Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Консервирование лейкоцитов в условиях околонулевых температур
- Ученая степень
- кандидата биологических наук
- ВАК РФ
- 14.01.21
Автореферат диссертации по медицине на тему Консервирование лейкоцитов в условиях околонулевых температур
00461
На правах рукописи
Лаптев Денис Сергеевич
КОНСЕРВИРОВАНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ В УСЛОВИЯХ ОКОЛОНУЛЕВЫХ ТЕМПЕРАТУР
(экспериментальное исследование)
14.01.21 - гематология и переливание крови
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
1 8 НОЯ 2010
Санкт-Петербург - 2010
004613144
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН
Научный руководитель доктор медицинских наук,
профессор
Сведенцов Евгений Павлович
Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,
профессор
Дуткевич Игорь Георгиевич
доктор биологических наук, профессор
Тарасова Людмила Николаевна
Ведущая организация ФГОУ ВПО «Военно-медицинская академия
им. С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации (г. Санкт-Петербург)
Защита состоится 22 ноября 2010 в ^¿7часов на заседании диссертационного совета Д 208.074.01 при Федеральном государственном учреждении «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства России» по адресу: 193024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д. 16.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии.
Автореферат разослан « октября 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук
Т.В. Глазанова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Изучению возможности сохранения физиологических функций клеток и тканей в условиях различной степени охлаждения посвящены работы многих исследователей (Белоус A.M., Грищенко Е.А., 1994; Утёмов C.B., 1999; Сведенцов Е.П., 2007; Goltsev A.N. et al, 2000; Halle P. et al, 2001; Nishimura M. et al, 2001). Основное внимание ученых обращено на выяснение механизмов перестроек биологических систем на различных уровнях организации, происходящих в условиях криоанабиоза различной глубины, и разработку методов консервации при низких и ультранизких температурах. Такой подход оправдан с точки зрения создания запасов клеток и тканей, так как позволяет сохранять свойства биоматериала в течение нескольких лет, но он требует высоких затрат (применения дорогостоящего криогенного оборудования, жидкого азота, привлечения высококвалифицированного обслуживающего персонала), что делает технологию крио-консервирования сложной, громоздкой, экономически неэффективной и поэтому имеет ограниченное практическое применение. Гораздо менее затратным и более доступным является способ хранения различных клеточных суспензий и биологических объектов в условиях +4° С. Альтернативного же метода краткосрочного хранения ядерных клеток крови при околонулевых температурах (+2° -s- 0 °С) не существует.
Показаниями для применения лейкоцитных концентратов (J1K) считают неонатальный сепсис, гранулоцитопению при 1рамположительных и грамот-рицательных инфекциях с продолжительностью периода лихорадки более 5 -7 суток и отсутствием эффекта от антибактериальной терапии; гранулоцитопению у больных лейкозом, апластической анемией с септицемией резистентной к антибиотикам (Абдулкадыров K.M., 1994; Румянцев А.Г., Агра-ненко В.А., 1998; Алексеев H.A., 2002; Engelfriet С.Р., 2000; Sputtek А., 2004). В каждом конкретном случае необходим индивидуальный подход, учитывающий большую стоимость и дефицитность этой трансфузионной среды.
Исследования по оценке влияния околонулевых температур (+2° О °С) на лейкоциты и их физиологические свойства, изучение механизмов повреждения ядерных клеток крови при охлаждении - отогреве позволят создать простой, эффективный, безопасный метод сохранения ЛК. Это сделает данную трансфузионную среду более доступной и расширит область ее применения особенно в условиях, когда отсутствует возможность использовать холодовой анабиоз для хранения ЛК.
Цель исследования - создание метода консервирования лейкоцитов крови человека при околонулевых температурах от +2° до О °С.
Задачи исследования:
1. Разработать хладоограждающий раствор для консервирования лейкоцитов в условиях околонулевых температур (+2° О °С).
2. Установить оптимальную концентрацию ингредиентов хладоограж-дающего раствора путем сравнения влияния трех его вариантов на сохранение жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов.
3. Изучить функциональную активность и морфологические показатели лейкоцитов в зависимости от сроков их хранения в условиях околонулевых температур.
4. Изучить биологические особенности оптимального хладоограж-дающего раствора и определить его переносимость лабораторными животными при внутривенном введении с отогретыми аутологичными лейкоцит-ными концентратами.
Научная новизна. Впервые установлена возможность сохранения на высоком уровне функциональной активности нейтрофилов, целостности плазматической мембраны лейкоцитов, стабильности их морфологического состава в условиях околонулевых температур (+2° + О °С) в течение 6 суток под защитой разработанного нетоксичного и не требующего отмывания хла-доограждающего раствора.
Предложен эффективный и широкодоступный метод краткосрочного хранения лейкоцитов при +2° + О °С.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты работы расширяют представления о механизмах холодового повреждения и защиты лейкоцитов крови человека в условиях околонулевых температур. Это создает предпосылки для разработки надежных и безопасных методов хранения лейкоцитов крови и других высокоспециализированных клеток.
С учетом особенностей воздействия околонулевых температур (+2° О °С) на ядерные клетки крови предложен оригинальный хладоограж-дающий раствор (патент РФ № 2311027 от 27 ноября 2007 г.), эффективно работающий в указанном диапазоне температур и не требующий применения дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного персонала. Дано научное обоснование применения каждого из ингредиентов препарата.
Под защитой данного хладоограждающего раствора удается сохранять на высоком уровне функциональную активность лейкоцитов в течение 6 суток, что в перспективе позволит накапливать большие дозы лейкоцитов.
Результаты исследования представляют интерес для учреждений медицинского и биологического профиля, специалистов криобиологов и сотрудников криобанков.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработанный хладоограждающий раствор позволяет сохранять на высоком уровне физиологическую активность и морфологическую полноценность лейкоцитов, хранившихся в течение 6 суток в условиях околонулевых температур (+2° О °С).
2. Хладоограждающий раствор, содержащий гексаметиленбистетраок-сиэтилмочевину, сукцинат оксиметилэтилпиридина, желатиноль, глюкозу, цитрат натрия и воду для инъекций, является нетоксичным, апирогенным, не требует отмывания перед применением ЛК и хорошо переносится экспериментальными животными при аутологичных трансфузиях лейкоцитов, хранившихся в условиях околонулевых температур (+2° 0 °С).
Апробация работы. Результаты исследования представлены в виде научных сообщений на Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: научный и образовательный аспекты» (Киров, 2006), V Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2006), Научно-практической конференции молодых ученых «Вопросы трансфузио-логии и клинической медицины» (Киров, 2007), Всероссийском совещании (Епифановские чтения): «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2008), объединенном заседании Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов и Кировского филиала Всероссийского общества физиологов им. И.П. Павлова (Киров, 2008), Ученом совете Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2008), а также на IX Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (С.-Петербург, 2006), «VI Сибирском физиологическом съезде» (Барнаул, 2008).
Личное участие автора в получении результатов. Автором самостоятельно выполнена работа по изучению жизнеспособности, морфологического состава лейкоцитов, фагоцитарной и метаболической активности ней-трофилов, а также работа по определению скорости образования малонового диальдегида в мембранах лимфоцитов. Проведена статистическая обработка результатов исследования. Автор принимал участие в разработке хладоогра-ждающего раствора, проведении его биологических испытаний и в написании статей.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК; получен патент РФ №2311027 от 27 ноября 2007 г.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 99 машинописных страницах, состоит из «Введения», четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты экспериментальных ис-
следований, обсуждение результатов экспериментальных исследований), «Выводов», «Практических рекомендаций», «Списка использованной литературы» (174 источника, в т.ч. 64 иностранных), «Списка работ, опубликованных по теме диссертации». Диссертация содержит 24 таблицы, 9 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Получение лейкоцитного концентрата
Объектом исследования явились ЛК (п = 22), полученные из цельной крови доноров-добровольцев (средний возраст 39,4±12,2 лет) с их информированного согласия путем цитафереза в отделении гравитационной хирургии крови при клинике ФГУ «КНИИГиПК ФМБА России».
Кровь донора в количестве 450 мл заготавливали в полиолефиновые контейнеры «ТегиЯех 450 - 400 - 400» и помещали в стакан центрифуги БогуаН (США), избегая образования складок, уравновешивали и центрифугировали (2500 об/мин, 960 g) при температуре 22 °С в течение 5 минут. С помощью плазмоэкстрактора «ПЭК-3» обогащенную тромбоцитами плазму переводили в спаренный контейнер, а лейкоцитарную пленку в контейнер «Компопласт 300». Оставшиеся эритроциты, разбавив 5:1 стерильным 0,9 % раствором хлорида натрия, реинфузировали донору. Полученный объем ЛК в среднем составлял 23,4±8,2 мл.
Методы исследования функционального состояния лейкоцитов до и после хранения в условиях околонулевых температур (+2° -г- О °С) Выполнено две серии исследований. В контрольной серии нативный ЛК, а в опытной нативный ЛК, смешанный в соотношении 1:1с хладоограждаю-щим раствором, эквилибрировали при комнатной температуре 20 минут, разливали в полипропиленовые пробирки по 1,5 мл, которые помещали в электрический холодильник (+2° 0 °С).
Длительность воздействия околонулевых температур (+2° + 0 °С) на ЛК составляла до 7 суток. Отогрев производили в условиях комнатной темпера-
туры (20° -г- 22 °С) в течение 2-3 минут при покачивании пробирки 2 раза в секунду.
Изучение функциональных свойств и морфологического состава лейкоцитов осуществляли до охлаждения и после отогрева по следующим методикам.
Подсчет общего количества лейкоцитов проводили в камере Горяева. Для этого смешивали 0,4 мл 3 - 5 % уксусной кислоты с 0,02 мл JIK и оставляли на 10 мин для разрушения эритроцитов.
Морфологический состав J1K изучали по методу Г.И. Козинца (1998).
Интегральность клеточной мембраны лейкоцитов определяли методом суправитального окрашивания эозином (Schreck R., 1936; ТрошинаВ.М., 1981), считая признаком гибели клетки ее диффузное окрашивание в розовый цвет.
Функционально-метаболическое состояние лейкоцитов оценивали по величинам фагоцитарной активности нейтрофилов, содержанию лизосомаль-но-катионных белков (ЛКБ-тест) и в тесте с нитросиним-тетразолием (НСТ-тест).
Фагоцитарную активность нейтрофилов определяли по методу С.Г. Потаповой и соавторов (1977), используя инертные частицы полистирольного латекса (Sigma, США) диаметром 0,80 микрона с разведением 1:10 средой Хенкса.
