Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Коррекция афобазолом побочных эффектов галоперидола и трифтазина и поиск новых нейролептиков в ряду Pro-Tyr-содержащих тетрапептидов

На правах рукописи

005009257

Кузнецова Анна Леонидовна

КОРРЕКЦИЯ АФОБАЗОЛОМ ПОБОЧНЫХ ЭФФЕКТОВ ГАЛОПЕРИДОЛА И ТРИФТАЗИНА И ПОИСК НОВЫХ НЕЙРОЛЕПТИКОВ В РЯДУ РНО-ТУЛ-СОДЕРЖАЩИХ ТЕТРАПЕПТИДОВ

14.03.06. - фармакология, клиническая фармакология

2 013 Ш

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2011

005009257

Работа выполнена в ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусона» РАМН

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук

Гарибова Таисия Леоновна

Каменский Андрей Александрович Колыванов Геннадий Борисович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится «....» 2012 года в.... часов на заседании

диссертационного совета Д.001.024.01 при ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8. С диссертацией можно ознакомиться в ученой части ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН, по адресу: 125315, Москва, ул. Балтийская, д.8.

Автореферат разослан «....» января 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Вальдман Е. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Шизофрения - относительно часто встречающееся хроническое психическое заболевание, затрагивающее около 0,4-0,6 % населения в мире (Goldner et al., 2002; Bhugra, 2006). Основными клиническими проявлениями шизофрении являются галлюцинации, мании, обеднение эмоциональной сферы, утрата социальных мотиваций, нарушения исполнительских функций, внимания, памяти, ассоциативного мышления и др. (Lambert, Castle, 2003; S. H. Fatemi, P. J. Clayton, 2008).

Для терапии шизофрении используется широкий спектр психотропных препаратов, среди которых ведущее положение занимают антипсихотические средства или нейролептики (Abi-Dargham and Moore, 2003; Guillin et al., 2007; Meisenzahl et al., 2007). Применяемые в настоящее время типичные нейролептики (производные фенотиазина, бутирофенона, дифенил пиперидина, тиоксантена и др.) эффективны преимущественно в отношении позитивных симптомов шизофрении (галлюцинации, мании). Выраженность негативной симптоматики (эмоциональная неадекватность, ангедония, алогия; апатия) классические нейролептики не ослабляют, а в некоторых случаях даже усугубляют когнитивный дефицит или провоцируют возникновение вторичных негативных симптомов. В последние годы нашли клиническое применение нейролептики атипичного профиля действия - клозапин, респиридон, сертиндол, оланзапин и др., которые не вызывают нарушений, характерных для классических антипсихотических средств и способны снижать выраженность негативных симптомов.

Нежелательные побочные явления, развивающиеся при применении традиционных и некоторых атипичных нейролептиков, снижают эффективность терапии шизофрении (Tandon, et. al., 2002; Данилов Д.С. 2010). Совокупность этих факторов вызывает необходимость поиска новых препаратов, обладающих высокой нейролептической активностью и лишенных нежелательных побочных эффектов. Для увеличения эффективности лекарственной терапии шизофрении известными препаратами представляет интерес поиск веществ, способных корректировать побочные нежелательные эффекты нейролептиков.

В ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН в течение нескольких десятилетий проводится работа по созданию и изучению механизма действия нейропсихотропных лекарственных препаратов (Воронина Т.А., 2004; Жердев В.П., Колыванов Г.Б. и др., 2006; Середенин С.Б., Воронина Т.А., 2007; Гарибова T.JI. и соавт, 2008; Островская Р.У., Гудашева Т.А., 2009; Ковалев Г.И. и соат., 2009; Мирзоян P.C. и соавт., 2010). В последние годы, создан и внедрен в медицинскую практику препарат афобазол, обладающий селективной анксиолитической активностью и нейропротективным действием (С.Б.Середенин и др., 2006). Анализ рецепторного профиля афобазола показал, что препарат является лигандомст i, МТ1, МТЗ рецепторов и обратимым ингибитором фермента МАО-А (С.Б. Середенин; М.В. Воронин; 2009).

Одним из перспективных направлений по созданию антипсихотических препаратов является дизайн пептидов - структурных аналогов нейротензина (HT), который принято рассматривать как эндогенный нейролептик. Ведется поиск веществ, содержащих последовательность аминокислот предполагаемого активного центра HT, которые обладали бы антипсихотическими и нейропротективными свойствами, но не вызывали побочных реакций (Gudasheva et al., 1998; Каменский A.A. и соавт., 2010; Мясоедов Н.Ф.

и соавт., 2010). В ФГБУ «НИИ фармакологии имени В.В. Закусова» РАМН в результате молекулярного моделирования была выявлена активная последовательность нейротензина Рго-Туг (Т.А.Гудашева и др. 1997), на основе которой было получено соединение, обладающее антипсихотической активностью и лишенное характерных для нейролептиков побочных эффектов - дилепт (Я. СЫгоузкауа е1 а1., 2007; Гузеватых Л.С. и др.,2002; Ретюнская М.В. др., 2005; Р.У.Островская, Гудашева Т.А. и др., 2009). В настоящее время дилепт находится на 1-ой стадии клинических испытаний как препарат, обладающий нейролептической и нейропротективной активностью. В Институте генетики РАН был синтезирован ряд тетрапептидов, содержащих Рго-Туг группу с предполагаемой нейролептической активностью (Кост Н.В. и соавт, 2010; Мясоедов Н.Ф. и соавт., 2011).

Целью настоящей работы явилось изучение возможности использования афобазола в качестве корректора побочных экстрапирамидных эффектов нейролептиков и поиск соединений с потенциальной нейролептической активностью среди тетрапептидов, содержащих последовательность Рго-Туг.

Были поставлены следующие задачи:

1. Изучить влияние афобазола на основной антипсихотический и побочный каталептогенный эффекты галоперидола и трифтазина.

2. Изучить влияние галоперидола на нейропротективные свойства афобазола на модели геморрагического инсульта у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой.

3. Провести первичный фармакологический скрининг Рго-Туг-содержащих тетрапептидов.

4. Изучить нейропротективные свойства Рго-Туг-содержащих тетрапептидов на модели геморрагического инсульта.

5. Изучить антиамнестические свойства Рго-Туг-содержащих тетрапептидов.

Научная новизна исследования. Впервые показано, что афобазол обладает способностью ослаблять побочные экстрапирамидные нарушения (каталепсию), вызванные классическими нейролептиками различных химических групп (галоперидол, трифтазин) и оказывать позитивное влияние на основной эффект препаратов в тесте апоморфиновой вертикализации. Эти эффекты афобазола выражены в большей степени при совместном использовании с галоперидолом. Афобазол потенцирует эффекты предшественника дофамина Ь-ДОФА в тестах экстраполяционного избавления и открытого поля. Показано, что на модели геморрагического инсульта галоперидол не влияет, а афобазол уменьшает неврологический дефицит и предотвращает гибель животных, корректирует поведение и память крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой. При совместном применении препаратов нейропротективные свойства афобазола на модели геморрагического инсульта сохраняются.

