Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Количественный прогностический мониторинг эффективности радиотерапии злокачественных опухолей

На правах рукописи

ГРИГОРЬЕВА Елена Юрьевна

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ ПРОГНОСТИЧЕСКИЙ МОНИТОРИНГ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАДИОТЕРАПИИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ (экспериментальные исследования)

14.00.14. - онкология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

003471Э61

МОСКВА 2009

003471961

Работа выполнена в Государственном учреждении Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН

Научные консультанты:

доктор биологических наук [P.A. Спрышкова) Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор А.Ю.Барышников

доктор биологических наук С.Е.Ульяненко

доктор химических наук В.Н.Кулаков

Ведущая организация: Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена МЗСР РФ.

Защита диссертации состоится «11 » июня 2009г. в_часов на заседании

специализированного совета (Д.001.17.01) ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан <>0 ¿л/^У«-/^ 2009г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук, профессор И

Ю.В. Шишкин

Актуальность проблемы. Современная онкология располагает большим арсеналом средств, позволяющих в зависимости от гистологии, темпов роста опухоли, иммунологического и гормонального статусов выбрать оптимальные способы лечения злокачественных новообразований. Среди этих способов одним из основных является лучевое лечение. Примерно 70% от общего числа больных с онкологическими заболеваниями назначают лучевую терапию либо в виде самостоятельного курса лечения, либо в сочетании с другими методами лечения.

Эффективность лучевой терапии во многом зависит от возможности раннего прогнозирования реакции опухоли на воздействие. Важным аспектом проведения терапии является также наличие методов, способных обеспечить оптимальное индивидуальное планирование и контроль ее проведения. Кроме того, для выработки оптимального индивидуального плана лечения злокачественных опухолей и коррекции ранее намеченной схемы в процессе курса терапии большое значение имеет возможность ранней оценки реакции опухоли на облучение. Однако в клинической практике нет метода, с помощью которого можно было бы быстро получить надежную количественную информацию.

Разработка методов прогнозирования на основе цитокинетических параметров (общего числа клеток, фракции роста, распределения клеток по фазам клеточного цикла), а также таких биологических параметров, как скорость пролиферации, ре-популяции, фракции выживших клеток и др., позволяющих осуществлять количественную оценку и прогнозирование ответа опухоли на воздействие в экспериментальной радиобиологии, в клинических условиях затруднено в силу различных причин. Большая вариабельность данных параметров даже для опухолей одного и того же типа, а также необходимость частых биопсий в процессе лечения практически не позволяют использовать эти важные параметры для раннего прогноза реакции опухоли. Применяющиеся в клинике рентгенологические, томографические, эндоскопические и другие методы позволяют получить ответ о реакции опухоли на терапевтическое воздействие лишь через некоторое время после курса лечения, когда оптимальное индивидуальное планирование уже исключено. Таким образом, терапевтическое воздействие на организм больного продолжают даже тогда, когда оно не приносит никакого положительного эффекта (в силу радио - или химиорезистентности опухоли), но приводит к тяжелым побочным эффектам. В

этой связи создание, в первую очередь, раннего, простого, нетравматичного, информативного метода получения надежных количественных параметров, характеризующих ответ опухоли на воздействие, является актуальной задачей современной онкологии. Мы считаем весьма перспективным для оценки эффективности лучевой терапии использование радионуклидных методов. В частности, применяя йод-дезоксиуридин (ЙДУР), меченный гамма-излучающими изотопами йода, можно с помощью внешних детекторов неинвазивно проследить за включением радиоактивной метки (РМ) в опухоль и оценить уровень синтеза ДНК в ответ на противоопухолевое воздействие. Основанием для использования скорости выведения ЙДУР из опухоли в качестве прогностического показателя эффективности терапии послужили особенности фармакокинетики ЙДУР, который включается в ДНК, особенно, активно пролиферирующих клеток, претерпевает в основном все биохимические превращения в течение 15 минут после введения и покидает эти клетки только после их гибели. Измерение включения ЙДУР в ДНК опухоли, т.е. количественная оценка пролиферативной активности опухоли неинвазивным способом, может стать инструментом для подбора оптимальных схем лечения опухолевых больных и обеспечить более раннюю и, возможно, более точную оценку реакции опухоли на проводимую терапию, а также предоставить информацию для составления клинического прогноза.

Цель настоящей работы - повышение эффективности лучевой терапии на основе индивидуального количественного прогнозирования реакции опухоли на противоопухолевое воздействие.

Задачами работы являются:

оценка эффективности лучевой терапии с использованием ЙДУР, меченного радиоизотопами йода;

- разработка параметров количественной оценки реакции опухоли индивидуального животного на облучение с использованием меченного различными изотопами йода ЙДУР;

- оценка эффективности использования разработанной модели для раннего индивидуального неинвазивного мониторинга лучевой терапии опухоли.

Научная новизна

Все исследования выполнены в нашей стране впервые, часть исследований выполнена впервые в мире.

• Разработаны критерии ранней неинвазивной оценки эффективности лучевой терапии индивидуальных опухолей на основе параметров, характеризующих скорость выведения из опухоли 1311-ЙДУР, введенного в организм до облучения опухоли, и |251-ЙДУР, введенного тому же животному после облучения опухоли.

• Определены количественные параметры зависимости включения ЙДУР в опухолевые клетки от уровня изменения синтеза ДНК опухоли при ее локальном рентгеновском облучении в различных дозах, а также при облучении тепловыми нейтронами и облучении тепловыми нейтронами в присутствии с |0В8Н - \У1(с1/0).

• Показано, что отношения угловых коэффициентов (К) начального участка (до 48 часов) кривых, построенных по регистрируемой над зоной опухоли радиоактивности после введения |3|1-ЙДУР до облучения и 1251-ЙДУР после облучения опухоли одному и тому же животному, коррелируют с параметрами роста опухоли.

• Определены функциональные зависимости между параметрами выведения радиоактивной метки ЙДУР (К), параметрами роста опухоли и дозой облучения для отдельных животных.

• Для оценки биологической эффективности разработаны в наших экспериментах и применены биологические критерии:

- параметр К, рассчитываемый по скорости выведения из опухоли радиоактивной метки введенного в организм ЙДУР, регистрируемой внешним детектором над зоной опухоли и функционально связанный с показателем ^Л^Цё/О), характеризующим зависимый от дозы облучения уровень синтеза ДНК в опухоли после ее облучения;

параметр М, характеризующий зависящую от дозы долю объёма опухоли, клетки которого сохранили пролиферативную активность после облучения. Он вычисляется на основании анализа закономерностей роста опухоли в ответ на облучение, позволяет нетравматично получать оценку реакции опухоли на облучение и заменить во многих случаях сложный метод изучения выжившей после облучения фракции опухоли клеток.

