Автореферат и диссертация по медицине (14.03.06) на тему:Кардиотропные свойства афобазола

Столярук Валерий Николаевич

КАРДИОТРОПНЫЕ СВОЙСТВА АФОБАЗОЛА

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

о 3 ОЕо¿ОН

£

Москва-2010

4853723

Работа выполнена в учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук Крыжановский Сергей Александрович Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Камкин Андрей Глебович доктор биологических наук, профессор Гарибова Таисия Леоновна

Ведущая организация: ГОУ ВПО Московский медико-стоматологический университет Росздрава

Защита состоится_ на заседании диссертационного совета

Д.001.024.01 при НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

С диссертацией можно ознакомится в ученой части НИИ фармакологии имени В.В. Закусова РАМН по адресу: 125315, г. Москва, ул. Балтийская, д. 8.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

профессор Е.А. Вальдман

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Тревожные и астено-депрессивные синдромы являются одними из наиболее распространенных психосоматических заболеваний и, помимо тревожных состояний (фобий), связанных, в тим числе, и со страхом наличия и/или возникновения сердечно-сосудистой патологии, включают в себя симптомокомплекс вегетативных расстройств, проявляющийся кардиалгиями, лабильностью артериального давления и сердечного ритма (тахикардия, тахиаритмия, экстрасистолия) и т.д. Эта вегетативная симптоматика зачастую носит достаточно выраженный характер и требует медикаментозного лечения. Показано, что пациенты, страдающие тревожными или астено-депрессивными синдромами, в 6 раз чаще обращаются за кардиологической помощью (Marciniak М. et al., 2004). Более того, согласно данным О. W. Nielsen у 80% пациентов, обратившихся к врачу по поводу заболевания ишемической болезнью сердца (ИБС), диагносцирован кардиофобический синдром (Nielsen O.W., 2004). Тревожные и астено-депрессивные синдромы не только затрудняют социальную адаптацию пациентов и ухудшают качество их жизни, но и существенно отягощают течение и прогноз сердечнососудистых заболеваний. Так, например, прослежена прямая зависимость между уровнем фобической тревоги и риском развития фатальных и нефатальных инфарктов миокарда, нарушений сердечного ритма и/или внезапной коронарной смерти. В проспективном эпидемиологическом исследовании, в котором приняло участие 72 359 женщин (продолжительность наблюдения 12 лет), выявлена корреляция между уровнем фобической тревоги и риском возникновения злокачественных нарушений ритма сердца, в том числе и внезапной коронарной смерти (Albert Ch. М. et al., 2005). Не менее важно, что во многих случаях фобические расстройства инициируют нарушения сердечного ритма у пациентов, не имеющих клинически значимой патологии сердца (Шпак JI.B., Кононова А.Г., 1999).

Таким образом, широкая распространенность тревожно-фобических расстройств, вызывающих у пациентов состояние тревоги, страха, в том числе, ожидания новых приступов нарушения сердечного ритма, во многих случаях провоцирующих развитие аритмий, делает актуальным поиск лекарственных средств, сочетающих в себе анксиолитическую и антиаритмическую активность.

Исходя из вышеизложенного представляется актуальным изучить спектр кардиотропной активности отечественного анксиолитика афобазола поскольку известно, что производные меркаптобензимидазола к которым относится и афобазол обладают выраженной кардиотропной активностью (Чичканов Г.Г. с соавт., 1997, 1998).

Цель исследования. Изучение спектра кардиотропной активности нового

отечественного анкснолитика афобазола как в условиях нормы, так и в модельных экспериментах, воспроизводящих различные нарушения ритма сердца и/или ишемию миокарда.

Задачи исследования:

1. Оценить влияние афобазола на основные показатели деятельности сердца и гемодинамики у различных видов лабораторных животных.

2. Оценить спектр антиаритмической активности афобазола на различных видах животных с интактным и ишемизированным миокардом.

3. Оценить противофибрилляторную активность афобазола на различных видах животных с интактным, денервированным и ишемизированным миокардом.

4. Изучить возможные механизмы, лежащие в основе антиаритмического действия афобазола.

5. Оценить противоишемическую активность афобазола на модели острого инфаркта миокарда.

6. В сравнительном аспекте оценить противофибрилляторную активность афобазола и анксиолитиков бензодиазепинового ряда диазепама и феназепама.

Научная значимость работы. В работе впервые систематически изучен спектр кардиотропной активности афобазола. В опытах на различных видах животных (кошки, крысы) с интактным миокардом показано, что афобазол оказывает мягкое, дозозависимое, обратимое отрицательное ино-, хроно-, дромотропное действие на миокард; понижает уровень АД и общее периферическое сопротивление сосудов. Изучение антиаритмической активности афобазола на различных видах животных (собаки, кошки, крысы) впервые показало, что афобазол обладает широким спектром антиаритмической активности на моделях как предсердных, так и желудочковых аритмий. При этом афобазол, в отличие от классических антиаритмических лекарственных средств, не вызывает удлинение корригированного интервала ОТ на ЭКГ, что позволяет говорить о том, что препарат потенциально не обладает проаритмической активностью.

При изучении особенностей противофибрилляторного действия афобазола на животных с интактным и денервированным миокардом впервые показано, что антиаритмическое действие препарата преимущественно обусловлено его способностью повышать электрическую стабильность кардиомиоцитов. Вклад центральных эффектов афобазола в реализацию его антиаритмического действия представляется незначительным.

При оценке противоишемической активности афобазола на модели острого инфаркта миокарда у крыс впервые показано, что афобазол не только уменьшает площадь

4

экспериментального инфаркта, но и препятствует постишемическому ремоделированию миокарда.

Научно-практическая значимость. В результате проведенных исследований показано, что афобазол, по своей химической структуре являющийся производным меркаптобензимидазола, обладает антиаритмической и противоишемической активностью, что делает перспективным поиск в этом химическом ряду соединений, обладающих аналогичной активностью.

Наличие у лиганда cri-рецепторов афобазола выраженной антиаритмической активности, реализующейся на уровне кардиомиоцитов, в определенной мере дополняет существующие представления о механизмах возникновения злокачественных нарушений ритма и возможности их фармакологической коррекции.