Среди новых Рго-Туг-содержащих тетрапептидов выявлены вещества МеЬРго-Туг-Тгр-ОМе (П4) и Тгр-Рго-Туг-РЬе (П9), обладающие нейролептической активностью в тестах апоморфиновой вертикализации, гиперкинезии, вызванной предшественником серотонина 5-окситриптофаном и кетаминовой гиперактивности. У соединений МсЬРго-Туг-Тгр-ОМе (П4) и Тгр-Рго-Туг-Р11е (П9) выявлены нейропротективные свойства на модели геморрагического инсульта. Показано, что у крыс с интрацеребральной

посттравматической гематомой эти соединения ослабляли нарушения неврологического статуса, уменьшали гибель и оптимизировали поведение животных в открытом поле. Антиамнестические эффекты новых Рго-Туг-содержащих тетрапептидов выявлены на модели амнезии условной реакции пассивного избегания, вызванной максимальным электрошоком или кетамином.

Научно-практическая значимость работы: Полученные результаты о способности афобазола корректировать двигательные нарушения, вызванные трифтазином и, в особенности, галоперидолом открывают перспективу использования афобазола в клинической практике для ослабления побочных эффектов нейролептиков классического профиля. Выявленные у Рго-Туг-содержащих тетрапептидов нейролептический эффект и способность корректировать состояние и поведение животных на модели геморрагического инсульта могут служить основанием для дальнейшей разработки на основе этих веществ потенциальных нейролептиков нового поколения.

Личный вклад. Автором самостоятельно проведены исследования по изучению влияния афобазола на основной и побочный эффекты нейролептиков, изучено влияние галоперидола на нейропротективный эффект афобазола на модели геморрагического инсульта. Выполнен поиск соединений с нейропсихотропной активностью в ряду новых Рго-Туг-содержащих тетрапептидов, обработаны результаты, сформулированы выводы. При активном участии автора подготовлены публикации по результатам работы.

Апробация работы: Результаты работы были представлены и докладывались на 5-ой Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 5 работ, из них 3 статьи в рецензируемых журналах и 2-е тезисов докладов.

Объем и структура диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, раздела с описанием материалов и методов исследования, двух глав посвященных результатам исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 138 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы и 43 рисунка. Библиографический указатель включает 43 отечественных и 194 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исследование фармакологической активности соединений проводилось с использованием стандартных методов, применяемых для оценки эффектов препаратов с нейропсихотропной и нейропротективной активностью (Vogel, 2008; Воронина Т.А., Островская Р.У., 2005; Воронина Т.А., Середенин С.Б., 2005; Раевский К.С. и соавт., 2005).

Опыты проведены на самцах белых нелинейных крыс массой 200-220 г и самцах белых беспородных или линии С57В1/мышеймассой 20-25 г. (питомник «Столбовая» РАМН). Содержание животных соответствовало правилам лабораторной практики при проведении доклинических исследований в РФ. Эксперименты проводили с 10 до 16 часов для избегания влияния циркадных ритмов.

В исследовании были использованы следующие вещества: апоморфин гидрохлорид (Sigma), мадопар (100 мг L-ДОФА + 25 мг бензеразида, ингибитора периферической

декарбоксилазы ароматических аминокислот, Ф. Хоффманн - Ля Рош., Лтд., Швейцария), галоперидол (ампулированный 0,5 % раствор, «Гедеон Рихтер» А.О., Венгрия), трифтазин (ампулированный 0,2 % раствор, ОАО «Дальхимфарм», Хабаровск), оланзапин (таблетки по 5 мг, Eli Lilly, Швейцария), дилепт (ФГБУ «НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН), кетамин (Sigma), афобазол (ФГБУ «НИИ Фармакологии им. В.В. Закусова» РАМН) а также тетрапептиды, синтезированные в Институте молекулярной генетики РАН под руководством д.х.н. академика Н.Ф. Мясоедова.

Были использованы следующие методы:

Тест апоморфиновой вертикализации. Исследуемые вещества вводили в/б за 25 минут, а апоморфин (3 или 5 мг/кг) - (беспородным или линии С57В1 за 10 минут до тестирования. Регистрировали число лапок на сетке (количество баллов) каждые 2 минуты на протяжении 1 часа. Одновременно в опыте наблюдали за 18 животными. Подсчитывалась сумма баллов для каждого животного за весь период наблюдений.

Тест 5-окситриптофанового гиперкинеза у мышей. Предшественник серотонина 5-окситриптофан в дозе 300 мг/кг вводили мышам внутрибрюшинно (в/б) через 30 мин. после исследуемых веществ. Подсчитывали число встряхиваний головой за 1 мин. с интервалами 10 мин. в течение 1 часа.

Тест гиперактивности, вызываемой кетамином проводили на крысах. Изменение двигательной активности изучали в открытом поле через 5 мин. после введения кетамина в дозе 10 мг/кг в/б.

Тест экстраполяционного избавления. Исследования проводилось на крысах по методике Н. А. Бондаренко (1990) в экспериментальной установке, которая представляет собой емкость (диаметр 35 см, высота 40 см), наполненную водой t=22°C со стеклянным цилиндром в центре. Крыс помещали внутрь цилиндра хвостом вниз. На протяжении 2 мин. регистрировали латентный период двигательной активности, число безуспешных попыток избегания и латентный период подныривания.

Изучение каталептогенных свойств веществ. Каталепсию, т.е. способность животного удерживать искусственно приданную позу, изучали в опытах на мышах и крысах с использованием тестов «поза лектора» и «параллельные стенки» (Costall, Naylor, 1974; Vogel, 2008; К.С. Раевский и соавт., 2005). В тесте «поза лектора» регистрировали время сохранения позы, а также определяли количество животных в группе, удержавших позу в течение 60 с. В тесте «параллельные стенки» крысу помещали между двух стенок высотой 11 см таким образом, чтобы передними конечностями она опиралась на одну стенку, а задними - на другую, спина животного оставалась прямой. Фиксировали длительность удержания животным неестественной позы и количество в группе крыс, удерживающих неестественную позу в течение 2-х минут. Максимальное время наблюдения составляло 120 сек. Попытки придать животному нужную позу продолжались не более 1 мин. Тестирование проводили каждые 30 мин. в течение 3-4 часов.

Методика обучения условной реакции пассивного избегания ГУРПИ). Оценку влияния веществ на формирование и воспроизведение памятного следа проводили с использованием условного рефлекса пассивного избегания - УРПИ (Ader et al.,1998; Воронина Т.А.,1989). Крыс помещали в установку Passive avoidance фирмы Lafaette Instrument Со (США) на освещенную платформу перед входом в темную камеру установки хвостом к входному отверстию и регистрировали латентное время рефлекса. В темной камере крыса получала однократное неизбегаемое (10 сек) электроболевое

раздражение (0,6 мА). Тест на воспроизведение УРПИ осуществляли через 24 часа после обучения, повторно помещая животных в установку с регистрацией в течение 3 минут латентного периода первого захода крысы в темную экспериментальную камеру, и количества животных, не зашедших в темный отсек камеры, в %. С целью анализа влияния вещества на угасание рефлекса процедуру воспроизведения навыка проводили через 3, 7 и 14 суток после обучения.

Амнезию УРПИ у крыс вызывали максимальным электросудорожным шоком (МЭШ) силой 15-20 мА и продолжительностью 200-500 мсек, который проводили через корнеальные электроды непосредственно после обучения или введением за 15 мин. до обучения кетамина в дозе 10 мг/кг в/б.

Методика открытого поля. Ориентировочно исследовательское поведение и двигательную активность у животных оценивали в условиях методики открытого поля. В процессе 3-х минутного пребывания крысы в открытом поле регистрировали число вставаний на задние лапки (вертикальная двигательная активность), число переходов из квадрата в квадрат (горизонтальная двигательная активность), число заглядываний в отверстия.