Научно-практическая значимость работы

Разработана система индивидуального количественного прогноза эффективности лучевого воздействия на опухоль с использованием параметров выведения меченного гамма-излучающими радиоактивными изотопами ЙДУР, что позволяет неинвазивно прогнозировать эффективность как лучевого воздействия на опухоль, так и других видов консервативного лечения в онкологии в течение первых двух суток.

Практическая значимость экспериментальных результатов заключается в возможности получить дополнительные сведения об индивидуальной чувствительности опухоли на терапевтическое лучевое воздействие с элементом предсказания дальнейшего развития опухоли, и, соответственно, позволит более точно выбирать для каждого пациента оптимальный режим облучения. Результаты данного исследования могут быть инструментом, дающим возможность обеспечить более раннее распознавание ответа опухоли на проводимую терапию, то есть позволяют количественно оценить индивидуальную чувствительность опухоли и прогнозировать эффективность лучевого воздействия на нее через 48 часов после облучения

Принципиально важно отметить, что разработанная и предлагаемая методика может быть использована не только при оценке лучевого воздействия, но и при других видах противоопухолевой терапии.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и докладывались на следующих международных и отечественных конференциях и совещаниях: XI International Symposium on Laboratory Animals and Experimental medicine (Riga, 2-4 October, 1990); Всероссийский съезд онкологов (Ростов-на-Дону, 10-12 октября 1995); 2-я Национальная конференция «Медицинская физика-95 с международным участием» (г. Москва, 4-8 декабря, 1995); совещание с международным участием «Применение нейтронов ядерных реакторов в лучевой терапии, состояние и перспективы» (г. Обнинск, 17-19 октября, 1995); Seventh International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer (Zurich, Switzerland, 4-7 September, 1996); Ca-теллитный симпозиум «Актуальные вопросы радиобиологии нейтронов и нейтронной терапии» в рамках 3 Съезда по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность), г. Обнинск, 16 октября, 1997; Международный коллоквиум по проблеме INTAS (Москва, ИОНХ РАН, 4 июня 1998);

Международное совещание по проблеме INTAS-96-1114 (г.Обнинск, 14 ноября 1998); Eighth International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer (13-18 September 1998, La Jolla, California, U.S.A.); XY1 Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, «Научная сессия по проектам INTAS» (25-29 мая 1998г., Санкт-Петербург); Seventh International Radiopharmaceutical Dosimetry Symposium (April 17-19, 2002, The Department of Radiology and Radiological Sciences of Vanderbilt University Medical Center, Nashvilli, TN); Second Int. Conference on X-Ray and Neutron Capillary Optics (22-26.09 2004, Zvenigorod, Russia; III-й съезд онкологов и радиологов СНГ (Минск, 24-28.05 2004); Семинар «Радионуклидные технологии в физике и медицине» (Москва, ГУ РНЦ «Курчатовский институт», 28 октября, 2004г); IV Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 16-18 марта, 2005); Всероссийская конференция «Радиобиологические основы лучевой терапии» (Москва, 19-20 апреля, 2005); VI Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 24-26 марта, 2007).

Отдельные разделы настоящих исследований вошли в работы, отмеченные премией имени И.В. Курчатова за лучшую научную работу 2004 года и премией ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в области клинической онкологии за лучшую прикладную научную работу (2005 г.).

Личный вклад автора состоял в постановке целей и задач исследования, выполнении основного объема экспериментальной работы. Автором проведены обработка и анализ полученных результатов, формулировка общих выводов и основных положений, выносимых на защиту.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 210 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов и техники экспериментов, трех глав, содержащих собственные экспериментальные данные с обсуждением их результатов, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 267 наименований отечественных и иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 27 рисунками, фотографиями и 11 таблицами.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во «Введении» обоснованы актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цели и задачи работы. Освещены научная новизна и практическая значимость результатов исследований.

В главе «Обзор литературы» обобщены и проанализированы литературные данные по теме «Оценка эффективности лучевой терапии опухолей».

Глава «Материалы и методы исследований» состоит из 8 разделов.

2.1. Постановка экспериментов. В разделе описаны два подхода для оценки эффективности лучевой терапии с использованием меченого ЙДУР, основанные на метаболическом поведении ЙДУР: а) Оценка уровня потери из опухоли радиоактивного ЙДУР, включившегося в ДНК опухоли, б) Оценка уровня включения радиоактивного ЙДУР в ДНК опухоли.

2.2. Экспериментальные животные и опухолевые модели. Эксперименты по оценке ответа опухоли на облучение выполнены на мышах линии C57BL/6 с перевивной опухолью меланома В-16 и на беспородных мышах SHK с перевивной опухолью саркома-180. Средняя масса животных - 20 г. Возраст животных 2 + 3 месяца. Суспензию опухолевых клеток перевивали внутримышечно в правую заднюю лапку животного в объеме 0,1мл, который содержал 3,5 4 млн. клеток. По достижении опухолью объема 700+900 ммЗ (10-11 день после перевивки меланомы и 8-9 день после перевивки саркомы) проводили ее локальное облучение. Каждая из групп, сформированных для экспериментальных исследований, включала по 10 -н 12 животных с опухолями приблизительно равных объемов. Объемы опухолей вычисляли как произведение константы 0,56 и размеров трех взаимно перпендикулярных осей эллипсоида. Для каждой временной точки t объем опухоли (Vt) нормализовали к ее объему на момент облучения (V0) и строили кривые Vt/Vо в зависимости от t (время от начала облучения) для каждой дозы D и для каждого отдельного животного с соответствующим ему контролем (D=0). Монослой клеток HeLa выращивали в питательной среде 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота, согласно стандартным методикам работы с клеточными штаммами. Сформированные экспериментальные группы составляли по 5-6 флаконов на точку. Каждый флакон содержал 100000 клеток в 2 мл среды.

2.3. Используемые радиоизотопные маркеры. В исследованиях применяли меченый 5-йод-2'-дезоксиуридин (ЙДУР). Для радиоактивной маркировки ЙДУР использовали как |251, так и |3|1. Период полураспада 1251 - 60 дней, он излучает гамма-кванты с сопровождаемым характеристическим рентгеновским излучением в диапазоне энергий 27 * 32 КэВ, то есть является источником мягкого фотонного излучения и электронов Оже. Период полураспада 1311 составляет 8 дней, он также является гамма-излучающим изотопом с энергией гамма-квантов 0,364 МэВ. Периоды полураспада 1251 и 13|1 учитывались при обработке результатов исследований. Количество введенного внутрибрюшинно ЙДУР на мышь составляло 7,1 -f- 7,3 мкг в объеме 0,2 мл. Выравнивание концентраций ЙДУР в рабочих растворах проводили добавлением рассчитанного количества нерадиоактивного ЙДУР. Общая величина радиоактивности в расчете на одно животное не превышала 0,7 ■*• 0,9 МБк. Такая активность дает возможность с достаточной точностью регистрировать уровень радиоактивности в зоне опухоли и при этом не вызывает радиотоксичности. Для снижения включения 1251 и Ш1 в щитовидную железу и уменьшения тканевого потребления меченого йодида, образующегося в процессе метаболизма радиоактивного ЙДУР, за 3 дня до введения препарата и до окончания эксперимента в питьевую воду животным добавляли 1% раствор Nal.

