Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Комбинированные криоконсерванты в сохранении функций лейкоцитов

На правах рукописи

ПОЛЕЖАЕВА Татьяна Витальевна

КОМБИНИРОВАННЫЕ КРИОКОНСЕРВАНТЫ В СОХРАНЕНИИ ФУНКЦИЙ ЛЕЙКОЦИТОВ

14.01.21 - гематология и переливание крови

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

2 6 СЕН 2013

Санкт-Петербург 2013

005533309

005533309

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор главный научный сотрудник ФГБУН Кировского НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России | Сведенцов Евгений Павлович|

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, начальник НИЛ заготовки и консервирования компонентов и препаратов крови ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им С.М.Кирова» Министерства обороны Российской Федерации Багаутдинов Шамиль Муталабович

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им Н.И.Пирогова» Минздрава России Голубева Вера Леонидовна

доктор медицинских наук, профессор кафедры трансфузиологии ГБОУ ВПО «СевероЗападный государственный медицинский университет им И.И.Мечникова» Минздрава России Дуткевич Игорь Георгиевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный

медицинский университет» Минздрава РФ

Защита состоится «Р^ГаД^Эг 2013 г. в часов на заседании

диссертационного совета Д 208.074.01 при ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА России» по адресу: 191024, г.Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБУ «Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии ФМБА» России.

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Т.В.Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Для создания общей теории криоповреждения и криозащиты клеток, а также эффективных научно обоснованных методов их криоконсервирования важным является всестороннее изучение структурно-функциональных изменений биологических мембран (плазматических, ядерных, лизосомальных и др.) и метаболических процессов, протекающих с их участием. Изменения окружающей среды (понижение температуры, вымерзание воды, рН, электролитный баланс, вязкость, появление чужеродных молекул и др.) первыми воспринимают плазматические мембраны. Основной причиной их первичных повреждений являются нарушения распределения липидсв, обеспечивающих высокую пластичность и растяжение мембраны. С трансформацией липидных компонентов взаимосвязаны фазово-структурные переходы фракций клеточной воды (свободной, связанной, фиксированной), каждая из которых имеет свою зону кристаллизации с определенной степенью замедления метаболизма (Сведенцов, 2004). С учетом того, что существенное снижение метаболических процессов в клетке наступает при низкой температуре (-70° н- -98°С) общепринятым является консервирование клеток при температурах ниже указанных с применением жидкого азота.

Для повышения криоустойчивости биообъекта используют криопротекторы и стабилизирующие добавки. Действие первых основано на способности создавать прочные связи с молекулами воды (вне и внутри клетки, более прочные, чем связи воды между собой) и на способности снижать концентрацию солей, что делает минимальным риск повреждения белковых структур клеток, а также образовывать связи со структурными компонентами мембраны, предохраняя их от разрушения кристаллами льда. Всего в мире обнаружено и создано более 120 криофилактических средств с экзоцеллюлярным, эндоцеллюлярным и смешанным криозащитным действием. Однако выраженными криопротекторными свойствами обладают: глицерин, ДМСО (диметилсульфоксид), ДМАЦ (диметилацетамид), 1,2-ПД (пропандиол), ПЭО-400 (полиэтиленоксид), которые имеют определенную токсичность и требуют отмывания после размораживания биообъекта, что дополнительно травмирует клетки. С 2003 г Минздравом РФ разрешено использование высокоочищенного ДМСО для криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток периферической крови и костного мозга. Производство криоконсервантов в России осуществляется главным образом в лабораторных условиях с использованием зарубежных протекторов.

В последние годы положительно зарекомендовало себя применение комбинированных криозащитных растворов, состав которых по причине видоспецифичности биологического объекта весьма вариабелен:

классические экзо- и эндоцеллюлярные протекторы (Корниенко, Бондаренко, 2008; Сведенцов, 2010); обладающие протекторным действием антифризные протеины, гликопротеины (Андреев и.др., 2008) и клатратные соединения инертных газов (Тельпухов, Щербаков, 2006; Sheleg et al., 2008); антиоксиданты и стабилизаторы биологических мембран, усиливающие устойчивость клеток к эндо- и экзогенным факторам физико-химического воздействия (Dalvit et al., 1988; Carrol J. et al., 1993), активаторы энергетического метаболизма клеток - гетерозиды (Кабачный, Горбунова, 2004); стабилизаторы температур замораживания и отогрева - наночастицы ферромагнетика (Сукач и др., 2008). Однако, несмотря на достигнутые успехи, продолжается поиск универсального для различных клеток и тканей криопротектора. Актуальным остается разработка эффективных технологий длительного хранения биообъектов в нетоксичных криоконсервантах при широком диапазоне отрицательных температур.

Степень разработанности темы исследования. Для эритроцитов и тромбоцитов крови человека используют способы консервирования (Чечеткин и др., 2005) при температурах от -20°С до -80°С в электрорефрижераторах под защитой моно- и бикриоконсервантов. В зависимости от используемой температуры срок хранения клеток составляет от 1 года до 5 лет. Применение электрических холодильников позволяет отказаться от громоздкого, дорогостоящего оборудования и не зависит от периодического восполнения запасов азота, кратковременные колебания в них температур не являются фатально губительными для клеточного материала. Все это имеет важное значение в практической деятельности криобанков. Возможность сохранности ядросодержащих клеток при температурах выше -196°С остается малоизученной, что связано с быстрым истощением энергетических запасов и накоплением продуктов метаболизма. На основании выше сказанного обозначены цель и задачи настоящего исследования.

Цель исследования - определить сохранность функций лейкоцитов при температурах от -10°С до -80°С с применением комбинированных криоконсервантов.

Задачи исследования:

1. Разработать комбинации криозащитных растворов, содержащие криопротекторы с различной проникающей способностью и реставрирующие компоненты, не требующие отмывания после отогрева биообъекта.

2. Сравнить влияние комбинированных криозащитных растворов на степень устойчивости лейкоцитов к воздействию отрицательных температур: переохлаждения (-10°С), субумеренно-низкой (-20°С), умеренно-низкой (-40°С), низкой (-80°С).

3. Установить возможные сроки структурно-функциональной сохранности лейкоцитов в условиях указанных отрицательных температур под защитой разработанных криозащитных растворов.

4. Определить влияние эффективных криозащитных растворов на характер перекисных процессов в мембранах лейкоцитов на разных этапах криоконсервирования и при варьировании сроков хранения.

5. Изучить физико-химические и биологические особенности (токсичность, пирогенность) эффективных криозащитных растворов и определить переносимость лабораторными животными внутривенных аутогемотрансфузий криоконсервированных с данными растворами лейкоцитов.

6. Разработать способы электрорефрижераторного криоконсервирования лейкоцитов крови в нетоксичных ограждающих растворах при температурах от -10°С до -80°С.

Научная новизна. В лабораторно-экспериментальном исследовании на примере лейкоцитов крови человека показана эффективность комбинирования в замораживаемой клеточной среде непроникающих и проникающих криопротекторов, реставрирующих компонентов, что обеспечивает сохранность биологического объекта при температурах от -10°С до -80°С и позволяет снизить токсичность ограждающего раствора, что доказано в опытах на экспериментальных животных.

Предложено охлаждение лейкоцитов до -10°С по нелинейной программе в незамерзающем криоконсерванте, содержащем проникающий протектор глицерин (в исходной концентрации 7%), непроникающий протектор желатин со средним молекулярным весом 16 кДа (7,5%) и антигипоксант-антиоксидант ОМЭПС (сукцинат гидроксиметилэтил-пиридина; 0,3%), что обеспечивает криоустойчивость более 75% лейкоцитов по разным тестам в течение 9 суток хранения.

Криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ (гексаметилен-бистетрагидроксиэтилмочевина) обеспечивает указанную сохранность лейкоцитов в широком диапазоне температур: при -20°С в исходной концентрации 28% совместно с ОМЭПС (0,2%) в течение 21 суток; при -40°С в концентрации 30% совместно с антигипоксантом фумаратом натрия (2,8%) и лимонной кислотой (0,06%) в течение 30 суток; при -80°С в концентрации 22% совместно с проникающим протектором ДМСО (8%) и ОМЭПС (0,4 %) в течение 180 суток (срок наблюдения). На основании полученных данных, а также имеющихся сведений об эффективности применения указанного криопротектора при ультранизком замораживании тромбоцитов и клеток костного мозга сформулирована концепция об универсальном криозащитном действии данного вещества.

Найден новый вид непроникающих криопротекторов -растительные полисахариды, которые наряду с иммуномодулирующими

свойствами способны оказывать криозащитный эффект за счет своих функциональных групп и не обладают токсичностью. Впервые показана перспективность использования лемнана пектинового полисахарида ряски малой в составе комбинированной криозащитной среды для — 10°С. Установлено, что криоконсервант, содержащий глицерин (в исходной концентрации 7%), лемнан со средним молекулярным весом 400 кДа (0,3%) и ОМЭПС (0,3%) обеспечивает сохранность исходных морфофункциональных параметров у лейкоцитов в течение 1 суток.

Теоретическая и практическая значимость. Получены новые сведения о возможности хранения ядросодержащих клеток не только в условиях ультранизкой (-196°С) температуры, но и при температурах от —10°С до —80°С, что является ценным для трансфузиологии, ветеринарной медицины, микробиологии, ихтиологии.

Результаты проведенных исследований вносят вклад в создание общей теории криоповреждения и криозащиты клеток, т.к. указывают на то, что в используемых нетоксичных комбинациях консервантов каждый протектор проявляет защитное свойство при определенных температурных условиях, что в итоге позволяет устранить несколько причин криоповреждения клеток с сохранением аддитивной криопротекторной эффективности выбранной комбинации ингредиентов.

Показана эффективность применения электрорефрижераторной технологии консервирования биообъектов при температурах от -10°С до —80°С в нетоксичных комбинированных консервантах, которая отличается от традиционной с использованием жидкого азота простотой выполнения и не требует дорогостоящего оборудования. С практической точки зрения важным является использование электрических морозильников и щадящих нелинейных программ замораживания, предупреждающих выброс кристаллизационного тепла и последующую рекристаллизацию, вызывающую гибель клеток. Особую значимость представляют предложенные криозащитные растворы (патенты РФ: № 2184449, 2002; № 2240000, 2004; № 2261595, 2005; № 2290808, № 2301524, 2007; № 2439877, 2012), которые не уступают по своей эффективности существующим консервантам, но при этом являются нетоксичными и не требуют отмывания клеток перед применением, что увеличивает число жизнеспособных лейкоцитов и снижает экономические затраты. Предложенные технологии криоконсервирования ядросодержащих клеток периферической крови являются доступными широкому кругу учреждений и могут быть использованы при создании запаса клеток для его одномоментного использования при ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций вследствие техногенных причин, природных явлений, террористических актов и вооруженных конфликтов, частота появления которых увеличивается в последние годы, а также для

сохранения биоматериала во время космических перелетов, в длительных научных экспедициях.

Методология и методы исследования. В работе использованы общенаучные методы: анализ (проспективный и ретроспективный), синтез (сравнительно-сопоставительный), частно-научные методы (лабораторный, инструментальный), методы математической статистики.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Комбинирование в замораживаемой биосреде непроникающих и проникающих криопротекторов, антиоксидантных и противогипоксантных компонентов обеспечивает высокую криоустойчивость лейкоцитов периферической крови при замораживании - отогреве и позволяет снизить токсичность ограждающего раствора.