Полученные данные, свидетельствующие о наличии у анксиолитика афобазола антиаритмической, в частности, противофибрилляторной активности, позволяют рекомендовать афобазол для лечения нарушений сердечного ритма у пациентов, страдающих фобическими и/или астено-депрессивными синдромами.

Объем и структура диссертации. Диссертация содержит следующие разделы: введение; обзор литературы; материалы и методы; результаты собственных исследований и их обсуждение; заключение; выводы; библиографический указатель, включающий работы на русском (45) и иностранных (243) языках; 22 таблицы; 18 рисунков. Диссертация изложена на 147 страницах машинописного текста.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на: III съезде Российского научного общества фармакологов (С.-Петербург, 2007 г.); V международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010 г.); на межлабораторной конференции отдела химии НИИ фармакологии им. В.В. Закусова РАМН (Москва, 2010 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ (5 статей, 4 тезисов).

Материалы и методы исследования

Опыты выполнены на 191 беспородных белых крысах самцах, 79 беспородных кошках обоего пола и 8 беспородных собаках обоего пола.

Содержание животных в виварии соответствовало Приказу МЗ РФ № 267 от 09.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».

Изучение влияния афобазола на основные показатели деятельности сердца и гемодинамики у животных с интактным миокардом выполнено на наркотизированных

5

пентобарбиталом натрия (40 мг/кг, в/в) беспородных кошках (п=12) обоего пола массой 2,8-4,5 кг в условиях искусственной вентиляции легких, и на наркотизированных уретаном (1300 мг/кг, в/б) белых беспородных крысах самцах (п=6) массой 300-350 г в условиях спонтанного дыхания. Афобазол вводили в/в с постоянной скоростью и в постоянном объеме в дозах 0,5-5,0-10,0 мг/кг. На основании анализа регистрируемых показателей (артериальное и левожелудочковое давление, ЭКГ, фазовый кровоток в восходящей части дуги аорты) рассчитывали следующие показатели гемодинамики и деятельности сердца: среднее артериальное давление, частоту сердечных сокращений, ударный и минутный объемы сердца, сократимость миокарда, индекс энергетических затрат сердца, работу сердца, общее периферическое сопротивление.

Изучение антиаритмической активности афобазола на модели аконитиновой аритмии проводили на нелинейных крысах самцах (п=35) массой 160-200 г. Аконитин вводили в/в в дозе, которая в контроле у всех животных вызывала смешанную (предсердно-желудочковую) экстрасистолию (в среднем 30-40 мкг/кг). Афобазол вводили в/в с постоянной скоростью и в постоянном объеме в дозах 0,6; 0,8 1,0 и 1,2 мг/кг профилактиктически, за 1-2 минуты до введения аконитина. Активность афобазола оценивали по его способности предотвращать смешанную экстрасистолию. В качестве критерия эффективности препарата рассчитывали ЕЭзо.

Изучение антиаритмической активности афобазола на хлоридкальциевой модели аритмии проводили на нелинейных крысах самцах (п=43) массой 250-300 г. Хлорид кальция вводили в/в (10% раствор) в минимальной дозе, вызывающей в контроле летальную фибрилляцию желудочков сердца (средняя доза 200 мг/кг). Афобазол вводили в/в с постоянной скоростью и в постоянном объеме за 2 минуты до введения раствора хлорида кальция. В качестве критерия эффективности препарата рассчитывали ЕЭ5о.

Изучение острой токсичности афобазола проводили на бодрствующих нелинейных крысах самцах (п=30) массой 160-200 г по общепринятой методике (Арзамасцев Е.В. с соавт., 2005). Афобазол вводили в/в в дозах 160; 175; 200; 225 и 240 мг/кг с одинаковой скоростью и в постоянном объеме. Токсичность каждой дозы препарата оценивали на 6 животных. О широте терапевтического действия афобазола судили по так называемому антиаритмическому индексу, который представляет собой отношение средней летальной дозы к средней эффективной (Г^о/ЕОзо).

Изучение противофибрилляторной активности афобазола на модели электрической фибрилляции желудочков сердца выполнено в опытах на анестезированных пентобарбиталом (40 мг/кг, в/в) беспородных кошках (п=7) массой 2,93,8 кг и анестезированных уретаном (1300 мг/кг, в/б) крысах-самцах (п=43) массой тела

6

350-400 г. Порог электрической фибрилляции сердца определяли повторяющимся сканированием уязвимого периода сердечного цикла серией из 20 прямоугольных импульсов постоянного тока увеличивающейся силы до возникновения фибрилляции. За порог фибрилляции принимали минимальную силу тока, стабильно вызывающую фибрилляцию желудочков при повторной стимуляции. Денервацию сердца в опытах на кошках осуществляли путем удаления правого и левого звездчатых ганглиев и пересечением правого и левого блуждающих нервов. Афобазол вводили в/в с постоянной скоростью и в постоянном объеме в дозе 7,5 мг/кг за 5 минут до начала стимуляции. Контрольные животные получали эквивалентный объем физиологического раствора. В работе использовали электростимулятор HSE Stimulator II (Hugo Sach Electronik, Германия).

Изучение влияния афобазола на модели ваготонической фибрилляции предсердий проведено на взрослых беспородных кошках обоего пола (п=26) массой 2,54,5 кг. Животных наркотизировали смесью альфа-хлоралозы и нембутала (75 и 15 мг/кг соответственно, в/в) Ваготоническую фибрилляцию предсердий вызывали путем кратковременной (5 сек) стимуляции миокарда правого предсердия при помощи электростимулятора HSE Stimulator II (Hugo Sach Electronik, Германия) на фоне постоянного раздражения блуждающего нерва при помощи электростимулятора ЭЛС-2 (Россия). Афобазол вводили в/в с постоянной скоростью и в постоянном объеме в дозе 7,5 мг/кг за 5 минут до начала стимуляции. Контрольные животные получали эквивалентный объем физиологического раствора.