Окислительно-восстановительный метаболизм нейтрофилов оценивали по НСТ-тесту (Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992), основанному на том, что под влиянием супероксиданиона, образующегося в результате молекулярной трансформации кислорода под действием НАДФ-оксидазы, растворимый краситель нитросиний-тетразолий, бесцветный в окисленном состоянии, превращается в нерастворимое соединение диформазан.
Содержание соединений, обеспечивающих микробицидность нейтрофилов без участия кислорода, определяли с помощью лизосомально-катионного теста по методу A.A. Славинского и Г.В. Никитиной (1999).
Спонтанную и индуцированную прооксидантами скорость образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах лимфоцитов определяли модифицированным способом, который основан на измерении содержания образующегося при окислении мембранных липидов малонового ди-альдегида (МДА) по цветной реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (Гази-зов В.З. и соавт., 2001; Василенко Т.Ф., 2004).
Методы изучения биологических особенностей хладоограждающего раствора Готовый раствор янтарного цвета, прозрачен, без запаха, хорошо смешивается со взвесью лейкоцитов, предотвращает их конгломерацию. Оценку рН проводили на ионометре Эксперт-001 фирмы «Эконикс-эксперт». Значение рН до охлаждения и после отогрева смеси ЛК и консерванта соответствовало физиологической норме: 7,0 - 7,4.
Изучение стабильности хладоограждающих свойств разработанного раствора проведено согласно «Временной инструкции по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре» (1979) в 9 экспериментах. Исследовали раствор через 45 суток с момента его изготовления и хранения при +60 °С, что соответствует двум годам хранения при +4 "С. До эксперимента оценивали прозрачность и рН раствора. Охлаждение лейкоцитов проводили до +2° 0 °С и хранили в течение 6 суток, после чего оценивали количество лейкоцитов, их жизнеспособность, морфологический состав и фагоцитарную активность нейтрофилов.
Изучение биологических особенностей хладоограждающего раствора проводили на лабораторных животных (табл. 1), согласно методике Х1-ой Государственной Фармакопеи (ГФ, 1990). Оценивали «острую», «хроническую» токсичность, пирогенность хладоограждающего раствора, а также переносимость трансфузий аутологичных ЛК, хранившихся с данным раствором.
Лабораторные животные, использованные в экспериментальных исследованиях_
Виды животных Число животных
Белые лабораторные мыши 25
Кролики 13
Беспородные собаки 3
Всего 41
Все полученные данные обработаны методами параметрической статистики, результаты выражали в виде М ± а, а различия оценивали по критерию Уилкоксона, считая их достоверными при р<0,05 (Гланц С., 1998).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Разработка метода хранения лейкоцитов в условиях околонулевых температур (+2° О °С) Ключевым моментом в разработке нового метода является поиск консерванта. При .разработке хладоограждающего раствора нами проанализированы повреждающие факторы, действующие на ядерные клетки крови в условиях околонулевых температур. С учетом полученных данных за основу хладоограждающего раствора был взят отечественный криопротектор гекса-метиленбистетраоксиэтилмочевина (ГМБТОЭМ), предложенный Е.П. Све-денцовым и соавт. (1981). ГМБТОЭМ относится к криофилактикам смешанного действия, малотоксичен. Его ЛД50 равна 15,5±0,6 г/кг массы мыши (Сведенцов Е.П. и соавт., 1997,1999).
Также в состав хладоограждающего раствора вводили сукцинат 3-окси-6-метил-2-этилпиридина (ОМЭПС), обладающий мембраностабили-зирующим, антиоксидантным и антигипоксическим действием, а также являющийся ингибитором перекисного окисления липидов (Лукьянова Л.Д., 1990; Девяткина Т.А. и соавт., 1999; Воронина Т.А., 2001).
В качестве дополнительных ингредиентов в раствор введены кровезаменитель «Желатиноль», раствор глюкозы, антикоагулянт цитрат натрия и бидистиллированная вода.
Все используемые ингредиенты доступны и производятся в Российской Федерации.
Изучены три варианта хладоограждающего раствора для ЛК, различающихся по концентрации входящих в них ингредиентов (табл. 2).
Таблица 2
Состав трех вариантов хладоограждающего раствора с конечной
концентрацией ингредиентов после смешивания с взвесью лейкоцитов
Номер варианта раствора ГМБТОЭМ, в% ОМЭПС, в% Глюкоза, в% Желатиноль, в% Цитрат натрия, в%
1 7,0 0,075 0,35 8,0 0,1
2 10,0 0,1 0,35 8,0 0,1
3 13,0 0,35 0,35 8,0 0,1
ЛК смешивали в соотношении 1:1 с одним из трех вариантов оригинального хладоограждающего раствора. При выборе оптимального раствора оценивали количество клеток в камере Горяева до охлаждения и после отогрева, эозинорезистентность методом суправитального окрашивания, фагоцитарную активность нейтрофилов, изучали морфологический состав.
Установлено, что после отогрева через 4 суток в равной степени сохраняются общее количество клеток и уровень клеток с сохраненными свойствами цитоплазматической мембраны со всеми вариантами хладоограждающего раствора.
При изучении морфологического состава лейкоцитов в процессе хранения при околонулевых температурах (+2° * О °С) установлено (табл. 3), что применение хладоограждающего раствора №2 не приводит к существенному (р>0,05) снижению количества гранулоцитов после отогрева, тогда как при
использовании вариантов №1 и №3 количество данных клеток достоверно (р<0,05) снижается.
Количество моноцитов (табл, 3) после отогрева не изменяется от исходного уровня при использовании всех вариантов хладоограждающего раствора. В связи с подсчетом клеток ЛК в мазках на 100 форменных элементов уменьшение числа гранулоцитов ведет к относительному увеличению числа лимфоцитов после отогрева.
Таким образом, установлен факт высокой морфологической сохранности лейкоцитных клеток после отогрева при использовании всех трех вариантов предлагаемого хладоограждающего раствора, однако, вариант №2 достоверно лучше сохраняет гранулоциты, чем № 1 и №3.
Таблица 3
Морфологический состав лейкоцитов до охлаждения при +2° + 0 °С
и после отогрева через 4 суток с использованием _трех вариантов хладоограждающего раствора (М ± а)_
Вариант п Клеточный До охлаждения После отогрева
раствора состав в % от общего числа лейкоцитов в % от общего числа лейкоцитов в % от исходного уровня
1 5 33,0±3,2 23,6±7,4* 73,8±13,0#
2 10 Гранулоциты 28,0±3,6 26,7±4,2 95,6±14,9
3 5 15,2±1,1 12,4±2,1* 81,5±ЗД#
1 5 48,0±0,0 54,0±13,4 113,3±27,8
2 10 Лимфоциты 50,0±8,3 52,3±2,3 104,7±4,6
3 5 68,6±2,2 75,4±3,3 109,8±4,6
I 5 20,0±5,0 17,5±0,7 87,5±3,5
2 10 Моноциты 22,0±4,7 20,Ш,5 93,7±7,!
3 5 16,0±2,1 14,1±0,8 88,0±8,4
Примечание: * - различия с данными до охлаждения достоверны при р<0,05; # - данные достоверно отличаются от результатов после охлаждения с раствором №2.
При оценке фагоцитарной активности нейтрофилов через 4 суток хранения выявлено (табл. 4) достоверное (р<0,05) ее снижение после отогрева при использовании всех вариантов хладоограждающего раствора. Но по от-
носительным данным при использовании варианта раствора №2 фагоцитарг ная активность нейтрофилов после отогрева достоверно (р<0,05) выше, чем при №1 и №3 вариантах раствора.
Таблица 4
Фагоцитарная активность нейтрофилов до охлаждения при +2° О °С
и после отогрева через 4 суток с использованием _трех вариантов хладоограждающего раствора (М ± а)_
Вариант раствора Число опытов Фагоцитарная активность нейтрофилов
до охлаждения, % после отогрева
% в % от исх. уровня
1 5 80,2±10,6 33,5±5,0* 41,5±6,4#
2 10 64,4±5,4 46,6±7,0* 72,4±8,3
3 5 73,0±6,3 35,3±4,0* 46,3±3,4#
Примечание: * - различия с данными до охлаждения достоверны при р<0,05; # - данные достоверно отличаются от результатов после охлаждения с раствором №2.
Таким образом, вариант раствора №2, в сравнении с вариантами раствора №1 и №3, судя по сохранности гранулоцитов и фагоцитарной активности нейтрофилов, проявляет лучшие хладоограждающие свойства в условиях околонулевых температур (+2° * О °С).
Изучение функциональных и морфологических особенностей лейкоцитов в зависимости от срока хранения при +2° + О °С Для определения оптимального срока хранения лейкоцитов с хладоо-граждающим раствором при +2" О "С образцы JIK были заложены в холодильник на 4, 6, 7 суток. Одновременно проводили контрольную серию экспериментов без применения хладоограждающего раствора.
При подсчете количества лейкоцитов до охлаждения и после отогрева не выявлено достоверного (р<0,05) снижения относительного количества лейкоцитов после 4 суточного хранения от данных контрольной серии (табл. 5). После 6 и 7 суточного хранения количество лейкоцитов в опытной серии по относительным данным достоверно (р<0,05) выше, чем в контрольной.
Количество лейкоцитов, хранившихся в условиях околонулевых температур (+2° О °С) от 4 до 7 суток (М ± а; п = 10)
| Срок (сутки) Серия экспериментов Число лейкоцитов
до охлаждения, в 1 мкл после отогрева
в 1 мкл в % от исходного уровня
4 опытная серия 8900±1096 7460±1408 84,0±15,9
4 контрольная серия 45330±3904 36090±5378 80,2±6,8
6 опытная серия Ш'ШШб 16700±6575 88,8±6,8#
6 контрольная серия 33500±980 27400±3984 75,7±9,1
7 опытная серия 24000±3200 19200±2878 79,6±11,2#
7 контрольная серия 42000±3800 2б580±4817 64,7±П,4
Примечание: # ~ достоверное отличие от результатов контрольной серии.
При оценке жизнеспособности лейкоцитов выявлено достоверное (р<0,05) отличие после отогрева по сравнению с контрольной серией при всех сроках хранения (табл. 6).
Таблица б
Эозинорезистентность лейкоцитов, хранившихся при +2° ■*■ 0 °С от 4 до 7 _суток (М±ст;п= 10)_
1 Срок (сутки) Серия экспериментов Количество эозинорезистентных лейкоцитов
до охлаждения, % после отогрева
% % от исходного уровня
4 опытная серия 100,0±0,0 92,8±5,5 92,8±5,5»
4 контрольная серия 99,7±0,5 67,6±5,0 67,8±5,0
6 опытная серия 99,3±1,0 81,1±9,5 84,1±б,3»
6 контрольная серия 99,7±0,5 45±8,6 45,1±8,7
7 опытная серия 98,5±0,6 4],7±18,5 45,0±12,8«
7 контрольная серия 100,0±0,0 30Д±4,5 30,1±4,5
Примечание; # - достоверное отличие от результатов контрольной серии.
