Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Низкотемпературное (-80°C) консервирование лейкоцитных концентратов

На правах рукописи

Утёмов Сергей Вячеславович

НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЕ (-80°С) КОНСЕРВИРОВАНИЕ ЛЕЙКОЦИТНЫХ КОНЦЕНТРАТОВ

(экспериментальное исследование)

14.0029- гематологияи переливание!фови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание у ч&юй степени кандидата медицинских наук

Санкт- Петербург 2005

УДК.615.385.3.014.41

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Кировский н^чно-исатедовательский институт гематологии и переливания крови Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

доктор медицинских нау кпрофессор Сведенное Евгений Павлович

доктор медицинских нау к профессор Мельникова Вера Николаевна доктор медицинских нау к профессор Фрегатова Любовь Михайловна

Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования

Защита состоится «ХЗ » ауЦ^СЬоЛ- 2005 года в УЗ часо в на заседании диссертационного совета Д 208.074Л1 Российского научно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии (193024, г. Санкт-Петербург,ул 2-я Советская, 16).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского н^чно-исследовательского института гематологии и трансфузиологии

авто реферат разослан « » 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских н^к Т.В. Глазанова

Jûûf- '/ июню

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Современная клиническая трансфузиология основана на применении компонентов крови, однако лейюцитные концентраты не получили до сих пор широюго распространения в лечебной практике. Лей № концентрат с заместительной цепью может использоваться при миело-токсических агранулоцитозах, возникающих на фоне высомэдозной химиотерапии больных онкогематологическими заболеваниями, а также при лейкопениях различного генеза, сопровождающихся септицемией, лихорадкой и клиническими признаками тяжелой локальной или ген фал изо ванной инфекции (Румянцев А Г., Аграненю В.А., 1997; Алексеев H А.,2002).

Трансфузия ^тологичных или донорских лейкоцитных концентратов позволяет заместить утраненную функцию клеточного звена иммунитета особенно в тех случаях, когда иммуностимулирующая терапия неэффективна или противопоказана(Попович A.M., Гусев C.B., 1995 ; Балашов Д Л.,2002).

Одной из причин, затрудняющих применение лейкоцитов, является отсутствие эффективного метода их низкотемпературного консервирования. Ранее предложенные криопротекторы - глицерин, полиэтиленоксид (ПЭО-400) -не в полной мере обеспечивают защиту лейкоцитов во время замораживания. Диметлацетамид (ДМАЦ), ПЭО-400 - не нашли применения в России, т.к. отсутствует их производство в нашей стране. Диметилсульфоксид (ДМОО) не разрешен для внутривенного введения Фармакологическим комитетом MB РФ.

Лечебная доза лейкоцитов, по данным разных авторов, составляет в среднем 2,5 х Ю10 клеток. Выделение такого количества клеток достаточно сложно и возможно с помощью фракционагоров крови, которые позволяют решить проблему получения больших количеств лейкоцитов (до 5,0 х Ю10) от одного донора.

Ограничение применения л ей ко концентрата в клинической практике связано с низкой устойчивостью нативных лейюцитов, особенно гранулоци-тов, при хранении в условиях положительных температур. Установлено, что у этих клеток, ввиду быстрого истощения энергетического потенциала через

•УС НАЦИОНАЛЬНАЯ i ВНБЛМОТСКА I СПсмрвпг^Дд!

короткий промежуток времени нарушаются морфофункциональные свойства, в частности, уже через 24-48 часов после кроводэти полностью исчезает способность к фагоцитозу (Цуцаева A.A.и соавт., 1983).

Температуры, близкие к 0°С, не нашли применения для хранения лейкоцитов, т.к в этом диапазоне клетки быстро теряют структуру и разрушаются без постоянного поддержания энергетических затрат и в связи с накоплением продуктов метаболизма (Lin P.S., Lionetti F.S ; 1980; Абезгауз H.H., Мартынова В.А., 1981). Длительное хранение лейкоцитов в функционально полноценном состоянии достигается при использовании ультранизких температур в условиях медленного замораживания (1-3°С/мин) под защитой криофилакгиков и стабилизирующих добавок. Наиболее изученными, по данным JA. Cavins , JDjerassi, (1968); H.H. Абезггуз, B.H. Трошиной (1981); C.B. Ермолович, В.А. Аграненко (1996), являются способы консервирования гранулоцитов при температурах от - 150°С до - 196°С с ДМАЦ. Указанный метод криоюнсерви-рования обеспечивает сохранность гранулоцитов (по резистентности к витальным гасителям) до 70 - 80 % и их функциональную полноценность до 50% от исходной. Отмеченные способы требуют применения дорогостоящего оборудования и жидкого азота, что делает технологию криоконсервирования сложной и экономически затратной. Методики консервирования лейкоцитов при температурах до -80°С в настоящее время не разработаны.

Исходя из вышеуказанных фактов, очевидна актуальность создания нового эффективного метода крио кон сервирован и я концентрата лейкоцитов и в разработке крио консерванта, который был бы нетоксичен, обеспечивал достаточную морфологическую и функциональную сохранность клеток и не требовал их отмывания послеразмораживания.