Изучение влияния афобазола на варнабильность сердечного ритма у крыс с экспериментальным инфарктом миокарда проведено на беспородных крысах-самцах (п=7) массой тела 350-400 г. За 3 дня до начала эксперимента у животных воспроизводили инфаркт миокарда по методу Селье (Selye A.I., 1960). На 3-й сутки наркотизированных уретаном (1300 мг/кг, в/б) животных брали в эксперимент. Регистрировали фоновую ЭКГ (стандартные отведения) и через 5, 10, 15, 20, 30, 45 мин после введения афобазола (5 мг/кг, в/в). Длительность записи 30 сек. Запись осуществляли с помощью электрокардиографа Поли-Спектр-8/B («Нейрософт», Россия). Обработку ЭКГ проводили при помощи программы Поли-Спектр-Ритм. Контрольные животные получали эквивалентный объем физиологического раствора.

Изучение антиаритмического действия афобазола на модели реперфузионного повре;вдения миокарда проведено на беспородных кошках обоего пола (п=22) массой 2,8-4,5 кг. Острую ишемию миокарда вызывали затягиванием лигатуры на нисходящей ветви левой коронарной артерии на (2-4 мм ниже ее выхода из-под ушка), а реперфузию

7

ишемизированного миокарда (через 30 минут от момента перевязки) - путем одномоментного снятия лигатуры.

Афобазол вводили в/в с постоянной скоростью (1 мл/мин) и в постоянном объеме (3 мл физиологического раствора) в дозах 0,5 и 5 мг/кг при помощи автоматического дозатора Syringe pump (Sage Instruments, Италия) за 5 минут до начала реперфузии. Контрольные животные получали эквивалентный объем физиологического раствора.

Изучение противоишемической активности афобазола выполнено на белых беспородых крысах-самцах (п=21) массой тела 180 - 200 г. Инфаркт миокарда воспроизводили по методу Селье (Selye A.I., 1960). Афобазол вводили в/б в дозах 5 и 10 мг/кг 1 раз в сутки в течение 7 дней. Первое введение осуществляли сразу после окклюзии коронарной артерии. Контрольные животные получали эквивалентный объем физиологического раствора. На восьмые сутки животных наркотизировали уретаном (1300 мг/кг, в/б), сердца извлекали и фиксировали в 10% растворе формалина. С помощью замораживающего микротома на двух уровнях (верхушка и середина) производили поперечные срезы сердца толщиной 10-15 микрон, срезы окрашивали галлоцианином-эозином и пикрофуксином по Ван-Гизону. Микропрепараты изучали в проходящем свете. Проводили качественную и количественную оценку микропрепаратов сердца. Последнюю осуществляли с помощью сетки Автандилова и 24-х кратной лупы, на которую нанесена линейка с ценой деления 0,05 мм. Площадь инфаркта, толщину стенок желудочков и межжелудочковой перегородки, диаметр полости левого желудочка и интенсивность пролиферативных процессов определяли на срединном срезе сердца.

Статистическая обработка. Для градуированных данных определяли нормальность распределения с помощью критерия Шапиро-Уилка. В случае нормального распределения значимость отличий оценивали с помощью одномерного дисперсионного анализа или дисперсионного анализа для повторных измерений с последующей обработкой методом множественных сравнений по Даннету. В том случае, если нормальное распределение отсутствовало, использовали непараметрический аналог дисперсионного анализа по Фридману с последующей обработкой методом множественных сравнений по Ньюману-Кейлсу или Даннету. Также использовали непараметрический критерий Уилкоксона для связанных выборок и Мана-Уитни. Альтернативные данные обрабатывали с помощью метода точной вероятности Фишера и критерия х2. ED50 и LDso рассчитывали по Литчфильду-Уилкоксону.

Результаты исследования и их обсуждение

При изучении влияния афобазола (0,5-5,0-10,0 мг/кг, в/в) на основные показатели деятельности сердца и гемодинамики в опытах на анестезированных кошках и крысах с

интактным миокардом было показано, что препарат вызывает дозозависимое обратимое угнетение регистрируемых показателей деятельности сердца и гемодинамики (таблица 1) и по особенностям влияния на эти показатели близок к пульс-замедляющим антагонистам ионов кальция - производным фенилалкиламина.

Таблица 1. Влияние афобазола (10 мг/кг, в/в) на основные показатели гемодинамики и деятельности сердца у анестезированных крыс с интактным миокардом (М±ш, п=6).

Показатели фон 5 мин 10 мин 20 мин 30 мин 40 мин 60 мин

САД, мм рт.ст. 81,0±3,2 73,3±2,6* 70,2±2,6* 70,3±2,2* 73,0±2,4* 75,8±2,2* 80,7±2,8

ЧСС, уд/мин 386±5 376±5* 374±6* 375±6* 379±5* 382±7 385±7

Ударный объем, мкл 163±4 158±6* 154±4* 155±5* 157±5* 160±5* 162±5

Минутный объем, мл 63,2±2,5 58,8±2,3» 58,0±2,6* 58,2±2,7* 59,8±2,6* 61,0±2,7» 62,7±2,7

Индекс энергетических затрат 31,2±0,9 27,5±0,7* 26,3±0,6* 26,3±0,6* 27,7±0,6* 28,9±0,6» 31,1±0,8

ОПС, кПа х сек/л 10,4±0,7 10,1 ±0,7 9,8±0,7* 9,8±0,6* 9,9±0,7* 10,1 ±0,6 10,4±0,7

* - Р<0,05 по сравнению с фоном.

Наблюдаемое на фоне препарата уменьшение ЧСС, снижение АД и постнагрузки на миокард влечет за собой достаточно существенное (в пределах 15-20%) уменьшение индекса энергетических затрат миокарда, что в условиях неадекватного кровоснабжения сердца можно рассматривать как гемодинамически благоприятный эффект афобазола.

При изучении эффективности афобазола на модели ваготонической фибрилляции предсердий у анестезированных кошек (п=8) показано, что афобазол (7,5 мг/кг, в/в) в 7 из 8 случаев препятствовал развитию ваготонической фибрилляции предсердий (рисунок 1 ).