2.4. Облучение опухолей. Локальное облучение опухоли проводили тремя видами излучения: рентгеновским, тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в сочетании с 10BSH, предварительно введенным в организм мышей. Облучение опухолей рентгеновским излучением в диапазоне доз 2 •*■ 40 Гр проводили на установке «Стабилипан» (мощность дозы 3,7 Гр в минуту, V=200 кВ, 1=18 мА, фильтр 2мм Al). Животных неподвижно фиксировали на подложке из оргстекла толщиной 6 мм. Экранировали мышей свинцовым коллиматором толщиной 10 -н 20 мм с отверстием под зоной опухоли, добиваясь тем самым облучения только опухолевой области. Погрешность в определении дозы облучения не превышала 3%. Для контроля дозы, подводимой на опухоль, использовали термолюминисцентные дозиметры TLD-100. Неравномерность по дозе в пределах объема опухоли и поглощения в нем излучения не превышала 6%. Облучение тепловыми нейтронами проводили на касательном пучке нейтронов реактора ИР-8 РНЦ ФГУ «Курчатовский институт». Мощность флюенса тепловых нейтронов составляла 1,2-108 н/см2 сек.

Примесь промежуточных и быстрых нейтронов не превышала 8% от полной мощности флюенса. Вклад фотонного излучения в полную поглощенную дозу был не больше 1,2%. За 11,5-12 ч до облучения нейтронами животным внутрибрюшинно вводили 0,2 мл раствора 10BSH в дозе 100 мкг/г массы мыши. Животных-опухоленосителей без анестезии помещали в тефлоновую клетку, которая ограничивала движение животных, но не препятствовала физиологическим отправлениям и приему пищи. Лапку, несущую опухоль, оттягивали, фиксировали и проводили локальное облучение опухоли в диапазоне следующих доз: тепловыми нейтронами - 0,51 + 8,94 Гр, тепловыми нейтронами в сочетании с 10BSH - 0,21 -н 9,5 Гр. Поскольку из-за невысокой мощности флюенса облучение тепловыми нейтронами было растянуто во времени, то для каждой группы животных или отдельного животного, облучаемых в данный день, использовали свою группу контрольных животных, по отношению к которым проводили в дальнейшем необходимые расчеты. 2.5. Радиометрия и дозиметрия. Образцы с культурой клеток HeLa для радиометрических измерений готовили следующим образом: меченую среду и 3-х кратные смывные воды собирали во флакон, затем к радиоактивным клеткам добавляли 2 мл свежей среды и вновь проводили радиометрические измерения как флаконов с клетками, включившими |251-ЙДУР, в свежей нерадиоактивной среде, так и флаконов с радиоактивной средой и промывками. Поскольку при замене среды в ней могут содержаться меченые клетки, то для сбора так называемых «плавающих клеток» проводили центрифугирование и фильтрацию среды. Радиометрию зоны опухоли и аналогичного участка интактной лапки животного проводили «¡n vivo» с помощью детектора со сцинтилляционным кристаллом NalfTL], многоканального анализатора типа BZ-27 (фирма «Бертольд»), используя набор свинцовых экранов с отверстиями различных диаметров и столика, для фиксации животных. Расстояние от детектора до опухоли рассчитывали, основываясь на двух основных требованиях: 1. необходимость превышения результатов измерений над фоном не менее чем в 4+5 раз; 2. максимальное уменьшение влияния геометрических факторов на результаты радиометрии. Исходя из вышесказанного, расстояние от детектора до опухоли составляло 80+90 мм. Тело животного экранировали свинцовой пластиной толщиной 10+20 мм с отверстием, соответствующим размеру опухоли. Для проверки точности показаний детектора (калибровки) радиоактивность эталонно-

го образца измеряли в различных точках столика для фиксации животных. Положение точки над центром детектора определяли с помощью центратора, соединенного с корпусом детектора с точностью ±1 мм. Учитывая, что размер эталонного образца (0,5см3) много меньше его расстояния до детектора, различия показаний по отношению к центральной точке должны соответствовать закону обратных квадратов расстояний от них до детектора (статистическая ошибка 5%). При проведении экспериментов животное фиксировали по отношению к детектору так, чтобы зона опухоли не попадала в область, где это условие нарушается. Использование многоканального анализатора позволяло одновременно проводить измерения двух различающихся по энергиям радиоизотопов в двух независимых окнах, настроенных на максимальное отношение образец/фон. Измерение радиоактивного фона проводилось перед началом радиометрии опухоли. Время радиометрии составляло 1мин. По мере уменьшения разницы между значением уровня радиоактивности, измеряемой в зоне опухоли, и значением фона время измерения увеличивали в соответствии с таблицей Белла, чтобы погрешность измерения за счет этого фактора не превышала 10 %. Радиоактивность «№> (имп/мин) измеряли через 0,25 ч, 3 ч, 6 ч, 10 ч, 24 ч и далее ежесуточно до 240 ч от момента введения ЙДУР. Данные (Ы,), полученные для каждой временной точки I, после вычитания фона и поправки на распад выражали как процент оставшейся ко времени I радиоактивности от фиксируемой в зоне опухоли через 0,25 ч после введения меченого ЙДУР (И 0,25)- Дозиметрия. Поглощенную дозу фотонного излучения измеряли термолю-минисцентными дозиметрами ТЬБ-ЮО. Отклонения от средней дозы не превышали 15%. Поглощенную дозу от тепловых нейтронов контролировали методом ней-тронно-радиационной дозиметрии, разработанным в совместных исследованиях с ГУ РНЦ «Курчатовский институт». Средняя мощность дозы в нативной ткани (без введения 10В8Н) составляла 0,25 Гр/ч. Суммарная поглощенная доза в опухоли определялась по трем ядерным реакциям, дающим основной вклад в поглощенную дозу при взаимодействии тепловых нейтронов с нуклидами биологической ткани -'Н (п,у)2Н; |4Ы (п,р)|4С; |0В (п,а)71л - и составила 95-97%. При этом, вклад в дозу от нейтронно-захватных реакций на нативном |0В составлял примерно 4%, на 'Н -30%, на - 60-65%. Доза от реакции на 10В, введенном с препаратом 10В8Н, составляла около 25% общей поглощенной дозы.