Анализ морфологического состава лейкоцитов, перенесших охлаждение, подтвердил наибольшую устойчивость к повреждающим факторам холода лимфоцитов и моноцитов, меньшую - гранулоцитов, что объясняется их более сложной морфологической организацией. Поэтому количество лимфоцитов и моноцитов ввиду снижения числа гранулоцитов в ЛК после отогрева относительно увеличивается (табл. 7).
Так, количество гранулоцитов после отогрева через 4, 6, 7 суток в опытной серии достоверно (р<0,05) выше, чем в контрольной. Число моноцитов достоверно ниже через 6 и лимфоцитов через 7 суток хранения в условиях околонулевых температур в опытной серии по сравнению с контролем.
Таблица 7
Количество отдельных морфологических форм лейкоцитов, хранившихся с оптимальным хладоограждающим раствором _при +2° * О "С от 4 до 7 суток (М ± <г; п = 10)_
До замораживания в % от общего числа После размораживания
х 3 д! Серия экспериментов в % от общего числа в % от исходного
и гу лейкоцитов лейкоцитов уровня
Гранулоциты
4 опытная серия 28,0±3,6 26,7±4,2 95,2±14,9#
4 контрольная серия 40,1±6,7 22, 9±4,0 58,4±9,3
6 опытная серия 38,7±8,1 24,4±6,4 62,9±8,7#
6 контрольная серия 40,3±6,8 11,б±4,1 25,4±7,3
7 опытная серия 44,0±1,1 24,5±3,6 55,1±9,0#
7 контрольная серия 47,0±0,0 13,7±4,3 22,5±4,2
Лимфоциты
4 опытная серия 50,0±8,3 52,3±2,3 104,7±4,6
4 контрольная серия 51,2±9,3 60,2±9,5 И7,9±4,9
6 опытная серия 48,9±0,9 61,7±3,7 125,8±8,2
6 контрольная серия 43,9±9,2 59,9±9,9 133,8±1б,4
7 опытная серия 48,5±0,6 63,3±4,1 130,7±8,8#
7 контрольная серия , 40,0±2,2 66,3±7,0 165,0±13,9
Моноциты
4 опытная серия 22,0±4,7 20,7±1,5 93,7±7, ]
4 контрольная серия 14,1±5,9 16,6±4,7 123,2±22,4
6 опытная серия 15,5±7,1 16,5±8,1 107,5±19,3#
6 контрольная серия 8,4±0,5 23,2±П,9 201,9±45,7
7 опытная серия 8,0±1,1 12,7±4,6 165,8±76,7
7 контрольная серия 13,0±0,0 15,2±3,1 116,7±23,9
Примечание: У - достоверное отличие от результатов контрольной серии.
При изучении основной функции нейтрофилов - фагоцитоза после хранения в условиях околонулевых температур установлено достоверное (р<0,05) снижение числа фагоцитарно активных нейтрофилов от исходного уровня при всех сроках наблюдения.
После 4, 6 и 7 суточной экспозиции в состоянии гипотермии число нейтрофилов, обладающих фагоцитарной активностью, в опытной серии достоверно выше, чем в контрольной (табл. 8).
Таблица 8
Динамика фагоцитарной активности нейтрофилов, хранившихся при +2° О °С разные сроки (М ± а; п = 10)_
1 Срок(су-[ тки) Серия экспериментов Количество фагоцитарно активных нейтрофилов
до охлаждения, % после отогрева
% % от исходного уровня
4 опытная серия 64,4±5,4 46,6±7,0 72,4±8,3#
4 контрольная серия 7б,4±8,7 40,6±4,8 57,9±б,9
6 опытная серия 66,2±5,6 35,6±7,7 52,7±8,6#
6 контрольная серия 74,9±9,7 19,5±4,7 26,2±6Д
7 опытная серия 64,0±6,6 13,0±2,8 20,0±4,8#
7 контрольная серия 70,0±0,0 8,8±2,3 12,4*3,2
Примечание: # - достоверное (р<0,05) отличие от данных контрольной серии.
Так как после 7 суток уровень фагоцитарной активности нейтрофилов резко снижается ниже 50 %, максимальный срок хранения ЛК по этому показателю составляет 6 суток.
Содержание соединений, обеспечивающих микробицидность нейтрофилов без участия кислорода, реализующих опсонизирующую и стимулирующую функции нейтрофилов, определяли по среднему цитохимическому коэффициенту (СЦК) ЛКБ-теста. Количество гранул с катионными белками у нейтрофилов остается на высоком уровне под защитой хладоограждающего раствора через все сроки наблюдения, тогда как в контрольной серии СЦК после 7 суток воздействия околонулевых температур снижается ниже 50 %, а именно до 45,1±4,5 % (табл. 9). Достоверные (р<0,05) отличия между контрольной и опытной сериями экспериментов выявлены лишь после 6 и 7 суток хранения ЛК при температуре +2° 0 °С.
Динамика СЦК нейтрофилов,
хранившихся при +2° О "С разные сроки (М ± а; п - 10)
Срок ("сутки) Серия экспериментов Средний цитохимический коэффициент (СЦК)
до охлаждения после отогрева после отогрева, в % к исходному уровню
4 опытная серия 2,51±0,0 2,42±0,2 96,5±6,1
4 контрольная серия 2,10±0,3 1,93±0,3 92,3±7,3
6 опытная серия 2,53±0,0 2,46±0,2 96,9±7,9#
6 контрольная серия 2,1б±0,1 1,54±0,4 69,7±19,4
7 опытная серия 2,55±0,0 2,40±0,1 93,9±3,9#
7 контрольная серия 2,27±0,1 1,05±0,1 45,1±4,5
Примечание: # - достоверное (р<0,05) отличие от данных контрольной серии.
Окислительно-восстановительный метаболизм в нейтрофилах оценивали, определяя степень активации их кислородзависимой биоцидной способности путем подсчета клеток с диформазаном. Данные НСТ-теста показали, что до охлаждения в среднем только 14,4±5,5 % нейтрофилов способны к восстановлению нитросинего тетразолия (табл. 10). После 4 суток пребывания лейкоцитов в условиях околонулевых температур продукция активных кислородных метаболитов нейтрофилами возрастает в 2 раза от исходного количества как в контрольной, так и в опытной серии. Через б и 7 суток хранения при околонулевой температуре число диформазан-положительных клеток в опытной серии достоверно (р<0,05) ниже, чем в контрольной. Мы полагаем, что в условиях околонулевых температур в качестве активаторов НАДФН-оксидазных комплексов лейкоцитов выступают холодовые стресс-факторы, такие как изменение потребления кислорода, рН среды и др. Образовавшиеся свободные радикалы, вероятно, ведут к повреждению полиненасыщенных мембранных локусов, а также к дегрануляции и выходу в цитоплазму кислых гидролаз, оказывающих повреждающее действие на компоненты плазматических мембран, генетического аппарата, митохондрий и других органелл. Все эти процессы приводят к нарушению функций целой клетки и в дальнейшем к ее аутолизу.
Таблица 10
Результаты НСТ-теста для нейтрофилов, хранившихся с хладоограждающим раствором при +2° О °С разные сроки (М ± а; п = 10)_
Срок (сутки) Серия экспериментов Количество нейтрофилов
до охлаждения, в % к их общему числу клеток после отогрева, в % к их общему числу клеток после отогрева, в % к исходному уровню
4 опытная серия 15,5±2,1 28,9*4,8 189,2*41,4
4 контрольная серия 6,6±0,8 11,1±2,3 181,1*31,4
6 опытная серия 15,8*0,8 30,8*3,4 196,3*27,8#
6 контрольная серия 12,7±0,9 30,8±5,3 227,1*19,1
7 опытная серия 14,9*1,8 34,9*1,6 235,0*20,6#
7 контрольная серия 8,1*1,4 27,2*5,7 372,9*85,8
Примечаиие: # - достоверное (р<0,05) отличие от данных контрольной серии.
Анализ всей совокупности полученных экспериментальных данных показал, что оптимальный срок хранения лейкоцитов при +2° -г- 0 °С с разработанным хладоограждающим раствором составляет 6 суток.
Определение скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах лимфоцитов, хранившихся при +2° ■*■ 0 °С Спонтанную и индуцированную скорости образования МДА (малоновый диальдегид) в мембранах лимфоцитов, хранившихся при +2° 0 °С в течение 6 суток, определяли модифицированным методом по цветной реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой. Установлено, что в контрольной серии экспериментов без применения хладоограждающего раствора спонтанная и индуцированная скорости образования МДА в мембранах лимфоцитов достоверно (р<0,05) выше исходного уровня в 1,7 раза. В мембранах лимфоцитов, хранившихся с хладоограждающим раствором, спонтанная и индуцированная скорости образования МДА не изменяются (табл. 11).
Таблица 11
Скорость образования МДА в мембранах лимфоцитов, хранившихся б суток в условиях околонулевых температур (М ± а; п = 9)
Серия опытов Скорость образования МДА
До охлаждения После отогрева
Спонтанная (нмоль/ч) Индуцированная (нмоль/ч) Спонтанная (нмоль/ч) Индуцированная (нмоль/ч)
Контрольная 106,8*20,2 113,3*36,1 185*54,2* 194,3*53,8*
Опытная 106,8*20,2 113,3*36,1 92,32*29,5# 100,5*35,3#
Примечание: * - различия с данными до охлаждения достоверны при р<0,05; # - достоверное (р<0,05) отличие от данных контрольной серии.
Влияние длительности хранения разработанного хладоограждающего раствора на его свойства
Всего было проведено 9 экспериментов. В каждом исследовании раствор разливали во флаконы объемом по 10 мл и подвергали ускоренному старению.