Исследование неврологического дефицита у животных. Неврологический дефицит у крыс определяли по шкале Stroke-index McGrow в модификации И.В. Ганушкиной (1996). Тяжесть состояния определялась количеством животных с легкой симптоматикой (вялость движений, слабость конечностей, птоз) и тяжелыми проявлениями неврологических нарушений (манежные движения, парезы и параличи конечностей, боковое положение).

Моделирование_геморрагического_инсульта_(интрацеребральной

посттравматической гематомы). Моделирование локального кровоизлияния в головном мозге - интрацеребральной посттравматической гематомы (ИПГ) проводилось согласно методике Макаренко и соавторов (1999). С этой целью крысам, наркотизированным хлоралгидратом (350 мг/кг, в/б), при помощи специального устройства (мандрен - нож) и стереотаксиса осуществляли деструкцию мозговой ткани в области внутренней капсулы с последующим (через 2-3 минуты) введением в место повреждения крови, взятой из-под языка животного (0,02 - 0,03 мл). Морфологические исследования показали, что таким способом достигается локальный геморрагический инсульт в области внутренней капсулы (диаметр - 2 мм, глубина - 3 мм) без существенных повреждений выше расположенных образований мозга и неокортекса. Динамику развития геморрагического инсульта (ГИ) исследовали в течение 14 дней, наблюдая поведение и состояние животных в 1-е, 7-е и 14 сутки после операции с регистрацией неврологического дефицита по шкале Stroke-index McGrow, гибели животных, ориентировочно-исследовательского поведения в открытом поле, обучения условной реакции пассивного избегания (УРПИ).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «Biostatistics III» и пакета программ Pharm/pcs, версия 4 с использованием методов Стьюдента, Фишера, % и определения площади под кривой (AUC).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АФОБАЗОЛА НА ОСНОВНЫЕ И ПОБОЧНЫЕ ЭФФЕКТЫ НЕЙРОЛЕПТИКОВ

Большинство используемых в медицинской практике нейролептиков помимо основного антипсихотического действия характеризуются целым рядом побочных нежелательных эффектов. Механизм антипсихотического действия галоперидола определяется антагонизмом с D2-рецепторами (J.M. Walker, et al., 1990; L.T. Schwartz, A.W. Brotman, 1992). Вместе с тем установлено, что галоперидол является антагонистом с i-рецепторов (S.W. Tarn, L. Cook, 1984; R.R. Matsumoto, В. Pouw, 2000). Показано, что взаимодействие с q рецепторами коррелирует с выраженностью двигательных нарушений у пациентов, применявших галоперидол и другие нейролептики (R.R.Matsumoto, B.Pouw, 2000). Анализ рецепторных взаимодействий афобазола, выполненный в сотрудничестве с компанией Сегер (Франция), показал, что препарат является лигандом ai рецепторов (1С50 7-lxlO"6 М) (S.B.Seredenin et al., 2008). Полученные данные явились основанием дня исследования влияния афобазола на выраженность основного и побочных эффектов нейролептиков.

Изучение влияния афобазола на основной и побочный эффекты галоперидола.

Изучение влияния афобазола, галоперидола и их совместного применения в тесте апоморфиновой вертикализации

В тесте апоморфиновой вертикализации показано, что галоперидол в дозе 0,05 мг/кг снижал вертикальную активность мышей на 50 %, а афобазол в дозах 2, 4, 10 и 20 мг/кг не оказывал влияния на поведение животных в этом тесте. При совместном введении препаратов афобазол в используемых дозах усиливал эффект галоперидола, статистически достоверно снижая количество стереотипных реакций относительно эффекта галоперидола (Табл.1).

Таблица 1.

Изучение эффектов афобазола, галоперидола и их совместного применения в тесте апоморфиновой вертикализации_

Вещества Доза в мг/кг, внб Вертикальная активность

Контроль (физ.р-р + апоморфин) Опыт (препарат + апоморфин) Относит. пок-ли,% к апоморфину Относит, пок- ли, % к галоперидолу

Галоперидол ОД 50,89±5,23 5,11+1,2* 10,04 -

Галоперидол 0,05 67,71±6,41 30,14+3,99* 44,51 -

Афобазол 2 53,22+9,278 48,67+7,29 91,45 -

Афобазол 4 54,56+6,263 48,22+3,55 88,37 -

Афобазол 10 56,89+6,39 52,11+4,72 91,59 -

Афобазол 20 53,44+3,40 44,33+ 5,72 82,95 -

Апоморфин+ Галоперидол + Афобазол 3 + 0,05+ 0,5 53,89+4,44 19,22+3,37*# 35,67 65,53

Апоморфин+ Галоперидол 3 + 0,05 + 51,44+3,28 14,44+5,64*# 28,19 49,23

+ Афобазол 1

Галоперидол 0,05 59,11 ±5,21 29,33±4,16* 49,61 -

Апоморфин+ Галоперидол + Афобазол 3 + 0,05 + 2 59,11±5,21 18,11±3,91 30,63 61,74

Апоморфин+ Галоперидол + Афобазол 3 + 0,05 + 4 59,11±5,21 17,89±2,74*# 34,62 60,99

Галоперидол +Апоморфин 0,05 + 3 52,22±5,73 32,89+6,45 62,98 -

Галоперидол + Афобазол+ Апоморфин 0,05 + 10 + 3 52,22+5,73 15,11±5,24*# 28,94 52,91

* достоверность отличий от группы контроля; # - достоверность отличий группы галоперидол + апоморфин от группы галоперидол+афобазол+апоморфин при р< 0,05; (¡-критерий Стьюдета)

Влияние галоперидола, афобазола и их совместного применения на двигательную гиперактивность крыс, вызванную кетамином.

При исследовании активности препаратов и их комбинации на модели гиперактивности, вызванной неконкурентным антагонистом КМОА-рецепторов прямого действия - кетамином в условиях методики открытого поля, обнаружено статистически достоверное усиление двигательной активности животных, получавших кетамин в дозе 10 мг/кг (Рис.1). Галоперидол на фоне кетамина снижал уровень двигательной и ориентировочно-исследовательской активности крыс. Афобазол при введении совместно с галоперидолом и кетамином не оказывал влияния на уровень ориентировочно-исследовательских реакций и двигательную активность крыс в условиях открытого поля.

Рис. 1. Влияние галоперидола, афобазола и их совместного введения на двигательную гиперактивность крыс, вызванную кетамином в открытом поле.

По вертикали — сумма горизонтальных и вертикальных перемещений; по горизонтали: 1 - контроль (физ. р-р), 2 - кетамин 10 мг/кг; 3 - галоперидол 1 мг/кг + кетамин 10 мг/кг; 4 - галоперидол I мг/кг + афобазол 10 мг/кг+ кетамин. Достоверность отличий;* - от группы контроля,; # - от группы кетамина, при Р<0,05 (I-критерий Стьюдента)

Таким образом, показано, что афобазол в комбинации с галоперидолом не оказывает влияния на ориентировочно-исследовательское поведения и двигательную активность крыс в тесте кетаминовой гиперактивности в открытом поле.

Влияние галоперидола, афобазола и их совместного применения на поведенческие эффекты Ь-ДОФА.

