностороннюю окклюзию левой сонной артерии в течение 3-х суток. У животных с ишемией мозга относительно интактных животных выявлены следующие изменения: увеличение содержания в мозге ДК на 35,3+3,3% и МДА - в правом на 35,3+1,9% и левом на 125,0±3.2% полушариях мозга, гипопротеинемия - уменьшение содержания общего белка на 26,7+2,2%, гиперкальциемия - увеличение концентрации ионов

кальция на 42,9+3,5%, гипергликемия - увеличение концентрации глюкозы на 24,7+2,4% и формирование отека-набухания головного мозга на 11,3+1,1%.

Установлено, что К-ацетил- р-аланин снижает содержание общего белка в плазме крови на 23,1+1,6% по сравнению с контролем, а Р-аланин, АКФ 89-4 и кальция пантотенат не оказывают существенного влияния на данный показатель (рис. 4).

Экспериментально выявлено, что АКФ 89-4 угнетает развитие отека-набухания головного мозга на 15,3+0,9% относительно контрольных опытов, превосходя действие кальция пантотената более чем в 1,8 раз, в то время как введение р-аланина и К-ацетил- р-аланина не препятствует гидратации мозга (рис. 4).

Применение К-ацетил- р-аланина ограничивает гиперкальциемию на 30,1+1,8%, АКФ 89-4 - на 13,2+1,7% по сравнению с контролем, а Р-аланин не оказывает влияния на исследуемый показатель (рис. 4).

При анализе эндогенной интоксикации установлено, что наиболее

Обозначены статистически значимые (р<0,05) отклонения: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с кальция пантотенатом. По оси абсцисс - изучаемые показатели, по оси ординат - изменения показателей в Рисунок 4 - Влияние бета-аланина и его производных

на проницаемость мембран и эндогенную интоксикацию (% относительно контроля)

выраженно снижают концентрацию средних молекул в сыворотке крови N ацетил- (3-аланин и АКФ 89-4 соответственно на 45,3+3,3% и 43,4+2,9% по сравнению с контролем. Терапевтическое введение -аланина не влияет на уровень средних молекул в сыворотке крови ишемизированных животных, а препарат сравнения кальция пантотенат даже увеличивает концентрацию молекул средней массы на 27,3+1,3% по сравнению с животными без лечения (рис. 4).

Учитывая, что энергодефицит является одним из основных патогенетических факторов ишемии (Гусев Е.И., Скворцова В.И., 2001), нами было проведено сравнительное изучение влияния р-аланина, ^ацетил-{3-аланина, АКФ 89-4 и кальция пантотената на углеводный обмен мозга.

Установлено, что среди исследуемых соединений лишь при введении аланина и ^ацетил- Р-аланина наблюдается угнетение постишемической гипергликемии на 36,1+2,4% и 37,2+2,2% соответственно.

Анализ показателей метаболитов глюкозы — лактата и пирувата свидетельствует, что ^ацетил-Р-аланин и кальция пантотенат существенным образом угнетают выраженность лактат-ацидоза как в артериальной, так и в венозной крови, снижая уровень молочной кислоты более чем на 20%, а -аланин и АКФ 89-4 не оказывают влияния на данный показатель.

При анализе показателя «утилизация глюкозы мозгом» выявлено, что только ^ацетил- Р-аланин и АКФ 89-4 препятствуют постишемическому снижению потребления глюкозы мозгом (на 24,4+1,8% и 18,1+1,6% соответственно) (рис. 5). Препарат сравнения кальция пантотенат угнетает утилизацию глюкозы ишемизированным мозгом относительно контроля на 44,5+2,7% (рис. 5).

Экспериментально установлено, что применение АКФ 89-4 и кальция пантотената тормозит накопление первичных продуктов ПОЛ в мозге на 12,8+0,8%, тогда как -аланин увеличивает концентрацию исследуемых продуктов пероксидации на 80,0+З,2% по сравнению с животными контрольной группы (рис. 6).