Таблица 12
Показатели ЛЕС перед охлаждением до +2° О "С и после отогрева
через 6 суток с вариантом №2 хладоограждающего раствора, _подвергнутого ускоренному старению (М ± а; п = 9)_
Показатели лейкоконцентрата До охлаждения После отогрева
ед. измерения ед. измерения в % к исходному уровню
Количество лейкоцитов 25450±6867 в мкл 21450±6273 в мкл 83,9±5,9
Количество жизнеспособных лейкоцитов 99,0±1,0 % 86,2±2,2 % 87,2±3,0
Морфологический состав гранулоциты 22,5±4,7 % 14,2±5,6% 62,5±19,5
моноциты 23,7±0,8 % 17,3±2,3 % 73,3±10,5
лимфоциты 54,2±5,3 % 68,3±6,0 % 126,7±11,9
Число фагоцитарно активных нейтрофилов 61,3±1,6% 33,3±5,5 % 54,2±9,5
Результаты исследований показали (табл. 12), что вариант раствора №2, хранившийся в течение 45 суток при +60 °С, способен сохранять общее количество лейкоцитов, их жизнеспособность, морфологический состав и число фагоцитарно активных лейкоцитов, находящихся при +2° О °С в течение 6 суток, в той же степени, как и свежеприготовленный раствор, т.е. не подвергавшийся «старению» (табл. 4 - 7). В процессе ускоренного «старения» цвет, прозрачность и рН среды раствора №2 остаются без изменений.
Оценка «острой» и «хронической» токсичности, пирогенности разработанного хладоограждающего раствора и переносимости аутологичных лейкоцнтных концентратов
В экспериментальных исследованиях на животных установлено, что однократное внутривенное введение белым лабораторным мышам разработанного хладоограждающего раствора не вызывает их гибели, что говорит об от-
сутствии «острой» токсичности препарата. При определении «хронической» токсичности раствора все животные (белые лабораторные мыши и кролики) благоприятно переносили многократное его введение. Не менялись их масса тела, поведение, в том числе не изменялся аппетит, а во внутренних органах и в мозге, как показали гистологические исследования, отсутствовали признаки деструктивных изменений. Об отсутствии признаков «хронической» токсичности раствора №2 свидетельствуют также результаты общего анализа крови (число эритроцитов, уровень гемоглобина и т.д.) и мочи (цвет, прозрачность, относительная плотность и т.д.) кроликов.
Показано, что разработанный нами хладоограждающий раствор, апиро-генен - при его введении кроликам ни у одного из опытных животных суммарное повышение температуры тела не превышл норму в 1,4 °С.
В опытах на собаках установлено, что трансфузия отогретого аутоло-гичного ЛК с хладоограяедающим раствором №2 после его суточного хранения при +2° О °С, не вызывает отклонений в поведении животных, не сопровождается изменением массы их тела, ректальной температуры, пульса, частоты дыхания, показателей крови (число эритроцитов, уровень гемоглобина и т.д.) и мочи (рН, цвет, прозрачность, относительная плотность мочи, содержание в моче сахара, белка, эритроцитов, лейкоцитов и трипельфосфатов).
Следовательно, на основании проведенных биологических испытаний хладоограждающего раствора №2 доказано, что он является нетоксичным, апирогенным, хорошо переносится при переливании и по этой причине не требует отмывания от ЛК перед трансфузией.
Таким образом, разработан эффективный, безопасный и широкодоступный метод краткосрочного хранения ядерных клеток крови в условиях околонулевых температур (+2° О °С). Применение данного метода позволяет защитить лейкоциты от неблагоприятных факторов, связанных с охлажде-
нием, и способствует сохранению лейкоцитами функциональной активности после отогрева.
ВЫВОДЫ
1. Разработан оптимальный состав хладоограждающего раствора для консервирования лейкоцитов при околонулевых температурах, содержащий в конечной концентрации протектор гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину (10%), антиоксидант сукцинат оксиметилэтилпиридина (0,1 %), кровезаменитель «Желатиноль» (8 %), глюкозу (0,35 %), антикоагулянт цитрат натрия (0,1 %) и воду для инъекций.
2. Предложенный хладоограждающий раствор сохраняет при температуре +2° 0 °С в течение 6 суток на высоком уровне общее количество лейкоцитов (88,8±6,8 %), их жизнеспособность (84,1±6,3 %), фагоцитарную активность нейтрофилов (52,7±8,6 %), а скорость образования продуктов пере-кисного окисления липидов в мембранах лимфоцитов при этом остается без изменений.
3. Результаты изучения биологических особенностей разработанного хладоограждающего раствора дня лейкоцитов доказывают его апирогенность, нетоксичность и хорошую переносимость лабораторными животными при траснсфузиях с отогретыми аутологичными лейкоцитными концентратами.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Способ краткосрочного хранения лейкоцитов человека (патент РФ №2311027 от 27 ноября 2007), основанный на использовании оригинального хладоограждающего раствора в условиях околонулевых температур (+2° -5- 0 °С), при котором функциональная активность лейкоцитов сохраняется в течение 6 суток, рекомендуется для использования в научных учреждениях биологического и медицинского профиля.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Патент:
1. Сведенцов Е.П., Туманова Т.В., Лаптев Д.С., Соломина О.Н., Зайцева О.О., Якшина С.А., Худяков А.Н., Утемов C.B., Костяев А.А. Раствор для консервирования лейкоцитов при околонулевой температуре. Патент на изобретение № 2311027. Заявлено 11.05.2006; Опубл. 27.11.2007, Бюл. 33.
Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:
2. Сведенцов Е.П. Новый метод сохранения лейкоцитов в условиях околонулевых температур / Е.П. Сведенцов, Д.С. Лаптев, Т.В. Туманова, О.Н. Соломина, О.О. Зайцева, С.А. Якшина, А.Н. Худяков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 144, №9. - С. 358-36].
3. Сведенцов Е.П. Разработка нового метода сохранения жизнеспособных лейкоцитов в условиях околонулевых температур / Е.П. Сведенцов, Д.С. Лаптев, Т.В. Туманова, О.Н. Соломина, О.О. Зайцева, А.Н. Худяков Н Казанский мед. журн. - 2008. - Т. 89, № 4. - С. 558-560.
4. Лаптев Д.С. Консервирование ядерных клеток крови при температуре +2° - 0 °С / Д.С. Лаптев // Пермский мед. журн. - 2008. - Т. 25, №5. -С.58-60.
5. Сведенцов Е.П. Сохранение лейкоцитов в условиях околонулевых температур / Е.П. Сведенцов, Д.С. Лаптев, Т.В. Полежаева, О.О. Зайцева, О.Н. Соломина, А.Н. Худяков // Физиология человека. - 2010. - Т. 36, №3. -С. 130- 134.
Тезисы докладов на конференциях:
6. Лаптев Д.С. К вопросу о выборе оптимального ограждающего раствора для хранения лейкоцитов при околонулевых температурах / Д.С. Лаптев, О.Н. Соломина, Т.В. Туманова, А.Н. Худяков // Тезисы докладов V молодежной научной конференции «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» 11-13 апреля 2006 г. - г. Сыктывкар. - С. 77-78.
7. Лаптев Д.С. Сохранность функциональной активности нейтрофилов в условиях околонулевых температур / Д.С. Лаптев, О.Н. Соломина, Т.В. Туманова, А.Н. Худяков, О.О. Щеглова // В сб. науч. трудов IX Всероссийской медико-биол. конф. молодых исследователей «Человек и его здоровье» (22 апреля). - С.-Петербург, 2006 - С. 178-179.
8. Лаптев Д.С. Разработка нового метода сохранения лейкоцитов в условиях околонулевых температур / Д.С. Лаптев, Е.П. Сведенцов, Т.В. Тумано-
ва, О.Н. Соломина, О.О. Зайцева, С.А. Якшина, А.Н. Худяков // В кн.: Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: научный и образовательный аспекты. Сборник материалов Всероссийской научной школы. Выпуск III. г. Киров. 28-30 ноября 2006 г. - С. 301-302.
9. Лаптев Д.С. Новый ограждающий раствор для сохранения морфофунк-циональных показателей ядерных клеток крови в условиях околонулевых температур / Д.С. Лаптев, А.Н. Худяков, Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, О.О. Зайцева, О.Н. Соломина, С.А. Якшина // Мат-лы иауч.-гтракт. конф. молодых ученых «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины». - Киров, 11-12 апреля 2007 г. - С. 24-25.
10. Зайцева О.О. Сохранность лейкоцитов человека в условиях околонулевых и отрицательных температур / О.О. Зайцева, О.Н. Соломина, А.Н. Худяков, Д.С. Лаптев, Е.С. Степанова, Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова // Тезисы докладов «VI Сибирского физиологического съезда», - г. Барнаул, 2527 июня 2008 г. - Том I. - С. 87-88.
11. Лаптев Д.С. Изучение биологических особенностей ограждающего раствора для хранения лейкоцитов в условиях околонулевых температур / Д.С. Лаптев, Е.Г1. Сведенцов, Т.В. Туманова, О.О. Зайцева, О.Н. Соломина, А.Н. Худяков // Мат-лы докладов Всероссийского совещания «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины». - г. Киров, 27-28 мая 2008 г. - 2008. - С. 43-44.
12. Лаптев Д.С. Определение скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах лимфоцитов, хранившихся при +2° 0°С / Д.С. Лаптев, О.Н. Соломина, О.О. Зайцева, А.Н. Худяков // Фундаментальная наука и клиническая медицина: тез. докл. XII Всерос. медико-биолог. конф. молодых исследователей. г.СПб. 18.04.2009. - СПб., 2009. -С. 205-206.
Считаю своим долгом выразить глубокую благодарность за помощь в выполнении диссертационной работы: научному руководителю доктору медицинских наук профессору Евгению Павловичу Сведенцову, сотрудникам лаборатории криофизиологии крови Коми НЦ УрО РАН: к.б.н. Т.В. Тумановой, к.б.н. О.О. Зайцевой, к.б.н. О.Н. Соломиной, Г.А. Никулиной, сотрудникам ФГУ «КНИИГ и ПК ФМБА России»: к.м.н. C.B. Утемову, Н.Л. Ежовой, Ф.С. Шерстневу, к.м.н. Н.В. Рябову, Т.А. Коряковцевой, работникам библиотеки Л. Н. Устюжаниновой и В.Н. Нечаевой, работникам вивария.
Подписано в печать 14.10.2010 г. Формат 60x84 Vi6. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,5. Тираж 100 экз. Заказ № 1089.
Издательство Вятского государственного гуманитарного университета, 610002, г. Киров, ул. Красноармейская, 26
Издательский центр Вятского государственного гуманитарного университета, 610002, г. Киров, ул. Ленина, 111, т. (8332) 673-674
Оглавление диссертации Лаптев, Денис Сергеевич :: 2010 :: Санкт-Петербург
Список использованных сокращений.
Введение.
ГЛАВА I. Состояние проблемы хранения лейкоцитов в условиях околонулевых температур (обзор литературы).
1.1 Структура и функциональные свойства лейкоцитов.
1.2 Способы получения лейкоцитного концентрата и его применение.
1.3 Особенности хранения лейкоцитов в условиях околонулевых температур.
ГЛАВА II. Материалы и методы исследований.
2.1 Получение лейкоцитного концентрата.