Известно, что тест экстраполяционного избавления (ТЭИ), нарушенного Ь-ДОФА, используется для оценки действия нейролептиков. В частности, показана высокая эффективность галоперидола (Бондаренко, 1990). В настоящем исследовании установлено, что в контрольной группе крыс количество не поднырнувших животных составляло 12,5 %. Мадопар (125 мг/кг) статистически достоверно увеличивал этот показатель до 87,5 %, т.е. нарушал экстраполяционное поведение у большинства животных. В группе крыс, получавших галоперидол, количество не поднырнувших животных не превышало 25%, т.е. галоперидол предупреждал нарушение экстраполяционного поведения крыс, вызванного мадопаром (Табл. 2). При совместном применении афобазола (10 мг/кг) с галоперидолом (0,1 мг/кг) количество не поднырнувших животных составило 100 %<$05) (Табл. 2) т.е афобазол устранял действие галоперидола.

Таблица 2.

Влияние веществ на нарушенное Ь-ДОФА поведение крыс в тесте экстраполяционного избавления.

Вещества Доза, мг/кг Латентное время подныривания 1,(с) Латентное время подныривания 2, (с) Кол-во не поднырнувших животных Кол-во не поднырнувших животных (%)

Контроль (физ. р-р) - 68,0± 16,44 46,12±16,84 2/16 12,5

Мадопар+ физ.р-р 125 93,11±11,85 114,4±5,62* 14/165, 87,5

Мадопар+ галоперидол + физ р-р 125 0,1 83,88±17,63 68,25±15,69* 4/16 25

Мадопар + афобазол 125 10 72,0±18,27 120,0±0,0* 16/165, 100

Мадопар+ галоперидол + афобазол 125 0,1 10 70,14±13,15 120,0±0,0*л 16/165« 100

Достоверность отличий по критерию Стьюдента, при Р <0,05г Ьт группы контроля; от группы с мадопаром, &- группы талоперидол+афобазол+мадопар от группы галоперидол + мадопар. Достоверность отличий по критерию Фишера при Р <0,05? - от группы контроля; ® - группы галоперидол+афобазол+мадопар от группы галоперидол + мадопар.

С целью выявления возможности взаимодействия афобазола и мадопара (Ь-ДОФА) изучалось влияние препаратов и их совместного введения на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность крыс. Установлено, что мадопар в дозе 125 мг/кг не влиял на двигательную активность крыс в открытом поле. Афобазол (10 мг/кг) незначительно увеличивал число горизонтальных и вертикальных перемещений крыс. При совместном применении мадопара и афобазола в значительной степени увеличилась двигательная активность крыс, число горизонтальных перемещений возросло более, чем в два раза по сравнению с контрольной группой (р< 0,05) (Рис. 2).

Рис. 2. Влияние препаратов на двигательную активность крыс в условиях открытого поля (сумма горизонтальных и вертикальных перемещений).

160

140 ------------------------------------------------------------------------------------------------—----------------------------------

| 120 ........................................................................................................................

1 100 | I »

« -— - - - - ^ щ

: ■■II

Контроль мэдопор 125 мг/кг Афобазол 10 мг/нг Млдолзр125

мг/кг*Афобаюл 10 мг/кг

Таким образом, в ТЭИ нарушенного мадопаром показано, что афобазол при совместном введении с галоперидолом предупреждает корректирующий эффект нейролептика, а в условиях методики открытого поля потенцирует действие мадопара. Полученные данные позволяют предположить, что ослабление эффекта галоперидола в ТЭИ опосредованно не прямым взаимодействием афобазола с галоперидолом, а его влиянием на эффекты Ь - ДОФА.

Влияние афобазола на выраженность экстрапирамидных расстройств, вызванных галоперидолом у крыс.

При изучении экстрапирамидных расстройств, вызванных галоперидолом у крыс, было показано, что препарат в зависимости от дозы увеличивал время удерживания вынужденной позы на параллельных стенках и количество животных с каталепсией. Для оценки влияния афобазола на экстрапирамидные нарушения, вызванные галоперидолом, анксиолитик в дозе 5 мг/кг вводили крысам совместно с галоперидолом (0,5, 1 и 2 мг/кг), а затем повторно в той же дозе на 90-й минуте наблюдения. Афобазол снижал степень выраженности экстрапирамидных расстройств, вызванных однократным введением галоперидола в дозах 0,5 и 1 мг/кг, и лишь незначительно ослаблял каталепсию, вызванную нейролептиком в дозе 2 мг/кг (Рис. 3).

Рис. 3. Влияние афобазола на каталепсию, вызванную галоперидолом у крыс, в тесте удерживания вынужденной позы на параллельных стенках.

Л Б В

По вертикали — сумма горизонтальных н

вертикальных перемещений. Достоверность отличий: * - от группы контроля р< 0,05 (I-критерий Стьюдента); # - от группы Мадопара при р< 0,05 (^критерий Стьюдента)

А - галоперидол( 0,5 мг/кг) и афобазол (5 мг/кг); Б - галоперидол (1 мг/кг) и афобазол (5 мг/кг 2 р/д): В -галоперидол (2 мг/кг) и афобазол (5 мг/кг). По горизонтали - время в минутах; по вертикали - количество животных с каталепсией, %. 1 - галоперидол + афобазол, 2 - галоперидол. * Достоверность отличий от группы с галоперидолом при Р < 0,05 (х2). Стрелка - повторное введение афобазола.

При хроническом (14 дней) совместном введении галоперидола (1 мг/кг) и афобазола (5 мг/кг х 2 р/д) показано, что афобазол в 1-е, 7-е и 14-е сутки ослаблял вызванную галоперидолом каталепсию в тесте удерживания вынужденной позы на параллельных стенках (Рис. 4).

Рис. 4. Влияние афобазола на кателепсию, вызванную галоперидолом у крыс, при хроническом (14 дней) совместном введении препаратов в тесте удерживания вынужденной позы на параллельных стенках

1-й день

7-й день

14-й день

вршфин)

время (мин)

время £мим|

Темная линия - галоперидол; светлая линия — совместное введение галоперидола (1 мг/кг) и афобазола (5 мг/кг х 2 р/д). По горизонтали - время в минутах. По вертикали - количество животных с каталепсией в %. Достоверность отличий от кошроля: *- р< 0,05 ('£).

Афобазол (5 мг/кг 2 р/д) как при однократном, так и при 2-х недельном введении совместно с галоперидолом (1 мг/кг) значительно снижал уровень двигательных расстройств у крыс в тесте удерживания вынужденной позы на параллельных стенках.

Изучение влияния афобазола на эффекты трифтазина.

В представленных выше результатах исследования показано, что афобазол корректировал нарушения двигательных функций, вызванные галоперидолом в тестах, регистрирующих каталепсию и, в зависимости от используемого теста и дозы, не оказывал существенного влияния или усиливал действие галоперидола на моделях, выявляющих антипсихотический эффект нейролептика, Есть достаточно оснований предполагать, что этот эффект афобазола в значительной степени опосредуется взаимодействием препаратов с ^.рецепторами. Вместе с тем, подавляющее большинство нейролептиков, как первого, так и второго поколений не взаимодействуют с а|-рецепторами и обладают побочными эффектами, связанными с нарушением двигательных функций. В связи с этим, представляло интерес исследование влияния афобазола на эффекты трифтазина, в механизме действия которого не участвуют 01-рецепторы.

Изучение влияния афобазола, трифтазина и их совместного введения в тесте апоморфиновой вертикализации.