Цель исследования

Целью настоящей работы явилось создание метода криоконсервирова-ния лейюцитного концентрата при температуре-80°С с использованием электро морозил ьни ю в.

Задачи исследования

1. Разработать лекарственную форму криоконсерванта для замораживания лейкоцитов, содержащего вещество гексаметиленбистетраоксиэтилмоче-вину (ГМБТОЭМ), не требующую отмывания после оттаивания биообъекта.

2. Разработать способ консервирования лейкоцитов путем нелинейного быстрого д^х ступенчато го замораживания до -80°Спри использовании предложенного ограждающего раствораи электроморозильников.

3. Изучить функциональные и морфологические свойства лейкоцита в, криоюнсервированных по предложенному методу, в процессе хранения и послеразмораживания.

4. Провести биологические испытания предложенного консерванта. Определить переносимость экспериментальными животными внутривенного введения лейкоцитов, консервированных замораживанием по новому способу.

Научная новизна. Разработан и экспер и ментально изучен оригинальный ьриоконсервант для замораживания лейкоцитов на основе криофилакти-ческого вещества ГМБТОЭМ, не требующий отмывания после оттаивания клеточной суспензии.

Создана новая программа нелинейного быстрого д^х ступенчато го зат мораживания до -30° С с помощью аппарата Криостат и электро морозильника на-80°С. Предложен метод замораживания биопродукта в отечественных полимерных контейнерах одноразового применения "Компопласт 300", упакованных в холдеры оригинальной конструкции и определены условия их дальнейшего хранения в низкотемпературном электрохолодильнике.

Экспериментально обоснованы режимы консервирования и хранения лейкоцитов, обеспечивающие морфологическую и функциональную сохранность л ей ко концентрата при -80°С, установлена переносимость взвеси лейкоцитов, крио юн сервированных по новому способу, при внутривенном введении лабораторным животным.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенных биологических, физических, морфологических, функциональных,

цитохимических экспериментальных исследований подтверждают выраженный криозащитный эффект нового криоконсфванта на основе ГМБТОЭМ для лейкоцитов при низко температурном замораживании.

Показано, что при использовании установленной оптимальной концентрации оригинального криопоротекгора клетки после размораживания сохраняют свои морфофункциональные свойства и ультраструетурную организацию на достаточном уровне. Биологические свойства примененного ионсер-ванта для лейшцитного концентрата позволяют рекомендовать его дальнейшего изучения в клинических условиях.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Оригинальный криононсервант для лейкоцитов на основе отечественного (фиопротектора ГМБТОЭМ нетоксичен, апирогенен и не требует отмьь ванияотсуспензии клетокпослеееотгаивания.

2. Предложенный криононсер вант на основе ГМБТОЭМ позволяет обеспечить высокую сохранность и функцию лейкоцитов при низкотемпературном замораживании по нелинейной программе и хранении при -80°С в электроморозильнике.

3. Новый способ низкотемпературного консервирования при 80°С может быть рекомендован для замораживания лейкоцитов человека в полимерных контейнерах "КомпопласгЗОО" и последующих клинических испытаний.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях в ГУ КНИИГПК (1997,1998, 1999, 2000), 25-ом Международном конгрессе по переливанию крови (Осло, Норвегия 1998), республиканской конференции «Актуальные вопросы трано фузиологии» (Киров, 2000), научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (С. Петербург, 2000), съезде Российского общества физиологов им ИЛ. Павлова ( Казань 2001), а также заседаниях Кировского областного нгучного общества гематологов и трансфузио-логов (1999,2000).

Личное участие автора в получении результатов. Автором лично разработан новый крио консервант, проводилась заготовка лейнэцитного концентрата, определена морфологическая и функциональная сохранность клеток до замораживания и после оттаивания, проведен анализ и статистическая обработка полученных результатов.

Объем и структура диссертации. Диссертация представляет собой рукопись объемом 99 страниц компьютерного текста и состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, указателя литературы, содержащего 171 наименований, в том числе 114 отечественных и 57 зарубежных источников. Работа иллюстрирована23 таблицами и 6 рисунками.

Диссертация выполнена в ГУ Кировский НИИ гематологии и переливания 1фови (директор д.м.н. профессор С.Л. Шарыгин), в лаборатории консервирования крови и тканей (руководитель лаборатории д.м.н. АА. Костяев), лаборатории патоморфологии крови (заведующая к.м.н. Н.С. Федоровская), лаборатории экспериментально-клинических исследований (руководитель к.м.н. Ю.В. Зиновьев), отделе контроля качества станции переливания крови ГУ КН ИИ ГПК (главный врач В.К. Куноф, руководитель отдела ГА. Гребене-ва). Фрагмент работы по гистологическим исследованиям выполнен в Кировской государственной медицинской академии совместно с доцентом кафедры патологической анатомии к.м.н. СЛ. Яволовым.