утилизация глюкозы утилизация лактата утилизация пирувата

| Ш Бета-аланин ЕШ-ацетил-бета-аланин | | РАКФ 89-4_И Кальция пантотенат_|

Обозначены статистически значимые (р<0,05) отклонения: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с кальция пантотенатом. По оси абсцисс - изучаемые показатели, по оси ординат - изменения показателей в Рисунок 5 - Влияние бета-аланина и его производных на утилизацию глюкозы, лактата и пирувата мозгом при его ишемии (% относительно контроля)

мозг(прав.) мозг (лев.) эритроциты | ЕЗ Бета-аланини Н Ы-ацетил-бета-аланин j I И АКФ 89-4_И Кальция пантотенат |

Обозначены статистически значимые (р<0,05) отклонения: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с кальция пантотенатом. По оси абсцисс - изучаемые показатели, по оси ординат - изменения показателей в % Рисунок 6 - Влияние бета-аланина и его производных на процессы ПОЛ (% относительно контроля)

Выявлено, что К-ацетил- р-аланин уменьшает содержание МДА в левом и правом полушариях головного мозга соответственно на 30,4+1,2% и 27,1+2,4% по сравнению с группой животных без лечения (рис. 6). Соединение АКФ 89-4 практически не оказывает влияние на концентрацию ТБК-активных продуктов в правом полушарии мозга, однако эффективно (на 25,6+1,4%) препятствует их накоплению в левом. Терапевтическое введение кальция пантотената не влияет на уровень МДА в мозге, а Р-аланин усугубляет данный процесс, т.к. концентрация ТБК-активных продуктов возрастает относительно контрольной группы животных на 142,1+4,7% в левом и на 116,6+3,8% в правом полушариях мозга (рис. 6). При анализе ТБК-активных продуктов в гемолизате эритроцитов выяв- -лено, что -аланин уменьшает концентрацию малонового диальдегида на 28,7+1,9% относительно контрольной серии опытов, а К-ацетил- Р-аланин, АКФ 89-4 и кальция пантотенат не влияют на данный показатель (рис. 6).

Заключительным этапом исследования явилось изучение терапевтического введения Р-аланина и его производных на активность ферментов антиокси-дантной защиты каталазы и СОД. Установлено, что Р-аланин увеличивает активность СОД на 42,8+3,0%, К-ацетил- р-аланина - на 39,4+2,7%, АКФ 89-4 -на 137+5,3% по сравнению с контрольной группой животных, чем, видимо, и обусловлено снижение процессов пероксидации при введении данных соединений. Введение кальция пантотената снижает активность СОД на 29,9+4,1% (рис. 6). У животных, которым вводили К-ацетил- -аланин и кальция пантоте-нат, не наблюдается увеличения активности каталазы, тогда как при введении Р-аланина и АКФ 89-4 отмечали падение активности данного фермента на 20,6+2,4% и 29,9+1,7% соответственно.

Таким образом, изучение влияния Р-аланина, К-ацетил- Р-аланина, АКФ 89-4 и кальция пантотената на метаболизм мозга при его ишемическом повреждении свидетельствует, что нейропротекторное действие -аланина и кальция пантотената менее выражено, чем у К-ацетил-р-аланина и АКФ 89-4.

ВЫВОДЫ

1. Экспериментально установлено наличие противогипоксической активности у р-аланина, ^ацетил-Р-аланина, АКФ 89-4 и кальция пантотената.

2. Отмечено, что эффективные нейропротекторные дозы: при профилактическом введении для всех исследуемых соединений — 1 мг/кг; при терапевтическом для р-аланина - 50 мг/кг, для ^ацетил- Р-аланина - 1 мг/кг, для АКФ 89-4 - 100 мг/кг, для кальция пантотената - 10 мг/кг.

3. Показано, что в условиях экспериментальной нормы Р-аланин, ^ацетил-Р-аланин, АКФ 89-4 и кальция пантотенат увеличивают объемную скорость мозгового кровотока и снижают системное артериальное давление.

4. Выявлено, что в постишемическом периоде Р-аланин, ^ацетил- Р-аланин, АКФ 89-4 и кальция пантотенат как при профилактическом, так и при терапевтическом введении угнетают развитие постишемических феноменов — гиперемии и гипоперфузии, а также способствуют поддержанию ауто-регуляторных реакций сосудов мозга.

5. Установлено, что -аланин, его производные и кальция пантотенат препятствует вызванному ишемией нарушению углеводного обмена, угнетают развитие отека-набухания головного мозга, ограничивает процессы пероксидации липидов мембран в мозге, а также гипопротеинемию и ги-перкациемию.

6. Экспериментально доказано, что эффективность применения АКФ 89-4 в качестве корректора ишемических повреждений мозга превосходит эффективность применения _р-аланина, ^ацетил- Р-аланина и кальция пантотената.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Анализ изменений церебральной гемодинамики и метаболизма мозга при левосторонней окклюзии сонной артерии в течение трех суток // Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция: Тез. докл. Рос. конф. (с меж-дунар. участием) (3; 7-9 октября 2002.; Москва). - М.: Изд-во РАМН, 2002. - С. 78-79. (Соавт. Макарова Л.М., Погорелый В.Е., Морозова В.Е., Слюнькова Т.Е., Приходько М.А.)