2. Предложенные комбинированные криоконсерванты не вызывают активацию перекисного окисления лип идо в в мембранах лейкоцитов и обеспечивают сохранность морфофункциональных параметров у более 75% клеток по разным тестам при -10°С в течение 9 суток (патент РФ № 2261595, 2005), при -20°С - 21 суток (патент РФ № 2240000, 2004), при -30°С - 30 суток (патент РФ №2184449, 2002) и при -80°С в течение 180 суток (срок наблюдения; патент РФ № 2290808, 2007).

3. Комбинированные криозащитные растворы нетоксичны, апирогенны и хорошо переносятся лабораторными животными в смеси с размороженными аутологичными лейкоцитными концентратами.

4. Способы электрорефрижераторного криоконсервирсвания лейкоцитов крови при температурах от -10°С до -80°С являются эффективными, доступными для широкого использования и рекомендуются в качестве альтернативы замораживанию биообъектов в жидком азоте.

Внедрение. Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе в ФГБОУ ВПО «Вятский государственный гуманитарный университет» и в ГБОУ ВПО «Кировская государственная медицинская академия» Минздрава РФ.

Степень достоверности и апробация работы. Достоверность результатов исследования подтверждается объемом фактического материала и использованием современных методик статистической обработки. Результаты работы доложены и обсуждены на Международных конференциях: «Сохранение генетических ресурсов» (С.-Петербург, 2004), «Криоконсервация как способ сохранения биологического разнообразия» (Пущино, 2008), «Фундаментальные и прикладные аспекты физиологии» (Гродно, 2009); на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины» (Киров, 2010); на XVIII и XIX Съездах Всероссийского физиологического общества им И.П.Павлова (Казань, 2001; Екатеринбург, 2004); на Всероссийских научно-практических

конференциях «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (С.Петербург, 2002, 2007); на Всероссийских совещаниях «Актуальные вопросы трансфузиологии и клинической медицины (Киров, 2008, 2012); на научной сессии Кировского филиала РАЕ и Кировского областного отделения РАЕН (Киров, 2004).

Апробация диссертации состоялась 27.02.2013 г. на заседании Ученого совета Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 200 машинописных страницах, содержит 34 таблицы и 31 рисунок. Список литературы включает 342 источник, в том числе 124 статьи зарубежных авторов.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 59 научных работ, в том числе одна монография, шесть патентов Российской Федерации, четыре статьи в зарубежных, 10 статей в Российских рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Работа выполнена в лаборатории криофизиологии крови Институт физиологии Коми НЦ УрО РАН в рамках плановых тем НИР «Функциональная активность ядросодержащих клеток крови, перенесших холодовой анабиоз разной глубины» (ГР № 01.200 107400) и «Закономерности восстановления функциональной активности ядросодержащих клеток крови, подвергнутых воздействию отрицательных температур» (ГР № 01.200 602860). Частично работа получила финансовую поддержку Российского фонда фундаментальных исследований (№08-0401423).

Личное участие автора в получении результатов. Автором принято непосредственное участие в разработке новых комбинированных криоконсервантов и в определении морфологической и функциональной сохранности лейкоцитов до замораживания и после отогрева. Проведен анализ и статистическая обработка полученных результатов, принято участие в определении физико-химических, биологических особенностей криозащитных растворов и в разработке новых технологий консервирования клеток.

Сокращения и условные обозначения. 1,2-ПД - пропандиол или а-пропиленгликоль, АОА - антиоксидантная активность, ГМБТОЭМ -гексаметиленбистетрагидроксиэтилмочевина, ГФ - государственная фармакопея, ГЭК - гидроксиэтилкрахмал, ДМАЦ - диметилацетамид, ДМСО - диметилсульфоксид, ОМЭПС - сукцинат

гидроксиметилэтилпиридина, ПОЛ - перекисное окисление липидов, ПЭО-400 - полиэтиленоксид с молекулярной массой 400.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы лейкоциты крови человека, полученные из цельной донорской крови (доноры-добровольцы 35,6 ± 5,2 лет) методом цитафереза (центрифуга «Sorvell» (США), 5 мин, 2500 об/мин, консервант цитратфосфатдекстроза) в отделении гравитационной хирургии ФГБУН Кировского НИИ гематологии и переливания крови ФМБА России. Количество лейкоцитного концентрата (Ж) в среднем составляло 22,7 ± 6,1 мл. Указанная трансфузионная среда с высоким содержанием лейкоцитов (20 000 - 32 000 в 1 мкл) имела незначительную примесь эритроцитов, тромбоцитов, стволовых клеток и плазмы.

Проведено более 6000 исследований по изучению структурно-функциональных особенностей лейкоцитов крови до и после воздействия отрицательных температур под защитой комбинированных криозащитных растворов (табл. 1). Необходимо отметить, что используемые дополнительные ингредиенты находятся в свободной продаже в аптечной сети на территории РФ.

В пластикатном контейнере "Компопласт 300" в соотношении 1:1 смешивали ЛК с раствором, выдерживали при комнатной температуре в течение 20 минут и погружали в заполненную хладоносителем (96%-ный этиловый спирт) и охлажденную (с растворами №1-7 до -10°С; с растворами №8-11 до -20°С; с растворами №12-24 до -28°С) 4-х-литровую ванну камеры электрического морозильника «Криостат». После достижения указанных температур биообъект с растворами №1-7 переносили для хранения в герметично закрытую емкость с охлажденным (-10°С) 45%-ым этиловым спиртом в морозильную камеру электрического холодильника на -10°С «ЗИЛ» (Россия); в опытах с растворами №8-11 - в воздушную камеру электрического морозильника «Derby» (Дания) на -20°С; в опытах с растворами №12-18 - для дальнейшего замораживания и хранения в воздушную камеру электрического морозильника «Derby» (Дания) на -40°С; в опытах с растворами №19-24 - в воздушную камеру электрического морозильника MDF-3086S «Sanyo» (Япония) на -80°С.

Температуру в каждой экспериментальной серии регистрировали с помощью прибора ГСП-04, датчик ТСМ-3-02 которого был установлен в одном из контейнеров с имитатором - криозащитным раствором с конечной концентрацией его ингредиентов (рис. 1). Скорость движения ленты самописца составляла 240 мм/ч. Регистрация термограмм проводилась с целью контроля выброса кристаллизационного тепла, способствующего росту кристаллов льда и гибели клеток.

Таблица 1. Комбинирование веществ исходной концентрации (в %) в составе криозащитных растворов.__

№ раствора Протектор эндоцеллюлярного действия Протектор смешанного действия Протектор экзоцеллюлярного действия Дополнительные ингредиенты

глицерин 92* диметилсульфоксид 78* пропандиол 76* гексаметиленбис-тетрагидроксиэтил-мочевина 378* желатин 16 000* желатин 20000* гидроксиэтил-крахмал 200 ООО* лемнан 400 000* сукцинат гидроксиметилэтил- АГ АО пипилина ■ 1 я 13 & •е- м хлорид холина сукцинат М-метил аммония натоия А0,АГ,АТ глюкоза' "V. Н О С! О § § о з я я •< ю я о & < § & 03 й е-

Для температуры переохлаждения (-10°С)

1 5,0 - - - 7,5 - - - 0,075 - - - - - - 0,14

2 7,0 - - - 7,5 - - - 0,3 - - - - - - 0,14

3 9,0 - - - 7,5 - - - 0,3 - - - - - - 0,14

4 7,0 - - - - 7,5 - - 0,3 - - - - 1,0 0,1 -

5 7,0 - - - - - - 0,2 0,3

6 7,0 - - - - - - 0,3 0,3

7 7,0 - - - - - - 0,4 0,4

Для субумеренно-низкой температу| эы (-20°С)

8 - - - 26,0 - - - - 0,1

9 - - - 28,0 - - - - 0,15

10 - - - 30,0 - - - - 0,2

11 7,0 - - - - - - 0,2 - - - - - - 0,1 -

Для умеренно-низкой температуры (-40°С)

12 - - - 36,0 - - - - - 3,2 - - - ),09 - -

13 - - - 30,0 - - - - - 2,8 - - - 3,06 - -

14 - - - 24,0 - - - - - 2,4 - - - 3,03 - -

15 6,0 - - - - - 5,6 - 0,2

16 4,8 - - - - - 5,7 - 0,1

17 3,6 - - - - - 5,8 - 0,01

18 - - 21,0 - - - 4,7 - 0,2 - 1,0 - 3,0 - - -

Для низкой температу ры (-80°С)

19 - 6,0 - 24,0 - - - - 0,3

20 - 8,0 - 22,0 - - - - 0,2

21 - 10,0 - 20,0 - - - - 0,1

22 - - 6,0 - - - 3,2 - - - - 0,6 - - - -

23 - - 3,0 - - - 3,4 - - - - 0,6 - - - -

24 - - 1,5 - - - 3,5 - - - - 0,6 - - - -

Примечания: * - молекулярный вес криопротектора; вещество обладает действием: АГ - антигипоксическим, АО - ангиоксидантным, АТ - антитоксическим, М -мембранопротекторным; Р - регулятор энергетического метаболизма, А - антикоагулянт.

Рисунок 1. Термограммы замораживания лейкоцитов в криозащитных растворах (КР) №9,18 и 20 и охлаждения в незамерзающем КР №2.

Деконсервирование биообъекта производили в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 35-50 сек (в зависимости от объема биообъекта) при интенсивном покачивании контейнера (3-4 раза в секунду) до температуры клеточной взвеси +2 Н- +4°С. В опытах с температурой переохлаждения (-10°С) объект отогревали в течение 2-3 сек.

Степень криоустойчивости различных популяций лейкоцитов определяли с помощью метода световой микроскопии (окраска мазков по Май-Грюнвальду и Романовскому), а субпопуляции лимфоцитов (Т, В) - с помощью моноклональных антител (LT3, LT22) в непрямом иммунофлуоресцентном тесте. С помощью световой микроскопии (Nikon H550S) оценивали общее количество лейкоцитов в камере Горяева.

Целостность клеточной мембраны лейкоцитов оценивали с помощью 1%-ного раствора суправитального красителя эозина (молекулярный вес 692) методом световой микроскопии. Признаком повреждения клеточной мембраны считали диффузное окрашивание цитоплазмы в розовый цвет, жизнеспособные клетки с неповрежденней мембраной имеют светло-зеленый цвет.

Степень активации мембраносвязанной NADPH-оксидазы нейтрофилов определяли с помощью регистрации супероксидного анион-радикала в НСТ-тесте (Гольдберг и др., 1992). Тест основан на реакции спонтанного восстановления нитросинего тетразолия (НСТ), который в окисленном состоянии бесцветен, а при восстановлении до диформазана (с образованием стабильного промежуточного продукта - частично восстановленного моноформазана) в клетках преципитирует в виде грубодисперсных гранул темно-синего цвета.

Активность ферментов и белков гранул (первичных и вторичных) нейтрофилов, обеспечивающих киллерный эффект определяли в лизосомально-катионном тесте (Славинский, Никитина, 1999). Данный

метод исследования также свидетельствует о глубине низкотемпературных повреждений нейтрофилов, т.к. мембраны лизосом весьма чувствительны к замораживанию и, теряя свои барьерные свойства, обеспечивают выход гидролаз в цитоплазму и развитие вторичных «латентных» повреждений клетки.

Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали по модифицированному методу (Потапова и др., 1977) с использованием инертных частиц латекса («81§та-АМпсЬ» Германия) диаметром 0,08 мкм. Определяли только процент фагоцитирующих клеток. Количество захваченных частиц (фагоцитарный индекс) во всех случаях до замораживания соответствовал П степени (11-30 частиц), а после отогрева -1 степени (до 10 частиц).

Потребление кислорода оценивали по его содержанию в среде амперометрическим методом на анализаторе Эксперт-001-4 (ООО «Эконикс-эксперт» г. Москва) в режиме работы «термооксиметр».

Интенсивность ПОЛ и АОА клеток определяли методом индуцированной (перекисью водорода с сульфатом железа) хемилюминесценции на биохемилюминометре БХЛ-07 (ЦНИЛ НГМА; «ИМБИО» Н.Новгород, Россия). По показателям хемилюминограммы: 1тах (мВ) и Б (мВхсек), — судили о степени активности ПОЛ, антиоксидантный потенциал (активность ферментативных систем клеток, регулирующих содержание гидроперекисей) оценивали по показателю tg(-2а) и коэффициентам а (БЯтах х г) и Z (БЛтах).

Изучение стабильности криозащитных свойств хладоограждающих растворов проводили в соответствии с «Временной инструкцией по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре (1983)». Образцы выдерживали в течение 45 суток при +60°С в стеклянных флаконах по 50 мл, что соответствует двум годам хранения при 44°С, проверяли прозрачность, рН и оценивали криозащитные свойства раствора при замораживании клеток.

Биологические свойства (токсичность, пирогенность, переносимость) криоконсервантов оценивали по указанным методикам на 194 животных (табл. 2).

При статистической обработке данных вычисляли среднее арифметическое значение ± среднее квадратичное отклонение (М±5). Для выявления статистической значимости различий между группами применяли непараметрический критерий Уилкоксона (Гланц, 1998) с использованием компьютерной программы для медико-биологической статистики «ВЮБТАТ».

Таблица 2. Биологические методы исследования криозащитных растворов_

Показатель Методика Вид животного Число животных

Острая токсичность ГФ XII (2007) Мыши белые лабораторные 20

Хроническая токсичность ГФ ХП (2007) Мыши белые лабораторные, кролики неальбиносы 100 50

Пирогенность ГФ ХП (2007) Кролики неальбиносы 12

Биологическая переносимость Сведенцов Е.П.(1999) Беспородные собаки 12

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние компонентов криозащитной среды на ПОЛ и ОАО лейкоцитов

Для включения в состав криозащитного раствора необходимо учитывать основные требования к его компонентам. Вещество должно быть нетоксичным (не требующим отмывания от биообъекта), хорошо растворяться в воде и стабилизировать ее молекулы, способствовать образованию мелких кристаллов льда и стеклованию воды, не откладываться в клетках и тканях организма и быстро выводиться из него, не должно иметь неприятного запаха (Сведенцов, 2010). Необходимо учитывать также и степень влияния веществ на уровень ПОЛ и АОА клеток, т.е. компонент криозащитной среды не должен вызывать разрушения биологических мембран. Показано (Гордиенко, Кудокоцева, 1980; Онищенко, Зинченко, 2005), что криопротекторы в зависимости от используемой концентрации могут снижать устойчивость мембран к перекисному окислению. В связи с этим у предполагаемых ингредиентов криозащитных растворов изучено влияние на интенсивность ПОЛ и антиоксидантную систему клетки.

Установлено, что при смешивании лейкоцитов с любым криопротектором (исключение лемнан) в указанных концентрациях отмечается совместное изменение показателей ПОЛ и АОА, причем АОА (активность ферментативных систем, регулирующих уровень перекисей), как правило, в большей степени (табл. 3). Выявлено также, что с увеличением молекулярного веса криопротектора до определенного значения отмечается повышение активности процессов ПОЛ-АОА, а затем их совместное снижение (рис. 2).

Таблица 3. Влияние веществ, входящих в состав хладоограждающих растворов, на интенсивность ПОЛ (по показателю хемилюминограммы Б) и АОА (по tg(-2a)) у лейкоцитов_

Вещество Молекулярная масса Концепт рация, % № раствора п S tg(-2a)

в % к исходному уровню, принятому за 100

пд 76 21 6 18 22 6 6 78,3*8,96* 78,3±8,96* 72,3±4,03* 72,3±1,4*

ДМСО 78 8 20 10 83,2±12,7* 83,2±22,4*

Глицерин 92 7 2 и 4 10 117,6±27,4 156,5 ±40,6*

Фумарат натрия 160 2,8 13 8 112,2±18,6 86,0+18,8

ОМЭПС 255 0,15 9 8 83,5+10,7* 83,5±11,2*

0,2 20 13 123,7±28,6* 79,8±24,05*

0,3 2и4 6 117,5±11,1* 77,2+29,7*

ГМБТОЭМ 378 22 20 12 139,3±25,9* 151,4±26,2*

28 9 6 138,4±26,9* 150,9±27,1*

30 13 8 142,1 ±24,9* 150,5±26,7*

Желатин 16000 7,5 2 6 402,0±60,8* 505,2±66,8*

20000 7,5 4 8 181,5±18,7* 147,2±18,3*

ГЭК 200 000 5,7 16 8 160,2±8,8* 131,0±15,8*

Лемнан 400 000 0,3 6 11 10 94,0±16,3 99,8±13,6

Примечания: М±а ; * - р<0,05.

На основании полученных данных обозначена группа протекторов, не только ускоряющих процессы ПОЛ, но и оказывающих стимулирующее действие на антиоксидантные системы клетки. Это глицерин, ГМБТОЭМ и желатин-16000, в меньшей степени - ГЭК и желатин-20000.

Рисунок 2. Динамика уровня ПОЛ (по показателю в) и АОА (по tg(-2a)) у лейкоцитов в зависимости от молекулярного веса криопротектора. о - р>0,05.

Протекторы ПД, ДМСО замедляют процессы ПОЛ и снижают АОА у лейкоцитов. Данное подавление метаболической активности клеток криопротекторами известно, как проявление их псевдотоксического эффекта, который устраняется при удалении протектора из клетки (Белоус, Грищенко, 1994).

Установлено, что дополнительный компонент криозащитной среды фумарат натрия не изменяет уровень ПОЛ и АОА у лейкоцитов, тогда как ОМЭПС в зависимости от используемой концентрации ведет себя неравнозначно: в концентрации 0,15% - снижает интенсивность ПОЛ и АОА, в концентрациях 0,2% и 0,3% - повышает ПОЛ на фоне сниженной АОА, т.е. во всех случаях ОМЭПС ингибирует собственные антиоксидантные системы клеток.

Показано, что в условиях целого организма, ОМЭПС, как и фумарат натрия (Филиппович, 1993), обладает выраженным антигипоксическим действием (Лукьянова, 1990), но способен также ингибировать стадию инициации ПОЛ (Барабой, 1991; Клебанов и др., 2001), путем взаимодействия с водорастворимыми радикалами и с ионами двухвалентного железа, хелатируя или окисляя последние в катион железа (Ш). Описанное выше действие выявлено только для 0,15%концентрации ОМЭПС.

Таким образом, для получения эффективной криозащитной среды целесообразным, по-видимому, является использование протекторов, обладающих выраженным стимулирующим действием антиоксидантных систем клеток: глицерин, ГМБТОЭМ, желатин-16000, - а также веществ, повышающих устойчивость клеток к гипоксии: фумарат натрия и ОМЭПС. Последний в концентрации 0,15% способен также ингибировать ПОЛ.

В последующих исследованиях установлено, что при воздействии на мембраны лейкоцитов комбинированных криозащитных растворов характер ответной реакции отличается от воздействия одного компонента, что, возможно, связано с образованием особых комплексов из ингредиентов консервантов, воды и биополимеров мембран. Во всех случаях, когда сохранность клеток после отогрева была выше 75%, использованы комбинированные консерванты, не вызывающие у лейкоцитов активацию процессов ПОЛ.

Очевидно, что оценка степени влияния криоконсервантов на Г10Л и АОА у клеток при разработке методов криоконсервирования позволит сделать прогноз об эффективности их применения для замораживания биообъектов.

Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие температуры переохлаждения (-10°С)

При разработке составов новых криоконсервантов необходимо

учитывать как основные требования (указаны выше) к его компонентам, так и состояние фракций клеточной воды и степень замедления метаболизма при замораживании. При температуре -10°С в присутствии широко используемых криопротекторов проникающего и непроникающего действия (в пределах 5-20% конечной концентрации) внеклеточная и все виды внутриклеточной (свободная, связанная, фиксированная) воды не замерзают, метаболизм в клетках имеет незначительное замедление (Сведенцов, 2004).

С учетом сказанного в состав криозащитных растворов включены протекторы: глицерин, гидролизат пищевого желатина (со средним молекулярным весом 16000 и 20000) и нетоксичный пектиновый полисахарид лемнан, который характеризуется высокой способностью к образовании вязких водных растворов и к гелеобразованию (Оводова и др., 2000).

Для повышения устойчивости клеток к гипоксии и реализации механизмов антиокислительной защиты липидов использован ОМЭПС.

На начальном этапе исследования опытным путем проведен подбор оптимальных концентраций указанных компонентов. Положительно зарекомендовали себя 7 вариантов хладоограждающих растворов (табл. 1).

Растворы №1-4 при охлаждении не замерзают, а образуют гель, что способствует стабилизации кристаллизации воды и предотвращает ее спонтанность. Указанная особенность обусловлена присутствием в среде желатина - линейного высокоасимметричного полипептидного полимера белковой природы (Малов, Неупокоева, 2006).

Остальные 3 раствора (№5-7) при охлаждении образуют лед, однако в их составе содержится лемнан, который может быть матрицей для образования мелких кристаллов льда. В природе широко распространены биологические нуклеирующие агенты, действующие как катализаторы кристаллизации при температуре выше -10°С (Гулевский, Релина, 2011). Наиболее полно в данном аспекте изучены нуклеаторы белковой природы у бактерий, грибов и животных. Сведения о нуклеаторах растительного происхождения (возможно, пектинов) единичны, что может быть связано с трудностью их выделения.

Необходимо учитывать, что сохранность клеточной мембраны зависит также и от скорости замораживания, и от отогрева биообъекта. В связи с этим в данной серии исследований и в последующих (при замораживании клеток до более низких температур) использована медленная нелинейная (экспоненциальная) программа, которая позволяет разным популяциям лейкоцитов в зависимости от скорости снижения температуры окружающей среды постепенно замедлять степень текучести многокомпонентного состава мембран, что связано с «вымораживанием» фракций воды и ее аморфной (менее травматичной) кристаллизацией и, в свою очередь, обеспечивает стабильное снижение метаболических

процессов. При использовании данного режима замораживания на термограммах не отмечается выброса кристаллизационного тепла, и, следовательно, не происходит роста гексагональных крупных кристаллов, вызывающих механическое повреждение мембран. При выбранном режиме замораживания целесообразным является быстрый отогрев биообъекта, позволяющий избежать активацию процессов рекристаллизации вне- и внутриклеточной воды.