2.2 Разработка метода хранения лейкоцитов в условиях околонулевых температур (+2° - 0 °С).
2.3 Методы исследования функционального состояния лейкоцитов до и после хранения в условиях околонулевых температур (+2° 0 °С).
2.4 Методы изучения биологических особенностей хладоограждающего раствора.
ГЛАВА III. Результаты экспериментальных исследований.
3.1 Сравнительное исследование влияния трех вариантов хладоограждающего раствора на функциональные и морфологические показатели лейкоцитов, хранившихся при +2° -ь 0 °С.
3.2 Изучение функциональных и морфологических особенностей лейкоцитов в зависимости от срока экспозиции в условиях +2° 0 °С.
3.3 Определение скорости образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах лимфоцитов, хранившихся при +2° 0 °С.
3.4 Влияние длительности хранения разработанного хладоограждающего раствора на его свойства.
3.5 Биологические особенности разработанного хладоограждающего раствора.
3.5.1 Испытание на «острую токсичность» разработанного хладоограждающего раствора.
3.5.2 Изучение «хронической токсичности» разработанного хладоограждающего раствора.
3.5.3 Определение пирогенности разработанного хладоограждающего раствора.
3.5.4 Изучение переносимости экспериментальными животными трансфузий аутологичных лейкоцитных концентратов, подвергнутых охлаждению до +2° 0 °С в течение 24 часов с разработанным хладоограждающим раствором.
Глава IV. Обсуждение результатов экспериментальных исследований.
Выводы.
Введение диссертации по теме "Гематология и переливание крови", Лаптев, Денис Сергеевич, автореферат
Актуальность темы. Изучению возможности сохранения физиологических функций клеток и тканей в условиях различной степени охлаждения посвящены работы многих исследователей (Белоус A.M., Грищенко Е.А., 1994; Утёмов C.B., 1999; Сведенцов Е.П., 2007; Goltsev A.N. et al, 2000; Halle P. et al, 2001; Nishimura M. et al, 2001). Основное внимание ученых обращено на выяснение механизмов перестроек биологических систем на различных уровнях организации, происходящих в условиях криоанабиоза различной глубины, и разработку методов консервации при низких и ультранизких температурах. Такой подход оправдан с точки зрения создания запасов клеток и тканей, так как позволяет сохранять свойства биоматериала в течение нескольких лет, но он требует высоких затрат (применения дорогостоящего криогенного оборудования, жидкого азота, привлечения высококвалифицированного обслуживающего персонала), что делает технологию криоконсервирования сложной, громоздкой, экономически неэффективной и поэтому имеет ограниченное практическое применение. Гораздо менее затратным и более доступным является способ хранения различных клеточных суспензий и биологических объектов в условиях +4° С. Альтернативного же метода краткосрочного хранения ядерных клеток крови при околонулевых температурах (+2° 0 °С) не существует.
Показаниями для применения лейкоцитных концентратов (ЛК) считают неонатальный сепсис, гранулоцитопению при грамположительных и грамотрицательных инфекциях с продолжительностью периода лихорадки более 5-7 суток и отсутствием эффекта от антибактериальной терапии; гранулоцитопению у больных лейкозом, апластической анемией с септицемией резистентной к антибиотикам (Абдулкадыров K.M., 1994; Румянцев А.Г., Аграненко В.А., 1998; Алексеев H.A., 2002; Engelfriet С.Р., 2000; Sputtek А., 2004). В каждом конкретном случае необходим индивидуальный подход, учитывающий большую стоимость и дефицитность этой трансфузионной среды.
Исследования по изучению влияния околонулевых температур (+2° О °С) на лейкоциты и их физиологические свойства, механизмов повреждения ядерных клеток крови при охлаждении — отогреве позволят создать простой, эффективный, безопасный метод сохранения ЛК. Это сделает данную трансфузионную среду более доступной и расширит область ее применения особенно в условиях, когда отсутствует возможность использовать холодовой анабиоз для хранения ЛК.
Цель исследования — создание метода консервирования лейкоцитов крови человека при околонулевых температурах от +2° до О °С.
Задачи исследования:
1. Разработать хладоограждающий раствор для консервирования лейкоцитов в условиях околонулевых температур (+2° -ь О °С).
2. Установить оптимальную концентрацию ингредиентов хладоограждающего раствора путем сравнения влияния трех его вариантов на сохранение жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов.
3. Изучить функциональную активность и морфологические показатели лейкоцитов в зависимости от сроков их хранения в условиях околонулевых температур.
4. Изучить биологические особенности оптимального хладоограждающего раствора и определить его переносимость лабораторными животными при внутривенном введении с отогретыми аутологичными лейкоцитными концентратами.
Научная новизна. Впервые установлена возможность сохранения на высоком уровне функциональной активности нейтрофилов, целостности плазматической мембраны лейкоцитов, стабильности их морфологического состава в условиях околонулевых температур (+2° О °С) в течение 6 суток под защитой разработанного нетоксичного и не требующего отмывания хладоограждающего раствора.
Предложен эффективный и широкодоступный метод краткосрочного хранения лейкоцитов при +2° О °С.
Теоретическая и практическая значимость. Результаты работы расширяют представления о механизмах холодового повреждения и защиты лейкоцитов крови человека в условиях околонулевых температур. Это создает предпосылки для разработки надежных и безопасных методов хранения лейкоцитов крови и других высокоспециализированных клеток.
С учетом особенностей воздействия околонулевых температур (+2° О °С) на ядерные клетки крови предложен оригинальный хладоограждающий раствор (патент РФ № 2311027 от 27 ноября 2007 г.), эффективно работающий в указанном диапазоне температур и не требующий применения дорогостоящего оборудования и высококвалифицированного" персонала. В работе дано научное обоснование применения каждого из ингредиентов препарата.
Под защитой данного хладоограждающего раствора удается сохранять на высоком уровне функциональную активность лейкоцитов1 в течение 6 суток, что в перспективе позволит накапливать большие дозы лейкоцитов.
Результаты исследования, представляют интерес для учреждений медицинского и биологического профиля, специалистов криобиологов и сотрудников криобанков.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Разработанный хладоограждающий раствор позволяет сохранять на высоком уровне физиологическую активность и морфологическую полноценность лейкоцитов, хранившихся в течение 6 суток в условиях околонулевых температур (+2° + О °С).
2. Хладоограждающий раствор, содержащий гексаметиленбистетраок-сиэтилмочевину, сукцинат оксиметилэтилпиридина, желатиноль, глюкозу, цитрат натрия и воду для инъекций, является нетоксичным, апирогенным, не требует отмывания перед применением ЛЕС и хорошо переносится экспериментальными животными при аутологичных трансфузиях лейкоцитов, хранившихся в условиях околонулевых температур (+2° О °С).
Апробация работы. Результаты исследования представлены в виде научных сообщений на Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: научный и образовательный аспекты» (Киров, 2006), V Молодежной научной конференции Института физиологии Коми НЦ УрО РАН «Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике» (Сыктывкар, 2006), Научно-практической конференции молодых ученых «Вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2007), Всероссийском совещании (Епифановские чтения): «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2008), объединенном заседании Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов и Кировского филиала Всероссийского общества физиологов им. И.П. Павлова (Киров, 2008), Ученом совете Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2008), а также на IX Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (С.-Петербург, 2006), «VI Сибирском физиологическом съезде» (Барнаул, 2008).
Личное участие автора в получении результатов. Автором самостоятельно выполнена работа по изучению жизнеспособности, морфологического состава лейкоцитов, фагоцитарной и метаболической активности нейтрофилов, а также работа по определению скорости образования малонового диальдегида в мембранах лимфоцитов. Проведена статистическая обработка результатов исследования. Автор принимал участие в разработке хладоограждающего раствора, проведении его биологических испытаний и в написании статей.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 4 в журналах, рекомендованных ВАК; получен патент РФ №2311027 от 27 ноября 2007 г.
Заключение диссертационного исследования на тему "Консервирование лейкоцитов в условиях околонулевых температур"
выводы
1. Разработан оптимальный состав хладоограждающего раствора для консервирования лейкоцитов при околонулевых температурах, содержащий в конечной концентрации протектор гексаметиленбистетраоксиэтилмочевину (10 %), антиоксидант сукцинат оксиметилэтилпиридина (0,1 %), кровезаменитель «Желатиноль» (8 %), глюкозу (0,35 %), антикоагулянт цитрат натрия (0,1 %) и воду для инъекций.
2. Предложенный хладоограждающий раствор сохраняет при температуре +2° 0 °С в течение 6 суток на высоком уровне общее количество лейкоцитов (88,8±6,8 %), их жизнеспособность (84,1±6,3 %), фагоцитарную активность нейтрофилов (52,7±8,6 %), а скорость образования продуктов перекисного окисления липидов в мембранах лимфоцитов при этом остается без изменений.
3. Результаты изучения биологических особенностей разработанного хладоограждающего раствора для лейкоцитов доказывают его апирогенность, нетоксичность и хорошую переносимость лабораторными животными трансфузий с отогретыми аутологичными лейкоцитными концентратами.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Способ краткосрочного хранения лейкоцитов человека (патент РФ №2311027 от 27 ноября 2007), основанный на использовании оригинального хладоограждающего раствора в условиях околонулевых температур (+2° 0 °С), при котором функциональная активность лейкоцитов сохраняется в течение 6 суток, рекомендуется для использования в научных учреждениях биологического и медицинского профиля.
Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Лаптев, Денис Сергеевич
1. Абдулкадыров K.M. Гемокомпонентная терапия при заболеваниях системы крови / K.M. Абдулкадыров // Клинич. медицина. — 1994. — Т. 72.-№2. -С. 10-13.
2. Алексеев H.A. Клинические аспекты лейкопений, нейтропений и функциональных нарушений нейтрофилов / H.A. Алексеев. СПб.: Фолиант, 2002.-416 с.
3. Алмазов В.А. Физиология лейкоцитов человека / В.А. Алмазов. Л.: Наука, 1973.-232 с.
4. Архиреев В.П. A.c. №419617 (СССР). Способ получения тетраоксиалкилзамещенных мочевин / В.П. Архиреев, Е.В. Кузнецов, В.Г. Костромина. Опубликовано в Б.И., 1974, № Ю.
5. Архиреев В.П. A.c. №189689 (СССР). Способ получения тетраоксиалкилзамещенных мочевин в водной среде / В.П. Архиреев, Ж.Г. Савагина, Е.П. Сведенцов и др. — Приоритет 29.06.1982. Зарегистрировано в Госреестре изобретений СССР 6.06.1983.
6. Атлас клеток крови и костного мозга / под ред. профессора Г. И. Козинца. М.: Триада - X, 1998. - 160 с.
7. Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов / В.А. Барабой // Успехи современной биологии. — 1991. Т. 111. - Вып. 6.-С. 21-28.
8. Барабой В.А. Перекисное окисление и стресс / В.А. Барабой, И.И. Брехман, В.Г. Голотин, Ю.Б. Кудряшов. СПб.: Наука, 1992. - 148 с.
9. Белова Л.А. Биохимия процессов воспаления и поражения сосудов. Роль нейтрофилов / Л.А. Белова // Биохимия. 1997. - Т.62, № 6. - с. 659-668.
10. Белоус A.M. Структурные изменения биологических мембран при охлаждении / A.M. Белоус, В.А. Бондаренко. Киев: Наук.думка. -1982.-256 с.
11. Белоус A.M. Молекулярные механизмы криоповреждения мембранных структур / A.M. Белоус, Т.П. Бондаренко, В.А. Бондаренко // Криобиология и криомедицина. — 1979. — №■ 5. — С. 3 — 13.
12. Белоус. А.М. Криобиология / A.M. Белоус, В.И. Грищенко. Киев: Наукова Думка, 1994. - 430 с.
13. Бут П.Г. Миелопероксидаза пероксидазосом нейтрофила / П.Г. Бут, В.А. Фомина, P.A. Муравьев, В.В. Роговин // Известия АН. Серия биологическая. 2003. — № 3. - с. 261-265.
14. Бут П.Г. Антимикробная активность миелопероксидазы пероксидазосом нейтрофила / П.Г. Бут, P.A. Муравьев, В.А. Фомина.и др. // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. 2002. - № 3. - С. 266-270.
15. Быков, B.JI. Цитология1 и общая- гистология (функциональная морфология клеток и тканей человека) / В.Л. Быков. СПб.: СОТИС, 1999. - 520 с.
16. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление* липидов и> физические свойства1 липидного слоя биологических мембран / Ю.А. Владимиров. // Биофизика. 1987. - Т. 32, № 5. - С. 830-844.
17. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в* живых системах / Ю.А.Владимиров, O.A. Азизова, А.И. Деев.и др. // Итоги науки и техники. Биофизика. 1992. - Т. 29. - С. 3-250.
18. Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах / Ю.А. Владимиров, А.Н. Арчаков. М:: Наука: - 1972. -252 с.
19. Виксман М.Е. Применение реакции^ восстановления нитросинего тетразолия для оценки функционального состояния нейтрофилов человека / М.Е. Виксман, А.Н. Маянский // Казан, мед. журн. 1997. -Т,55,№ 5.-С. 99-100.
20. Воронина Т.А. Антистрессорные эффекты антиоксиданта мексидола и его- аналогов в экстремальных ситуациях / Т.А. Воронина, Л.Д. Смирнов; E.G. Телешова, Л.И. Ларенцова, И.Л. Бабаев, Г.Г. Незнамов,
21. JI.H. Неробкова, С.А. Сюняков, М.М. Ганиев // Психофармакол. Биол.Наркол. 2001. - Т.1, № 1. - С. 2-12.
22. Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре. — М., 1979. — 7 с.
23. Газизов В.З. Биохимические реакции перекисного окисления липидов и физиологические процессы антиоксидантной защиты организма плотоядных / В.З. Газизов, C.JI. Жданов, JI.E. Бояринцев. Киров. — 2001.-40 с.
24. Герасимов И.Г. Функциональная неравнозначность нейтрофилов крови человека: генетика активных форм кислорода / И.Г. Герасимов, Д.Ю. Игнатов // Цитология. 2001. - Т. 43, № 5. - С. 432-436.
25. Герасимов И.Г. Кинетика реакции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами крови человека / И.Г. Герасимов, O.A. Калуцкая5 // Цитология. 2000. - Т. 42, № 2. - С. 160-165.
26. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. М.: Практика, 1998.-459 с:
27. Гольдберг Е.Д. Методы культуры ткани в гематологии / Е.Д: , Гольдберг, A.M. Дыгай, В.П. Шахов: Томск: Изд-во Томского гос. унта, 1992.-264 с.
28. Гордиенко Е.А. Физические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспензий / Е.А. Гордиенко, Н.С. Пушкарь. Киев: Наукова Думка, 19941 - 144 с.
29. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа, лекарственное растительное сырье /11-е изд. — Mi: Медицина, 1990. — С.182 —185.
30. Гребенюк А.Н. Нейтрофил и экстремальные воздействия / А.Н. Гребенюк, А.Е. Антушевич, В.Ф. Беженарь и др. СПб., 1998. - 216 с.
31. Гребенюк А.Н. Цитохимия нейтрофила / А.Н. Гребенюк, H.A. Смирнов, Е.Е. Давыдова и др. СПб., 1999. - 68 с.
32. Гулевский A.K. Барьерные свойства биомембран при низких температурах / А.К. Гулевский, В.А. Борндаренко, A.M. Белоус. -Киев: Наук, думка, 1988. — 208 с.
33. Гусейнов И.С. Выделение лейкоцитов из крови доноров для экспериментальных и клинических целей / И.С. Гусейнов, Л.И. Федорова // Пробл. гематологии и переливания крови. — 1963. № 4. -С.52-55.
34. Деветьярова О.Н. Функциональная активность лейкоцитов, перенесших криоанабиоз при -20 °С: автореф. дис. . канд. биол. наук / Деветьярова Ольга Нурзадиновна. — Киров, 2005.
35. Демин С.Ю. Основные типы и жизненные формы периферических и ФГА-стимулированных лимфоцитов человека, выявляемые in vitro / С.Ю. Демин // Цитология. 2003. - Т. 45, № 6. - С. 535 - 547.
36. Дюмаев K.M. Антиоксиданты в профилактике и терапии патологий \ ЦНС / K.M. Дюмаев, Т. А. Воронина, Л.Д. Смирнов. 1995. - М, 271 с.
37. Жибурт Е.Б. Трансфузиология / Е.Б. Жибурт. СПб.: Питер, 2002. -736 с.38.3аривчацкий М.Ф. Основы трансфузиологии / Под ред. М.Ф. Заривчацкого. Пермь: Изд-во Пермского ун-та, 1995. - С. 74-75.
38. Инструкция по применению полимерных контейнеров «Гемакон» и «Компопласт» / В.П. Кошивая, Е.М. Макарова, Н.М. Шишов и др. М., 1983.- 13 с.
39. Истаманова Т.С., Функциональная гематология / Т.С. Истаманова, В.А. Алмазов, C.B. Канаев. — Л.: Медицина, 1973. 310 с.
40. Калинин И.Н. Получение и применение концентрата тромбоцитов и лейкоцитов / И.Н. Калинин // Пробл. гематологии и переливания крови. -1980. -№ Ю.-С. 50-56.
41. Калинин И.Н. Получение концентрата тромбоцитов и лейкоцитов с помощью сепаратора клеток крови и их применение при миелодепрессии: автореф. дис. . канд. мед. наук / Калинин И.Н., 1978.-20 с.
42. Козинец Г.И. Практическая трансфузиология / Г.И. Козинец, Л.С. Барюкова, H.A. Горбунова и др. М.: Триада-Х, 1997. - 435 с.
43. Лаврик С.С. Применение низкомолекулярного ПВП в качестве защитной среды для консервирования и длительного хранения лейкоцитов методом глубокого замораживания / С.С. Лаврик, Г.И. Когут, Е.Ю. Афанасьева // Врачеб. дело. 1971. -№ 12. - С. 80-83.
44. Ларионов Л.Ф. Химиотерапия злокачественных опухолей / Л.Ф. Ларионов. М.: Медгиз, 1962. - 464 с.
45. Лебедев К.А., Иммунограмма в клинической практике / К.А. Лебедев, И.Д. Понякина. М.: Наука, 1990. 224 с.
46. Левин C.B. Структурные изменения клеточных мембран / C.B. Левин-Л.: Наука, 1976. 197 с.
47. Леонтович В.Н. Условия, удлиняющие срок хранения жизнеспособности клеток в лейкоцитарной массе / В.Н. Леонтович, H.H. Абезгауз // Проблемы гематологии и переливания крови. 1960. -№ 6, с. 44-50.
48. Леонтович В.А. Получение лейкоцитной массы из периферической крови человека и ее фракционирование на гранулоциты и лимфоциты / В.А. Леонтович, H.H. Абезгауз, В.М. Трошина // Пробл. гематологии и переливания крови. — 1971. — № 1. С. 51—57.
49. Луговой В.И. Механизмы повреждающего действия замораживания на растворимые и мембраносвязанные ферменты: автореф. дис. . д-ра биол. наук. / Луговой В.И. Харьков, 1985. - 38.
50. Лукьянова Л.Д. Проблемы фармакологической коррекции гипоксии и поиска антигипоксантов / Л.Д. Лукьянова // Клеточные механизмы реализации фармакологического эффекта. М.: Медицина. - 1990. — С. 184-216.
51. Лукьянова Л.Д. Особенности'антигипоксического действия мексидола, связанные с его специфическим влиянием на энергетический обмен / Л.Д: Лукьянова, В.Е. Романова и др. // Хим. фарм. журн. - 1990. - № 8.-С. 9-11
52. Мамаев А.Е. Применение модежеля и взвеси эритроцитов в модежеле в комплексном лечении больных разлитым перетонитом: автореф дис. . к.м.н. / Мамаев А.Е. СПб, 1998 - 16с.
53. Мамаев А.Е. Опыт применения взвеси эритроцитов в модежеле в комплексном лечении больных разлитым перетонитом / Мамаев А.Е.,
54. М.Д. Ханевич, Е.А. Селиванов // Terra medika nova 1997. - Т.З, № 3. -С.42 - 44.
55. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Изд. 15-е, перераб., испр. и доп. / М.Д. Машковский. М.: Новая волна, Умеренков изд. — 2007. — 1206 с.
56. Марковский А.Л. Влияние факторов криоконсервации на гидратацию глобулярных белков: автореф. дис. . канд. биол. наук / Марковский А.Л. Харьков, 1984. - 20с.
57. Мельникова В.Н. Заготовка, консервирование крови и ее компонентов. Руководство по, общей и клинической трансфузиологии / В.Н. Мельникова, В.Г. Плешаков, Е.А. Селиванов. — СПб.: Фолиант, 2003. -С. 115-150.
58. Мельникова В.Н. Получение и клиническое применение при гнойно-септических заболеваниях лейкоцитарной взвеси из крови иммунных доноров / В.Н. Мельникова // Трансфузионная медицина. 1995. - № 5. -С. 32-36.
59. Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меныцикова, В.З. Ланкин, Н.К. Зенков, И.А. Бондарь, Н.Ф. Круговых, В.А. Труфакин. -М.: Фирма «Слово», 2006. -556 с.