2. Особенности действия пантотеновой кислоты и винпоцетина в условиях тканевой гипоксии // Вопросы теоретической и практической медицины: Материалы 68-й Респуб. итоговой науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых Республики Башкортостан с междунар. участием, посвящ. Году Спорта и здорового образа жизни. - Уфа: Изд-во БГМУ, 2003. — С. 28-29. (Соавт. Макарова Л.М.;

3. Изучение влияния производного -аланина на церебральную гемодинамику // Вопросы теоретической и практической медицины: Материалы 68-й Респуб. итоговой науч.-практ. конф. студентов и молодых ученых Республики Башкортостан с междунар. участием, посвящ. Году Спорта и здорового образа жизни. - Уфа: Изд-во БГМУ, 2003. - С. 30. (Соавт. Макарова Л.М., Слюнькова Т.Е.)

4. Изучение антигипоксической активности -аланина и его производных // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Материалы межрегион, конф. по фармации, и фармакологии (58; 2003; Пятигорск): Материалы... - Пятигорск: ПятГФА, 2003. - С. 377378. (Соавт.Погорелый В.Е., Макарова Л.М., Слюнькова Т.Е.)

5. Оценка антигипоксической активности нового фосфорилированного производного нейромедиаторной аминокислоты -аланина / Н.Е. Слюнькова, В.Е. Погорелый, Л.М. Макарова и др. // Токсикологический вестник. — 2003. - № 5. — С. 13-16. (Соавт. Погорелый В.Е., Макарова Л.М., Слюнькова Т.Е.)

6. Антигипоксическая активность Р-аланина // Человек и лекарство: Тез. докл. 10 Рос. нац. конгресса 7-11 апр. 2003 г. - М., 2003. - С. 663-664.

7. Влияние производных нейромедиаторных аминокислот на процессы пе-рекисного окисления липидов при ишемии мозга // Человек и лекарство: Тез. докл. 10 Рос. нац. конгресса 7-11 апр. 2003 г. - М., 2003. - С. 664. (Соавт. Погорелый В.Е., Макарова Л.М., Приходько М.А., Слюнькова Т.Е., Морозова В.Е.)

8. Новые аспекты изучения фармакологической активности кальциевой соли пантотеновой кислоты // Фундаментальные проблемы фармакологии: Сб. тез. 2-го Съезда Рос. нац. общ-ва фармакологов 21-25 апр. 2003 г. -М., 2003. - Ч.11. - С. 89. (Соавт. Погорелый В.Е., Макарова Л.М., Слюнь-кова Т.Е.)

9. Разработка принципов и методологических особенностей изучения потенциальных нейропротекторов // Клинические исследования лекарственных средств: Материалы междунар. конф. (3; 15-17 октября 2003 г; Москва). - М., 2003. - С. 339-341. (Соавт. Погорелый В.Е., Макарова Л.М., Слюнькова Т.Е.)

10. Использование ауторегуляторных реакций сосудов мозга в качестве интегративного показателя для оценки нейропротекторного действия // Санкт-Петербургская медицинская Ассамблея-2003 «Врач-провизор-пациент»: Материалы Ассамблеи. — СПб: ООО «Гастро», 2003. - С. 6263. (Соавт. Погорелый В.Е., Макарова Л.М., Слюнькова Т.Е.)

11. Реакция аутоокисления адреналина как метод скрининговой оценки антиокислительной активности // Аналитика и аналитики: Каталог рефератов и статей междунар. форума 2-6 июня 2003 г. - Воронеж, 2003. - Т. 2. - С. 384. (Соавт. Погорелый В.Е., Макарова Л.М., Слюнькова Т.Е.)

12. Изучение влияния Р-аланина на церебральную гемодинамику и ауторе-гуляцию мозгового кровотока // Молодые ученые - медицине (Аспирантские чтения-2003): Сб. тезисов докладов Всерос. конф. - Самара, 25-26 сентября 2003. - Самара: СамГМУ, 2003 - С. 258-259.

КОРРЕКЦИЯ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ, МЕТАБОЛИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ НАРУШЕНИЙ ПРОИЗВОДНЫМИ БЕТА-АЛАНИНА

СЛЮНЬКОВА НИНА ЕВГЕНЬЕВНА

Автореферат диссертации на соисканиеученой степени кандидата фармацевтическихнаук

Подписано в печать 2004 г.