Трифтазин в дозе 0,5 мг/кг снижал вызванную апоморфином (3 мг/кг) вертикальную активность мышей на 50 %. При совместном введении с трифтазином афобазол в дозах 2 и 10 мг/кг не влиял на эффект трифтазина, а в дозе 5 мг/кг - усиливал действие нейролептика (Рис. 5).

Рис. 5. Эффект афобазола, трифтазииа и их совместного применения в тесте апоморфиновой вертикализации

По вертикали: вертикальная активность в абсолютных показателях; по горизонтали: 1 - апоморфин (3 мг/кг (контроль); 2 - апоморфин 3 мг/кг)+трифтазин (0,5 мг/кг); 3 - апоморфин (3 мг/кг)^грифтазин (0,5

мг/кг)+афобазол (2 мг/кг); 4 -апоморфин (3

мг/кг)+трифтазин (0,5

мг/кг)+афобазол (5 мг/кг); 5 -апоморфин (3

мг/кг)+трифтазин (0,5

мг/кг)+афобазол (10 мг/кг); достоверность отличий: *- от группы контроля ; #-от группы с трифтазином при р< 0,05 {(-критерий Стьюдента)

Влияние афобазола на каталепсию у крыс, вызванную трифтазином в сравнении с галоперидолом в тесте «поза лектора».

При изучении побочных эффектов нейролептиков показано, что трифтазин и галоперидол в эквиэффективных дозах вызывали каталепсию у 70-80 % крыс. Как видно на Рис. 6, афобазол в первый день эксперимента на 90 минуте наблюдения статистически достоверно уменьшал количество животных с каталепсией, вызванной трифтазином. На 7-е и 14-е сутки совместного введения препаратов существенного, статистически достоверного корректирующего действия афобазола на каталепсию, вызванную у крыс трифтазином, не отмечалось. При совместном введении афобазола с галоперидолом антикаталептогенный эффект афобазола регистрировался у крыс на протяжении всего времени наблюдения (Рис.6).

Рис. 6. Влияние афобазола на каталепсию, вызванную трифтазином (А) или галоперидолом (Б) у крыс, в тесте «поза лектора».

(А) 1-й день 7-й день 14-й день

(Б) 1 -й день

7-й день

14-й день

30 60 90 120 150 180 время (мин)

30 60 90 120 150 130 время (мин)

30 60 90 120 150 180 веррля(глин)

Темная линия - нейролептики: трифтазин в дозе 3 мг/кг (А); галоперидол в дозе 1 мг/кг (Б); светлая линия — совместное введение нейролептиков и афобазола в дозе 5 мг/кг 2 р/д. По горизонтали - время в минутах. По вертикали - количество животных с каталепсией в %. Достоверность отличий от контроля: *- р< 0,05

Ос2).

Таким образом, показано, что афобазол способен ослаблять экстрапирамидные нарушения в тесте «поза лектора», вызванные галоперидолом, и в значительно меньшей степени корректировать побочные эффекты трифтазина при длительном (14 дней) совместном введении препаратов.

Изучение влияния галоперидола на нейропротективные свойства афобазола на модели геморрагического инсульта.

Известно, что афобазол помимо психотропных эффектов — анксиолитического и антидепрессивного обладает отчетливым нейропротективным действием, которое, в частности, обнаружено на модели геморрагического инсульта у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой (Середенин С.Б., Крайнева В.А., 2009). В то же время, у галоперидола нейропротективных свойств не выявлено (Wang and Deutch, 2008). Учитывая полученные ранее данные о способности афобазола усиливать основной и ослаблять побочный эффекты галоперидола, представляло интерес изучение эффектов препаратов при их совместном применении на модели ГИ.

Исследование неврологического статуса крыс показало, что в группе крыс с ИПГ на протяжении всего времени наблюдения у большинства животных (36,4 - 85,7 %) отмечались выраженные неврологические нарушения, такие, как манежные движения, парезы, параличи (Табл. 3). Галоперидол в дозе 0,5 мг/кг не оказывал влияния на неврологический статус крыс с ИПГ. Афобазол в дозе 1 мг/кг в значительной степени ослаблял у крыс с ИПГ неврологический дефицит, статистически достоверно уменьшая количество животных с тяжелыми неврологическими нарушениями на 1-е и 14-е сутки наблюдения (Табл. 3). Сходным, но менее выраженным эффектом обладал афобазол в дозе 10 мг/кг. При совместном введении галоперидола и афобазола в дозе 1 мг/кг показатели состояния крыс с ИПГ не отличалось от показателей в группе получавшей только афобазол, где наблюдалось существенное ослабление неврологических отклонений (Табл. 3). Сходные закономерности отмечались при совместном введении галоперидола и афобазола в дозе 10 мг/кг. Таким образом, показано, что афобазол в обеих дозах — 1 и 10 мг/кг ослабляет неврологический дефицит у крыс с ИПГ, а галоперидол при совместном применении с афобазолом не оказывает влияния на этот эффект препарата.

Было показано, что среди ложнооперированных животных гибели крыс не наблюдалось. В группе животных с ИПГ к 14-м суткам выжило 45 % крыс. Галоперидол

(0,5 мг/кг) не оказывал существенного влияния на выживаемость крыс с ИПГ. Афобазол в дозах 1 и 10 мг/кг на протяжении всего времени наблюдения увеличивал количество выживших животных, но статистически достоверными были результаты на 1-е сутки для афобазола в дозе 1 мг/кг и на 7-е сутки при использовании препарата в дозе 10 мг/кг. При совместном применении афобазола в обеих дозах и галоперидола не было выявлено существенных изменений протекторного действия афобазола.

Таблица 3.

Изучение влияния галоперидола, афобазола и их совместного применения на неврологические нарушения и выживаемость крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой._

Вещества время после операции, сут.

1-е 7-е 14-е

Количество животных с тяжелыми нарушениями

а.е. % а.е. % а.е. %

ЛО 0/20 0,0 0/20 0,0 0/20 0,0

ИПГ 12/ 14* 85,7 4/11* 36,4 4/9* 44,4

Галоперидол (0,5 мг/кг) 11/19 57,9 5/14 35,7 6/12 50

Афобазол (1 мг/кг) 4/16" 25 4/14 28,6 0/11* 0,0

Галоперидол (0,5 мг/кг)+ Афобазол (1 мг/кг) 10/16 62,5 2/12 16,7 0/10* 0,0

Афобазол (10 мг/кг) 4/11* 36,4 1/11 9,1 0/7 0,0

Галоперидол (0,5 мг/кг)+ Афобазол (10 мг/кг) 5/12* 41,6 3/8 27,5 0/6 0,0

Показатели выживаемости (%)

ЛО 20/20 100 20/20 100 20/20 100

ИПГ 14/20* 70 11/20* 55 9/20* 45

Галоперидол (0,5 мг/кг) 19/20 95 14/20 70 12/20 60

Афобазол (1 мг/кг) 16/16* 100 14/16 87,5 11/16 68,7

Галоперидол (0,5 мг/кг)+ Афобазол (1 мг/кг) 16/16* 100 12/16 75 10/16 62,5

Афобазол (10 мг/кг) 11/12 91,6 11/12* 91,6 7/12 58,3

Галоперидол (0,5 мг/кг)+ Афобазол (10 мг/кг) 12/12 100 8/12 66,6 6/12 50

Достоверность отличий: * - группы ложнооперированных животных от группы крыс с ИПГ; # - от группы крыс с ИПГ, при р< 0,05 (критерий Фишера).