Установлено, что при охлаждении клеток по нелинейным программам в хладоограждающих растворах №2, №4, №6 и хранении биообъекта в течение 1 суток при -10°С показатели сохранности клеток в большей степени соответствуют исходному уровню (табл. 4).

Таблица 4. Показатели сохранности лейкоцитов (М+ст), перенесших воздействие температуры переохлаждения (-10°С) в течение 1 суток в соответствующем криозащитном растворе_

Показатели сохранности %*

№ раствора п общее количество лейкоцитов количество эозино резистентных клеток количество гранулоцигов количество фагоцитарно активных нейтрофилов количество диформазан-положительных нейтрофилов количество нейтрофилов с катионными белками

1 7 99,3±1,б 87,9±9,б+ 91,0±6,7 79,4±5,7+ 106,1±7,7 98,2±3,1

2 7 95,2+6,4 95,0±4,1 88,4±6,4+ 101,0±0,9 104,0±5,8 99,1 ±0,7

3 7 79,2±7,4+ 89,5±4,9+ 52,0±4,2+ 69,7±4,1+ 95,0+11,2 98,6±9,4

4 7 98,4±2,1 98,2±1,2 89,4±3,9 88,8±3,0+ 102,2+4,8 99,2±0,5

5 8 90,7±6,6+ 81,6+15,9+ 78,9±10,5+ 86,1+5,6+ 330,0±11,5+ 80,7±8,2+

6 13 98,2±3,1 97,6+1,7 99,1±1,2 99,7±0,7 113,4±9,3+ 99,2+8,1

7 5 86,5±6,2+ 83,5+12,1+ 95,5+5,8 98,7±2,9 300,0±20,0+ 94,7±8,0

Примечания: "данные представлены в процентах по отношению к уровню до замораживания, принятому за 100%; + - р<0,05.

На следующем этапе исследования установлены допустимые сроки хранения клеток в указанных растворах. Показано, что большинство показателей жизнеспособности сохраняются на исходном уровне в криоконсерванте №2 - 7 суток, №4 - 5 суток, №6 - 1 сутки (табл. 5). При этом, количество фагоцитарноактивных нейтрофилов, которое является главным критерием оценки сохранности функции гранулоцита, после отогрева остается на уровне выше 70% (от исходного) в опытах с раствором №2 - 12 суток, раствора №4 - 9 суток, а раствора №6 - 2 суток. Следовательно, применение незамерзающих растворов (№2 и №4) является более эффективным, чем замерзающего (№6).

Таблица 5*. Показатели сохранности лейкоцитов (М±ст), перенесших воздействие температуры -10°С в течение разных сроков в криозащитных растворах №2, №4, №б_

Показатели сохранности %

Сроки хранения, сутки п общее количество лейкоцитов количество эозино резистентных клеток количество гранулоцитов количество фагоцитарно активных нейтрофилов количество диформазан-положительных нейтрофилов содержание катионных бежов в нейтрофилах

в криозащитном растворе №2

5 7 96,1±2,1 89,1+9,8+ 93,0±6,9+ 94,7±4,3 102,7±7,6 94,1+4,9

7 9 94,2±8,7 91,1+8,9+ 83,6±5,8+ 94,8±4,8 116,0±9,9+ 99,1±0,1

9 10 93,2±5,7 86,9±11,2+ 88,0±9,3+ 76,6±5,0+ 120,8±8,9+ 87,2±1,3+

11 7 94,6±5,5 91,4+4,7* 81,7±5,5+ 75,5+9,8* 133,8±7,9+ 68,6±1,3+

12 6 92,6±5,7 81,3±4,6+ 82,2±3,6+ 75,7+4,3+ 145,8±7,0+ 57,0±1,8+

14 7 95,2±4,8 56,6+7,8+ 81,4±4,5+ 52,9±6,1+ 204,1±18,2+ 46,2±4,1+

в криозащитном растворе №4

5 7 93,9+5,2 95,8±4,6 69,4±9,3+ 91,0±11,1 103,6±7,7 92,1±1,9+

7 8 92,7±7,3+ 86,8±4,7+ 67,2±6,7+ 78,5+2,7+ 104,9+10,9 83,0+2,9+

9 9 84,8±10,9+ 83,5±6,0+ 77,2±8,8+ 72,6+3,8+ 1X1,5+9,8 71,2±2,3+

11 7 80,7±8,9+ 82,7±6,8+ 68,0±4,6+ 61,4±2,8+ 120,3±14,1+ 62,6±3,3+

12 9 81,6±4,8+ 76,б±7,7+ 64,4±3,3+ 57,2+4,4* 131,7+10,1+ 56,9±1,8+

14 8 80,4±2,9+ 74,7±12,7+ 62,8±6,9+ 45,5±3,0+ 140,8+8,3+ 47,2±3,1+

в криозащитном растворе №6

2 10 86,1±0,9+ 73,0±12,8+ 67,8±15,8+ 70,1±9,5+ 99,2±8,1 113,4±9,3

3 10 79,5±16,1+ 57,2±11,5+ 61,5+12,9* 69,7+4,9+ 101,5±3,0 119,1±13,8+

*См. примечания к Табл. 4.

Показано также, что раствор №2 повышает интенсивность ПОЛ у лейкоцитов до охлаждения примерно в 1,2 раза, а АОА - в 1,9 раза и сохраняет данные значения в течение 12 суток экспозиции клеток в нем при -10°С (табл. 6). В опытах с раствором №4 исходно уровни ПОЛ и АОА снижаются в 1,4 и 1,7 раза, однако через 9 суток хранения (срок наблюдения) уровень ПОЛ повышается в 1,2 раза, а АОА - в 1,5 раза (табл. 7). В каждом случае у отогретых клеток отмечается более высокий уровень АОА, чем интенсивность процессов перекисного окисления, что позволяет клеткам оставаться жизнеспособными.

Следует отметить, что основным ингредиентом растворов №2 и №4 является глицерин (ЛД50 = 4,57±0,14 г/кг массы мыши; Anderson et al„ 1950) в исходной слаботоксичной 7% концентрации, (не требует отмывания перед применением), которая по результатам исследований является достаточной для проявления свойств данного протектора: легко проходить через клеточные мембраны (при +22°С), поддерживать переохлажденное состояние клетки, обеспечивать действие противосолевого буфера, уравнивать осмотическое давление по обе

стороны мембраны. Кроме того, данный протектор эффективнее защищает клетки при медленном охлаждении, которое применялось в работе. С учетом незначительного замедления метаболизма в клетках при -10°С для «профилактики» гипоксии применен ОМЭПС в исходной концентрации 0,3%. Однако совместное использование глицерина и ОМЭПС в указанных концентрациях обеспечивает сохранность (п=10, М±о) при данной температуре в течение 1 суток 90,3±1,7% (от исходного уровня) лейкоцитов, у 96,2±1,5% отогретых клеток отмечается устойчивость к эозину, сохранность гранулоцитов составляет лишь 57,2±2,6%. Определить способность нейтрофилов к фагоцитозу после отогрева оказалось невозможным в связи с разрушением их ядерной мембраны.

Таблица 6. Показатели хемшпоминограммы лейкоцитов (п=6, М±о), перенесших воздействие температуры переохлаждения (-10°С) под защитой

Лейкоцитный концентрат Показатели

Imax S tß(-2a) а Z

до замораживания 73,0±12,7 * 543,0±106,2 * 17,0±2,3 * 0,25±0,004 * 7,4±0,1 *

до замораживания с раствором №2 261,5±7,5 1601,а±з,5 58,0±ЗД 0,21±0,01 6,2±0,5

через 7 суток хранения 289,2±21,4 * 1841,0±48,4 * 55,б±6,4 0,22±0,01 6,5+0,4

через 12 суток хранения 270,5±17,2 1649,2±8,6 57,0±5,1 0,22±0,01 6,6±0,5

Примечание. * - различие с величинои показателя до замораживания с хладоограждающим раствором р<0,05.

Таблица 7. Показатели хемшпоминограммы лейкоцитов (п=8, М±а), перенесших воздействие температуры переохлаждения (-10°С) под защитой

Лейкоцитный концентрат Показатели

Imax S tg(-2a) а Z

до замораживания 118,2+10,8 * 773,2±14,02 * 28,9+3,9 * 0,22+0,02 * 6,6±0,5 *

до замораживания с раствором №4 95,4±2,2 639,8±7,12 16,2±0,1 0,29±0,004 8,8±0,1

через 9 суток хранения 111,8±12,5 * 759,8±71,8 * 24,1±3,7 * 0,23 ±0,02 * 6,8±0,5 *

Примечание. * - различие с величиной показателя до замораживания с хладоограждающим раствором р<0,05.

В связи с этим для повышения эффективности глицерина и ОМЭПС использованы лемнан и желатин, вещества, которые не проникают в клетку по причине большого молекулярного веса и связывают молекулы внеклеточной воды, также «оттягивая» на себя воду из клетки. Согласно теории Шраго М.И. (1981) вещество, обладающее функциональными

группами (-ОН, -СООН, -СН3, =Б=0 и др.) может оказывать криозащитное действие. Лемнан содержит радикалы -ОН (как и глицерин) и -СООН (как и желатин). Установлено, что указанные вещества повышают криозащитный эффект смеси глицерина с ОМЭПС. Однако с увеличением их молекулярного веса отмечается снижение криопротекторного действия в ряду: желатин (16 ООО) - желатин (20 ООО) - лемнан (400 ООО). При этом увеличение концентрации последнего не влияет на сохранность клеток.

Таким образом, для эффективного консервирования лейкоцитов при температуре переохлаждения целесообразным является их нелинейное охлаждение в незамерзающем нетоксичном криозащитном растворе №2, содержащем глицерин (в исходной концентрации 7%), желатин со средней молекулярной массой 16 ООО (7,5%) и ОМЭПС (0,3%). Указанный раствор в лучшей степени, чем остальные исследуемые растворы, способствует повышению криоустойчивости клеток при -10°С, что связано с возможностью снижения концентрации проникающего криопротектора в криоконсерванте и ослаблением постгипертонического стресса при размораживании.

Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие субумеренно-низкой температуры (-20°С)

Показано, что в диапазоне температур от -15°С до -20°С процессы метаболизма в клетках имеют малое замедление, т.к. происходит кристаллизация только внеклеточной воды и свободной внутриклеточной, в то время как связанная и фиксированная вода остаются в незамерзшем состоянии (Сведенцов, 2004). Следовательно, для эффективного консервирования лейкоцитов при указанной температуре необходимо наличие в замораживаемой среде не только протекторов, замедляющих скорость образования кристаллов и изменяющих их структуру при данной температуре, но и веществ, обладающих противогипоксическим и антиоксидантным действием.

Криозащитный раствор №2, который хорошо зарекомендовал себя при -10°С, не может быть использован при более низких температурах, что связано с холодовой денатурацией его основного компонента -гидролизата пищевого желатина.