Формат бумаги 60x84 1/16. Бумага книжно-журнальная. Печать ротапринтная Усл. печл. 1.0. Тираж 100 экз. Заказ № 1209 Пятигорская государственная фармацевтическая академия 357532, г. Пятигорск, пр-т Калинина, 11

04- 1 3 6 9 6

В настоящее время острые нарушения мозгового кровообращения (ОНМК) являются наиболее распространенными заболеваниями головного мозга [36, 139]. Инсульт является третьей по частоте причиной смертности в большинстве стран и ведущей причиной инвалидности [128, 134]. В последние десять лет в России ежегодно регистрируется около 400 тыс. инсультов, из них чаще (70-80%) встречаются ишемические инсульты. Основным патогенетическим направлением в лечении ОНМК в настоящее время считают борьбу с шиемической гипоксией мозга путем применения средств метаболической защиты, цереброваскулярных препаратов и препаратов, улучшающих микроциркуляцию [36, 53, 76, 139].

Высокая летальность и инвалидизация больных с сосудистыми заболеваниями головного мозга обусловливают особую актуальность данной проблемы неврологии [94, 95, 99]. Терапия и предупреждение цереброваскулярных поражений представляет важнейшую проблему современной медицины, а распространенность заболеваний, сопровождающихся кислородным голоданием мозга, заставляет искать новые, патогенетически обоснованные методы терапии [19, 37, 59, 72,89, 108, 109, 111, 132, 141, 164, 190]. Поиск новых эффективных средств ведется среди различных классов химических соединений [26, 91, 95, 99, 112, 130]. Особый интерес представляют новые соединения, синтезированные на основе эндогенных метаболитов, в том числе этими соединениями являются нейромедиаторные аминокислоты [95, 99, 100, 101].

Еще в 60-х годах XX века была высказана гипотеза о том, что дикарбо-новые аминокислоты - глутаминовая и аспарагиновая, являются медиаторами в возбуждающих синапсах, а монокарбоновые аминокислоты, такие, как ГАМК, р-аланин и глицин, выполняют роль медиаторов в тормозных синапсах [100, 102]. В настоящее время хорошо изучены и успешно применяются в качестве нейропротекторов возбуждающие и тормозные нейромедиаторные аминокислоты и их препараты: глутаминовая кислота и глутаминат кальция, глицин, многочисленные препараты ГАМК (пирацетам, пикамилон, фенибут и др.). Однако особенности действия ß-аланина на ЦНС в условиях нормы и ишемии мозга не изучены.

Учитывая высокую церебропротекторную активность аминокислот и препаратов, созданных на их основе [101, 102], в НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета профессором A.A. Озеровым была проведена работа по целенаправленному синтезу производных аминокислоты ß-аланина - ацилированному (соединение N-ацетил-Р-аланин) и фосфорилированному (соединение АКФ 89-4), обладающих выраженным нейротропным действием. Эффективность фармакологической коррекции ишемических и реперфузионных повреждений головного мозга ß-аланином и его производными не исследовалась, что явилось основанием для проведения системного изучения вышеперечисленных соединений в качестве нейропроте кторов.

Не смотря на то, что не существует препаратов ß-аланина, кальция пантотенат (кальциевая соль D (+) а,у-диокси^$-диметилбутирил^-аланина) можно рассматривать в качестве препарата на его основе. В медицинской практике он применяется в качестве вспомогательного средства при терапии нарушений обмена веществ различного генеза. Вместе с тем известно, что пантотеновая кислота в организме входит в состав кофермента А, играющего важную роль в процессах ацетилирования, окисления; она участвует в углеводном и жировом обмене, в синтезе ацетилхолина; стимулирует образование кортикостероидов [6, 13, 90]. Учитывая важную биологическую роль пантотеновой кислоты, а также то, что ß-аланин является структурным компонентом кальция пантотената, представляется целесообразным провести изучение ß-аланина и его производных - И-ацетил^-аланина, АКФ 89-4, а также кальция пантотената в качестве нейропротекторов.

Цель работы: экспериментальное исследование нейропротекторной активности р-аланина и его производных - К-ацетил-р-аланина и АКФ 89-4 в сравнении с кальция пантотенатом.

Задачи исследования:

1. Провести изучение антигипоксической активности Р-аланина и его производных.

2. Исследовать эффективность применения Р-аланина, Ы-ацетил-Р-аланина, АКФ 89-4 в условиях экспериментальной нормы и острых нарушений мозгового кровообращения при профилактическом и терапевтическом применении.

3. На основании противогипоксической активности и результатов исследования воздействия церебральную гемодинамику выявить дозы, оказывающие наиболее выраженное нейротропное действие.