В качестве препаратов сравнения были использованы этацизин - отечественный антиаритмический препарат 1С (по классификации Vaughan Williams), который, согласно экспериментальным и клиническим наблюдениям эффективно предотвращает и купирует пароксизмы мерцательной аритмии (Лукошявичюте Ф.Й., Гедремене Д.А., 1988; Лазинский Л.Г. с соавт., 1989), и соединение АЛ-275 - кардиоциклид, обладающее, согласно экспериментальным данным, электрофизиологическими свойствами «истинных» антиаритмиков III класса (Poppe H. et al., 1999; Каверина H. В. с соавт., 2000). Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что этацизин (1 мг/кг, в/в), введенный за 10 минут до начала электрической стимуляции п. vagus, во всех случаях (п=5) препятствовал -^развитию пароксизмов фибрилляции предсердий. Кардиоциклид (2,4 мг/кг, - в/в);

введенный по аналогичной схеме, также во всех экспериментах (п=6) препятствовал развитию пароксизмов фибрилляции предсердий.

Рисунок 1. Антиаритмическое действие афобазола (7,5 мг/кг, в/в) на модели ваготонической фибрилляции предсердий. А - электрическая стимуляция п. vagus, Б -начало электрической стимуляции предсердий на фоне стимуляции п. vagus, В -окончание электрической стимуляции предсердий на фоне стимуляции п. vagus, Г -фибрилляция предсердий на фоне стимуляции п. vagus (контроль), Д- синусовый ритм на фоне стимуляции п. vagus у животного получавшего афобазол.

ЭКГ

I Ml) : i......;■ : \

IfiO. АД 40'

мм рт. CT,

В В

ЭКГ Я

М» h. *

Tj^^lfc'—iirji j^'"!*"j "E '*•" f. I'!""?'* >'"'"fr' |t

1 •

^ j 1 IP--j-j-!------------------------......

Таким образом по интенсивности антиаритмического действия афобазол не уступает эталонному антиаритмическому лекарственному средству этацизину и кардиоциклиду. Однако, если у этацизина эффект длился в среднем 110,0+15,8 минуты, то продолжительность действия афобазола колебалась в пределах 20-60 минут и в среднем составила 31,4+5,8 минуты.

Афобазол проявляет антиаритмическую активность и на модели реперфузионных аритмий у анестезированных кошек. Так, если в контрольной группе у 4-х животных из 10 реперфузия приводили к развитию фибрилляции желудочков сердца, то у животных (п=12), получавших афобазол (0,5 - 5 мг/кг, в/в), фибрилляция не наблюдалась (Р=0,03). У всех животных контрольной группы в первые 10-15 минут от момента начала реперфузии была зарегистрирована групповая желудочковая экстрасистолия, тогда как в группе животных, получавших афобазол, подобные нарушения ритма были отмечены лишь в одном случае, а у четырех животных в первые 2-3 минуты от момента начала реперфузии регистировались единичные желудочковые экстрасистолы, которые самостоятельно

купировались в течение нескольких минут (рисунок 2). Различие статистически значимо (Р=0,005).

Рисунок 2. Влияние афобазола на основные показатели деятельности сердца и гемодинамики в условиях реперфузии. Сверху вниз: ЭКГ II стандартное отведение, кривая давления в бедренной артерии, кривая давления в левом желудочке сердца, кривая фазового кровотока в восходящей части дуги аорты, (dp/dt)/P. Слева направо: А - фон до окклюзии, В - 25 минута ишемии, С - начало реперфузии, Д - 30 минута реперфузии.

КОНТРОЛЬ

А

В

_| |_l mV

140

! üi»> ■■ чйн'Уа ■ ' tlt

[ iilliii I <>00

l Iii!m

Ё

V=2,5 мм/мин V= 50 мм/мин

АФОБАЗОЛ

А В

п lu.-1 ! '.г ■■'■ . .V..

JWVA

[o fiv-VA/ ^w^w-A,

100 W_,

V=2,5 мм/мин V=50 мм/мин

Эти результаты хорошо коррелируют с данными, полученными ранее при изучении ангиаритмической активности афобазола на модели реперфузионных аритмий у крыс (Чичканов Г.Г., Цорин И.Б., 2009).

В опытах на анестезированных кошках (п=7) и крысах (п=7) с интактным миокардом было показано, что афобазол (7,5 мг/кг, в/в) во всех случаях значительно повышает порог электрической фибрилляции сердца.

Таблица 2. Влияние афобазола (7,5 мг/кг, в/в) на порог электрической фибрилляции у кошек с интактным миокардом.

N опыта 1о, мА 1пр, мА

1 1,0 >100

2 2,0 >100

3 0,5 >100

4 1,0 >100

5 5,0 >100

6 2,0 >100

7 2,5 >100

М±т 2,0±0,6 >100±0,0*

МесКапа 2 >100

25 и 75 % 1,5-2,0 100-100

* - Р<0,05 по сравнению с исходным порогом фибрилляции.

Обозначения:

1о - исходный порог фибрилляции (интактный миокард);

1пр - порог фибрилляции на фоне афобазола.

Так, если исходный порог фибрилляции сердца у интактных кошек был получен при силе тока 0,5-5,0 мА, то на фоне афобазола фибрилляцию желудочков не удавалось вызвать электрическими импульсами, сила тока которых колебалась в пределах от 0,5 до 100 мА (таблица 2).

Поскольку афобазол является высокоэффективным анксиолитиком, представляло интерес определить вклад центральных и периферических механизмов в реализацию антиаритмического действия препарата. В связи с этим в следующей серии оценивали противофибрилляторное действие препарата у кошек (п=6) с денервированным сердцем.