В связи с этим для включения в состав новой хладоограждающей среды были выбраны глицерин (в нетоксичной концентрации), лемнан и вещество, обладающее смешанным криопротекторным действием -ГМБТОЭМ. Предполагается, что в используемых комбинированных средах каждый криопротектор будет проявлять свое защитное свойство при свойственных ему низкотемпературных условиях, что в итоге позволит устранить несколько причин повреждения разных популяций лейкоцитов и обеспечит аддитивную криопротекторную эффективность

комбинированного криоконсерванта. Для повышения устойчивости клеток к гипоксии и ингибирования ПОЛ в составе растворов использован ОМЭПС.

Эффективность ГМБТОЭМ впервые показана при криоконсервировании (-196°С) клеток костного мозга (Сведенцов, 1987). Данное вещество образует связи со структурными компонентами мембраны, что повышает ее устойчивость к повреждающему действию кристаллов, а также, частично проникая в клетку, связывает воду и способствует образованию преимущественно мелких кристаллов льда при замораживании. ГМБТОЭМ является также хорошим растворителем, что способствует поддержанию концентрации солей в межкристаллических пространствах на физиологически допустимом уровне и, следовательно, защищает клетки от неблагоприятного воздействия гиперконцентрации солей и денатурации клеточных белков. Его двойное (экзо- и эндоцеллюлярное) криопротекторное действие обусловлено размером молекул (378 Да) и наличием функциональных групп: гидроксиэтильных (СН2-СН2-0-), гидроксильных (-ОН), метальных (-СН3). Отсутствие циклических групп обуславливает его низкую токсичность (ЛД5о=15,5±0,6 г/кг массы мыши).

После проведенных предварительных испытаний более тщательному изучению криозащитных свойств подвергнуты четыре консерванта, отличающиеся природой и концентрацией компонентов.

Установлено, что хладоограждающий раствор №9, содержащий в исходной концентрации 28% ГМБТОЭМ и 0,15% ОМЭПС, в отношении лейкоцитов крови проявляет лучший криозащитный эффект, чем раствор с меньшей (№8) или с большей (№10) концентрацией указанных ингредиентов, а также раствор (№11), содержащий глицерин (7,0%) и лемнан (0,2%; табл. 8).

Показано, что криозащитный раствор №9 способен обеспечить сохранность лейкоцитов при -20°С в течение 21 суток (табл. 9). Данный срок обозначен на основании результатов сохранности гранулоцитов и способности нейтрофилов к фагоцитозу, а также дополнительных исследований. В частности, установлено, что содержание микробицидных белков в нейтрофилах после 21 суток холодового воздействия (-20°С) достоверно не изменяется - исходный уровень среднего цитохимического коэффициента составляет 2,3±0,6 у.е (п=10, М±о), после отогрева - 1,9±0,4 у.е.

Таблица 8*. Показатели сохранности лейкоцитов (М±а), перенесших воздействие субумеренно-низкой температуры (-20°С) в течение 1 суток в соответствующем криозащитном растворе_

Показатели сохранности %

№ раствора п общее количество лейкоцитов количество эозинорезистентных клеток количество гранулоцитов количество фагоцитарно активных нейтрофилов количество диформазан-положительных нейтрофилов количество нейтрофилов с катионными белками

8 5 92,4±1,5 73,5±4,7+ 62,3+8,1* 63,8±6,4+ - -

9 7 91,0±6,2 86,9±1,4+ 80,8±12,3+ 75,7±7,9+ 257,5±19,8+ 80,3±1,4+

10 6 94,3±4,6 78,1±8,1+ 65,7±4,0+ 57,6±6,5+ - -

11 12 88,9±10,5+ 78,0±6,7+ 52,2±11,9+ 76,0±12,9+ 380,6±19,3* 94,5±7,8*

*См. примечания к Табл. 4.

Таблица 9*. Показатели лейкоцитов (М±о; п=7), перенесших воздействие температуры -20°С в хладоограждающем растворе №9 в течение 70 суток_

Сроки хранения, сутки Показатели сохранности

общее количество лейкоцитов количество эозинорезистентных клеток количество гранулоцитов количество фагоцитарно , активных нейтрофилов количество диформазан-положительных нейтрофилов

14 90,1±9,0+ 94,2±3,8+ 80,8±12,3+ 75,2±8,1* 254,1±0,9+

21 90,9±7,6+ 89,3±6,8+ 93,7±9,8+ 71,7±10,8+ 304,8±1,2+

28 93,4±0,5+ 90,0±4,4+ 87,3±6,7+ 60,6±7,3+ 330,0±3,9+

42 87,4+11,0+ 82,1±8,5+ 75,1±9,9+ 58,3±10,8+ -

56 94,6±5,6+ 82,7+9,3* 71,9±17,6+ 60,4+10,7+ -

70 90,1±5,9+ 87,5±6,2+ 84,0±10,6+ 57,1±8,3+ -

*См. примечания к Табл. 4.

Установлено, что содержание растворенного в биосреде кислорода к 21 суткам нахождения лейкоцитов при указанной отрицательной температуре снижается (р<0,05), что указывает на возможность развития гипоксии (рис. 3). Однако уровень ПОЛ и антиоксидантный потенциал клеток достоверно не отличаются от исходного (табл. 10). Можно предположить, что стабильный уровень прооксидантно-антиоксидантного равновесия при данном холодовом воздействии указывает на нахождение клеток в стадии долговременной адаптации.

1,18 ■

22 22,5 23 23,5 24 24,5

температура, град.С —ЛК+КР№9 —А— Размороженный ЛК + КР

Рисунок 3. Содержание растворенного кислорода в смеси лейкоцитных концентратов (Ж; п=10) с криопротекторным раствором (КР) №9 до и после экспозиции при -20°С в течение 21 суток. + - р<0,05.

Интерес представляет то, что раствор №9 обеспечивает сохранность в течение 21 суток популяции Т-лимфоцитов (согласно активности СОЗ), но не способен повысить криоустойчивость В-лимфоцитов (по СП22; табл. 11), тогда как известно, что Т-лимфоциты являются более чувствительными к замораживанию (-80°С; -196°С), отогреву и осмотическому шоку (Белоус, Грищенко, 1994). Следовательно, предложенная технология обеспечивает сохранность не только клеток, способных к неспецифическому (фагоциты) иммунному ответу, но и к специфическому (Т-лимфоциты).

Таблица 10. Показатели хемилюминограммы лейкоцитов (п=6, М±а), перенесших воздействие субумеренно-низкой температуры (-20°С) под защитой криоконсервирующего раствора №9 в течение 21 суток__

Лейкоцигный концентрат Показатели

1шах 8 16(-2а) а 2

до замораживания 117,7±20,3 899,3±181,5 23,4±2,2 * 0,25+0,01 * 7,6±0,2 *

до замораживания с раствором №9 139,0±30,6 939,7±150,3 32,9±7,0 0,22±0,01 6,6±0,4

через 21 сутки хранения 158,0±27,4 1022,0±182,6 30,9+3,9 0,22±0,005 6,5±0,2

Примечание. * - различие с величиной показателя до замораживания о хладоограждающим раствором р<0,05.

Таблица 11. Содержание Т- и В-лимфоцитов (М±о; п=5), в лейкоцитных концентратах, подвергнутых холодовому воздействию (-20°С) разные сроки в хладоограждающем растворе №9

Популяция лимфоцитов Количество лимфоцитов в %

до замораживания (контроль) после размораживания

через 1 сутки через 21 сутки

Т-лимфоциты, % 75,0+8,4 86,2±7,6 85,2±3,3

В-лимфоциты, % 8,7±2,7 6,7±2,5 1,7±0,9*

Примечание. * - р<0,05.

Таким образом, нелинейное замораживание биообъекта в криозащитном растворе №9, содержащем ГМБТОЭМ (в исходной концентрации 28%) и ОМЭПС (0,15%), позволяет обеспечить структурно-функциональную сохранность лейкоцитов при -20°С в течение 21 суток.

Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (—40°С)

Температура -40°С характеризуется неустойчивой кристаллизацией связанной внутриклеточной воды, и самое незначительное нарушение температурного режима может стать губительным для замороженной клетки. Поэтому применяли большее количество ингредиентов для поиска эффективной комбинации хладоограждающего раствора в данной серии исследований, чем в других.

Использованы протекторы разного действия: эндоцеллюлярные -глицерин и ПД, экзоцеллюлярный - ГЭК, смешанного действия -ГМБТОЭМ.

ПД, являясь двухатомным спиртом, легко проникает в клетки и за счет своих функциональных групп (-ОН; СН3+-) связывает фракции свободной и связанной воды, тем самым снижает эвтектическую температуру замерзания и способствует формированию мелкозернистых кристаллов льда. Кроме того, он связывает и соли, защищая мембраны от гиперосмотического шока. Его токсичность гораздо ниже, чем глицерина (ЛД5о=13 мг/кг массы крысы, Белоус, Грищенко, 1994). Данное вещество обладает также слабым антиоксидантным и антибактериальным действием.

ГЭК образует водородные связи с водой и стабилизирует ее решетку, при этом структурированность воды изменяется, и в процессе замораживания повышается способность ее молекул формировать аморфные кристаллы льда (Белоус, Грищенко, 1994). Кроме того, ГЭК оказывает стабилизирующее влияние на плазматическую мембрану и является биологически инертным препаратом, не токсичен, в РФ используется как трансфузионная среда.

Для защиты клеток от гипоксии в случае активации метаболизма в замороженной клетке при незначительном повышении температуры окружающей среды в составе растворов использованы ОМЭПС и фумарат натрия. Кроме того, применяли следующие компоненты: хлорид холина -представитель комплекса витаминов группы «В», который входит в состав фосфолипида лецитина и обладает мембранопротекторным действием; глюкозу, которая обладает слабым эндоцеллюлярным криопротекторным действием и регулирует осмотические и метаболические процессы в клетках, способствует их эффективной репарации; лимонную кислоту -для нейтрализации основной реакции раствора и как необходимое звено в системе биохимических реакций клеточного дыхания, реализующее энергетический метаболизм клетки (Точилкин, 1980).

В результате исследованы структурно-функциональные параметры клеток, замороженных в 7 криозащитных растворах.

Установлено, что большей криоустойчивостью к факторам холодового воздействия обладают лейкоциты, замороженные з хладоограждающем растворе №13, содержащем 30% ГМБТОЭМ, 2,8% фумарата натрия и 0,06% лимонной кислоты (табл. 12). По эффективности ему незначительно уступает раствор №16, ингредиентами которого являются криопротекторы глицерин (4,8%) и ГЭК (5,7%), а также ОМЭПС (0,1%). Менее эффективен хладоограждающий раствор №18, содержащий ПД (21%), ГЭК (4,7%), ОМЭПС (0,2%) и хлорид холина (1%), что указывает на целесообразность применения ГЭК совместно с глицерином, но не с ПД.