Выражаю глубокую благодарность научному руководителю д.м.н. профессору ЕЛ. Сведенцову за помощь в подготовке диссертации, руководителю лаборатории консервирования фови и тканей д.м.н. АА. Костяеву, ученому сефетарю института к.м.н. доценту М.Е. Ковтуновой, заместителю директора по научной работед.м.н. профессору Г.А.Зайцевой.

Публикации материалов исследования

По теме диссертации опубликовано 10 ночных работ, в том числе две из них в центральной и одна в зарубежной печати.

Материалы и методы исследований. Концентрат лейкоцитов получали выделением из цельной донорской крови с информированного оо гласи я доноров-добровольцев в отделении гравитационной хирургии крови ГУ КНИИГПК. После центрифугирования (900g) с использованием центрифуг ЦЛП 3 - 3,5 и К-70 удаляли плазму, а образовавшийся над эритроцитами лейнэтромбоцитар-ный слой переводили в контейнер "Компопласт 300" или "Гемакон 300". Полученное количество лейковзвеси в разных случаях составляло от 20 до 40 мл . В опытах использовано 103 образца концентрата лейкоцитов от 68 доноров. Для крио нэнсервирования применяли лейкоциты, полученные вышеуказанным способом.

Экспериментальные исследования выполнены на 128 животных. Для проведения экспериментов использовалось четыре вида животных: белые лабораторные мыши массой 19-20 г., кролики породы «Шиншилла» массой 233 -3,4 кг, морские свинки массой 400-520 г и беспородные собаки массой 6,7 -6$ кг и 15 -24 кг (табл. 1).

Таблица 1

Виды и количество животных, использованных в исследованиях

Виды животных Число животных

Белые мыши 75

Кролики 38

Морские свинки 9

Беспородные собаки 6

Всего 128

"Острую" и "хроническую" токсичность, пирогенностьнового криокон-сер ванта изучал и по методикам,указанным втаблице2.

Таблица2

Методики оценки биологических свойств крио консерванта

Исследуемый пока « гель Виды животных Методика N

«Острая токсичность» Лабораторные мыши ГФ XI с 182 45

«Хроническая токсичность» Лабораторные мыши ГФ XI с 182 20

Пирогенность Кролики «Шиншила» ГФ XI с 953 28

«Местное раздражающее действие» Морске свинки, Сведенцов Е П 9

кролики «Шиншила» (1987) 10

«Генотоксическое действие» Лабораторные мыши Меерзон Ф 3 (1993) 10

Биологическая переносимость Беспородные собаки Сведенцов ЕП (1999) 6

Генотоксичность крио протектор а тестировали по влиянию на частоту хромосомных аберраций в клетках костного мозга мышей. Препараты костного мозга готовили по методу С. Е Ford., I. L Hamerton (1956), позволяющему учитывать повреждения хромосом на стадии метафазы.

Эвтаназию животных производили ингаляционной передозировкой эфира Состояние внутренних органовоценивали визуально. Кроме того, производили взвешивание изъятых органов и рассчитывали коэффициенты их массы. Результаты сравнивали с аналогичными, полученными при вскрытии интакт-ных животных.

Для гистологических исследований фрагменты тканей и органов (легкие, печень, сердце, почки, селезенка, головной мозг) эвтаназированных животных фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин. Микротомные срезы толщиной 5-7 мкм окашивали гематоксилин-эозином, по ван Гизо-ну, азур Н-эозином. В отдельных случаях использовали ШИК- реакцию для выявления углеводов и окраску Суданом IV для выявления липидов в срезах.

Испытание на стерильность опытных образцов крио юн сер ванта проводили согласно Инструкции по контролю стерильности.

Оптическую плотность образцов криопротекгора определяли с помощью рефрактометра ИРФ, о смол яр но сть - миллиосмометра фирмы « Кнауор». Вязкость испытуемого фиопротектора в различных концентрациях изучали при помощи вискозиметра ВК-4. Концентрацию водородных ионов в растворах и испытуемой биосреде измеряли при комнатной температуре на ионо-мере ЭВ-74 и рН -150 стеклянными электродами.

Изучение криопротекторных свойств гексаметиленбистетраоксиэтилмочевины при низкотемпературном замораживании донорских лейкоцитов до -80°С и оцен^ влияния данного вещества на морфофункциональные свойства клеток in vitro в период эквилибрации проводили с растворами, содержащими 5,75,10,125,15,175 и 20%-ые конечные концентрации ГМБТОЭМ. Растворы крио юн сер ванта добавляли к концентрату лейкоцитов в соотношении 1:1, смесь клеток, находящуюся с ограждающим раствором в полимерном мэнтей-

нере "Компопласт 300" или "Гемакон 300", эквилибрировали при комнатной температуре втечение20 мин.

Охлавдение лейкоцитов проводили в электрическом морозильнике "Криостат", разработанном совместно ГУ Кировский НИИ гематологии и переливания фови и Институтом проблем (фиобиологии и криомедициныНАН Украины и предназначенном для реализации процедуры замораживания биообъектов по двухступенчатому режиму.