2.6. Параметры изменения роста опухоли. Для оценки изменения роста опухоли в течение всего эксперимента ежедневно проводили измерение трех взаимоперпендикулярных диаметров опухоли и, принимая форму опухолей эллипсоидальной, их объемы вычисляли по формуле V= 7t/6-d|-d2-d3, где di, d2, d3 - линейные размеры трех осей эллипсоида. Ошибка при измерении линейных размеров составляла ±2 мм. Для каждой временной точки t объем опухоли (Vt) нормализовали к ее объему на момент облучения (V0) и строили кривые Vt/V0 в зависимости от t (время от начала облучения) для каждой дозы D и для каждого отдельного животного с соответствующим ему контролем (D=0). По этим кривым вычисляли параметры: М = [ Vt/Vo (D)]/[ V/V0 (0)], время задержки роста опухоли (Т(3)) - время дорастания объема опухоли до своего первоначального значения в момент облучения, и время дорастания ее до двойного объема (Т(дор)) по сравнению с Vo. Параметры определяли графически по кривым изменения Vt/V0 от t для каждого животного.

2.7. Включение ЙДУР в ДНК опухолевых клеток. Выделение ДНК из опухолевых клеток осуществляли по методу Шмидта и Тангаузера. Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрическим методом A.C. Спирина. Активность фракций измеряли в пробирках на гамма-спектрометре MAG-510 (фирма «Бертольд»), Измеренная радиоактивность выражалась как процент от введенной дозы на грамм ткани. На все результаты радиометрических измерений делали поправки на радиоактивный распад изотопа после его введения животным.

2.8. Методы оценки экспериментальных данных. Поскольку доверительные оценки как средних значений, так и дисперсий основаны на гипотезе нормальности закона распределения случайных ошибок измерения, мы проверяли нормальность распределения используя критерий К, Пирсона х2 (хи-квадрат) и методом оценки центральных моментов третьего и четвертого порядков М3 и М4. Показателем асимметрии As считали отношение центрального момента третьего порядка к кубу среднего квадратического отклонения. As = Цр *a3)/n*S3(a- отклонение вариант от средней арифметической, р - повторяемость отдельных вариант). Величина этого показателя колеблется от 0 до 1; при совершенно симметричных распределениях этот коэффициент равен 0; асимметрия считается незначительной, если А$ <0,25; при As > 0,5 скошенность распределения оказывается уже значительной. Величину эксцесса Ex (Ех = Цр *a4)/n*S4-3) измеряли как центральный мо-

мент четвертого порядка, отнесенный к среднему квадратическому отклонению в четвертой степени минус 3 (для строго симметричных нормальных распределений показатель эксцесса равен 3). При Ех 5 0,2 эксцесс практически отсутствует. Если Ех > 0.5, но < 1, эксцесс считается уже заметным. Крайняя степень отрицательного эксцесса равна -2, что указывает на наличие двух вариационнах рядов. Частотная гистограмма распределения значений N,/N0.25 У контрольной группы животных показала, что ряд N[/N0.25 подчиняется закону нормальных распределений. Аналогичная ситуация характерна и для распределения относительных объемов опухолей У/Уо, поэтому выбор способа усреднения не принципиален. Достоверность различий, наблюдаемых между двумя средними, производили на основе нормирования, то есть по оценке критерия достоверности С или по сравнению с доверительными границами случайных колебаний, среднюю квадратическую ошибку разности между средними арифметическими вычисляли по формулам в зависимости от величины сравниваемых выборок, исходя из 95% уровня доверительной вероятности. Для сравнительной оценки выборочных данных небольшого объема использовали непараметрический критерий статистической значимости различий (критерий Уайта), не требующий нормальности распределения исследуемых рядов. Динамику связи между двумя признаками характеризовали с помощью регрессионного анализа. Для построения кривых регрессий и получения функций регрессий применяли метод наименьших квадратов. Доверительная зона регрессии определяла ошибку нахождения прогнозируемой величины при 95% уровне значимости. Принимая во внимание, что, как правило, линия регрессии - нелинейна и коэффициент регрессии не может служить ее надежным показателем, степень зависимости между переменными оценивали с помощью коэффициента корреляции г. Приняли следующую градацию г. от 0,1 до 0,5 - слабая связь между признаками, от 0,5 до 0,7 - средняя степень сопряженности, свыше 0,7 - сильная, г = 1 означает уже не коррелятивную, а функциональную связь между переменными. Достоверность коэффициента корреляции определяли показателем преобразования Фишера. Площади под кривыми выведения радиоактивной метки из зоны опухоли рассчитывали аналитически. Для этого проводили анализ эмпирических значений и выбирали аппроксимирующую функцию с наилучшим приближением. После определения параметров искомой функции вычисляли ее определенный интеграл. Пре-

делы интегрирования задавались от 0,25 ч до 72 ч. Чтобы охарактеризовать изменение уровня накопления меченого соединения в опухоли при ее локальном облучении различными дозами в сравнении с необлученными, полученные значения площадей (Ба) нормировали на значения площадей (8о) в контрольных группах (Ба / Бо). Оценка параметров моделей для приближения экспериментальных данных производилась с помощью нелинейного метода наименьших квадратов.

Глава 3. «Кинетика выведения 5-йод-2'-дезоксиуридина» посвящена анализу различных подходов для оценки эффективности лучевой терапии с использованием ЙДУР, меченного радиоизотопами йода.

3.1. Выведение 5-йод-2'-дезоксиуридина из опухолевой и здоровой ткани. Способность 5-йод-2'-дезоксиуридина встраиваться в ДНК, а не в другие биологические макромолекулы, является определяющим фактором для использования этого соединения как маркера реакции опухоли на противоопухолевое воздействие. После введения ЙДУР накопление соединения в опухолевой ткани наблюдается на протяжении 15-90 мин в зависимости от метода введения и достигает 12 % от радиоактивности, измеренной во всем теле. Уже в первые сутки существует преимущественное накопление ЙДУР в опухоли, в сравнении с различными органами и тканями животных. Согласно результатам радиометрических измерений т укго, коэффициент дифференциального накопления (КДН) радиоактивного ЙДУР для различных органов и тканей к 30 ч убывает согласно следующей последовательности: опухоль - 29 %, кишечник - 13 %, селезенка - 9 -И 1 %, кость бедренная - 5 -ь 7 %, кожа -6,5 + 4 %, кровь — 5^-6%, почки - 3,5 %, печень - 1,5+2 %, жир - 1+2 %, мышцы - 1,5 %. При этом, через 15 мин после введения в организм 90 - 94 % находящегося в опухоли ЙДУР связано с ее ДНК, где он удерживается при медленном клиренсе в течение 1 - 4 суток.