Таблица 12*. Показатели сохранности лейкоцитов (М±а), перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (-40°С) в течение 1 суток в соответствующем криозащитном растворе__

Показатели сохранности %

№ раствора п общее количество лейкоцитов количество эозинорезис-тентаых клеток количество гранулоцитов количество фагоцитарно активных нейтрофилов количество диформазан-положительны х нейтрофилов о 2 й § ё 2 | | " л. Я ™ 6 о о е а и я

12 13 97,1±3,0 52,8±5,1+ 61,3±6,Г 49,8±6,8+ 420,2±15,6+ 52,6±12,3+

13 12 94,2±3,7 84,3±6,6+ 88,9±9,0+ 95,9+4,5 254,0±10,1+ 81,7±12,4+

14 14 91,6±9,3 54,9±8,4+ 57,1±6,5+ 50,4±4,7* 440,3±12,8+ 61,3±8,1+

15 6 99,3±1,6 60,4±2,9+ 85,0±11,5+ 33,5±9,0* - -

16 6 98,3±4,1 82,0+4,1+ 96,2+8,5 72,0+7,6+ 335,0+15,5+ 60,2±8,2+

17 6 88,3+14,0+ 51,0±7,4+ 88,2+7, Г 47,8+6,6* - -

18 5 85,4±7,1+ 79,0+10,1* 74,6±6,6+ 66,4±4,6+ - -

*См. примечания к Табл. 4.

Определение длительности хранения клеток при —40°С в криозащитном растворе №13 показало, что возможным сроком являются 30 суток, после чего наблюдается существенное ухудшение жизнеспособности клеток (табл. 13).

Согласно данным хемилюминограммы выявлено, что через 30 суток экспозиции биообъекта при -40°С не отмечается повышения ПОЛ и сохраняется высокий уровень АОА (табл. 14). Не изменяется также содержание растворенного в среде кислорода. Таким образом, в растворе №13 при исследуемой отрицательной температуре наблюдается стабильное замедление метаболизма в клетках и отсутствие гипоксии.

Таблица 13*. Показатели лейкоцитов (М±а; п=7), перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (-40°С) в хладоограждающем растворе №13 в течение 50 суток_

Сроки хранения, сутки Показатели сохранности %

общее количество лейкоцитов количество эозинорезистент ных клеток количество гранулоцитов количество фагоцитарно активных нейтрофилов количество диформазан-положительных нейтрофилов количество нейтрофилов с катионными белками

20 94,4±6,2 75,1±8,0+ 89,2+7,1* 92,9+0,6* 291,8±2,8* 100,8±6,8

30 84,5±10,8+ 70,1±14,9+ 62,4+4,9* 92,2±6,4+ 433,5±8,1* 102,0+9,1

40 87,4±8,5+ 79,7±8,3* 57,9±9,8+ 53,1±1,4+ - -

50 84,7±2,6+ 61,2±12,8+ 42,4±3,2+ 44,3+2,1* - -

*См. примечания к Табл. 4.

Таблица 14. Показатели хемилюминограммы лейкоцитов (п=5, М±а), перенесших воздействие умеренно-низкой температуры (—40°С) под защитой криоконсервирующего раствора №13 в течение 30 суток_

Лейкоцитный концентрат Показатели

1тах Б 1Е(-2а) а Ъ

до замораживания 77,2± 11,9 590,8±50,6 17,7+3,3 0,25±0,02 7,7±0,8

до замораживания с раствором №13 94,0±21,6 674,0±99,0 20,4±5,7 0,24±0,02 7,2+0,7

через 30 суток хранения 101,5±12,1 669,5±51,6 24,7±3,8 0,22±0,02 6,6±0,5

Кроме того, в исследуемом криозащитном растворе эффективно сохраняется популяция Т-лимфоцитов (табл. 15), что может представлять практический интерес при разработке способов криоконсервирования лимфоидной ткани.

Таблица 15. Содержание Т- и В-лимфоцитов (М±сг; п=5), в Ж, подвергнутых холодовому воздействию (-40°С) в течение разных сроков в хладоограждающем растворе №13

Популяция лимфоцитов Количество лимфоцитов в %

ДО замораживания (контроль) после размораживания

через 1 сутки через 30 суток

Т-лнмфоциты, % 82,8+1,9 88,3±2Д 87,2±3,1

В-лимфоциты, % 9,2+3,9 2,7±0,6* 1,9±0,8*

Примечание. * - р<0,05.

Таким образом, замораживание лейкоцитов по нелинейной программе в хладоограждающем растворе №13, содержащем в исходной концентрации 30% ГМБТОЭМ, 2,8% фумарата натрия и 0,06% лимонной кислоты обеспечивает структурно-функциональную сохранность лейкоцитов при -40°С в течение 30 суток. Применение криопротехторг смешанного действия ГМБТОЭМ в качестве основного ингредиента криозащитного раствора является эффективным не только при -20°С, но и при ^Ф0°С.

Структурно-функциональные показатели лейкоцитов, перенесших воздействие низкой температуры (-80°С)

Температура -80°С характеризуется стабильной кристаллизацией воды, исключение составляет фиксированная фракция. В клетках при этом отмечается выраженное замедление метаболизма. Следовательно, в замораживаемой биосреде необходимо наличие протекторов, способствующих мелкокристаллической кристаллизации как внеклеточной, так и внутриклеточной воды. В связи с этим использованы протекторы разного действия: эндоцеллюлярные ДМСО и ПД, экзоцеллюлярный - ГЭК, смешанного действия - ГМБТОЭМ.

ДМСО легко проникает в клетки, образует комплексы с внутриклеточной водой (сила взаимодействия между молекулами протектора и воды в 1,5 раза больше, чем между молекулами воды) и ионными комплексами, реорганизует структуру образующего льда (Пушкарь и др., 1978). Является токсичным (для лабораторных мышей ЛД50 ДМСО - 3,8±0,1 г/кг м.т., А$Ь\уоо(1-81тШ, 1961), поэтому требуется коррекция в сторону уменьшения токсичности дополнительной химической очисткой или совместным использованием с растворами декстрозы, полиглюкина, ГЭК или ГМБТОЭМ.

Составлены две комбинации веществ: ДМСО + ГМБТОЭМ + ОМЭПС (растворы №19-21) и ПД + ГЭК + сукцинат Ы-метиламмония натрия (№ 22-24). Последний, так же как и ОМЭПС, обладает

антигипоксическим, антитоксическим и антиоксидантным действием (Хлябич, 1997).

При изучении криозащитных свойств б растворов, отличающихся природой и концентрацией используемых ингредиентов, установлено, что высокие показатели жизнеспособности наблюдаются у клеток, замороженных по нелинейной программе в хладоограждающем растворе №20, содержащем в исходной концентрации ДМСО - 8%, ГМБТОЭМ -22% и ОМЭПС - 0,2%. (табл. 16).

Таблица 16*. Показатели сохранности лейкоцитов (М±о), перенесших воздействие низкой температуры (-80°С) в течение 1 суток в соответствующем криозащитном растворе_

Показатели сохранности %

№ раствора п общее количество лейкоцитов количество эозинорезистен-тных клеток количество гранулоцитов количество фагоцитарно активных нейтрофилов количество диформазан-положительных нейтрофилов количество нейтрофилов с катионными белками

19 7 79,8±5,0+ 77,0±7,7+ 82,8±13,4+ 55,0+7,2* 639,0±30,8* 80,2±8,4*

20 7 96,8+4,1 88,6±7,3+ 94,5±6,9 75,5±8,5* 426,7±39,3* 91,7±4,6*

21 7 91,4±4,0+ 77,6±8,4+ 68,2±18,3+ 57,0±4,0+ 362,5±41,1* 99,0±1,3

22 11 93,7±3,9+ 82,3±10,6+ 24,0+5,6* 52,4+2,8* 785,8±96,9* 98,6±10,9

23 11 93,7±4,8+ 87,0±7,6+ 68,2±12,7+ 57,3±5,9* 300,0±53,5+ 99,1+0,8

24 11 96,2±3,8 60,2±10,4+ 24,1±9,2+ 29,7+3,9* 410,5±70,5* 93,6+4,9*

*См. примечания к Табл. 4.

Применение данного раствора позволяет сохранить клетки при -80°С в течение 180 суток (срок наблюдения; табл. 17). При этом, количество Т- и В-лимфоцитов соответствует исходному. Таким образом, применение указанной технологии обеспечивает эффективную сохранность как клеток, реализующих реакции неспецифического иммунитета, так и клеток, ответственных за гуморальный и клеточный специфический иммунитет.

Содержание растворенного в биообъекте кислорода и через 1 сутки, и через 180 суток замораживания в растворе №20 не изменяется, что, наряду с благоприятными результатами жизнеспособности клеток, свидетельствует об эффективности выбранной криотехнологии.

Таблица 17. Показатели лейкоцитов (п=12, М±а), перенесших воздействие низкой температуры (~80°С) в хладоограждающем растворе №20 в течение 180 суток_

Показатели До замораживания После отогрева Сохранность"

Количество лейкоцитов в 1 мкл 16290±3189 15020±3987 89,3±6,4+

Количество эозинорезистентных лейкоцитов в % 98,1±1,6 89,3±5,0* 91,0+5,1*

Количество гранулоцитов в % Зб,7±8,0 33,6+6,0 85,3±7,2+

Количество фагоцитарно активных нейтрофилов в % 65,3±1,7 41,8±4,0* 76,7±14,7+

Количество диформазан-положительных нейтрофилов в % 3,4±0,5 24,7±7,0* 652,5±75,4+

Содержание катионных белков в нейтрофилах в у.е. 2,3±0,2 2,2±0,1* 93,8±9,4+

Количество Т-лимфоцитов в % 80,0±14,1 83,7±9,8 -

Количество В-лимфоцитов в % 8,5±2Д 8,5±2,1 -

Примечания: * - различие с показателем до замораживания р<0,05; # - данные представлены в процентах по отношению к уровню до замораживания, принятому за 100%;+ - р<0,05.

Интерес вызывает характер колебаний уровня ПОЛ и АОА после отогрева через разные сроки хранения (табл. 18). Так, если через 1 сутки отмечается снижение ПОЛ и АОА, что, вероятно, связано с замедлением процессов метаболизма в связи с проявлением «псевдотоксического» эффекта ДМСО, то через 180 суток отмечается повышение активности антиоксидантных систем клеток на фоне сниженного ПОЛ, при этом уровень АОА достигает исходного (до замораживания с раствором) и, возможно, сдерживает активацию ПОЛ.

Таблица 18. Показатели хемшпоминограммы лейкоцитов (п=6, М±а), перенесших воздействие низкой температуры (-80°С) в хладоограждающем растворе №20 в течение 1 и 180 суток__

Лейкоцитный Показатели

концентрат Imax S tg(-2a) а Z

до замораживания 86,2+10,5 * 642,8±71,3 * 19,2+2,1 * 0,25±0,004 * 7,5±0,1 *

до замораживания с хладоограждающим раствором №20 109,4±6,7 851,2±65,2 22,9±1,8 0,27±0,01 7,8+0,3

через 1 сутки 64,0±8,5 430,8+77,9 14,4±1,2 0,22±0,01 6,6±0,4

хранения * * * * *

через 180 суток 82,5+11,9 518,0+87,7 22,7±3,1 0,21 ±0,01 6.2±0,4

хранения * * * *

Примечание. * - различие с величиной показателя до замораживания с хладоограждающим раствором р<0,05.

Для сравнения эффективности указанной технологии с традиционной (применение жидкого азота) в дополнительной серии исследований лейкоциты в криозащитном растворе №20 были заморожены по линейной программе в программном аппарате УОП 00.00.00 (Украина): на 1-м этапе со скоростью 1°С/мин от +22 до -ТС, на 2-м этапе - 10°С/мин от -7 до —40°С, на 3-м этапе - 20°С/мин от -40 до -80°С. Общее время замораживания составило 37 мин. После этого образцы переносили для хранения в электроморозильник MDF-3086S «Sanyo» (Япония) на -80°С, где хранили в течение суток.