Подготовленный биообъект погружали в заполненную хладоносителем (4000 мл 96° этиловый спирт) камеру криостата, охлавденную до -28° ± 2°С (температура адаптации). Экспозиция опытных образцов при заданной температуре со станл ял а 25 мин. Замороженный б ио матер и ал переносили в электроморозильник -80°С для дальнейшего замораживания и хранения. Сроки хранения при указанных условиях составили от 1 суток до 12 месяцев (срок наблюдения). Запись термограмм осуществляли с помощью прибора ГСП - 04 по датчик ТСМ - 3-02, установленному в одном из контейнеров (имитатор) с испытуемым биопроду кгом. Скорость движения ленты самописца составляла 240 ммА (рис.1.).

] ♦ раствор гмбтоэм 15%

Рис. 1. Термограмма охлаждения лейкоцитаого концентрата с раство-ромГМБТОЭМ 15% концентрации по экспоненциальному режиму

Размораживание биообъектов производили вручную в 40-литровой водяной ванне при температуре+39°С в течение 45-60 се^нд с частотой покачивания контейнераЗ-4 раза в секунду.

Изучение морфологии и функции лейкоцитов осуществляли на этапах выделения их из крови, и после смешивания с консервантом, а также после размораживали я испытуемых образцов. Концентрат лейкоцитовоценивали по следующим показателям: подсчет количества лейкоцитов до и после криоконсервирования в 1 мкл с использованием камеры Горяева. При изучении морфологического состава определяли процентное соотношение гранулоцитов, лимфоцитов и других клеток.

Ультраструетуру гранулоцитов изучали с помощью электронного микроскопа ЭВМ-100 АК на ультратонких срезах при увеличениях 20000-30000 при ускоряющем напряжении 75 кВ. При этом применяли общепринятые методики проводки.

Из цитохимических реакций были выбраны характеризующие состояние клеток наличием или отсутствием химических веществ и ферментов: липидов (с Суданом черным В), гликогена (ШИК-реакция), неспецифической эстеразы (с альфа-нафтилацетатом в качестве субстрата), пероксидазы (с орто-толуидином в качестве субстрата), кислой фосфатазы (реакция азо сочетай и я), сукцинатдегидрогеназы (с янтарнокислым натрием). Рассчитывали средний цитохимический показатель реакции (СЦПР).

Интегральность клеточной мембраны лейкоцитов определяли в пробах исключения 1% ю дно го раствора эозина по RA. Shreck. Функциональную способность исследуемых клеток оценивали по поглотительной способности нейтрофилов с использованием инертных частиц латекса (методика Потаповой С.Г. и ооавт., 1977.). Метаболическую функцию лейкоцитов (гранулоцитов) регистрировали по реакции восстановления нитро-синего тетразолия (НСТ -тест, методика Park В., 1969). Полученные результаты подвергали статистиче-сюй обработке с помощью программы Biostat. Вычисляли средние арифметические величины(М) и стандартное отклонение, используя метод Стьюдента.

Результаты исследований и их обсуждение. На перюм этапе исследования эмпирически определили лекарственную форму крио юн сер ванта для замораживания лейкоцитов, включающего вещество гексаметиленбистетраокси-

11

этил мочевину (ГМБТОЭМ) в начальных концентрациях от 10 до 40%, лимонную кислоту и воду для инъекций: изучали физико-химические свойства растворов с целью выявления оптимально го (табл.3,4).

Таблица 3

Состав ограждающих растворов на основе ГМБТОЭМ для замораживания концентрата лейкоцитов при-80°С

Компоненты Пор ад ко вые но мер а растворов

растворов 1 2 3 4 5 6 7

ГМБТОЭМ в г сухого вещества 10Й 15Й 20.0 25 А ЗОЙ 350 40.0

Лимонная кислота в г 0250 0375 0.500 0.625 0.750 0575 1.00

Бидисгиллиро-ванная вода, мл до 100 мл

Введение в состав растворалимонной кислоты обеспечивало приведение концентрации водородных ионов к физиологическому уровню (рН 73 - 7,4), необходимому для сохранения морфологических и функциональных свойств клеток. Лимонная кислота выполняла также функцию ан та ко агул ян та. В таб-лице4 представлены физииэ-химические свойства растворов.

Таблица4

Физико-химические свойства растворов, со держащих криопротектор ГМБТОЭМ и лимонную кислоту в различных концентрациях

Показатель Порядковые но мер а растворов

1 2 3 4 5 6 7

Оптическая плотность 1350 1359 1367 1375 1381 1390 1399

Концентрация, % 100 15Й 20 А 25 0 ЗОЙ 35Й 40 й

рн после авто- клавирова- ния 73 72 12 12 72 7.1 12

после хранения (1 год) 73 7.1 12 7.1 72 7.0 12

Цветность, у .е. 7Б 7Б 7Б 7Б 6Б 5Б 5Б

Вязкость, ото.ед. 1.6 1.9 25 33 42 6.0 73

О смол яр но сть, тОзт/кг 270 355 420 525 610 660 700

Полученные данные свидетельствовали о стабильности основных показателей исследуемых растворов, т к. оптическая плотность среды, концентрация водородных ионов, цветность и вязкость ее не изменялись при хранении в течение длительного времени (более 1 года).