Для определения количества |251-ЙДУР, включающегося в ДНК при облучении опухолей, была выделена ДНК опухолевых клеток. Радиоактивность образца ДНК выражали как % от дозы на 1 г опухолевой ткани и сравнивали со значениями общей радиоактивности в первоначальной ткани. В таблице 1 приведены данные включения 1251-ЙДУР в ДНК необлученных опухолей для 24 ч, 48 ч, 96 ч от момента введения |251 ЙДУР (количество образцов на точку - 6). Оставшиеся 7%

приходятся на долю меченых метаболитов (преимущественно йодида и йодированных белков).

Таблица 1

Включение 1251 ЙДУР в ДНК опухолевой ткани

Время взятия образца(после введения |251 ЙДУР), ч Радиоактивность опухолевой ткани (% от дозы на 1 г опухолевой ткани) Радиоакти вность ДНК (% от дозы на 1 г опухолевой ткани) Вклад радиоактивности ДНК в радиоактивность опухолевой ткани(%)

24 0,48±0,13 0,44±0,12 91±1,29

48 0,49±0,13 0,46±0,13 93±1,33

96 0,47±0,11 0,44±0,14 93±1,18

На рисунке 1 представлены результаты измерений внешним детектором опухоли (меланома В-16) и аналогичной зоны коллатеральной безопухолевой лапки животного. Кривые зависимости N[/N0,5 от I даны для групп однородных животных и представляют собой динамику отношений уровней РМ в импульсах в минуту в момент времени г (!\\) и через 0,5 мин после введения ЙДУР, меченного П51 (N0,5)-Измеренная радиоактивность приведена к общему количеству введенной РМ. Кривая 2 изменения РМ зоны интактной лапки животного не показывает накопления РМ, и спустя уже 10 ч значение РМ уменьшается на порядок. Зарегистрированная в интактной лапке радиоактивность преимущественно локализована в ДНК красного костного мозга бедра, что и обусловливает медленный спад кривой в дальнейшем. Кривая 1 изменения радиоактивности опухоли характеризуется 4-мя выраженными участками: быстрое увеличение РМ, спад, значительное замедление скорости выведения - «плато», затем некоторое увеличение скорости выведения. В пределах первых суток на фоне включенного в ДНК опухолевых клеток ЙДУР происходит спад радиоактивности в зоне опухоли, который обусловлен в первую очередь потерей меченого материала за счет выведения из организма радиоактивных продуктов метаболизма ЙДУР, не включившихся в ДНК, главным образом, быстро экскретируемого почками йодида. Возникающее затем между 24 ч и 80 ч «плато» отражает уровень включенного в ДНК опухолевых клеток ЙДУР и остаточной радиоактивности выводимого йодида и может характеризо-

вать количество ДНК-синтезирующих клеток. Дальнейший медленный спад кривой (80 часов и далее) является следствием суммы нескольких процессов: «вымывание» радиоактивных метаболитов, репарация ДНК с последующим дейодировани-ем ЙДУР, клеточная смерть, приводящая к катаболизму ДНК с соответствующим высвобождением РМ. Реутилизация ЙДУР во время нормального клеточного цикла по данным Lee D. составляет менее 10% и, следовательно, уровень ЙДУР, вступившего в повторный цикл не должен привносить значительную ошибку в оценку фармакокинетики включения и задержки ЙДУР. Оценить эффективность лучевой терапии с использованием меченого ЙДУР возможно с помощью двух подходов. N,/NW/£PM 100

Время после введения '"г-йдур (ч) №/N0,5 Опухоль / интакт. зона

0 3,6

0,5 25,3

3 75,0

6 89,8

12 112,0

24 94,1

48 67,7

72 60,0

96 28,6

время (ч)

Рисунок 1. Изменение во времени уровня радиоактивности над зоной опухоли (1) и аналогичной зоной интактной лапки (2) у мышей линии С57В1/6 с привитой мелано-мой В-16 после введения 1251-ЙДУР;

N,/N0,5/ХРМ - отношение радиоактивности (имп. / мин), измеренной в момент времени t к радиоактивности через 0,5 мин после введения 1251-ЙДУР и приведенное к общему количеству введенной РМ.

При первом подходе - облучить опухоль через несколько суток после введения в организм радиоактивного ЙДУР, когда РМ в опухоли практически вся связана с ЙДУР, включенным в ДНК и оценить уровень потери ЙДУР, включившегося в опухолевые клетки. Потеря радиоактивности в опухоли после ее облучения может служить количественной мерой гибели опухолевых клеток в ответ на противоопухолевое воздействие/При втором подходе радиоактивный ЙДУР следует ввести в организм после облучения опухоли и да-

лее регистрировать уровень включения РМ в опухоль. Снижение радиоактивности в зоне опухоли в ответ на облучение будет характеризовать уровень подавления синтеза ДНК. 3.2. 011енка уровня потери из опухоли радиоактивного 5-йод-2'-дезоксиуридина, включившегося в опухоль до облучения. Принципиальная возможность оценки реакции опухоли на лучевое воздействие с помощью |251-ЙДУР, включившегося в клетки до облучения была нами показана на культуре клеток НеЬа и на перевиваемой опухоли меланома В-16. 3.2.1. Культура клеток НеЬа. Во флаконы с культурой клеток добавляли содержащую |251-ЙДУР среду из расчета 74 кБк /мл (148 КБк на флакон) и инкубировали при температуре +37°С. Спустя 44 ч - 46 ч проводили радиометрические измерения, затем клетки подвергали рентгеновскому облучению с последующей ежедневной радиометрией до 200 часов от момента мечения клеток ЙДУР-м. Облучение клеток, включивших 1251-ЙДУР, проводили различными дозами рентгеновского излучения (5 Гр, 10 Гр, 30 Гр). Данные радиометрических измерений после радиационного воздействия приводили к измеренной перед облучением образцов радиоактивности, принятой за 100%. В этом случае по снижению радиоактивности облученных клеток можно было оценить степень поражения, и рассчитать число погибших клеток. Однако в проведенных нами исследованиях дисперсионный анализ показал, что различия между данными контрольной и опытных групп недостоверны. 3.2.2. Меланома В-16. Оценку потери радиоактивного ЙДУР из опухоли после облучения мы повторили на привитой мышам линии С57 ВЬ/6 меланомы В-16. Опухоли облучали локально рентгеновским излучением в дозах 5, 10, 20, 30 Гр через 5 сут после введения 1251-ЙДУР. Снижение уровня радиоактивности можно было заметить через 1-2 суток после облучения опухолей, однако, как и в экспериментах с культурой клеток НеЬа различия между данными опытных и контрольных групп не являются достоверными (Табл.2). Можно заключить, что полученные нами результаты, при этом подходе, не позволяют достоверно судить о различиях в выведении РМ из опухоли в контрольных и облученных группах раньше чем через 6-9 дней после введения ЙДУР, что не отвечает задаче ранней оценки ответа опухоли на терапевтическое воздействие. Результаты потери радиоактивности в опухоли после ее облучения несколько занижены, то есть занижено число погибших клеток, а, следовательно, уменьшена разница между уровнями радиоактивности в контроле и опыте. Причина этого заюпо-

чается в том, что РМ, высвобождающаяся из погибших раковых клеток, в силу ряда факторов (поглощение ее в этом месте макрофагами, задержка в некротических зонах) не всегда быстро удаляется из места гибели клетки, что и приводит к искажению результатов анализа.