Таким образом, афобазол в дозе 1 и 10 мг/кг обладал нейропротективным действием на модели геморрагического инсульта, предотвращая гибель крыс и существенно ослабляя нарушения неврологического статуса. Галоперидол в дозе 0,5 мг/кг не оказывал влияния на выживаемость и неврологический дефицит у животных с ИПГ. При оценке влияния комбинации галоперидола и афобазола не было выявлено существенных изменений нейропротективного действия афобазола.

Схема 1. Эффекты совместного применения галоперидола и афобазола галоперидол

ш

афобазол

Я| основной эффект В нейропротективные свойства ■ экстрапирамидные нарушения

В результате проведенных исследований показано, что афобазол способен ослаблять побочные эффекты галоперидола и трифтазина и, в зависимости от дозы и используемого теста, усиливать или не влиять на основной эффект нейролептиков, сохраняя при этом свои нейропротективные свойства (Схема 1).

ИЗУЧЕНИЕ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ Рго-Туг-СОДЕРЖАЩИХ

ТЕТРАПЕПТИДОВ

Целью настоящего раздела работы явилось изучение фармакологической активности синтезированных в Институте генетика РАН под руководством академика Н.Ф. Мясоедова Рго-Туг-содержащих тетрапептидов с предполагаемой нейролептической активностью (Кост Н.В. и соавт., 2010; Мясоедов Н.Ф. и соавт., 2011) на классических моделях скрининга нейролептиков и на модели нейродегенерации, вызванной ИПГ. В качестве эталонных препаратов были использованы: нейролептик первого поколения галоперидол, нейролептик второго поколения - оланзапин, дипептидный аналог нейротензина - дилепт, нейропротектор - мемантин. Были изучены следующие тетрапептиды: МеьРго-Тут- РЬе (III); Тут-Рго-Туг-РИе (П2); МеЯ>го-Туг-Тгр-ОМе (П4); Ме<:-Рго-Туг-Р11е-ОМе (П5); МеьРго-Туг-А^ (П6); МеЮ-Рго-Туг- РИе (П7); Уа1-Рго-Туг-РЬе (П8); Тгр-Рго-Туг-РЬе (П9).

Изучение активности Рго-Туг-содержащих тетрапептидов в тесте апоморфиновой вертикализации.

Дофаминнегативное действие соединений оценивалось в тесте апоморфиновой вертикализации, широко используемом для скрининга соединений с антипсихотической активностью. Апоморфин в дозе 5 мг/кг вызывал у животных вертикапизацию,

интенсивность которой колебалась между 65-80 единицами (Рис.7). У соединений под шифрами П1, П2, П6, П7 и П8 наблюдалась лишь тенденция снижения апоморфиновой вертикализации. Соединения под шифрами П4 и П9 в дозе 1 мг/кг статистически достоверно снижали вертикальную активности у мышей. Сходным дофаминнегативным эффектом обладал дилепт в дозе 0,8 мг/кг. Галоперидол (0,05 мг/кг), оланзапин (0,1 мг/кг) снижали вертикальную активность в 2 раза (Рис.7).

Рис. 7. Эффект Рго-Туг-содержащих тетрапептидов в тесте апоморфиновой вертикализации ___________

По вертикали: интенсивность вертикальной активности; по горизонтали: темные столбики - апоморфин, светлые столбики - апоморфин ^соединение. Достоверность отличий от контроля: *- р< 0,05; ***-р<0,001 (1-критерий Стьюдента)

Изучение влияния Рго-Туг-содержащих тетрапептидов на гиперактивность серотонинергической системы в тесте гиперкинеза, вызванного 5-окситриптофаном.

Изучение влияния Рго-Туг-содержащих тетрапептидов на гиперактивность серотонинергической системы, вызванной 5-окситриптофаном (300 мг/кг) показало, что соединения под шифрами П1, П4, П5 и П7 в дозе 1 мг/кг уменьшали у мышей количество встряхиваний головой (Рис. 8). Сходным эффектом обладал и оланзапин в дозе 0,1 мг/кг. Рис. 8. Эффект Рго-Туг-содержащих тетрапептидов в тесте «встряхивания головой»,

По вертикали: количество встряхиваний головой в %; Достоверность отличий от контроля (5-ОТ) при * - р< 0,05 О-критерий Стьюдента)

Изучение влияния веществ на, вызванную кетамином, гиперактивность у крыс в открытом поле.

Изучение влияния веществ на глутаматергическую нейротрансмиссию проводилось на поведенческой модели шизофрении, основанной на использовании антагониста №кША-рецепторов - кетамина. Эффект кетамина изучался в опытах на крысах в условиях методики открытого поля. Установлено, что кетамин значительно увеличивал двигательную активность у животных в сравнении с контрольной группой крыс. При введении соединений под шифрами П4 и П9 у животных наблюдалось статистически достоверное снижение горизонтальных перемещений. Соединения под шифрами П2, П6 и П8 были неэффективны в тесте кетаминовой гиперактивности. (Табл. 4).

Таблица 4.

Влияние Рго-Туг-содержащих тетрапептидов в дозе 1 мг/кг на гиперактивность у

крыс, вызванную кетамином (5 мг/кг) в условиях методики открытого поля.

Вещества Горизонт, движения Верт. движения. Обсл. отверстий

Контроль (Физ. р-р) 34,29 ± 6,66 6,71 ± 1,62 9,14 ± 1,08

Кетамин 71,14 ±7,07* 3,43 ± 1,18 6,57 ± 2,61

ГО 52,43 ± 6,79 6,00 ±3,00 5,14 ±0,83

П4 49,43 ±6,39" 5,14 ±1,93 4,29 ±1,71

П6 65,57 ±14,04 4,43 ± 1,40 3,86 ± 0,95

П8 72,57 ±7,74 4,00 ±1,22 4,86 ±1,76

П9 43,86 ± 5,38" 3.86 ±1,99 5,71 ± 1,34

Достоверность отличий: *- от контроля; # - от группы кетамина при р< 0,05 (t-критерий Стьюдента).

Таким образом, результаты, полученные в трех тестах — апоморфиновой вертикализации, гиперкинеза, вызванного 5-ОТ и кетаминовой гиперактивности в открытом поле показали, что среди изученных соединений наиболее эффективными были вещества под шифрами П4 и П9 в тесте апоморфиновой вертикализации и кетаминовой гиперактивности, а соединение под шифром П4 — в тесте гиперкинеза, вызванного 5-ОТ.

Изучение эффектов Рго-Туг-содержащих тетрапептидов на модели геморрагического инсульта

Известно, что шизофрения вызывает прогрессирующие патофизиологические процессы, которые характеризуются возникновением нейродегенеративных нарушений и расстройствами, возникающими вследствие нарушения развития головного мозга (Cahn et al., 2002; Kasai et al., 2003; Steen et al., 2006; Walterfang et al.,2006; Lieberman et.al., 2008; Wang and Deutch, 2008). Большой интерес представляют нейропротективные эффекты некоторых атипичных нейролептиков (клозапин, оланзапин и др.), которые оказывают позитивное влияние на уровень нейротрофических факторов, нейрогенез, нейрональную пластичность и уровень защитных антиоксидантных ферментов (Lu et al., 2005; van Haren et al., 2007; Lieberman et.al., 2008). В исследованиях Островской Р.У. и соавт. (2003) был обнаружен нейропротективный эффект дилепта. В связи с этим, целью настоящего раздела работы являлось изучение нейропротективных свойств Рго-Туг-содержащих тетрапептидов на модели геморрагического инсульта.