Показано, что после денервации сердца происходит статистически значимое (Р=0,011) снижение ЧСС (со 145,8+8,2 до 110,5+4,4 уд/мин), что свидетельствует о подавлении центральных тонических влияний на сердце, т.к. хорошо известно, что собственно синоатриапьный узел генерирует ЧСС с меньшей частотой (Камкин А.И., Каменский А.И., 2004). Порог электрической фибрилляции денервированного сердца

уменьшался в 2-3 раза, что, вероятно, связано с уменьшением электрической стабильности кардиомиоцитов, вызванной денервацией (таблица 3). Так, если электрическая фибрилляция сердца у животных с интактным миокардом вызывалась силой тока 1,0-3,0 мА, то на фоне денервации порог фибрилляции снижался до 0,5-1,0 мА.

Афобазол (7,5 мг/кг, в/в) у животных с денервированным миокардом (таблица 3),

также как и у животных с интактным миокардом, во всех опытах статистически значимо

(Р<0,05) повышает порог электрической фибрилляции сердца - фибрилляцию не

удавалось вызвать электрическими импульсами силой тока в пределах от 0,5 до 100 мА.

Таблица 3. Влияние афобазола (7,5 мг/кг, в/в) на порог электрической фибрилляции денервированного сердца у кошек.

N опыта 1о, мА 1денерв, мА 1пр, мА ЧСС до денервации ЧСС после денервации

1 1,0 0,5 >100 167 125

2 2.0 1,0 >100 130 96

3 1,5 1,0 >100 157 120

4 3,0 1,0 >100 130 103

5 2,0 1,0 >100 143 114

6 3,0 1,0 >100 147 109

М±ш 2,1±0,3 0,9±0,1 >100±0,0* 146±8 111±4**

МеШапа 2 1 >100

25 и 75 % 1,5-3,0 1-1 100-100

* - Р<0,05 по сравнению с исходным порогом фибрилляции,

** - Р<0,05 по сравнению с ЧСС до денервации.

Обозначения:

1о - исходный порог фибрилляции (интактный миокард);

1денерв - порог фибрилляции после денервации сердца;

1пр - порог фибрилляции денервированного сердца на фоне афобазола.

Поскольку интенсивность противофибрилляторного действия афобазола не различалась у животных с интактным и денервированным миокардом, есть все основания полагать, что антиаритмическое действие препарата преимущественно обусловлено его способностью непосредственно повышать электрическую стабильность кардиомиоцитов.

Такое предположение о способности афобазола реализовать свои антиаритмические эффекты, непосредственно влияя на функциональное состояние сердечной мышцы, нашло подтверждение в экспериментах по изучению его действия на вариабельность сердечного ритма у крыс с острым инфарктом миокарда. В этих экспериментах, в частности, показано, что афобазол (5 мг/кг, в/в) статистически значимо (Р<0,05) по сравнению с фоном до введения препарата уменьшает ЧСС, однако при этом препарат практически не влияет на соотношение низкочастотного и высокочастотного

компонентов ЧСС (ЬР/НР) и индекс вегетативного равновесия. Эти данные дают основание полагать, что пульс-замедляющее действие афобазола не связано с изменением активности симпатического и парасимпатического отделов вегетативной нервной системы, а реализуется на уровне сердца.

Проведенный параллельно с этим анализ структуры ЭКГ показал, что афобазол вызывает статистически значимое (Р<0,05) удлинение интервалов ЯЯ и Р(}, однако практически не влияет на продолжительность корригированного интервала (¿Т (ОТс). Эти данные позволяют говорить о том, что афобазол, так же как и истинные антиаритмические лекарственные средства (ЛС), уменьшает ЧСС и замедляет атриовентрикулярную проводимость, о чем свидетельствует статистически значимое удлинение интервалов Ю1 и Р(3 на ЭКГ, т.е. обладает отрицательным хроно- и дромотропным действием (таблица 4).

Таблица 4. Влияние афобазола (5 мг/кг, в/в) на структуру ЭКГ у крыс с экспериментальным инфарктом миокарда.

И-И, ис РО,мс <}Тс

фон 124,9±1,8 47,0±1,3 180,0±6,7

2 мин 141,3±4,4* 47,9±1,0 183,6±6,1

5 мин 144,3±4,9* 48,4± 1,0 178,1±3,8

10 мин 155,6±7,6* 49,6±1,9* 177,3±8,2

15 мин 159,7±7,2* 50,|±|,6* 174,7±7,3

20 мин 158,4±6,6* 51,6±1,5* 175,3±6,3

30 мин 161,0±6,0* 51,4±1,5* 182,4±6,9

45 мин 164,4±5,9* 54,0±|,8* 178,3±4,2

* - Р<0,05 по сравнению с фоном.

Однако в отличие от истинных антиаритмических ЛС афобазол не влияет на общую продолжительность ПД желудочков, поскольку практически не изменяет длительность интервала (}Тс, и, следовательно, потенциально не обладает проаритмической активностью. Близкие данные были получены и при изучении влияния афобазола на продолжительность (2Тс в дозе 10 мг/кг, в/в у анестезированных крыс (п=6) с интактным миокардом.

При изучении противоишемической активности афобазола у крыс (п=21) с острым инфарктом миокарда, воспроизводимым по методу Селье (Бе1уе А. I. е1 а1., 1960) показано, что хроническое (в течение 7 дней) применение афобазола (10 мг/кг, в/б) вызывает статистически значимое (Р=0,0266) уменьшение площади ишемического поражения миокарда (рисунок 3). При этом препарат не только уменьшает зону инфаркта, но и препятствует постишемическому ремоделированию. миокарда (рисунок 4).

Рисунок 3. Влияние афобазола (5 и 10 мг/кг, в/б, 7 дней) на размер экспериментального инфаркта миокарда в % от общей площади поперечного сечения сердца. По оси ординат -размер инфаркта (%)

контроль ;1ф00-<г10Л 5 мг/кг ;»фоб;» »ол 10 мг/кг

* - Р<0,05 по сравнению с контролем.

Рисунок 4. Влияние афобазола (5,0 и 10,0 мг/кг/сутки, в/б, 7 дней) на сердце крыс в условиях экспериментального инфаркта миокарда. А - поперечный срез ингактного сердца; Б - поперечный срез сердца животного с инфарктом миокарда (контроль); В -поперечный срез сердца животного с инфарктом миокарда получавшего афобазол в дозе 5.0 мг/кг/сутки, в/б, 7 дней; Г - поперечный срез сердца животного с инфарктом миокарда получавшего афобазол в дозе 10,0 мг/кг/сутки, в/б, 7 дней.