Изучение влияния исследуемых криоконсервирующих растворов с ГМБТОЭМ на нативные донорские лейкоциты в динамике (в процессе 20-90-минутной эквилибрации) выявило, что они не оказывали на клетки разрушающего действия. Контролем в экспериментах служили данные оценки морфологических и функциональных свойств лейкоцитов до их мэнтакта с исследуемыми растворами (табл.5).

После ин!убации при 20°С нативных лейкоцитов с криозащитными растворами, содержащими 10%, 15 % и 20% ГМБТОЭМ в процессе 20-ти, 60-ти и 90-минутного контакта не происходило разрушения клеток. Даже после 90 -минутной экспозиции сохранялось более 85% клеток от исходного юличества, в то же время наблюдалось достоверное (р < 0,05) уменьшение показателей ФАН со всеми исследуемыми растворами в сравнении с данными до ингуба-ции. В большинстве случаев незначительно снижалось количество жизнеспособных клеток. С раствором №5 до 93£±1,3%, №3 до 91Р±1£% и №7 до 93,4±2,1%. Крио кон сер вант оказывал слабое ингибирующее действие на функциональную активность лейкоцитов через 60 и 90 минут ин^бации. В течении 20 минут, необходимых для подготовки лейкоцитов к замораживанию не происходило существенных изменений указанных показателей. Наилучшие результаты функции клегокбыли отмеченыпри ин^бации втечение20 минут раствором № 5, в котором конечная концентрация ГМБТОЭМ составляла 15%.

В ходе изучения морфологических и функциональных характеристик лейкоцитов при крио консервировании их под защитой 15% раствора ГМБТОЭМ с использованием аппарата непрограммного замораживания «Криостат» установлено, что более высокую сохранность клеток обеспечивало быстрое двухступенчатое замораживание л ей ю цито в со скоростью 8-10°С/мин до начала кристаллизации (установленного опытным путём), с последующа!

Таблица 5

Влияние криопротектора ГМБТОЭМ на нативиыедонорские лейкоциты в процессе экспозиции с его растворами 10%, 15% и 20% конечной концентрации при 20°С

Содержание Содержание Содержание

ГМБТОЭМ 10% ГМБТОЭМ 15% ГМБТОЭМ 20%

Показатели, п =5 п =7 п =5

время Кол-во Проба Кол-ю Проба Кол-ю Проба

экспозиции клеток с кра- ФАН клеток с кра- ФАН клеток с краси- ФАН

в си- % в си- % в телем %

1 мкл телем 1 мкл телем 1 мкл

% % % % % %

Исходные

показатели 100% 97,6 673 100% 97 £ 66,1 100% 97 Р 592

лейюцитов ±1,7 ±52 ±1,4 ±5,1 ±1,6 ±72

20 минут 95,1 96,8 653 96,2 96,7 62,7 962 95 £ 54£

экспозиции ±3,7* ±13 ±5,9 ±3,5" ±1,6 ±4,6 ±3£ ±1,7 ±4,4

60 минут 88£ 943 61,2 90^ 95 Р 58£ 95,5 95/5 533

экспозиции ±6,2* ±1,7' ±63 ±з,Г ±13' ±3£* ±2£* ±1,1 ±6,4

90 минут 85,4 91/) 553 83,4 93 £ 533 882 93,4 49,4

экспозиции ±7,1* ±1£* ±7,5* ±5£* ±13* ±43' ±52* ±2,1* ±3,9*

* - данные достоверно (р<0,05) отличаются отисходных показателей

экспозицией при температуре холодовой адаптации в течение 25 минут, и начиная с момента кристаллизации до температуры постоянного хранения -80°С по 3-5°С/мин.

В результате опытов оптимальным для кп его к о казап ся раствор № 5, с которым проводили дальнейшие исследования - изучение морфофункцио-нальной сохранности лейкоцитов, находившихся в замороженном состоянии, (табл.6,7).

Таблица6

Функциональная активность лейкоцитов, подвергнутых холодовому (- 80° С) анабиозу (п = 22)

Показатель До замораживания Послераз-моражива-ния Сохранность в % от исходного показателя Р

Количество лейнэцитов в 1 мкл 11630 ± 7122 8314 ±4725 88,7 ± 113» >0,05

Жизнеспособность впробеШрека, % 96,7 ±2,1 70.6 ±14,9 73,1 ± 15,7 <0,05

Фагоцитарная акта вностьней-тро филов, % 59£± 112 31,7 ± 7,8 52,5 ± 10,2 <0,05

Как следует из представленных в таблице данных, несмотря на то, что количество лейкоцитов, подвергнутых холодовому анабиозу, значительно не сокращалось, происходило достоверное снижение их функциональной активности, оценивавшееся в пробе исключения витального фасителя и по уровню ФАН. Полученные результаты свидетельствуют о высокой морфологической (88,7±11£%) и функциональной (52,5 ± 10,2%) сохранности лейкоцитов крови человека при замораживании по предложенному способу с использованием хладоограадающего раствора № 5, признанного оптималь-

ным Данный раствор является нетоксичным и не требует отмывания после размораживания.