Моделирование ГИ у крыс проводили согласно описанной выше методике. В первой серии экспериментов тетрапептиды под шифрами П2, П4, П6, П8 и П9 вводили крысам в/б через 3-3,5 часа после операции однократно.

В группе ложнооперированных крыс тяжелых неврологических нарушений и гибели не наблюдалось. При изучении неврологического статуса было показано, что у 4560 % крыс с ИПГ отмечались неврологические нарушения различной степени тяжести, а показатели выживаемости к 14 суткам не превышали 45 % (р< 0,05). Пептиды под шифрами П4 и П9 в дозе 1 мг/кг снижали уровень неврологических нарушений и в значительной степени (в 1,5 раза) предупреждали гибель животных. Соединение под шифром П9 статистически достоверно увеличивало количество выживших к 14 суткам животных (83,3 %). Соединения под шифрами П2, П6 и П8 практически не предупреждали развитие неврологических дефицитов.

С целью более детального изучения нейропротективных свойств веществ, наиболее эффективные соединения под шифрами П4 и П9 вводили животным с ИПГ субхронически (3 дня) с регистрацией состояния и поведения крыс в течение 2-х недель. В качестве препарата сравнения был использован мемантин (2мг/кг/3 дня), обладающий нейропротективными свойствами в клинической практике. Показано, что соединения под шифрами П4 и П9 в дозе 1 мг/кг значительно снижали уровень тяжелых неврологических расстройств и гибель крыс с ИПГ на протяжении всего периода наблюдения, и их эффект был сравним с эффектом мемантина. (Табл. 5).

Таблица 5.

Влияние субхронического введения тетрапептидов (1 мг/кг/3 дня), на динамику неврологических нарушений и гибель крыс с ИПГ._

Группа животных время после операции, сут.

1-е 7-е 14-е

а.е. % а.е. % а.е. %

Количество животных с тяжелыми нарушениями

ЛО 0/14 0,0 0/14 0,0 0/14 0,0

ИПГ 15/17* 88,2 6/14* 42,9 6/11* 54,5

Мемантин 5/20 25 2/20 10 0/16 0,0

П4 3/8* 37,5 2/8 25,0 1/7 14,3

П9 2/8# 25,0 2/6 33,3 2/6 33,3

Показатели выживаемости

ЛО 14/14 100 14/14 100 14/14 100

ИПГ 17/23 73,9 14/23* 60,9 11/23 47,8

Мемантин 20/20 100 20/20" 100 16/20* 80

П4 8/9 88,9 8/9 88,9 7/9" 77,8

П9 8/9 88,9 6/9 66,7 6/9 66,7

Достоверность отличий: * - группы ложнооперированных животных от группы контроля с ИПГ; # - группы с веществами от группы контроля с ИПГ при р< 0,05 (критерий Фишера).

При изучении поведения крыс с ИПГ в открытом поле отмечалось угнетение ориентировочно-исследовательских реакций и двигательной активности на 1-е, 7-е и 14-е сутки после операции. Соединение под шифром П4, и мемантин восстанавливали

двигательную активность крыс с ИПГ, статистически достоверно увеличивая количество горизонтальных и вертикальных перемещений на протяжении всего периода наблюдения. При регистрации эффекта соединения под шифром П9 статистически достоверное повышение показателей суммарной двигательной активности зарегистрировано на 7-е и 14-е сутки эксперимента (Рис. 9).

Рис. 9. Влияние тетрапептидов на ориентировочно-исследовательское поведение в открытом поле крыс после ГИ.

1-й день 7-й день 14-й день

ЛО ГИ П4 П9 Мем ЛО ГИ П4 ПЭ Мем Л О ГИ П4 П9 Мем

По вертикали: общее число перемещений; по горизонтали: ЛО-ложнооперированные животные; ГИ -группа животных с геморрагическим инсультом, Мем - мемантин; П4 и П9 исследуемые тетрапептиды. Достоверность отличий: * - ЛО от ИПГ; # - группы с веществами от группы с ИПГ при р< 0,05 (Меритерий Стьюдента)

Таким образом, соединения под шифрами П4 и П9 корректировали поведение животных с ИПГ в открытом поле, восстанавливая ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность.

При изучении влияния Рго-Туг-содержащих тетрапептидов на обучение УРПИ крыс с ИПГ показано, что соединение под шифром П4, как и препарат сравнения мемантин в используемых дозах статистически достоверно увеличивали латентное время рефлекса захода в темную камеру и количество обучившихся крыс на1-е и 7-е сутки после операции. Тетрапептид под шифром П9 оказывал статистически достоверное влияние только на 1-е сутки после обучения (Рис. 10).

Рис. 10 Влияние тетрапептидов (1 мг/кг/Здня) на обучение крыс УРПИ на модели ГИ.

По вертикали: общее число перемещений; по горизонтали: ЛО-ложнооперированные животные; ГИ - группа животных с геморрагическим инсультом, Мем - мемантин; П4 и П9 исследуемые тетрапептиды. Достоверность отличий: * - ЛО от ИПГ; # - группы с веществами от группы с ИПГ при р< 0,05 (^критерий Стьюдента)

Таким образом, показано, что соединения под шифрами П4 и П9 обладают способностью ослаблять нарушения неврологического статуса, уменьшать гибель и оптимизировать поведение животных на модели ГИ. Кроме того, соединение П4 обладало способностью улучшать воспроизведение УРПИ у крыс с ИПГ.

Изучение антиамнестических свойств Рго-Туг-содержащих тетрапептидов.

В предыдущих экспериментах было показано, что Рго-Тут-содержащие тетрапептиды обладают способностью ослаблять амнезию УРПИ у крыс с ИПГ. В связи с этим, представлялось целесообразным провести исследования по выявлению веществ с антиамнестической активностью среди тетрапептидов.

Изучение антиамнестической активности проводилось на модели амнезии УРПИ, вызванной МЭИ! или кетамином. Установлено, что в группе крыс, получавших МЭШ при воспроизведении рефлекса через 24 часа после обучения помнили об ударе током и не заходили в темную камеру 37,5% животных. Соединение под шифром П4 оказывало антиамнестический эффект статистически достоверно увеличивая количество животных, воспроизводящих УРПИ, а соединение под шифром П9 на модели амнезии УРПИ, вызванной МЭШ антиамнестическими свойствами не обладало (Табл.6).

На модели амнезии УРПИ, вызванной кетамином, оба соединения проявляли антиамнестическую активность и статистически достоверно увеличивали количество животных, воспроизводящих условный рефлекс (Табл. 6)

Таблица 6.

Влияние Рго-Туг-содержащих тетрапептидов на амнезию УРПИ, вызванную МЭШ или кетамином.

Вещество Шифр Доза, мг/кг, внб Воспроизведение через 24 часа

Латентное время рефлекса, (с) Кол-во животных, не зашедших в темную камеру(%)

Контроль - - 148,4±21,1 75

МЭШ - - 72,88±27,135, 37,5*

Ме1-Рго-Туг-Тгр-Оте П4 1 104,2±29,56 50*

Тф-Рго-Туг-РЬе П9 1 88,62±27,35 37,5

Контроль (физ. р-р.) - - 142,5±12,5 62,5

Кетамин - 10 72,62±16,621 37,5*

МеЬРго-Туг-Тгр-Оте П4 1 130,6±15,15® 62,5*

Тгр-Рго-Туг-Р11е П9 1 128,8±19,03® 62,5*

*- достоверность отличий от группы контроля; "-достоверность отличий групп соединений от группы с МЭШ или кетамином при р< 0,05 (х2); $- достоверность отличий от группы контроля при р<0,05 р-критерий Сгьюдента); ® "достоверность отличий групп соединений от группы с МЭШ или кетамином при р< 0,05 0-критерий Стьюдента).