В

Эти данные косвенно подтверждаются результатами экспериментов на крысах с инфарктом миокарда, свидетельствующими о том, что длительная терапия афобазолом препятствует формированию хронической сердечной недостаточности (Г.Г.Чичканов, И.Б.Цорин, 2006).

В отдельной серии экспериментов в сравнительном аспекте оценивали антиаритмическую активность афобазола и наиболее широко применяемых в нашей стране анксиолитиков бензодиазепинового ряда диазепама и феназепама. В опытах на анестезированных крысах показано, что афобазол (7,5 мг/кг, в/в; п=6) и феназепам (1 мг/кг, в/в; п=6) статистически значимо (Р<0,05) повышают порог электрической фибрилляции сердца (таблица 5), тогда как диазепам (0,5 и 1,0 мг/кг, в/в; п=12) подобного действия не оказывает.

Таблица 5. Сравнительный анализ влияния афобазола (7,5 мг/кг в/в) и феназепама (1,0 мг/кг в/в) на порог электрической фибрилляции сердца у крыс.

№ опыта афобазол феназепам

|о, мА 1пр, мА !о, м А 1пр, мА

1 4,0 > 100 5,0 > 100

2 3,0 > 100 3,0 > 100

3 2,0 > 100 2,0 > 100

4 4,0 > 100 2,0 > 100

5 4,0 > 100 4,0 > 100

6 1,0 > 100 2,0 > 100

Mediana 3,5 >100* 2,5 >100*

25% 2 100 2 100

75% 4 100 4 100

* - Р<0,05 по сравнению с фоном до введения препарата.

Обозначения:

1о - исходный порог фибрилляции (интактный миокард);

1пр - порог фибрилляции на фоне препарата.

Поскольку нами ранее было показано, что вклад центральных механизмов в антиаритмическое действие афобазола незначителен, представляло интерес оценить вклад центральных и периферических механизмов в антиаритмическое действие феназепама, тем более что имеются литературные данные о том, что лиганды периферических бензодиазепиновых рецепторов (свойствами которых может обладать и феназепам), локализованных в сократительных кардиомиоцитах, проявляют антиаритмическую активность (Wang X. et al., 1989; Li J. et al., 2009).

Для этого в опытах на анестезированных крысах (п=6) с денервированным миокардом (по методу McEwan J.E.) оценивали антиаритмическую активность феназепама. Согласно полученным данным денервация сердца приводит к статистически

значимому урежению частоты сердечных сокращений (с 420,6 ± 18,6 до 302,4 ±21,6 уд/мин; Р=0,003), что, по всей видимости, связано с прекращением центральных тонических влияний на сердце, т.к. хорошо известно, что собственно синоатриальный узел генерирует сердечный ритм с меньшей частотой. При изучении в этих условиях противофибрилляторной активности феназепама было показано, что препарат не препятствует развитию нарушений сердечного ритма, что позволяет предположить, что антиаритмическое действие феназепама реализуется преимущественно на уровне ЦНС. Такое предположение подтверждают данные о том, что в опытах in vitro антиаритмическое действие, наблюдаемое в опытах in vivo, не наблюдалось (Меерсон Ф.З. с соавт., 1989).

Известно, что анксиолитическое действие афобазола связано с его способностью восстанавливать связывание в бензодиазепиновом участке ГАМКд-рецептора, нарушенное вследствие стресс-индуцированных воздействий (Середенин С.Б. с соавт., 1998). Однако поскольку сам афобазол не связывается с ГАМКл-рецепторным комплексом (Яркова М.А., 1996), его способность восстанавливать функциональную активность ГАМКл-рецептора, по всей видимости, опосредована высоким сродством препарата к Ст|- и/или мелатониновым МТ1 и МТЗ-рецепторам и/или способностью препарата подавлять активность МАО-А (Середенин С.Б., Воронин М.В., 2009).

Помимо нейронов ЦНС, ai-рецепторы идентифицированы в различных органах и тканях организма, в том числе и в кардиомиоцитах (Schaefer М. et al., 2000; Hayshi Т. et al., 2005b; Johannessen M„ et al., 2009; Su T.P. et al., 2009; Fontanilla D. et al., 2009).

В настоящее время at -рецепторы рассматривают как внутриклеточное эволюционное образование, играющее важную роль в защите клеток от патологических воздействий, в связи с чем их можно позиционировать как своеобразный «ремонтный» комплекс, обеспечивающий гомеостаз клетки и тем самым поддерживающий ее жизнедеятельность (Середенин С.Б. с соавт., 2009). ci-Рецепторы преимущественно локализуются внутри клетки на мембране саркоплазматического ретикулума, а также на мембранах митохондрий (Hayashi Т., Su Т., 2007; Wu Z., Bowen W.D., 2008; Tsai S.Y. et al., 2009). Активированные ai-рецепторы в составе липидных микродоменов экспортируются с мембраны эндоплазматического ретикулума к внутренней поверхности клеточной мембраны, где при помощи сфинголипидов и холестерина, входящих в состав окружающего их микродомена, фиксируются к трансмембранным потенциалзависимым ионным каналам (Hayashi Т., Su Т., 2005а).

Из литературы известно, что агонисты ai-рецепторов подавляют быстрый входящий Na+ ток, протекающий через Na»l,5 каналы кардиомиоцитов (Johannessen М. et

17

al., 2009), выходящий К* ток (в среднем на 50%), протекающий через трансмембранные Kvl,4 и К, 1,5 калиевые каналы (Aydar Е., 2002), и входящий Са++ ток, протекающий через трансмембранные потенциапзависимые кальциевые каналы L-типа (Hayashi T. et al., 2000). Но способности блокировать кальциевые каналы L-типа агонисты ai-рецепторов близки к эталонным антагонистам ионов кальция (Tchedre К.Т. et al., 2008). Афобазол также обладает способностью блокировать трансмембранные Na+, К+ и Са++ токи (Середенин С.Б. с соавт., 2005), т.е. так же, как и известные агонисты ai-рецепторов, проявляет электрофизиологические свойства, характерные для антиаритмических ЛС I, III и IV классов по классификации Vaughan Williams.