При оценке морфологии клеток в окрашенных по стандартной методике мазках отмечена лучшая сохранность лимфоцитов. После размораживания все клетки были уменьшены в размере на 15-20% в сравнении с исходными. Структурные изменения ядер нейтрофилов были незначительными и представлены фрагментоэом и пикнозом. Процесс пикнотизации распространялся на отдельные сегменты ядер, редко на все ядро. Встречались отдельные го-лоядерные элементы, образованные вследствие цитолиза.

Таблица 7

Морфологический состав концентрата лейкоцитов до и после холодового анабиоза (- 80°С)

Клеточный состав До замораживания п = 14 Послеразмора-живания п =14 р

Сегментоядерные % 19,0+8,1 14^6 + 5,9 >0,05

Палочюадерные % 43+2,0 9,1 +3,1 <0,05

Лимфоциты % 53^6+73 62^ + 7,1 <0,05

Моноциты % 22,4 + 8,4 132 + 43 <0,05

Из приведенных в таблице 7 данных видно, что после размораживания лейкэцитной взвеси незначительно (на 4%) снижается количество сегментоя-дерных нейтрофилов и моноцитов с 22,4 + 8,4% до 132- ± 43%, вследствие этого достоверно увеличивается количество палочюядерных нейтрофилов с 43 + 2,0%до 9,1 +3,1 % и лимфоцитов с 53,6+73 %ДО 62,9 +7,1%.

Таким образом, процесс крионэнсервирования с фиопротектором на основе ГМБТОЭМ вызывал морфологические изменения всего пула лейкоцитов, при этом степень их в различных клетках была неоднозначна среди лимфоцитов, нейтрофилов и моноцитов. Дегенеративная перестройка в клетках под воздействием экстремальных факторов при фиоиэнсервировании неизбежна, однако при эффективной криопротекции морфологические нарушения лейюцитов в целом незначительны.

Проведенные цитохимические исследования показали, что до замораживания нейтрофильные клетки (палочкоядерные, сегментоадерные) содержали липиды, пероксидазу, гликоген, а лимфоциты - гликоген, кислую фос-фатазу и сукцинатдегидрогеназу. В таблице 8 представлена сравнительная хфактеристика цитохимических показателей до и после замораживания клеток.

Таблица8

Цитохимические показатели нейтрофильных лейкоцитов до и через 1 год после низкотемпературного консервирования

Группа клеток Липиды Гликоген Пфоксидаза

% СЦПР % СЦПР % СЦПР

до замораживания п = 12 99,1 ±1.4 237±0.07 98Д±2,9 234±0,08 97,7 + 4,1 2,28+0,09

послераз мо-ражи ван и я п = 13 883+1 1,77 ±039 952+4,0 2,13 ±0,19 95,5 ±4,0 2,08+0,28

Р р <0,05 р <0,05 р>0,05 р <0,05 р > 0,05 р <0,05

После длительного (до одного года) хранения лейкоцитов при - 80°Си размораживания процентное содержание цитохимически активных палоч-коядерных и сегментоядерных нейтрофилов незначительно снижалось. Следует отметить, что средние цитохимические показатели реакции (СЦПР) оказались статистически различными. Наибольшим изменениям подверглось со-держаниелипидов, их снижениена 10% явилось статистически достоверным. Показатели гликогена и пероксидазы по сравнению с интактными лейкэци-тами не подверглись значительным изменениям. При этом количество лимфоцитов, содержащих гликоген, су кцинатдегидрогеназу и кислую фосфатазу, как до замораживания, так и после оттаивания клеток осталось практически неизмененным (табл.9). Средний цитохимический показатель реакции по гликогену и кислой фосфатазе не изменился. Существующие различия статистически недостоверны^ >0,05).

Таблица9

Цитохимические показатели лимфоцитов до и после низкотемпературного консервирования

Группа клеток Гликоген Ки ел ая фо сфатаза сдг

% СЦПР % СЦПР % СЦПР

до замораживав ни я п = 12 14,8+6,3 0,15+0.06 40,8 ±8,8 0,48 ±0,11 60,0±15,9 0,71 ±0,24

после размора-жи вания п = 13 15,0 ±7,0 0,15 ±0,07 43,4±11,1 0,49±0,12 65,7±193 0^3 ±0,43

Р р > 0,05 р > 0,05 р > 0,05 р >0,05 р > 0,05 р>0,05

Таким образом, во всех сохранившихся после размораживания клетках показатели цитохимических реакций практически не отличались от таковых в натавных лейкоцитах.

НСГ-тест оценивали по восстановлению фор мазан а у нейтро филов. Установлено, что при смешивании с раствором №5 уровень активности кислород зависимой биоцидной способности клеток относительно исходных показателей не изменялся.