Установлено, что замораживание клеток по нелинейной программе способствует большей сохранности гранулоцитов и повышению количества нейтрофилов с гранулами диформазана, по остальным показателям различий не выявлено (табл. 19). Следовательно, оба режима замораживания являются альтернативными.

Таблица 19. Влияние режимов замораживания (-80°С) лейкоцитов в криозащитном растворе №20 на показатели жизнеспособности клеток (п=10, М±о), отогретых через сутки консервирования_

Режим замораживания Показатели Сохранность"

ДО замораживания после отогрева

Количество лейкоцитов в 1 мкл

Нелинейный 15470±3967 14940±3636 95,9±3,9

Линейный 12800+3009 12171±2692 96,1+1,7

Количество эозинорезистснтных лейкоцитов в %

Нелинейный 97,8±0,9 88,7+7,0* 90,9±7,1

Линейный 99,7±0,5 86,6±3,7* 86,9±3,8

Количество гранулоцитов в %

Нелинейный 34,0±2,3 32,3±2,7 95,5±7,9 л

Линейный 42,2±9,8 39,2±9,3 87,5±6,5

Количество фагоцитарно-активных нейтрофилов в %

Нелинейный 57,4±6,2 50,0±1,7* 88,1±5,9

Линейный 27,6±2,2 24,3+3,0* 89,0±5,4

Количество диформазан-положительных нейтрофилов в %

Нелинейный 4,5±0,7 21,2±2,3* 436,1+43,6 л

Линейный 16,8+2,3 28,3 ±3,3* 176,5±7,3

Содержание лизосомально-катионных белков в нейтрофилах в у.е.

Нелинейный 2,6±0,2 2,4±0,5 92,6±4,7

Линейный 2,4±0,1 2,2±0,2 95,6±3,1

Примечания: # - данные представлены в процентах по отношению к уровню до замораживания, принятому за 100%; * - различие с показателем до замораживания р<0,05; л - различие с показателем сохранности при использовании линейного режима замораживания р<0,05.

Необходимо отметить, что применение нелинейной технологии замораживания клеток требует меньших экономических затрат. Костяевым

A.A. (2003) показано, что на реализацию низкотемпературного (-80°С) консервирования гемопоэтических стволовых клеток по нелинейному режиму без учета стоимости криоконсерванта требуется в 2 раза меньше средств (33632 $), чем на криоконсервирование (-196°С) по линейным программам с использованием жидкого азота (64083 $). При этом 98% себестоимости любого метода составляют затраты на технические средства, остальные 2% приходятся на оплату труда, затраты на электроэнергию, перевязочные средства и медикаменты.

Таким образом, для эффективного консервирования лейкоцитов при низкой температуре (-80°С) целесообразным является нелинейное замораживание биообъекта в криозащитном растворе №20, содержащем ГМБТОЭМ (в исходной концентрации 22%), ДМСО (8%) и ОМЭПС (0,2%). Применение указанной технологии обеспечивает сохранность лейкоцитов в течение 180 суток.

Физико-химические и биологические свойства эффективных криозащитных растворов

При изучении влияния длительного хранения стерильных растворов №4, №9, №13 и №20 на их криозащитные свойства установлено, что все растворы по истечении срока хранения (45 суток при +60°С) остаются прозрачными, а изменение кислотности отмечается только в серии с раствором №20 (исходное значение рН=7,29; после хранения - 6,05), т.е. данный раствор необходимо готовить непосредственно перед процедурой замораживания.

Со всеми подвергнутыми хранению растворами были заморожены лейкоциты и выдержаны при соответствующих температурах (раствор №4 при -10°С; №9 при -20°С; №13 при -40°С; №20 при -80°С) в течение суток. Показано, что растворы №9, №13 и №20 сохраняют морфологическую полноценность клеток и их функциональную активность на том же уровне, что и соответствующий раствор, не подвергавшийся «старению». Функциональная активность лейкоцитов при хранении с использованием раствора №4 снижается, что, возможно, связано с гидролизом (+60°С) ингредиента раствора - желатина. Данное предположение нашло свое подтверждение в дополнительной серии исследований, в которой «ускоренному старению» подвергался раствор без желатина, последний добавляли в раствор непосредственно перед охлаждением клеток. Следовательно, раствор №4 необходимо готовить непосредственно перед процедурой охлаждения.

При изучении «острой» и «хронической» токсичности и пирогенности растворов №4, №9, №13 и №20 на лабораторных животных, а также переносимости животными аутотрансфузий, консервированных с растворами клеток, установлено, что все указанные растворы

соответствуют требованиям, предъявляемым к трансфузионной среде для внутривенного введения, в том числе и к криозащитной среде (ГФ ХП, 2007). При определении «острой» токсичности хладоограждающих растворов все белые мыши по истечению 5 суток остались живы. При выявлении «хронической токсичности» растворов белые мыши и кролики перенесли без осложнений и реакций многократное введение хладоограждающих растворов, что подтверждается данными об их состоянии и гистологическими исследованиями внутренних органов. В эксперименте на пирогенность растворов ни у одного из использованных кроликов не было зафиксировано суммарного изменения температуры тела, превышающего норму (1,4°С). При изучении переносимости собаками аутотрансфузий отогретых клеток без отмывания определенного хладоограждающего раствора установлено, что у животных отсутствуют отклонения от нормы в поведении, изменения температуры и массы тела, в норме сохраняются показатели гемограммы и урограммы, частоты дыхания и частоты сердечных сокращений.

Таким образом, хладоограждающие растворы №4, №9, №13 и №20 нетоксичны, апирогенны, благоприятно переносятся животными. Следовательно, их применение в медицинской практике не требует дополнительной трудоемкой и травмирующей клетки процедуры удаления фракций связанного криопротектора из биологической системы после цикла замораживания-отогревания.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые комбинированные криозащитные растворы, содержащие криопротекторы непроникающего, проникающего, смешанного типа действия, а также реставрирующие компоненты, не требующие отмывания после отогрева биообъекта.

2. В присутствии предложенных комбинированных растворов у лейкоцитов на всех этапах криоконсервирования и при варьировании сроков хранения не происходит активация ПОЛ.

3. При -10°С сохранность более 75% лейкоцитов по разным тестам в течение 9 суток обеспечивает незамерзающий криозащитный раствор, содержащий глицерин (в исходной концентрации 7%), желатин со средней молекулярной массой 16 ООО (7,5%) и антигипоксант-антиоксидант ОМЭПС (0,3%).

4. Комбинирование в замораживаемой клеточной среде ГМБТОЭМ (28%) с ОМЭПС (0,2%) обеспечивает полноценность лейкоцитов крови человека при -20°С в течение 21 суток.

5. Структурно-функциональные параметры у более 75% лейкоцитов сохраняются при -40°С в течение 30 суток в среде

криозащитного раствора, содержащего ГМБТОЭМ (30%), фумарат натрия (2,8%) и лимонную кислоту (0,06%).

6. Сохранность лейкоцитов при -80°С в течение 180 суток обеспечивает криозащитный раствор, содержащий ГМБТОЭМ (22%), ДМСО (8%) и ОМЭПС (0,2 %).

7. Криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ, обладающий выраженной криозащитной активностью в широком диапазоне температур (от —20°С до -80°С) и характеризующийся низкой токсичностью среди подобных веществ, может рассматриваться в качестве универсального протектора.

8. Предложен новый вид непроникающего криопротектора -пектиновый полисахарид лемнан, который в исходной концентрации 0,3% совместно с глицерином (7%) и ОМЭПС (0,3%) обеспечивает сохранность исходных морфофункциональных параметров у лейкоцитов при -10°С в течение 1 суток.

9. Разработанные комбинированные криозащитные растворы по физико-химическим и биологическим свойствам не токсичны, апирогенны и без осложнений переносятся лабораторными животными в смеси с размороженными аутологичными лейкоцитными концентратами.

10. Способы электрорефрижераторного криоконсервирозания лейкоцитов периферической крови в нетоксичных ограждающих растворах при температурах от -10°С до -80°С являются эффективными, доступными для широкого круга учреждений медицинского и биологического профиля и могут быть рекомендованы в качестве альтернативы криоконсервированию биообъектов в жидком азоте.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Предложены доступные способы криоконсервирования лейкоцитов крови человека под защитой комбинированных криозащитных растворов, обеспечивающих высокую сохранность морфологически?: и функциональных свойств клеток. Рекомендуются в качестве альтернативы замораживанию биообъектов в жидком азоте.

2. Для эффективного консервирования лейкоцитов:

а) при -10°С в течение 7 суток клетки смешивают (1:1) со свежеприготовленным криозащитным раствором, содержащим глицерин (в исходной концентрации 7%), желатин со средней молекулярной массой 16 000 (7,5%) и ОМЭПС (0,3%). Стоимость 1 литра раствора составляет приблизительно 1300 руб. Смесь выдерживают 20 мин при комнатной температуре и помещают для охлаждения и последующего хранения в заполненную антифризом (45%-ным этиловым спиртом) и охлажденную до -10°С емкость. Деконсервирование клеток производят покачиванием контейнера в емкости с водой, нагретой до +38°С до температуры

биообъекта +2 4- +4°С. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 2-3 мин.

б) при -20°С в течение 21 суток - клетки смешивают (1:1) с криозагцитным раствором, содержащем ГМБТОЭМ (28%) и ОМЭПС (0,2%), и выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Стоимость 1 литра раствора составляет приблизительно 900 руб. Биообъект на 10 мин для замораживания помещают в охлажденную до -20°С емкость с 96%-ным этиловым спиртом, после чего переносят в воздушную камеру для последующего хранения. Деконсервирование клеток производят аналогично пункту 2.а. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 40 сек.

в) при -40°С в течение 30 суток - клетки смешивают (1:1) с криозащитным раствором, содержащем ГМБТОЭМ (30%), фумарат натрия (2,8%) и лимонную кислоту (0,06%), выдерживают 20 мин при комнатной температуре. Стоимость 1 литра раствора составляет приблизительно 300 руб. Для замораживания смесь помещают на 15 мин в охлажденную до -28°С емкость с 96%-ным этиловым спиртом, после чего переносят для дальнейшего замораживания и хранения в воздушную камеру электрического морозильника на -40°С. Деконсервирование клеток производят аналогично пункту 2.а. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 45 сек.

г) при -80°С в течение 180 суток - клетки смешивают (1:1) со свежеприготовленным криозащитным раствором, включающем в себя ДМСО (8%), ГМБТОЭМ (22%) и ОМЭПС (0,2%). Стоимость 1 литра раствора составляет приблизительно 1300 руб. Смесь выдерживают 20 мин при комнатной температуре и помещают для замораживания на 15 мин в охлажденную до -28°С емкость с 96%-ным этиловым спиртом, после чего переносят для дальнейшего замораживания и хранения в воздушную камеру на -80°С. Деконсервирование клеток производят аналогично пункту 2.а. При объеме замороженного биообъекта 20 мл время отогрева составляет 45 сек.