Для того, чтобы оценить вклад <Т|-рецепторов в антиаритмическое действие афобазола, в опытах на анестезированных крысах на модели электрической фибрилляции сердца оценивали антиаритмическое действие афобазола на фоне блокады ai-рецепторов. В качестве лиганда ai-рецепторов использовали препарат галоперидол (Collier Th.L. et al., 2007; Cobos E.J. et al., 2008; Entrena J., et al., 2009 и др.). Хотя галоперидол является неселективным блокатором о-рецепторов, установлено, что его сродство к ai-рецепторам в 170 раз выше, чем к (^-рецепторам (Klouz A. et al., 2001). Как следует из полученных данных, что если в контрольной серии экспериментов афобазол (7,5 мг/кг, в/в) статистически значимо (Р<0,05) повышал порог электрической фибрилляции сердца, то на фоне предварительного введения галоперидола (0,5 мг/кг, в/в) противофибрилляторное действие афобазола не проявлялось (таблица 6). Помимо этого отмечено, что у интактных животных афобазол урежает ЧСС, а у животных, получавших галоперидол, пульс-замедляющее действие афобазола не реализуется. Различия статистически значимы (Р=0,046).

Таблица 6. Влияние афобазола на порог электрической фибрилляции желудочков сердца крыс на фоне предварительного введения галоперидола.

№/№ Фоновая величина порога Галоперидол (0,5 мг/кг, в/в) Афобазол (7,5 мг/кг, в/в)

Порог ЧСС до введения ЧСС после введения Порог

1 3 0,5 416 416 0,5

2 3 1 400 400 1

3 1 0,5 375 375 0,5

4 2 I 261 261 1

5 2 4 366 366 4

6 3 3 300 300 3

7 2 1 333 333 1

8 1 0,5 316 250 3

М±т 2,19+0,29 Мед 2,0 1,5-3,0 1,44+0,47 Мед 1,0 0,5-2,0 345,9+18,6 337,6+22,1 1,75+0,48 Мед 1,0 0,75-1,3

Таким образом, полученные данные дают все основания полагать, что антиаритмическое действие афобазола может быть в той или иной мере опосредовано его сродством к ci-рецепторам, локализованным в кардиомиоцитах, поскольку, как следует из приведенных выше данных, вклад центральных механизмов в реализацию антиаритмического действия препарата незначителен. Это предположение подтверждают данные полученные в экспериментах на изолированном сердце и свидетельствующие о том, что острое аритмогенное действие галоперидола связано с блокадой ai-рецепторов (Fialova К. et al., 2009).

Можно предполагать, что кардиотропное действие афобазола не ограничивается подавлением собственно активности трансмембранных ионных каналов, т.к. известно, что агонисты а|-рецепторов, к которым, по всей видимости, относится и афобазол, обладают способностью оптимизировать внутриклеточный гомеостаз ионов Са++ посредством взаимодействия с 1P3R-3 рецепторами инозитол-1,4,5-трифосфата, принимающими участие в регуляции высвобождения ионов Са++ из саркоплазматического ретикулума (Hayashi T. et al., 2000; Cobos E.J. et al., 2008). По крайней мере, с этими эффектами агонистов с-рецепторов связывают их нейротропное действие (Hong W. et al., 2004; Peeters M. et al., 2004; Yagaasaki Y. et al., 2006).

Другим возможным механизмом, лежащим в основе кардиотропного действия афобазола, может быть известная для агонистов ai-рецепторов способность защищать клетку от свободнорадикального повреждения (Lysko P.G.et al., 1992; Vagnerova К. et al., 2006 и др.).

Эти эффекты агонистов С|-рецепторов обусловлены их способностью подавлять активность индуцибельной нитрооксидсинтетазы - iNOS (Vagnerova К. et al., 2006). В настоящее время последняя рассматривается как один из возможных «медиаторов» повреждения ишемизированных кардиомиоцитов. Из литературы известно, что гиперпродукция iNOS не только оказывает повреждающее действие на кардиомиоциты, но и инициирует дисфункцию левого желудочка, вызывая его постишемическое ремоделирование, повышает риск развития внезапной коронарной смерти (Somers J.S. et al., 2008 и др.). Помимо этого, имеются данные, что iNOS оказывает повреждающее действие на мембрану митохондрий, что приводит к их дезэнергизации. Разрушение митохондрий способствует выходу в цитозоль клетки митохондриального флавопротеина AIF, который инициирует независимые от каспаз пути апоптоза (Petit Р.Х. et al., 1996; Ravagnan L. et al., 1999). Выделившийся в цитозоль AIF посредством активации протеазы ICE активирует ADP-рибузилтрансферазу и латентную ДНКазу, которые собственно и инициируют апоптоз (Petit Р.Х. et al., 1996; Ravagnan L. et al., 1999).

19

Можно полагать, что известная для агонистов ai-рецепторов способность подавлять экспрессию iNOS влечет за собой восстановление экспрессии в клетках eNOS и, возможно, nNOS, которые, в отличие от iNOS, способствуют не только защите клетки от свободно-радикального повреждения, но и поддерживают сократительный статус кардиомиоцитов и препятствуют развитию нарушений ритма сердца (Calvert J.W., Lefer D.j., 2009; Misra M.K. et al., 2009 и др.).

Не исключено, что агонисты 0|-рецепторов могут препятствовать апоптозу кардиомиоцитов путем экспрессии гена, кодирующего белок Bcl-2 (Yang S. et al., 2007), поскольку известно, что этот белок способен подавлять апоптический каскад, инициированный iNOS (Messmer U.K. et al., 1996; MelkovâZ. et al.,1997;).

Также возможно, что определенный вклад в кардиопротективное действие афобазола вносит его способность блокировать активность МАО-А, расположенной на митохондриальных мембранах кардиомиоцитов.