4. Изучить влияние терапевтического применения Р-аланина, ацетил-(3-аланина, АКФ 89-4 на метаболизм мозга при его ишемиче-ском повреждении.

5. Провести сравнение нейропротекторной активности Р-аланина и его производных с кальция пантотенатом.

Научная новизна.

Впервые выявлена противогипоксическая активность у Р-аланина, И-ацетил-Р-аланина, АКФ 89-4 и кальция пантотената на различных моделях гипоксии. Экспериментально показано, что наиболее выраженное антигипок-сическое действие из изучаемых производных Р-аланина оказывает АКФ 894.

Установлено дозозависимое действие р-аланина, Ы-ацетил-Р-аланина,

АКФ 89-4 и кальция пантотената на параметры церебральной гемодинамики в условиях экспериментальной нормы и при реперфузионных повреждениях мозга. Экспериментально показано, что в постишемическом периоде Р-аланин, Ы-ацетил-р-аланин, АКФ 89-4 и кальция пантотенат угнетают развитие постишемических феноменов — гиперемии и гипоперфузии и способствуют поддержанию ауторегуляторных реакций сосудов мозга.

Получены новые данные о механизме нейропротекторного действия р-аланина, его производных и кальция пантотената. Показано, что эффективность в качестве корректоров ишемических повреждений мозга связана с поддержанием мозгового кровотока, активацией потребления глюкозы мозгом, угнетением гипопротеинемии, гиперкальциемии, эндогенной интоксикации, развития отека-набухания головного мозга и процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических паук. Диссертация выполнена в соответствии с планом НИР кафедры фармакологии Пятигорской государственной фармацевтической академии в рамках темы «Поиск и изучение новых церебропротекторов среди агонистов и антагонистов рецепторов нейромедиаторных аминокислот» (номер государственной регистрации 0.1.200.112152).

Практическая значимость.

Выявленная антигипоксическая и противоишемическая активность кальция пантотената расширяет представления о его механизме действия при церебральных патологиях ишемического генеза.

Полученные данные о наличии антигипоксической и нейропротектор-ной активности р-аланина, >1-ацетил-р-аланина и АКФ 89-4 свидетельствуют о перспективности поиска новых нейропротекторов в ряду производных Раланина.

Экспериментально обоснована целесообразность дальнейшего проведения исследований АКФ 89-4 в качестве нейропротектора при острых и хронических ишемических нарушениях в мозге в объеме требований Фармакологического государственного комитета.

Внедрения результатов исследования

На основании полученных данных составлен отчеты по исследованию противогипоксической и нейропротекторной активности (3-аланина и его производных, которые были представлены в НИИ фармакологии Волгоградского государственного медицинского университета и используются в научно-исследовательской работе по целенаправленному синтезу нейропротекто-ров среди новых производных нейромедиаторных аминокислот, что подтверждено 2 актами внедрения.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.Р-Аланин, И-ацетил-р-аланин, АКФ 89-4 и кальция пантотенат способствуют увеличению резистентности организма к дефициту кислорода.

2.|3-Аланин, М-ацетил-Р-аланин, АКФ 89-4 и кальция пантотенат угнетают развитие постишемических феноменов и способствуют сохранению ауторегуляции сосудов мозга в период реперфузии.

3.Нейропротекторный эффект Р-аланина, М-ацетил-Р-аланина, АКФ 89-4 обусловлен противогипоксическим, сосудистым, метаболическим действием.

4.АКФ 89-4 превосходит по нейропротекторной активности Р-аланин, 14-ацетил-Р-аланин и кальция пантотенат.

Апробация работы.

Результаты работы и основные положения диссертации доложены и обсуждены на 57-й, 58-й, 59-й Региональных конференциях «Проблемы фармации, фармакологии и подготовки кадров» (Пятигорск, 2002; 2003; 2004), 68-й Республиканской итоговой научно-практической конференции студентов и молодых ученых Республики Башкортостан с международным участием, посвященной Году Спорта и здорового образа жизни (Уфа, 2003), 1-м Международном Форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003), на Всероссийской конференции «Молодые ученые - медицине. Аспирантские чтения» (Самара, 2003), III Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы, содержащей описание используемых в работе материалов и методов, 3-х глав, содержащих экспериментальные данные, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 6 таблицами, 34 рисунками. Список литературы включает 141 отечественных и 54 иностранных источников.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Экспериментально установлено наличие противогипоксической активности у Р-аланина, 1М-ацетил-Р-аланина, АКФ 89-4 и кальция пантоте-ната.