Таблица 2

Значения критерия Р для разницы в дисперсиях результатов измерений 1251-ЙДУР в клетках НеЬа и меланоме В-16 при рентгеновском облучении

клетки HeLa меланома В-16

Группы: Контроль, 5 Гр, 10 Гр, 30 Гр Группы: Контроль, 5 Гр, 10 Гр, 30 Гр

Дисперсия внутри-групповая Дисперсия межгрупповая F F крит. Дисперсия внутри-групповая Дисперсия межгрупповая F F крит

91,14 1,18 2,74 334,02 307,35 0,92 2,67

Ркрит. для уровня статистической значимости р< 0,05 временные точки: от 1сут до 8 сут после облучения. Ркрит. для уровня статистической значимости р< 0,05 временные точки: от 1 сут до 9 сут после облучения.

3.3. Оценка уровня включения радиоактивного 5-йод-2'-дезоксиуридина в опухоль. Наиболее адекватна разработке быстрого, чувствительного метода in vivo оценки реакции индивидуальной опухоли на противоопухолевое воздействие схема, когда опухоль облучают до введения радиоактивного ЙДУР и регистрируют уровень включения РМ в опухоль. При этом наибольший эффект достигается при введении метки в интервале 2 - 4 ч после облучения. В экспериментах использовали две разные по радиочувствительности опухоли: меланома В-16 и саркома-180. Локальное облучение меланомы В-16 проводили различными дозами рентгеновского излучения, тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в сочетании с 10BSH. Саркому-180 облучали различными дозами только рентгеновского излучения (2 Гр, 10 Гр, 20 Гр ). Динамика изменения отношений уровней радиоактивности в зоне опухоли меланомы В-16 в момент времени t (Nt) и в момент первого измерения t0 через 15 мин (0,25 ч) после введения |251-ЙДУР (No,25) для усредненных по группам однородных животных для различных доз 3-х видов облучения и для рентгеновского облучения саркомы-180 представлены на рисунке 2.

N,/N.j

\s\ \

~ Л К онтроль

|-21>

101р.

-к

— :огр. 40 Гр.

N -

80 120

время (ч)

N./Nojs

IVNuj

время (ч)

время(ч)

Рисунок 2. Изменение во времени уровня радиоактивности над зоной опухоли после введения |251-ЙДУР при локальном облучении различными дозами рентгеновского излучения меланомы В-16 (А), саркомы-180 (Б), при локальном облучении меланомы В-16 различными дозами тепловых нейтронов (В) и тепловых нейтронов в сочетании с '"ввН (Г);

N(/N0,25 - отношение радиоактивности (имп/мин), измеренной над зоной опухоли в момент времени 1 к радиоактивности через 0,25 ч после введения 1251-ЙДУР

Форма этих кривых в целом согласуется с метаболическим поведением ЙДУР: как правило, вслед за быстрым снижением радиоактивности в первые двое суток выведение РМ значительно замедляется так, что в интервале между 24 - 48 ч и 70 -80 ч на кривых возникает плато, после которого скорость выведения метки вновь немного возрастает. В некоторых случаях плато на кривой менее выражено, что особенно характерно для опухолей, облученных в больших дозах. При идентично-

сти формы кривых зависимости N,/N0,25 от I у необлученных опухолей и у опухолей, подвергнутых воздействию доз 3-х видов излучения, скорости выведения РМ различаются. При времени I более одних суток различия в скоростях выведения РМ становятся достоверными (табл.3), при этом с увеличением подводимой к опухоли дозы падает уровень оставшейся к этому времени радиоактивности. Также следует обратить внимание на различие параметров кривых N[/N0,25 для одной и той же дозы (например 2 Гр) для разных видов излучения. Уровень включения 1251-ЙДУР в опухоль на 48 ч составляет по средним данным примерно 14 - 16 % для рентгеновского облучения опухоли, 4,5 - 5 % - для тепловых нейтронов и 3 - 3,5 % - для тепловых нейтронов в сочетании с |0В8Н, что свидетельствует о разнице биологического эффекта трех видов поражающих факторов. Наличие зависимости радиометрических параметров от дозы говорит о достаточной чувствительности данного метода в использовании ЙДУР как маркера ответа опухоли и позволяет предположить возможность использования динамики РМ ЙДУР для установления количественной связи между дозой облучения и пролиферативной активностью индивидуальной опухоли.

Таблица 3

Значения критерия Рдля разницы в дисперсиях результатов измерений 1251-ЙДУР в опухолях необлученных и при их рентгеновском облучении

меланома В-16 саркома -180

Группы:Котролъ,2 Гр, 10 Гр, 20 Гр, 40Гр Группы: Контроль, 2 Гр, 10 Гр, 20 Гр

Дисперсия внутри-групповая Дисперсия меэк-групповая F F крит. Дисперсия внутри-групповая Дисперсия межгрупповая F F крит

15,06 212,37 14,1 2,866 231,05 1019,85 4,41 2,70

Б крит. для уровня статистической значимости р< 0,05 временные точки: опт 15 мин до 120 ч после введения |251-ЙДУР.