60. Мовшев Б.Е. Трансфузионные среды: прикладные и фундаментальные аспекты / Мовшев Б.Е., Витвицкий В.М., Лисовская И.Л., Атауллаханов Ф.И. // Гематология и трансфузиология, № 3, 2001. с. 74-82.
61. Моисеев В.А. Молекулярные механизмы криоповреждения и криозащиты белков и биологических мембран: автореферат, дис. . д-ра биол. наук / Моисеев В.А. Харьков, 1984. — 47.
62. Муравьев P.A. Механизм бактерицидной активности в фагосомах нейтрофилов / PIA. Муравьев, П.Г. Бут, В.А. Фомина и др. // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. 2002. - № 4. - С. 437-441.
63. Муравьев P.A. Желатиназные гранулы нейтрофильных гранулоцитов / P.A. Муравьев, В.А. Фомина, В.В. Роговин // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. 2003. - №4. - С.389-394.
64. Основы физиологии человека / Под ред. Ткаченко Б.И. — СПб.: Международный фонд истории науки, 1994. — С. 212-218.
65. Петров В.И. Современные антиоксиданты в медицине / Под ред. В:И. Петрова. Волгоград: ФРУП «ИПК «Царицын». - 2001. - С. 12.
66. Пигаревский В.Е. Зернистые лейкоциты и их свойства / В.Е. Пигаревский. М.: Медицина, 1978. - С. 104 - 108.
67. Пигаревский В.Е. Лизосомально-катионный тест. Методические рекомендации / В.Е. Пигаревский. М., 1979. - 10 с.
68. Покровский В.М. Физиология человека / В.М. Покровский^ Г.Ф. Коротько. -М.: Медицина, 1997.
69. Полякова А.И. Изучение влияния, низких температур (-196 °С) и криопротектора (ПЭ0400) на сохранность клеток лейкоконцентрата и лимфоконцентрата периферической крови: автореф. дис. . канд. биол. наук / Полякова А.И. Харьков, 1975. — 14 с.
70. Попов C.B. Взаимодействие фагоцитов, млекопитающих сполисахаридами растений'/ C.B. Попов. — Сыктывкар, 2002. — 100 е./
71. Попов C.B. Функциональные реакции нейтрофилов и макрофагов на растительные полисахариды: автореф. дис. . канд. биол. наук / Попов C.B. Сыктывкар, 1999. - 19 с.
72. Потапова С.Г. Изучение поглотительной' способности нейтрофилов крови с использованием инертных частиц латекса / С.Г. Потапова, B.C. Хрустиков, Н.В. Демидова, Г.И. Козинец // Пробл. гематологии ипереливания крови. 1977. - № 9: - С. 58 - 59.
73. Пушкарь Н.С. Физико-химические- механизмы- криоповреждений биологических структур / Под- ред. Н.С.Пушкаря. Итоги науки и техники, вып. Биофизика, Т. 9:-Москва; 1978.
74. Пушкарь Н.С. Введение в криобиологию / Н.С. Пушкарь, A.M. Белоус. Киев: Наукова Думка, 1975. - 342 с.
75. Пушкарь Н.С. Разработка оптимальных режимов программного замораживания' лейкоцитов / Н.С. Пушкарь, Г.С. Лобынцева, А.И. Полякова и др. // Пробл. гематологии и*переливания крови. 1978. - № 8.-С. 8-13:
76. Румянцев А.Г. Клиническая трансфузиология / А.Г. Румянцев; А.Г. Аграненко М.: ГЭОТАР Медицина, 1998.-575 с.
77. Рыжков С.В:, Калеко С.П., Плоцкий А.Н. Клиническое применение лейкоконцентрата/ С.В. Рыжков, С.П. Калеко, А.Н: Плоцкий // Вест, хирургии. 1992. - № 1-3. - С. 78-82.
78. Рыжков С.В. Применение лейкоконцентрата при гнойно-септических состояниях / С.В. Рыжков, А.Н. Плоцкий, С.Ф: Малахов, и др. //
79. Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии (Тез. докл. Рос. конф., 1995, С. Петербург) СПб, 1995. - С. 343-344.
80. Сведенцов Е.П. Руководство по трансфузионной медицине / Под ред. Е.П. Сведенцова. Киров, 1999. - 715 с.
81. Сведенцов Е.П. К классификации разных уровней отрицательных температур, используемых для консервирования биообъектов/ Е.П. Сведенцов // Материалы научной сессии (30-31 марта 2004 г.). Киров, 2004.-С. 117-120.
82. Сведенцов Е.П. Получение и криоконсервирование костного мозга для клинического применения: автореф. дис. . д-ра мед. наук / Сведенцов Е.П.-Л., 1987.-45 с.
83. Сведенцов Е.П. Способ введения лейкоцитов крови человека в холодовой анабиоз при -50 °С / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, С.А. Якшина и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2003. - №11. -С. 35-37.
84. Сведенцов Е.П. Функциональное состояние лейкоцитов после выхода из криоанабиоза / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова Екатеринбург: УрО РАН, 2007. - 81 с.
85. Сведенцов Е.П. Отечественные криоконсерванты для костного мозга / Е.П. Сведенцов, A.A. Костяев // Вестник службы крови России. -1997. №1.-С. 26-28.
86. Свиридов C.B. Гетерогенные коллоидные плазмозамещающие растворы: настоящее и будущее / C.B. Свиридов // Российский Журнал Анестезиологии и Интенсивной Терапии. 1 999. — № 2.
87. Славинский A.A. Цитоплазматическая зернистость нейтрофильных лейкоцитов/ A.A. Славинский // Клинич. лаб. диагностика. — 2002. — № З.-С. 39-42.
88. Смирнов Л.Д. Фармакологические свойства и перспективные области клинического применения антиоксидантов гетероароматического ряда / Л.Д. Смирнов // Свободные радикалы и антиоксиданты в химии и биологии. Тезисы докладов М.: РАН. - 2000. - С. 11.
89. Смирнов Л.Д. Фармакологическая коррекция гипоксических состояний алкилзамещенными 3-окси-пиридинами / Л.Д. Смирнов, Т.А. Воронина и др. //Фармакологическая коррекция кислородзависимых патологических состояний. М., 1989 - С. 87
90. Строев Е.М. Практикум по биологической химии. Учебное пособие для фармац. вузов и факультетов / Е.М. Строев, В.Г. Макарова М: Высш.шк., 1986. - С. 211-213.
91. Терентьева Э.И. Субмикроскопическая организация клеток крови, хранившихся в замороженном состоянии / Э.И. Терентьева, В.А. Леонтович, Л.И. Федорова и др. // Р.Ж. ВИНИТИ 04.Ai Общие проблемы биологии. — 1966. — № 1. — С. 154-168.
92. Трошина В.М. Криоконсервирование гранулоцитов с диметилацетамидом: автореф. дис. . канд. биол. наук / Трошина В.М. -М., 1981.-14 с.
93. Утемов C.B. Методы выделения лейкоцитов для клинических целей // Препараты крови и кровезаменители производство, контроль и клиническое применение: Мат-лы науч.-практ. конф / Утемов C.B. — Киров, 1995.-С. 68.
94. Файнштейн Ф.Э. Современные вопросы терапии больных хроническим миелолейкозом / Ф.Э. Файнштейн, Н.Д. Хорошко // Пробл. гематол. и перелив, крови. 1981. - № 4. - С. 3-7.
95. Фонталин Л.Н. Иммунологическая реактивность лимфоидных органов и клеток / Л.Н. Фонталин. Л.: Медицина, 1967. - 209 с.
96. Ханевич М.Д. Использование лейкоцитарной массы при лечении тяжелых форм разлитого перитонита / М.Д. Ханевич, А.В1 Маринин // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии: Тез. докл. Рос. конф. (С.-Петербург, 1995 г.). СПб, 1995. - С.344-345.
97. Хлябич Г.Н. Кровезаменители, консерванты крови и костного мозга / Под ред. Г.Н. Хлябича. М.: Медицина, 1997. - 192 с.
98. Цуцаева A.A. Криоконсервирование клеточных суспензий / Под ред. A.A. Цуцаевой — Киев: Наукова Думка, 1983. — 240 с.
99. Чередеев А.Н. Fc-рецепторы на фагоцитирующих клетках / А.Н. Чередеев // Иммунология. 1995. - №3. - С. 21-25.
100. Шевченко Ю.Л. Руководство по общей и клинической трансфузиологии / Ю.Л. Шевченко, В.Н. Шабалин, М.Ф. Заривчацкий, Е.А. Селиванов. СПб.: Фолиант, 2003. - 608 с.
101. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови / Ф.Дж. Шиффман. М. -СПб.: БИНОМ Невский диалект, 2000. - 448 с.
102. Шмидт Р. Физиология человека: в 3-х томах / Под ред. Р. Шмидта и Г. Тевса. М.: Мир, 1996. - 288 с.
103. Щеглова О.О. Функциональное состояние лейкоцитов после выхода из холодового анабиоза при умеренно-низкой температуре: Автореф. дис. . канд. биол. наук /. Щеглова Оксана Олеговна. -Киров, 2005.
104. Abdel-Mageed A. Effect of temperature variation on cell number, viability and clonogenic potential / A. Abdel-Mageed, M.L.U. Rosalio, C.E. Hutcheson // Blood. 1997. - Vol.90. - P. 321b (4194).
105. Aderem A. A. Mechanisms of phagocytosis in macrophages/ A. A. Aderem, D. M. Underhill // Annu. Rev. Immunol. 1999. - Vol. 17. - P. 593-623.
106. Baggiolini M. Chekines and leukocyte traffic / M. Baggiolini // Nature. 1998. - Vol. 392. - P. 565-568.
107. Bainton D.F. The development of neutrophilic polymorphonuclear leukocytes in human bone marrow / D.F. Bainton, J.L. Ulliot, M.G. Farquhar // J. Exp.Med. 1971 - Vol. 134(4 ): P. 907-934.
108. Bainton D.F. Distinct granule populations in human neutrophils and lysosomal organelles identified by immuno-electron microscopy / Bainton D.F. // J. Immunol. Methods. 1999. - Vol.232. - P. 153-168.
109. Bainton D.F. Neutrophilic leukocyte granules: from structure to function / Bainton D.F. // Adv. Exp. Med. Biol. 1993. - Vol. 336. - P. 1733.
110. Bhatia S. Granulocyte Transfusions: eficacy in treating fungal infections in neutropenic patients following bone marrow transplantation / S. Bhatia, J. McCullough, E.H. Perry et. al. // Transfusion. 1994. - Vol. 134. -P. 226-232.