Высокая сохранность размороженных лейюцитов подтверждена данными электронной микросмэпии. Отмечена сохранность архитектоники клеток. Поверхностная цитомембрана гранулоцитов, как правило, не имела повреждений. Ядра оттаянных клеток не отличались от интактных (до замораживания). В ядерной оболочке клеток наблюдали расширение пор. Сохранность архитектоники лимфоцитов после оттаивания была лучше, чем гранулоцитов при исследуемых концентрациях растворов криопротекгора ГМБТОЭМ, что обусловлено более высокой фиоустойчивостью данного вида клеток.

При токсино-фармакологическом исследовании криозащитного раствора, проведенном на4 видах лабораторных животных и на клетках периферической крови человека, было показано отсутствие каких-либо отрицательных реакций.

Острую токсичность изучали при введении лабораторным мышам с массой тела 19 - 20 г в хвостовую вену 0,5 мл растворов ГМБТОЭМ в 5%, 7,5%, 10%, 12,5%, 15%, 17,5 и 20% конечных концентрациях. Эта доза в пересчете на "сухое вещество" составляет от 0,88 до 3$5 г/кг массы тела животных . После внутривенного введения препарата срок наблюдения за животными составил 5 суток. В ходе эксперимента не отмечено гибели мышей и каких-либо отклонений в их поведении и внешнем статусе. ЛД0 ГМБТОЭМ для мышей составляет 15,5 ± 0,6 г/кг массы, что доказывает низкую токсичность ограждающего раствора по сравнению с другими известными крио-протекторами. При сопоставлении данных по ЛДоДля ГМБТОЭМ и других криопротекторов, используемых для замораживания биообъектов, сделан вывод, что токсичность ГМБТОЭМ более, чем в 3 раза ниже, чем у глицерина, диметилацетамида и в4 раза ниже, чему ДМСО.

Определение острой токсичности криофилакгика произведено на кроликах породы "Шиншилла" весом 2100-2700 г. Им внутривенно вводили с целью сокращения объема тест-дозу раствора в 20%-й юнечной концентрации ГМБТОЭМ. Указанная доза вводимого криофилактика составляла 33 г/кг массы тела кролика, что в 4 раза больше, чем получает реципиент при инфузии максимальной дозы размороженных клеток. При пагологоанатоми-чеснэм вскрьпии животных изменений со стороны внутренних органов и систем не обнаружено как на макроскопическом, так и гистологическом уровнях, что дает основания сделать вывод об отсутствии "острой" токсичности исследуемых растворов ГМБТОЭМ.

При изучении мутагенной активности криоюнсерванта по влиянию на частоту хромосомных аберраций в клетках кэстного мозга мышей достоверных отличий в контрольной (частота аберраций 0,012 ± 0,005) и опытной

группах (частота аберраций 0,016 ± 0,005) не бьшо отмечено. Можно утверждать, что криопротектор ГМБТОЭМ не оказывал генотоксичесиэго действия на соматические клетки и не индуцировал кластогенный эффект.

Морфологические изменения органов лабораторных животных, выявляемые обычными гистологическими методиками, однотипны и представлены в основном расстройствами кровообращения по типу полноцэовия, фо-воизлияний, отека стромы.

При исследовании переносимости размороженной взвеси лейкоцитов, криоконсервированных с ограждающим раствором на основе ГМБТОЭМ, при ее внутривенном введении экспериментальным животным (собаки) установили, что масса, температура тела, частота сердечных сокращений животных после трансфузии размороженных аутологичных лейкоцитных концентратов не изменились по сравнению с исходными показателями. Достоверных изменений в показателях гемограмм собак до и после трансфузии небьь ло выявлено, что дает возможность применения указанных лейкоцитных концентратов с целью апробации в клинических условиях.

На основании проведенных комплексных физико-химических и биологических исследований доказано, что разработанный криоюнсервирующий раствор (содержащий 30% ГМБТОЭМ; 0,75 % лимонной кислоты и воду для инъекций) безвреден для организма, стабилен в процессе хранения, не требует отмывания перед введением деюнсервированных клеток реципиенту, обеспечивает высокую морфологичеаую и выраженную функциональную сохранностьлейнэцитовпри низкотемпературном замораживании.

Результаты выполненных исследований свидетельствуют о возможности консервирования леймэцитов при низких темп фату pax в пласта катной таре отечественного производства. Это позволит повысить эффективность низкотемпературного консервирования, значительно упростить его для учреждений слуябы крови, отказавшись от применения жидкого азота, алюминиевых контейнеров и аппаратов программного замораживания

выводы

1. Разработан криоконсервант для низкотемпературного консервирования лейкоцитов, содержащий 30% ГМБТОЭМ; 0,75 %лимонной кислотыи воду для инъекций (остальное).

2. Предложенный раствор обеспечивает высолю морфологически) (873 ± 33 %) и выраженную функциональную (52,5 ± 10,2 %) сохранность лейкоцитов (по данным тестов in vitro) и не требует отмывания от ютеточной суспензии после ее размораживания.

3. Определена оптимальная программа охлаждения лейкоцитов с новым консервантом путем нелинейного быстрого двухступенчато го замораживания при температуре адаптации -28°±2°С в морозильнике «Криостат» в течение 25 минут и последующем хранении в электро морозильнике при -80°Сдо 12 месяцев.