Таким образом, мы показали возможность оценки эффективности лучевой терапии с использованием меченого ЙДУР по уровню включения радиоактивного ЙДУР в опухоль, когда ЙДУР вводят в организм после облучения. В отличие от первого подхода, в этом случае достоверно установлена зависимость радиометрических параметров от дозы облучения как для разных видов излучения - рентгеновского, тепловых нейтронов и тепловых нейтронов в сочетании с |0В8Н, так и

для двух различных по радиочувствительности опухолей - меланомы В-16 и саркомы-180. Достоверное различие скоростей выведения ЙДУР из зоны опухоли при локальном воздействии на нее предполагает возможность установления количественной связи между величиной скорости выведения и дозой облучения. 3.4. Сравнительная кинетика выведения ,:!1-ЙДУР и 13,1-ЙДУР при локальном лучевом воздействии на опухоли. Применение ЙДУР, меченного только одним изотопом йода (1251), для оценки реакции опухоли иа воздействие для одного и того же животного невозможно из-за наложения радиометрических данных. Для того чтобы обойти эту проблему можно дополнительно использовать ЙДУР, меченный |3|1. Одним и тем же животным за 24 ч до облучения ввести |3|1-ЙДУР, при этом уровень измеренной радиоактивности в зоне опухоли будет соответствовать «нормальному» состоянию данной опухоли (контроль). Через 3 ч после облучения ввести |251-ЙДУР, который будет характеризовать реакцию опухоли в ответ на облучение. Прдварительно мы показали, что разница в дисперсиях величин (N/N025), для 1311-ЙДУР и |251-ЙДУР во всех временных точках является недостоверной, т.е. при исследованиях in vivo, массовое число метящего изотопа йода не оказывает влияния на кинетику выведения ЙДУР. На рисунке 3 представлены характерные кривые зависимости N,/N0.25 от t для отдельных животных.

Рисунок 3. Изменение во времени уровня радиоактивности над зоной опухоли у отдельных животных после введения 13,1-ЙДУР до облучения и 1151-ЙДУР после локального облучения меланомы В-16, привитой мышам С57В1/6, рентгеновским излучением в дозе 10 Гр;

N(/No,25 - отношение радиоактивности (имп/мин), измеренной над юной опухоли в момент времени t к радиоактивности через 0,25 ч после введения ИДУР

Результаты измерений |3|1-ЙДУР и |251-ЙДУР фиксировались в двух независимых каналах многоканального анализатора, соответствующих энергиям этих радиоизотопов. Видно, что параметры кривых выведения РМ |3|1-ЙДУР (до облучения) и |231-ЙДУР (после облучения опухолей дозой 10 Гр) из зоны опухоли существенно

время (ч)

различаются даже при наличии вариабельности уровней радиоактивности, которая отражает индивидуальную реакцию опухолей, привитых сингенным животным и связана с различным балансом в них двух независимых процессов: синтезом ДНК и индукцией апоптоза. Проведенный дисперсионный анализ совокупностей параметров этих кривых показал достоверность различий их парных вариант, начиная с 10 ч (Р=3,09 при Ркрит. =1,56 для р< 0,05 и п (количество животных) =25).

На основании полученных данных можно заключить, что применение ЙДУР, меченного двумя различными радиоизотопами йода, позволяет оценить реакцию опухоли на облучение для каждого отдельного животного, то есть индивидуальную реакцию организма. При этом методика прижизненного определения параметров, характеризующих кинетику выведения меченного радиоизотопами йода ЙДУР, при воздействии на опухоль различными дозами облучения обладает удовлетворительной разрешающей способностью.

В главе 4 рассмотрены параметры выведения 5-йод-2'-дезоксиуридина и Ыа+125Г и предложена методика оценки реакции опухоли на облучение. Особенности метаболизма ЙДУР указывают на то, что в первые 70 - 80 часов после инъекции этого соединения мы имеем дело с суперпозицией двух основных процессов: выведение продуктов трансформации ЙДУР (главным образом йодида) и включение ЙДУР в опухолевые клетки (что является показателем изменения активности синтеза ДНК опухолевых клеток). Разделение этих процессов, а таюке определение параметров последнего позволило нам дать количественную оценку изменения синтеза ДНК при противоопухолевом воздействии. 4.1. Сравнение выведения меченого йодида в форме Л'я'7~ и 5-йод-2'-ЙДУР ш зоны опухоли. Ранее упоминалось, что одним из основных продуктов трансформации ЙДУР является свободный йо-дид-ион. Несмотря на то, что количество йодида-иона не превышает 3-7% от исходного количества ЙДУР, но его влияние должно в некоторой степени сказываться на результатах измерений РМ внешним детектором и, следовательно, необходимо оценить вклад йодид-иона в суммарный процесс. Проведенные эксперименты с использованием Ыа1, меченного |251, показали, что параметры выведения РМ из зоны опухоли зависят от величины радиационного воздействия. Несмотря на то, что эта зависимость менее выражена, чем при введении ЙДУР (рис.4), ее существование не позволяет напрямую, без должного анализа, вычленить из получаемых

при радиометрии ЙДУР данных радиоактивность, относящуюся к иодиду. Следовательно, встает вопрос о сравнении параметров экспериментальных кривых в том и другом случае, и одним из возможных решений этого вопроса является применение метода моделирования. Для этого необходимо по отдельным точкам реконструировать ход всей кривой или интересующего нас участка и подобрать аппроксимирующую функцию с наиболее близким приближением. Далее - выделить параметры, характеризующие отдельные процессы, и использовать полученные параметры моделей для предсказания изменения уровня ЙДУР в ДНК опухолевых клеток.

Рисунок 4. Изменение во времени уровня радиоактивности над зоной опухоли меланома В-16 привитой мышам С57Ш/6

- при введении '"1-ЙДУР: без облучения (1), после рентгеновского облучения дозой 20 Гр (3);

- при введении Иа'!51: без облучения (2), после рентгеновского облучения дозой 20 Гр. (4);

N(/N0,25 - отношение радиоактивности (ими/мин), измеренной над зоной опухоли в момент времени I к радиоактивности через 0,25 ч после введения га1-ЙДУР или N3'"!

время (ч)

Математический анализ кривых выхода РМ Nal (N,/ N0.25 от t) из опухоли как для контроля, так и для различных режимов облучения показал, что эти кривые хорошо аппроксимируются функцией вида: Y =А*е"ах + В*е"Ьх (коэффициент детерминации г2=93 + 98 при 95% достоверности). Оценка параметров моделей для приближения экспериментальных данных производилась с помощью нелинейного метода наименьших квадратов. Ход кривой определялся по 1(Ь-11 точкам при 8-42 значениях на каждую. Такое двухфазное падение величины Nt/ N0,25 отражает процесс выведения из зоны опухоли свободного йодида (быстрая - вторая экспонента). Клиренс остаточной радиоактивности является быстрым, поскольку обусловлен активностью главного продукта трансформации ЙДУР - йодида. Первая экспонента - медленная - отражает выведение йодида «условно связанного», то есть всту-

пившего в обменные процессы большей частью представлена кислоторастворимой фракцией йодированного белка плазмы. Напомним, что щитовидная железа животных во время проведения экспериментов блокирована нерадиоактивным йодом и не может депонировать радиоактивный йод. Кривая изменения РМ (Nt/N0.25 от времени) в опухолевой зоне при введении меченого ЙДУР имеет более сложную форму, чем аналогичная зависимость, полученная при введении Nal. Однако, как показал анализ экспериментальных данных, в интервале от 0,25 до 72 часов также проявляются две основные фазы, и оба эти участка аппроксимируются экспоненциальными функциями с высокой степенью соответствия (г2=96-^98 при 95% достоверности). Эмпирические формулы при обработке результатов каждого эксперимента находились по 8-И0 значениям на каждую из 11-И2 пар зависимых величин. В фармакокинетических исследованиях при оценке степени изменения количества препарата в тканях используется такой параметр как площадь под фармакоки-нетической кривой (AUC) «концентрация-время» - интегральный параметр пропорциональный общему количеству лекарственного средства в организме. Мы использовали площадь под фармакокинетической кривой в качестве условной количественной характеристики содержания меченого йодида и ЙДУР в зоне опухоли. Математическая величина площади (S) равна интегралу аппроксимирующей функции или, в нашем случае, сумме двух интегралов экспоненциальных функций в интервале от 0,25 ч до 72 ч. Выбор данного временного интервала обусловлен удержанием в опухоли включенного в ДНК ЙДУР (Гл.З).