111. Bjerrum O.W. Mixed enzyme-linked immunosorbent assay (MELISA) for HLA class I antigen: a plasma membrane marker / O.W. Bjerrum, N. Borregaard // Scand. J. Immunol. 1990. - Vol. 31, № 3. - P. 305-313.
112. Blystone S.D. Integrin avP3 differentially regulates adhesive and phagocytic functions of the fibronectin receptor a5Pi / S.D. Blystone, I.L. Graham, F.P. Linberg, E.P. Brown // J. Cell Biol. 1994. - Vol. 123. - P. 1129-1137.
113. Borregaard N. Biosynthesis of granule proteins in normal human bone marrow cells. Gelatinase is a marker of terminal neutrophil differentiation / N. Borregaard, M. Sehested, B. S. Nielsen et al. // Blood. 1995. - Vol. 85, № 3. - P. 812-817.
114. Borregaard N. Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte / N. Borregaard, J.B. Cowland // Blood. 1997. - V. 89. № 10. -P. 3503-3521.
115. Borregaard N. Development of neutrophil granule diversity / N. Borregaard // Ann. N.Y. Acad. Sci. 1997. Vol. 15. № 832. - P. 62-68.
116. Cairo M.S. Randomized trial of granulocyte transfusions versus intravenous immuneglobulin therapy for neonatal neutropenia and sepsis / M.S. Cairo, C.C. Worchester, R.W. Rset et. al. // J.Pediatr. 1992. -Vol.120.-P.281-285.
117. Carroll M.C. The role of complement and complement receptors in induction and regulation of immunity / M.C. Carroll // Annu. Rev. Immunol. 1998. Vol. 16. - P. 545-568.
118. Clark R.A. The human neutrophil respiratory burst oxides / R.A. Clark // J. Infect. Dis. 1990. - Vol.161. - P.l 140-1147.
119. Clark R.A. Activation of the neutrophil respiratory burst oxides / R.A. Clark//J Infect Dis. 1999; 179: S309-S317.
120. Claus V. Lysosomal enzyme trafficking between phagosomes, endosomes, and lysosomes in J774 macrophages / V. Claus, A. Jahraus, T. Tjelle et al. // J. Biol. Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 9842-9851.
121. Cottier-Fox M. Bone marrow collection techniques. In: Areman E.M., Deeg H. J., Sacher R. A. (eds) Bone marrow and stem cell processing: Amanual of current techniques / M. Cottier-Fox. Philadelphia: F.A. Davis, 1992: 38-48.
122. Cowland J.B. Molecular characterization and pattern of tissue expression of the gene for neutrophil gelatinase-associated lipocalin from humans/ J.B. Cowland, N. Borregaard //Genomics. — 1997. Vol. 45,№1. — P. 17-23.
123. Daeron M. Fc receptor biology / M. Daeron // Annu. Rev. Immunol. -1997. Vol. 15. - P. 203-234.
124. De Haas M. Neutrophil Fc Y RHIb deficiency, nature and clinical consequences: A study of 21 individuals from 14 families / De Haas M., Kleijer M., van Zwieten R. et al. // Blood. 1995, Vol. 86, N. 6, p. 2403.
125. De Montalembert M. Granulocyte transfusion in children / De Montalembert M., N.Jabado, D. Leman et al. // Blood, 1998, Vol. 92, N. 10, Suppl. 1, p. 131.
126. Gullberg U., Biosynthesis, processing and sorting of neutrophil proteins: insight into neutrophil granule development / U. Gullberg, E. Andersson, D. Garwicz et al. // Eur. J. Haematol. 1997, Vol. 58, N. 3, p. 137.
127. Hampton M.B. Inside the neutrophil phagosom: oxidants, myeloperoxidase and bacterial killing / M.B. Hampton, A.J. Kettle, C.C. Winterbourn//Blood. 1998. V. 92. № 9. P. 3007-3017.
128. Hill R.S. Nitroblue tetrazolium (NBT) activity in human leucocytes after freezing / R.S. Hill, M. Kennedy, C. Mackinder // Pathology, 1978. Vol. 10, No. l.P. 69-75.
129. Hartman M.L. Human peripheral blood eosinophils express stem cell factor / M.L. Hartman, A.M. Piliponsky, V. Temkin, F. Levi-Schaffer // Blood. 2001. - Vol. 97. - P.1086-1091.
130. Hubl W. Effect of storage on stem cell concentration and viability in cord blood / W. Hubl, J. Iturraspe, C.E. Hutcheson et al. // Blood. 1997. -Vol. 90.-P. 4217.
131. Hume H. The transfusion support patients with acquired or congenital bone marrow Ch. 2 // S.M. Wilson, J.S. Levott, R.G. Strauss / Improving transfusion practice for pediatric patients Arlington, AABB. 1991.-P. 19 -39.
132. Hurst J.K. Myeloperoxidase: active site strukture and catalyticmehanisms / J.K. Hurst, J. Everse, K.E. Everse, M.P. Grisham // Peroxidase in Chemistry and Biology. Boston: CRC Press. - 1991. - P. 37-62.
133. Jialan Shi. Role of the liver in regulating numbers of circulating neutrophils / Jialan Shi, Gary E. Gilbert, Yoshihiro Kokubo, Takashi Ohashi.//Blood, 15 August 2001, Vol. 98, No. 4, pp. 1226-1230.
134. Jahraus A. Evidence for retrograde traffic between terminal lysosomes and the prelysosomal/late endosomal compartment / A. Jahraus, B. Storrie, Griffiths, M. Dèjardins // J. Gell Sci. 1994.-Vol. 107. № 1. -P:145-157.
135. Klebanoff S.J. Oxygen metabolism from phagocytes // Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. Second Edition / S.J. Klebanoff, Eds Gallin J.I., Goldstein I.M., Snyderman R.N.Y.: Raven Press, 1992. P. 541-588.
136. Mohn H. The sre-family protein tyrosine kinase p59 is locatcd on the secretory granules towards the phagosome during cell activation / H.
137. Mohn, V. LeOabec, S. Fisher, J. Mordonnean— Parini // Biochem. J. 1995. - V. 309. № 2. P. 657-668.
138. Neppert J. Therapie mit Granulozyten / J. Neppert // Transfusions — medizin, Berlin: Verlog Springer. - 1996. - S. 339-344.
139. Nesterova I.V. Current Views on the Role of Neutrophil Granulocyte System / I.V. Nesterova, N.V. Kolesnikova // Russ. J. Immunol. 1999. -Vol. 4, №3.-P. 229-233.
140. Nishimura M. Frozen-stored granulocytes can be used for an immunofluorescence test to detect granulocyte antibodies / M. Nishimura, S. Mitsunaga, T. Juji // Transfusion. 2001. - Vol.41, №10. - P.1268-1272.
141. Nusbacher J. Granulocyte collection and processing: function and clinical utilisation. Granulocyte / J. Nusbacher 1997. № 7. - P. 175-183.
142. Pettit E.J. Cytosolic Free Calcium and the Cytoskeleton in the Control of Leukocyte Chemotaxis / EJ. Pettit, F.S. Fay // Physiological Reviews; -1998. Vol.78,-P.949-967.
143. Ruthl R.C. Efficavy of granulocyte transfusions in control of systematic candidiasus in the leukopenic host / R.C. Ruthl, B.R. Anderson, B.L. Cunningham et al. // Blood. 1978. № 52. - P. 493-498.
144. Strauss R.G. Granulocyte transfusions. In:: Rossi E.C., Simon T.L., Moss G.S., Gould S.A. (eds). Principles of transfusion medicine, 2nd ed. Baitimor, MD: Williams and Wilkins, 1995: 321-8.
145. Schiffer C.A. Granulocyte transfusions:. An overlooked therapeutic modality/ C.A. Schiffer// Transfus. Rev. 1990 № 4. - P. 2 - 7.
146. Schreck R. A method for counting the viable cells in normal and malignant cell suspension / R. Schreck // Ann. J. Cancer 1936. - Vol.28 -P. 389-391.
147. Segal A.W. The NADPH oxidase of phagocytic leukocytes / A.W. Segal, K.P. Shatwell // Ann. N.Y. Acad. Sei. 1997. - Vol. 832. - P. 215 -222.
148. Segal B.H. Genetic, biochemical, and clinical features of chronic granulomatous disease / B.H. Segal, T.L. Leto, J.I. Gallin, H.L. Malech, S.M. Holland //Medicine.-2000; 79 : 170-200.
149. Sputtek A., Sputtek R. Cryopreservation in Transfusion Medicine and Haematology/ Sputtek A., Sputtek R. // In Life in the Frozen State / Fuller B. J., Lane N., Benson. London, New York, Washington: CRS Press, 2004.-P. 483-504.
150. Svedentsov E.P. Low temperature Leukocyte concentrate conserving / E.P. Svedentsov, V.P. Archireyev, S.V. Utyomov et al. // Vox Sanguineous. 25th Congress JSBT, 1998. Oslo, Norway. - P. 1254.
151. Svedentsov E.P. Effect of cryohypobiosis on concervation of human blood leukocytes / E.P. Svedentsov, E.S. Stepanova, T.V. Tumanova et al. // J. Cryoletters., 2005. Vol.26, No. 6. P. 387 394.
152. Taylor M.J. Function of lymphocytes and macrophages after cryopreservation by procedures for pancreatic islets: potential for reducing tissue immunogenicity / M.J. Taylor, H.L. Bank // Cryobiology. 1988. -Vol. 25, №1.-P. 1-17.
153. Warkentin P.I. Clinical backgroung for marrow and progenitor cell processing. In: Lasky L.C., Warkentin P.I. (eds). Marrow and stem cell processing for transplantion, Bethesda, MD: American Association of Blood Banks, 1995: 1-20.
154. Weis W.I. The C-type lectin superfamily in the immune system / W.I. Weis, M.E. Taylor, K. Drrickamer // Immunological Rev. 1998. - Vol. 163.-19-34.
155. Список работ, опубликованных по теме диссертации1. Патент:
156. Статьи в журналах, рекомендованных ВАК:
157. Лаптев Д.С. Консервирование ядерных клеток крови при температуре +2° 0 °С / Д.С. Лаптев // Пермский мед. журн. - 2008. - Т. 25, №5. -С. 58-60.
158. Сведенцов Е.П. Сохранение лейкоцитов в условиях околонулевых температур / Е.П. Сведенцов, Д.С. Лаптев, Т.В. Полежаева, О.О. Зайцева, О.Н. Соломина, А.Н. Худяков // Физиология человека. 2010. - Т. 36, №3. - С. 130-134.
159. Тезисы докладов на конференциях:
160. Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины». -г. Киров, 27-28 мая 2008 г. 2008. - С. 43-44.