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

Перспективными являются исследования, направленные на изучение сохранности функций стволовых клеток различной локализации при температурах выше -196°С в нетоксичных консервантах. Это обусловлено необходимостью создания новых доступных и эффективных методов криоконсервирования данных клеток с учетом возрастающей в них потребности.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах, соответствующих перечню ВАК, Россия

1. Svedentsov Е.Р. A method of introducing human blood leukocytes into cryoanabiosis at -50°C / E.P. Svedentsov, T.V. Polezhaeva (Tumanova), S.A. Jakshina, S.V. Utemov, A.A Kostyaev, D.A. Karpov // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2003. - V.136. - №11. - P.527-529.

2. Svedentsov E.P. Phagocytic activity of neutrophils and lymphocytes at various periods of storage in the state of cold anabiosis 40°C) / E.P. Svedentsov, O.O. Shcheglova, T.V. Polezhaeva (Tumanova), O.N. Devet'yarova, A.A. Kostyaev, S.V. Utemov // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. -2004. - V.138. - №10. - P.354-356.

3. Сведенцов Е.П. Введение лейкоцитов в холодовой анабиоз (-20СС) по экспоненциальной программе / Е.П. Сведенцов, О.Н. Деветьярова, Т.В, Полежаева (Туманова), О.О. Щеглова, А.А. Костяев, С.В. Утемов // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2005. - №3. - С.558-566.

4. Svedentsov E.P. Lymphocyte resistance to cold anabiosis of different degree / E.P. Svedentsov, T.V. Polezhaeva (Tumanova), O.O. Shcheglova, O.N. Devet'yarova // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2006. - V.142. -№2. -P.179-181.

5. Сведенцов Е.П. Создание ограждающего раствора для консервирования лейкоцитов на основе препаратов желатина / Е.П. Сведенцов, Е.С. Степанова, Т.В. Полежаева (Туманова), О.О. Зайцева, О.Н. Соломина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. -Т. 144. - №10. - С.445-447.

6. Сведенцов Е.П. Сохранение биологических мембран ядерных клеток крови при температуре -80°С / Е.П. Сведенцов Е.П., Т.В. Полежаева (Туманова), А.Н. Худяков. О.О. Зайцева, О.Н. Соломина, С.В. Утемов, Ф.С. Шерстнев // Биологические мембраны. - 2008. - Т.25. - №1. - С.18-24.

7. Сведенцов Е.П. Криозащитное действие лемнана, пектина ряски малой / Е.П. Сведенцов, Т.В. Полежаева (Туманова), Р.Г. Оводова, В.В. Головченко, О.О. Зайцева, О.Н. Соломина, Е.С. Степанова, Ю.С. Оводов // Доклады академии наук. - 2008. - Т.421. - №4. - С. 559-561.

8. Svedentsov Е.Р. Use of choline chloride for leukocytes cryopreservaticn (-40°C) / E.P. Svedentsov, O.O. Zaytseva, T.V. Polezhaeva (Tumanova), O.N. Solomina, A.N. Khudyakov // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. -2009. - V.148 - № 3. - P. 461-463.

9. Соломина О.Н. Криопротекторные свойства ряда пектинов / О.Н. Соломина, Е.П. Сведенцов, О.О. Зайцева, Т.В. Полежаева, Р.Г. Оводова, В.В. Головченко, Д.С. Лаптев, А.Н. Худяков, Е.С. Степанова, Ю.С. Оводов // Доклады академии наук. - 2010. - Т. 430. - № 4. - С. 559-561.

10. Сведенцов Е.П. Сохранение лейкоцитов в условиях умеренно-низких температур / Е.П. Сведенцов, Д.С. Лаптев, Т.В. Полежаева, О.О. Зайцева, А.Н. Худяков, О.Н. Соломина // Физиология человека. - 2012. -Т.38. - №5. - С.124-128.

Статьи в зарубежных научных изданиях

1. Svedentsov Е.Р. Effect of cryohypobiosis on concervation of human blood leukocytes / E.P. Svedentsov, E.S. Stepanova, T.V. Polezhaeva (Tumanova), O.O. Shcheglova, O.N. Devetyarova, S.V. Utyomov // J. Cryoletters. - 2005. - V.26. - N6. - P.387-394.

2. Svedentsov E.P. Freezing leukocytes to -40°C and -20°C under an exponential programme with original cryopreservatives / E.P. Svedentsov, T.V. Polezhaeva (Tumanova), O.O. Shcheglova, O.N. Deveryarova, E.S. Stepanova // International Journal of Refrigeration. - 2006. - V.29. - N1. - P.368-373.

3. Svedentsov E.P. Preservation of leukocytes in conditions of cryoanabiosis / E.P. Svedentsov, T.V. Polezhaeva (Tumanova), O.O. Zaytseva, O.N. Solomina, S.V. Utemov // Cell Preservation Technology. - 2007. - V.5. -№3. -P.144-150.

4. Khudyakov A.N. Effect of cryoprotective solutions and their components on intensity of lipid peroxidation and antioxidant activity in leukocytes at cryopreservation / A.N. Khudyakov, T.V. Polezhaeva, O.O. Zaytseva, D.S. Laptev, O.N. Solomina, A.A. Kostyaev // Problems of Cryobiology. - 2013. -V.23. - N1. - P.l-14.

Статьи в журналах

1. Сведенцов Е.П. Использование холодового анабиоза (-40°С) для консервирования гранулоцитов / Е.П. Сведенцов, Т.В. Полежаева (Туманова), О.О. Щеглова, О.Н. Деветьярова, С.В. Утемов // Пермский медицинский журнал. - 2004. - Т.21. - №3. - С. 82-85.

2. Сведенцов Е.П. Сохранность лейкоцитов в условиях криоанабиоза (-40°С) / Е.П. Сведенцов, О.О. Щеглова, Т.В. Полежаева (Туманова), О.Н. Соломина // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2006. - T.2. - №1. -С. 28-34.

3. Сведенцов Е.П. Ресурсосберегающие технологии для криоконсервирования лейкоцитов / Е.П. Сведенцов, Т.В. Полежаева (Туманова), О.О. Зайцева, О.Н. Соломина, А.Н. Худяков, Д.С. Лаптев // Фундаментальные исследования. - 2007. - №12 - Ч. 2. - С. 377-379.

4. Сведенцов Е.П. О сохранении функции ядерных клеток крови при низких температурах / Е.П. Сведенцов, Т.В. Полежаева (Туманова), А.Н. Худяков, О.О. Зайцева, О.Н. Соломина // Вестник Поморского университета. - 2007. - Вып. 1(11). - С. 28-35.

5. Сведенцов Е.П. Новый метод сохранения лейкоцитов в условиях холодового гипобиоза (-10°С) / Е.П. Сведенцов, Е.С. Степанова, Т.В. Полежаева (Туманова), О.О. Зайцева, О.Н. Соломина, C.B. Утемов // Трансфузиология. - 2008. - Т.9. - №1. - С. 13-19.

6. Зайцева О.О. Эффективность применения оригинальных криофилактиков для сохранности лейкоцитов при -40°С / О.О. Зайцева, Т.В. Полежаева, Е.П. Сведенцов, О.Н. Соломина, C.B. Утемов // Journal of Stress Physiology & Biochemistry. - 2011. - T. 7. - № 4. - С. 197-206.

Монография

Сведенцов Е.П. Функциональное состояние лейкоцитов после выхода из криоанабиоза. / Е.П. Сведенцов, Т.В. Полежаева (Туманова). -Екатеринбург: УрО РАН, 2007. - 81 с.

Патенты

1. Сведенцов Е.П., Полежаева (Туманова) Т.В., Хомякова С.А., Утемов C.B., Костяев A.A., Семенов А.Н., Криозащитный раствор для замораживания лейкоцитов при умеренно-низкой температуре. Патент РФ № 2184449 от 10.07.2002. БИ № 19, 2002.

2. Сведенцов Е.П., Полежаева (Туманова) Т.В., Деветьярова О.Н., Утемов C.B., Костяев A.A., Щеглова О.О. Хладоограждающий раствор дня замораживания лейкоцитов при субумеренно-низкой температуре. Патент РФ № 2240000 от 20.11.2004. БИ№32, 2004.

3. Сведенцов Е.П., Полежаева (Туманова) Т.В., Камышева Е.С., Костяев A.A., Утемов C.B., Деветьярова О.Н., Щеглова О.О. Протекторный раствор для консервирования лейкоцитов при температуре -10°С. Патент РФ №2261595 от 10.10.2005. БИ №28,2005.

4. Сведенцов Е.П., Полежаева (Туманова) Т.В., Деветьярова О.Н., Щеглова О.О., Утемов C.B., Костяев A.A. Криопротекторный раствор для замораживания лейкоцитов при низкой температуре. Патент РФ №2290808 от 10.01.2007. БИ №1,2007.

5. Сведенцов Е.П., Полежаева (Туманова) Т.В., Оводова Р.Г., Оводов Ю. С., Головченко В.В., Соломина О.Н., Щеглова О.О., Утемов C.B., Костяев A.A. Криоконсервант для лейкоцитов. Патент РФ ^ííí2301524 от 27.06.2007. БИ №18, 2007.

6. Сведенцов Е.П., Полежаева (Туманова) Т.В., Лаптев Д.С.. Соломина О.Н., Зайцева О.О., Худяков А.Н., Утемов C.B., Шерстнев Ф.С. Криопротекторный раствор для консервирования лейкоцитов при умеренно-низкой температуре (-40°С). Патент РФ №2439877 от 20.01.2012. БИ №2, 2012.

Автор выражает глубокую признательность научному консультанту д.м.н., профессору Евгению Павловичу Сведенцов^ за предложенную идею и отеческую поддержку при выполнении данной работы, академику Юрию Семеновичу Оводову за ценные рекомендации на заключительном этапе работы.

Автор искренне благодарит за всестороннюю помощь в выполнении работы д.м.н. профессора В.И. Циркина, сотрудников лаборатории криофизиологии крови ФГБУНИнститута физиологии Коми НЦ УрО РАНк.бм. О.О. Зайцеву, к.б.н. О.Н. Соломину, к.б.н. А.Н. Худякова, к.б.н. Е.С. Степанову, к.б.н. Д.С. Лаптева, Г.А. Никулину и сотрудников отдела молекулярной иммунологии и биотехнологии к.х.н., стм.с. Р.Г. Оводову и к.х.н., доц. В.В. Головченко за любезно предоставленные образцы охарактеризованных пектиновых полисахаридов.

Автор выражает большую признательность зам.директора ФГБУН Кировского НИИ гематологии и переливания крови д.м.н. профессору Галине Алексеевне Зайцевой и сотрудникам лаборатории консервирования крови и тканей д.м.н. А.Н. Костяеву, клл.н. C.B. Утемову, НЛ. Ежовой за оказанную помощь в проведении исследований.

Автор выражает благодарность Российскому фонду фундаментальных исследований за оказанную финансовую поддержку (грант №08-04-01423) при выполнении раздела данной работы.

Лицензия № 0025 от 20.06.96

Компьютерный набор. Формат 60x90 1\16 Бум. 10 АНгоипс!. Отпечатано на ризографе. Усл.печл. 2,0

Тираж 100 Заказ № 124

Информационно-издательский отдел Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологии Коми НЦ УрО РАН 167982, Республика Коми, г.Сыктывкар, ул.Первомайская, д.50