2. Отмечено, что эффективные нейропротекторные дозы: при профилактическом введении для всех исследуемых соединений - 1 мг/кг; при терапевтическом для Р-аланина - 50 мг/кг, для ]М-ацетил-Р-аланина - 1 мг/кг, для АКФ 89-4 - 100 мг/кг, для кальция пантотената - 10 мг/кг.

3. Показано, что в условиях экспериментальной нормы Р-аланин, Ы-ацетил-Р-аланин, АКФ 89-4 и кальция пантотенат увеличивают объемную скорость мозгового кровотока и снижают системное артериальное давление.

4. Выявлено, что в постишемическом периоде Р-аланин, 1М-ацетил-Р-аланин, АКФ 89-4 и кальция пантотенат как при профилактическом, так и при терапевтическом введении угнетают развитие постишемиче-ских феноменов - гиперемии и гипоперфузии, а также способствуют поддержанию ауторегуляторных реакций сосудов мозга.

5. Установлено, что Р-аланин, его производные и кальция пантотенат препятствует вызванному ишемией нарушению углеводного обмена, угнетают развитие отека-набухания головного мозга, ограничивает процессы пероксидации липидов мембран в мозге, а также гипопро-теинемию и гиперкациемию.

6. Экспериментально доказано, что эффективность применения АКФ 89-4 в качестве корректора ишемических повреждений мозга превосходит эффективность применения Р-аланина, ]М-ацетил-Р-аланина и кальция пантотената.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Профилактика и терапия цереброваскулярных нарушений остается одной из главных проблем современной медицины, поэтому особое значение имеет разработка препаратов российского производства, которые могли бы успешно применяться в неврологии, в том числе при ишемических инсультах [39, 94, 95].

Учитывая важную роль, которую выполняют аминокислоты в мозге, ученые интенсивно работают над созданием лекарственных препаратов на основе эндогенных аминокислот [100, 115]. Ацилированные и фосфорилиро-ванные производные нейромедиаторных аминокислот сочетают в себе хорошую растворимость в воде с повышенной липофилыюстыо, что увеличивает их биологическую доступность и проникновение соединений через гемато-энцефалический барьер [102, 120].

В данной работе проведено исследование по оценке эффективности применения ß-аланина и двух его производных - 1Ч-ацетил-Р-аланина и соединения с лабораторным шифром АКФ 89-4 в качестве корректоров ишемических и реперфузионных повреждений мозга. Учитывая, что кальция панто-тенат ранее не изучался в качестве нейропротектора, а также то, что ß-аланин является практически неизученной аминокислотой, представляется актуальным изучение эффективности применения ß-алашш, 1\Г-ацетил-Р-аланин, АКФ 89-4 и кальция пантотената при ишемических повреждениях мозга.

Так как гипоксия является одним из основных патогенетических факторов ишемических и реперфузионных повреждений в мозге [17, 44, 48, 71, 73], первым этапом исследования явилась оценка антигипоксической активности ß-аланина и его производных в сравнении с кальция пантотенатом на моделях гемической, гистотоксической, гипобарической и гиперкапнической гипоксии. Экспериментально установлено, что фосфорилированное производное ß-аланина - соединение АКФ 89-4 является универсальным антиги-поксантом: повышает устойчивость экспериментальных животных в воздействию гемической, гистотоксической, гипобарической и гиперкапнической гипоксии. Менее эффективным оказалось профилактическое введение Р-аланина и N-ацетил-Р-аланина, которые проявили противогипоксическое действие на 3-х моделях гипоксии (р-аланин - на моделях гемической, гисто-токсической и гиперкапнической гипоксии, а N-ацетил-Р-аланин - на моделях гемической, гистотоксической и пшобарической гипоксии). Полученные данные о способности кальция пантотената повышать устойчивость организма к недостатку кислорода в условиях высокогорья (модель гипобарической гипоксии) и при моделировании гистотоксической гипоксии являются обоснованием для расширения области применения данного лекарственного препарата. Важно отметить, что антигипоксическая активность кальция пантотената уступала активности Р-аланина и его производных.

Известно, что возникающие при ишемии мозга расстройства церебральной гемодинамики способствуют снижению мозгового кровотока до критического уровня и ведут к формированию сосудисто-мозговой недостаточности [36, 171], поэтому следующим этапом нашего исследования явилось изучение влияния Р-аланина, его производных, а также кальция пантотената при профилактическом и терапевтическом введении на основные показатели церебральной гемодинамики.