В настоящее время приводятся достаточно убедительные данные о том, что в развитии сердечной недостаточности, формирующейся в условиях ишемии/реперфузии, важную роль играет апоптоз кардиомиоцитов, вызванный гиперпродукцией МАО-А (van Empel V.P. et al., 2005; Kitsis R.N., Mann D.L., 2005; Villeneuve С. et al., 2009; Fabio D.L. et al., 2009; Kaludercic N. et al., 2010 и др.). Полагают, что этот процесс может быть, в частности, следствием свободнорадикального поражения, инициированного МАО-А (Pchejetski D. et al., 2007), т.к. показано, что в основе митохондрия-обусловленного апоптоза кардиомиоцитов может лежать способность МАО-А подавлять активность сфингозинкиназы1 - SphKl; up-регуляция проапоптической активности Вах-белка и down-регуляция активности антиапоптического белка Bcl-2 (Bianchi P. et al., 2005; Pchejetski D. et al., 2007).-

Поскольку известно, что афобазол обладает способностью подавлять активность МАО-А в нейронах ЦНС, то можно полагать, что он может подавлять активность этого фермента, локализованного и на мембранах кардиомиоцитов, и, как следствие этого, будет препятствовать постреперфузионному апоптозу кардиомиоцитов, восстанавливая активность SphKl и антиапоптического белка Вс1-2 и препятствуя реализации действия проапоптических Вах-белков.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что анксиолитик афобазол обладает широким спектром кардиотропной активности, включающей в себя как антиаритмическое, так и противоишемическое действие и может быть рекомендован для лечения нарушений сердечного ритма у пациентов, страдающих фобическими и/или астено-депрессивными синдромами.

выводы

1. Афобазол в диапазоне доз 5,0-10,0 мг/кг, в/в у животных с интактным миокардом оказывает обратимое дозозависимое отрицательное ино-, хроно- и дромотропное действие, понижает уровень артериального давления и общее периферическое сопротивление сосудов.

2. Афобазол (5,0-7,5 мг/кг, в/в) обладает антиаритмической и противофибрилляторной активностью и эффективен на моделях наджелудочковых и желудочковых нарушений ритма сердца.

3. Антиаритмические эффекты афобазола (5-10 мг/кг, в/в) реализуются преимущественно на уровне кардиомиоцитов.

4. Афобазол (7,5 мг/кг, в/в) на фоне блокады асрецепторов галоперидолом в дозе 0,5 мг/кг, в/в не проявляет противофибрилляторной активности.

5. Афобазол в дозах 5-10 мг/кг, в/в не удлиняет продолжительность корригированного интервала ОТ т.е. не обладает проаритмической активностью.

6. Афобазол (10,0 мг/кг/сутки, в/б, 7 дней) на модели острого инфаркта миокарда проявляет противоишемическую активность. Препарат не только уменьшает зону ишемического поражения, но и препятствует постишемическому ремоделированию миокарда.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Крыжановский, С.А. Изучение антиишемического действия «афобазола» в условиях экспериментального инфаркта миокарда [текст] / С.А. Крыжановский, A.B. Сорокина, В.Н. Столярук, М.Б. Вититнова, И.А. Мирошкина, и др. // Бюллетень эксп. биологии и медицины. -2010.-Т. 150,№9.-С. 284-287.

2. Крыжановский, С.А. К механизму противофибрилляторного действия афобазола [текст] / С.А. Крыжановский, В.Н. Столярук, М.Б. Вититнова, И.Б. Цорин, С.Б. Середенин // Бюллетень эксп. биологии и медицины. - 2010. - т. 149, № 3. - С. 290-293.

3. Сорокина, A.B. Влияние афобазола на размер экспериментального инфаркта миокарда [текст] / A.B. Сорокина, В.Н. Столярук, М.Б. Вититнова, И.А. Мирошкина, И.Б. Цорин, С.А. Крыжановский // Эксперим. и клин, фармакология. - 2010. - Приложение. Мат. Конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», 1-4 июня 2010. - С. 82-83.

4. Столярук, В.Н. Изучение антиаритмической и противофибрилляторной активности афобазола [текст] / В.Н. Столярук, М.Б. Вититнова, С.А. Крыжановский // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - т.7, спец. Выпуск сентябрь «Мат. Ill съезда фармакологов России «Фармакология - практическому здравоохранению», С.-Пб., 23-27 сентября 2007 г. - С. 2-1966.

5. Столярук, В.Н. Изучение вклада al-рецепторов в противофибрилляторное действие афобазола [текст] У В.Н. Столярук, М.Б. Вититнова, И.Б. Цорин, С.А. Крыжановский // Эксперим. и клин, фармакология. - 2010. - Приложение. Мат. Конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», 1-4 июня 2010. - С. 84.

6. Столярук, В.Н. Изучение кардиотропных эффектов афобазола [текст] / В.Н. Столярук, М.Б. Вититнова, И.Б. Цорин, С.А. Крыжановский // Эксперим. и клин, фармакология. - 2010. - Приложение. Мат. Конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам», 1-4 июня 2010. - С. 83-84.

7. Столярук, В.Н. Изучение противофибрилляторной активности афобазола у животных с интактным и денервированным миокардом [текст] / В.Н. Столярук, М.Б. Вититнова, И.Б. Цорин, С.А. Крыжановский // Вестник Российской АМН. - 2010. - №4. - С. 45-48.

8. Столярук, В.Н. Изучение эффектов афобазола на модели реперфузионных аритмий [текст] / В.Н. Столярук, М.Б. Вититнова, С.А. Крыжановский // Вестник Российской АМН. -2010. -№ 4. - С.41-45.

9. Столярук, В.Н. Оценка эффективности афобазола на модели ваготонической фибрилляции предсердий [текст] / В.Н. Столярук, М.Б. Вититнова, И.Б. Цорин, С.А. Крыжановский // Вестник Российской АМН. - 2010. - №4. - С. 49-52.

Подписано в печать 02.12.2010 Формат 60x88 1/16. Объем 1 п.л.

Тираж 100 экз. заказ № 807 Отпечатано в ООО «Конверсия»