Таким образом изучение антиамнестических свойств пептидов под шифрами П4 и П9 позволило установить, что наиболее эффективным соединением является Ме1-Рго-Туг-Тгр-Оте (П4), т.к. его эффект реализовался на обеих моделях амнезии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В проведенном экспериментальном исследовании осуществлялись два подхода к поиску адекватной лекарственной терапии шизофрении: коррекция побочного действия известных нейролептиков афобазолом и поиск новых эффективных препаратов с минимальными нежелательными побочными эффектами среди Рго-Туг-содержащих тетрапептидов. Показано, что афобазол обладает способностью ослаблять экстрапирамидные нарушения, вызванные трифтазином, и, особенно ярко, галоперидолом при умеренном усилении эффектов нейролептиков в тесте антагонизма с апоморфином. Учитывая тот факт, что ci-рецепторы принимают участие в развитии нарушений двигательных функций при проведении терапии больных шизофренией галоперидолом и некоторыми другими нейролептиками (Matsumoto and Pouwl, 2000; Guitart et al., 2004; Cobos et al., 2007), а афобазол имеет сродство к ci -рецепторам (Середенин С.Б. Воронин М.В., 2009) можно предположить, что формирование фармакологических эффектов препаратов при совместном применении может определяться их взаимодействием с этим типом рецепторов. Известно, что агонисты ai-рецепторов способны модулировать дофаминергические нейромедиаторные процессы (М.А. Paquette et al., 2010), что может объяснять усиление антипсихотического эффекта галоперидола при совместном введении с афобазолом и послужить одной из причин менее выраженного влияния афобазола на каталептогенный эффект трифтазина. Проведенные в настоящем исследовании эксперименты показали способность афобазола потенцировать эффекты L-ДОФА. Анализ рецепторных взаимодействий афобазола показал, что препарат является лигандома i, МТ1, МТЗ рецепторов и обратимым ингибитором МАО-А (С.Б. Середенин; М.В. Воронин; 2009). Совокупность этих данных позволяет предположить, что помимо ci-рецепторов в механизм взаимодействия афобазола с галоперидолом и трифтазином могут быть вовлечены и другие нейромедиаторные системы.

В настоящем исследовании выявлены нейролептические свойства новых Рго-Tyr-содержащих тетрапептидов, которые могут объясняться их влиянием на дофамин-, серотонин- и глутаматергическую системы. У наиболее активных соединений под шифрами Met-Pro-Tyr-Trp-OMe (П4) и Trp-Pro-Tyr-Phe (П9) обнаружены дополнительные нейропротективные свойства на модели геморрагического инсульта и установлено их позитивное влияние на нарушенные различными факторами процессы обучения и памяти. По спектру фармакологической активности эти соединения сопоставимы с оланзапином и дилептом и существенно отличаются от типичных нейролептиков.

выводы

1. Афобазол ослабляет интенсивность каталепсии, вызванной галоперидолом или трифтазином и, в зависимости от дозы и используемого теста, усиливает основной антипсихотический эффект нейролептиков (апоморфиновая вертикализация) или не влияет на него (кетаминовая гиперактивность).

2. Галоперидол при совместном применении с афобазолом не оказывает влияния на нейропротективные свойства афобазола на модели геморрагического инсульта, проявляющиеся в предотвращении гибели и ослаблении нарушений неврологического статуса у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой.

3. Показано, что среди изученных Рго-Туг-содержащих тетрапептидов в тестах апоморфиновой вертикализации, гиперкинезии, вызванной 5-ОТ и кетаминовой гиперактивности наиболее эффективными являются вещества под шифрами П4 (Met-Pro-Tyr-Trp-OMe) и (П9) Trp-Pro-Tyr-Phe, а у соединений под шифрами П1, П2, П6, П7 и П8 активности не отмечается.

4. Установлено, что соединения под шифрами П4 (Met-Pro-Tyr-Trp-OMe) и П9 (Trp-Pro-Tyr-Phe) обладают способностью ослаблять нарушения неврологического статуса, уменьшать гибель и оптимизировать поведение животных на модели геморрагического инсульта. Соединение под шифром П4 (Met-Pro-Tyr-Trp-OMe) улучшают воспроизведение УРПИ у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой.

5. Соединение Met-Pro-Tyr-Trp-OMe (П4) обладает антиамнестическими свойствами на модели амнезии УРПИ, вызванной МЭШ и кетамином, а соединение Trp-Pro-Tyr-Phe (П9) проявляет активность только в опытах с использованием в качестве амнезирующего фактора кетамина.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Гарибова Т.Л. Особенности действия мемантина на моделях холинергического дефицита и интрацеребральной посттравматической гематомы (геморрагического инсульта) в опытах на крысах [Текст] / T.JI. Гарибова, Т.А. Воронина, С.А. Литвинова, А.Л. Кузнецова, А.Е. Кульчиков, A.B. Алесенко // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. -Т.71, № 2. - С. 8 - 13.

2. Середенин С.Б. Афобазол снижает двигательные расстройства, вызванные галоперидолом [Текст] / С.Б. Середенин, Т.А. Гарибова, АЛ. Кузнецова, М.В. Воронин, М.А. Яркова, Т.А. Воронина // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - Т.72, № 1. - С. 15 - 18.

3. Гарибова Т.Л. Изучение взаимодействия афобазола с нейролептиками [Текст] / Т.Л. Гарибова, А.Л. Кузнецова, С.А. Литвинова, Т.А. Воронина // Материалы 5-ой международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва, 1-4 июня 2010 г. - С. 34.

4. Кузнецова А.Л. Поиск веществ с антиамнестической активностью среди производных адамантана [Текст] / А.Л. Кузнецова, С.А. Литвинова, Т.Л. Гарибова, Т.А. Воронина, С.О. Крайнева, Н.И. Авдюнина, Б.М. Пятин // Материалы 5-ой международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», Москва, 1-4 июня 2010 г. - С. 55.

5. Колик Л.Г. Отсутствие толерантности и синдрома отмены у нового L-триптофансодержащего дипептидного анксиолитика ГБ-115 [Текст] / Л.Г. Колик Т.Л. Гарибова, С.А. Литвинова, АЛ. Кузнецова, И.Г. Капица, И.А. Кадников, М.А. Константинопольский, Т.А. Гудашева, Т.А. Воронина, С.Б. Середенин // Вестник Российской Академии Медицинских Наук. - 2011, №7. С. 37 - 42.

Список сокращений:

ГИ - геморрагический инсульт

ИПГ - интрацеребральная посттравматическая гематома

ЛО - ложнооперированные

МЭШ - максимальный электрошок

5-ОТ - 5-окситриптофан

ТЭИ - тест экстраполяционного избавления

УРПИ - условная реакция пассивного избегания

NMDA - Ы-метил-О-аспарагиновая кислота

Заказ № 325-1 /01/2012 Подписано в печать 29.12.2011 Тираж 120 экз. Усл. пл. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:гак@с/г.ги