Экспериментально показано, что все исследованные соединения при профилактическом и терапевтическом применении оказывают дозозависимое действие на показатели кровообращения мозга в постишемическом периоде. Важно отметить, что наиболее эффективной дозой у р-аланина, N-ацетил-Р-аланина как при профилактическом, так и при терапевтическом введении оказалась доза 1 мг/кг, у кальция пантотената - 50 мг/кг, у АКФ 89-4 при профилактическом введении - 1 мг/кг, а при терапевтическом - 100 мг/кг. Исследуемые соединения в этих дозах нивелируют как феномен «роскошной перфузии», так и феномен «невосстановления мозгового кровотока».

В настоящее время доказано, что одной из причин развития феномена «no-reflow» является нарушение кровотока и проницаемости сосудов на уровне микроциркуляторного русла [88]. Это обусловлено адгезией и arperaцией элементов крови, особенно лейкоцитов и тромбоцитов, сужением просвета сосудов поврежденным и отечным сосудистым эндотелием, сдавливанием мелких сосудов, нарастанием в реперфузионном периоде внеклеточным отеком [87]. Основная же роль в развитии постишемических феноменов отводится повышению тонуса гладких сосудов, т.к. хорошо известно, что в местах максимального отека сосуды не сужены, а расширены [36]. Поэтому выявленная способность р-аланина, №ацетил-р-аланина, АКФ 89-4 и кальция пантотената подавлять развитие постишемических феноменов свидетельствует о возможном сосудистом механизме действия соединений в условиях острых нарушений мозгового кровообращения.

Как известно, одной из функциональных особенностей мозга является способность к ауторегуляции, т.е. сохранению постоянства мозгового кровотока при изменения САД [18]. Поэтому способность церебральных сосудов к поддержанию ауторегуляторных реакций мозга является важным интегра-тивным показателем функций мозга при оценке противоишемической активности потенциальных церебропротекторов [28, 29]. В связи с этим следующим этапом работы явилось изучение влияние Р-аланина, И-ацетил-Р-аланина, АКФ 89-4 и кальция пантотената на ауторегуляторные реакции мозговых сосудов. Все изученные соединения при профилактическом введении в условиях экспериментальной нормы способствовали поддержанию функциональной устойчивости мозгового кровотока в пределах физиологической нормы при острой гипотензии. Более того, эти соединения дозозависимо способствовали сдвигу нижней границы ауторегуляции в область более низких значений САД (до 40 мм рт.ст.), следовательно, объекты исследования расширяют адаптационные возможности организма в условиях острой кровопо-тери. В постишемическом периоде Р-аланин, его производные и кальция пан-тотенат способствуют восстановлению нарушенных после ишемии ауторегуляторных реакций мозговых сосудов и сохранению их в пределах физиологической нормы.

Доказано, что феномен ауторегуляции мозгового кровотока контроляруется и реализуется неГфоиальными структурами ствола мозга и его глубинных отделов, а способность мозга к поддержанию ауторегуляции напрямую коррелирует со степенью ишемического повреждения мозга и изменениями САД[9, 18, 28]. Поэтому способность р-аланина, >1-ацетил-Р-аланина, АКФ 89-4 и кальция пантотената к поддержанию ауторегуляторных реакций церебральных сосудов в постишемическом периоде свидетельствует о сохранении функциональной активности мозга, и, следовательно, о наличии це-ребропротекторной активности у изучаемых соединений.

Исследование терапевтического применения Р-аланина и его производных в сравнении с кальция пантотенатом на некоторые параметры метаболизма мозга стало заключительным этапом нашего исследования. Это связано с тем, что изменение метаболизма мозга при снижении мозгового кровотока, и как следствие, ограничение поступления в нервную ткань кислорода и глюкозы является одной из причин нарушений функций мозга [39, 48, 73]. Механизмы повреждающего действия церебральной ишемии изучались на протяжении последних десятилетий [2, 13, 36, 39, 64, 194]. В начале 90-х годов XX века было показано, что развитие инфаркта в первые минуты и часы заболевания происходит по быстрым механизмам некротической смерти клеток. Пусковым звеном является энергетический дефицит, который инициирует так называемый глутамат-кальциевый каскад, характеризующийся избыточным высвобождением возбуждающих аминокислот - аспартата и глута-мата — и чрезмерным внутриклеточным накоплением ионов Са2+ - основного триггера конечных механизмов каскада, приводящих к смерти клетки [75, 103].