4. Новый криозащитный раствор по физинэ-химическим и биологическим (пирогенность, генотоксичность, острая и хроническая токсичность) свойствам обладает низкой токсичностью и хорошей переносимостью лабораторными животными как в чистом виде, так и в смеси 1:1 с размороженными аутологичными лейноцитными концентратами.

5. Созданный метод консервирования лейиэцитов путем замораживания при -80°С с разработанным огравдающим раствором отличается эффективностью, простотой выполнения и доступностью.

Практические рекомендации

1. Разработанный метод двухступенчатого замораживания лейкоцитов крови человека при -80°С в электрических холодильниках под защитой крио-консерванта на основе ГМБТОЭМ обеспечивает высокую сохранность морфологических и функциональных свойств клеток, рекомендуется как альтернативный замораживанию биообъектов в жидком азоте.

2 В качестве криопротектора при низкотемпературном консервировании лейкоцитов возможно использовать криофилактический раствор на основе ГМБТОЭМ, который по своим криозащитным свойствам не уступает другим криопротекторам, но, при этом, гораздо менее токсичен и не требует отмывания от кгтеток перед трансфузией реципиенту.

3. Предложенный метод криоиэнсервирования лейкоцитов пригоден

для внедрения в работу научных лабораторий и криобиологическою практик-

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Svedentsov Е.Р. Low temperature leuoocyte concentrate conserving / E.P. Svedentsov, V.P. Ardiireyev, S.V. Utyomov, AA. Kostyaev, O.M. Se-lesneva. ^S41 Congress JSBT. Osb, Norvey) // Vox Sanguin is .-1998.- Abstr., 1254.

2. Овсепян BA. Изучение генотоксической активности фиопротекго-ра А-378/ ВА. Овсепян, C.B. Утёмов, О.М. Селезнёва // Пробл. гематологии и переливания 1фови.-2000.-№2.- С. 34.

3. Утёмов C.B. Использование отечественных полимерных контейнеров для криоюнсервирования клеток 1фови/ C.B. Утёмов, К.В. Кузнецов //Физиология человека и животных: от эксперимента к клинической практике: Тез. тр. конф. молодых ученых ин-та физиологии Коми НЦ УрО РАН,-Сыктывкар, 2000.- С. 77

4. Сведенцов ЕЛ. Консервирование лейкоцитов замораживанием при низких температурах (-60°+-80°Q/ ЕЛ. Сведенцов, C.B. Утёмов, А А. Костя-ев, В.М. Новосадов// Актуальные вопросы гематологии, и трансфузиологии: Мат-лы науч.-практ. конф. (Санкт -Петербург, 6-8 июня 2000 г.).- С.Петербург, 2000 .-С.261-262.

5. Сведенцов Е.П.Функциональная активность лейкоцитов, консервированных замораживанием при -80°С/ Е.П. Сведенцов, C.B. Утёмов, А А. Костяев, В.М. Новосадов, О.М. Селезнева //Актуальные проблемы трансфу-

зионной медицины: Мат-лынауч.-практ. юнф.4-5 окг.2000 г -Киров,2000.-С.ЗЗ

6. Костяев A.A. Влияние озонированных криоконсервантов и умеренно-низких температур на качественные характеристики контейнеров «Гема-кон» и «Компопласт»/ А А.Костяев, C.B. Утёмов, Ал. А. Костяев, О.М. Селезнёва // Реаниматология и интенсивная терапия. Анестезиология: Инфор-мац. сб. -2000 .-№4.- С32.

7. Сведенцов Е.П. Функциональная активность лейкоцитов, подвергнутых холодовому (-80°Q анабиозу/Е.П .Сведенцов, C.B. Утёмов, А А. Костяев, Т.В. Туманова //Восемнадцатый съезд физиологического общества им. ИЛ.Памова(Казань, сент. 2001г.).- Казань,2001.- С. 421-422.

8. Костяев АА. Оценка опыта применения злеюроморозильника «Криостат» для быстрого д^х ступенчато го замораживания клеточных суспензий / A.A. Костяев, Е.П. Сведенцов, C.B. Утёмов, К.В. Кузнецов, ЕА. Гордиенко, Н.С. Пушкарь// Материалы ночной сессии Пермской гос. мед. академии.- Пермь-2001. С-154.

9. Сведенцов Е.П. Консервирование лейнэцито в человека при умерен-но-низюй температуре / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, C.B. Утёмов, АА.Костяев, С.А. Якшина, АН. Семёнов // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии: Мат-лы Рос. науч.- практ. конф. (С.-Петербург, 18-20 июня2002 г.).- С.-Петербург,2002.- С.267-268.

10. Патент РФ №2195111 Споооб криоконсервирования клеточных суспензий/ Костяев А А., Утёмов C.B.- Заявлено 16j052001; Опубл. 27.122002,Бюл.36.

Л-7220

РНБ Русский фонд

2006-4 3795

Отпечатано РИО КГМА Подписано в печать 4 04 2005 Тираж 100 экз