В развитии отека мозга при его ишемии большую роль играют повреждение интимы капилляров, изменение их проницаемости вследствие нарушения мембранных структур [160, 186]. К важным диагностическим критериям ишемического повреждения мембран относят возникающие при ишемии ги-попротеинемию и гиперкациемшо и отек-набухание головного мозга [83, 88, 92, 171]. Тот факт, что производные Р-аланина - Ы-ацетил-Р-аланин и соединение АКФ 89-4 препятствуют падению концентрации белка в сыворотке крови, а также развитию «кальциевого парадокса» и отека-набухания головного мозга, является показателем эффективности применения Ы-ацетил-Р-аланина и АКФ 89-4 при цереброваскулярной патологии ишемического гене-за.

Известно, что развитие эндогенной интоксикации в условиях ишемии мозга определяется прогрессирующими метаболическими расстройствами [126, 127]. При этом существенным является усиление катаболизма, снижение процессов дезинтоксикации, выраженные органные и системные поражения. Это связано с тем, что среднемолекулярные пептиды обладают нейро-тропными и психотропными свойствами, вызывают нарушение проницаемости гематоэнцефалического барьера, микроциркуляторного русла, ингиби-руют митохондриалыюе окисление, нарушают процессы транспорта аминокислот. Выявлено почти полное разобщение окисления и фосфорилирования и нарушение механизмов регуляции интенсивности дыхания адениловыми нуклеотидами под влиянием молекул средней массы. Одним из возможных механизмов нейротоксического действия средних молекул является ингиби-рование механизма активного транспорта ионов натрия и калия через мембрану клеточных элементов ткани центральной нервной системы [39, 124, 126, 127]. Поэтому уменьшение концентрации молекул средней массы в сыворотке венозной крови в постишемическом периоде при терапевтическом введении Ы-ацетил-р-аланина и АКФ 89-4 свидетельствует о выраженной де-токсикационной активности производных Р-аланина и активном воздействии на метаболические процессы ткани мозга.

Хорошо известная взаимосвязь функциональной активности мозга и потребления глюкозы является причиной тому факту, что обмен АТФ и фос-фопротеидов в ткани мозга происходит только при окислении глюкозы [73, 78]. Поэтому уменьшение потребления глюкозы мозгом, выявленные нами в постишемическом периоде в группе контрольных животных, свидетельствуют о глубоких нарушениях метаболизма мозга. Производные р-аланина - Иацетил-Р-аланин и АКФ 89-4 увеличивают потребление глюкозы мозгом на 24,4% и 18,1% соответственно. Анализ показателей метаболитов глюкозы — лактата и пирувата свидетельствует, что N-ацетил-Р-аланин и кальция панто-тенат существенным образом блокируют лактат-ацидоз как в артериальной, так и в венозной крови более чем на 20%. Таким образом, установлено, что N-ацетил-р-аланин и АКФ 89-4 эффективно препятствуют метаболическим нарушениям при ишемических повреждениях мозга.

Одним из повреждающих звеньев «ишемического каскада» является активация процессов ПОЛ. Характерной особенностью «свободнорадикаль-ной патологии» является поражение ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав биологических мембран, в силу чего она именуется также мембранной патологией [22, 24, 156, 168].

Анализ влияния ß-аланина и его производных на процессы свободно-радикального окисления показал, что ß-аланин, N-ацетил-Р-аланин и АКФ 89-4 увеличивают активность фермента антиоксидантной защиты СОД, что свидетельствует об усилении антирадикальной активности организма, ß-аланин и его производные препятствуют росту концентрации первичных — диеновых конъюгатов и вторичных — малонового диальдегида продуктов ПОЛ в ткани мозга. Эти факты являются благоприятным прогностическим признаком, т.к. особая опасность развития оксидантного стресса в ткани мозга обусловлена высоким содержанием в ней липидов (около 50% сухого вещества) [39], ненасыщенные связи которых являются субстратом для ПОЛ. Кроме того, активность ферментативных антиоксидантных систем в мозге значительно ниже, чем в других'тканях, что еще больше повышает риск развития оксидантного стресса [3, 119, 121].

При изучении метаболического компонента действия ß-аланина, его производных и кальция пантотената установлено, что они препятствуют проницаемости капилляров, развитию процессов эндогенной интоксикации и свободно-радикального окисления, а также нарушению углеводного обмена в мозге.

Полученные данные о противогипоксической и нейропротекторной активности кальция пантотената позволяют рекомендовать данное лекарственное средство в качестве корректора реперфузионных нарушения в мозге.

Проведенное исследование свидетельствует о наиболее высокой эффективности производного Р-аланина - АКФ 89-4 при ишемии мозга. Результаты коррекции сосудистых, функциональных и метаболических нарушений при острой ишемии мозга данными соединениями являются обоснованием для рекомендации проведения фармакологическим комитетом исследований в клинической практике для применения АКФ 89-4 в качестве нейропротек-торов.