72 72

S£) = J A*e"atdt + JВ*еы dt = S (1) + S (2), где

0,25 0,25

S(£) - площадь под суммарной кривой N,/N0.25 отражает совокупный процесс выведения РМ; S (1) = А/а * (е 'а*0'25 - е"а*72) - площадь под медленной экспонен-той; S(2) = B/b * (е 'ь*0,25 - е'"ь*72) - площадь под быстрой экспонентой.

Следует отметить, что при радиометрии in vivo практически невозможно регистрировать уровень радиоактивности только опухоли, поскольку на результаты радиометрии влияет также РМ, содержащаяся в органах и тканях, непосредственно находящихся в зоне «видимости» детектора (кожа, бедренная кость), и РМ прилегающей к опухоли ткани. При нормировании значений радиометрических данных к их контрольному значению, влияние этого фактора сказывается в меньшей сте-

пени, чем для абсолютных значений. Кроме того, нахождение относительных значений позволяет оценить влияние доз облучения на индивидуальную реакцию опухоли. Поэтому, учитывая вышесказанное, вместо абсолютной величины площади под кривой выхода РМ мы использовали относительное изменение площади, условно обозначив его коэффициентом W. Коэффициент W рассчитывается как: 1. W£(d/0) = S(]T)d / S(Y) ц - отношение площади под общей кривой выхода РМ при облучении опухоли дозами 2, 10, 20 или 40 Гр [S(£)d ] к соответствующей площади РМ контроля [S(V) о 12. Wl(d/0) = S(l)d / S(l)o - отношение площади под первой экспонентой при облучении опухоли дозами 2, 10, 20 или 40 Гр [S(l )j ] к соответствующей площади контроля [S(l)0].

3. W2(d/0) = S(2)d / S(2)0 - отношение площади под второй экспонентой при облучении опухоли дозами 2, 10, 20 или 40 Гр [S(2)d ] к соответствующей площади контроля [S(2)0].

Согласно описанной в главе 2 технике проведения экспериментов при оценке изменения радиоактивности в зоне опухоли для индивидуальных животных использовали одну группу животных с последовательным введением двух разноме-ченных ЙДУР: РМ |3|1 (контроль до облучения) и РМ |251 (параметр после облучения). В ходе исследований было установлено, что параметры быстрых экспонент кривых выведения РМ ЙДУР из меланомыВ-16, саркомы-180 и свободного йодида из меланомы В-16 для одних и тех же доз облучения идентичны.

Это позволяет расценивать процесс, описываемый 2-ой экспонентой, как процесс выведения из зоны опухоли основного продукта, возникающего при метаболизме ЙДУР, - свободного йодида, что согласуется с литературными данными по метаболизму ЙДУР. Ниже (Табл.4) приведены коэффициенты W2(d/0) (средние по 8 экспериментам) полученные в исследованиях с использованием ЙДУР и Nal.

Таблица 4

Относительное изменение площади [W 2(d/0)] под быстрой экспонентой при рентгеновском облучении опухоли

W 2(d/0)% 2 Гр 10 Гр 20 Гр 40 Гр

Nal меланома В-16 98,7 ±4,3 84,3 ± 3,8 77,9 ±2,1 75,4 ±1,5

ЙДУР меланома В-16 97 ±3,6 83 ±2,5 78,9 ±2,0 76 ±2,8

ЙДУР саркома-180 98,2 ±3,8 84,9 ±3,6 76,3 ±3,7

Участок кривой, описываемый медленной экспонентой, представляет для нас наибольший интерес, поскольку именно он, как мы полагаем, отражает динамику уровня радиоактивности в опухоли, связанную с ДНК, а 8ЙДУР (1) соответственно - количество ЙДУР, включенного в ДНК опухолевых клеток в интервале времени от 15 минут до 72 часов. В это время ЙДУР связан с ДНК опухоли и где он удерживается при медленном клиренсе в течение 1- 4 суток. Для того чтобы оценить вклад РМ, связанной с медленной экспонентой, в измеряемую в зоне опухоли радиоактивность, при воздействии каждой дозы мы использовали отношение площади под первой экспонентой к площади под суммарной кривой выхода РМ. W(l/£) = Wl[0,2. lo, го, 40] / W£[o,2, ю.20,40]. Вычисление коэффициентов W для каждой дозы позволило установить, что при введении в организм Nal процент «условно связанного» йодида W(l/V), находящегося в опухолевой зоне, по отношению к общему количеству йодида в радиометрируемой области является постоянной величиной, не зависящей от дозы рентгеновского облучения и равен 17%. При использовании ЙДУР существует зависимость коэффициента W(l/£)d ЙДУР от дозы радиационного воздействия, при которой коэффициент уменьшается с 39% в контроле (без облучения) до 33%, 28%, 23%, и 17% при рентгеновском облучении меланомы В-16 в дозах 2, 10, 20, и 40 Гр соответственно. Критерии достоверности различий величин W(l/£)d между группами, равные 7,35; 8,95; 8,54; 21,64, значительно превосходят свое критическое значение t=2,30, что говорит о статистически значимых отличиях полученных данных. (Число степеней свободы определяли по формуле для малых выборок. Уровень статистической значимости р< 0,05). При рентгеновском облучении саркомы-180 дозами 2, 10 и 20 Гр значения коэффициента W(l/Z)d ЙДУР таюке различаются с высокой степенью достоверности и составили: 29%, 24%, 16%. Следовательно, надо полагать, что W(l/£) равный 17% - это вклад радиоактивности, которая не связана с синтезом ДНК, а является результатом метаболизма йодида, образующегося в процессе распада ЙДУР.

Таким образом, участок кривой выведения РМ ЙДУР из зоны опухоли характеризующийся медленной экспонентой отражает совокупную РМ как ЙДУР включенного в ДНК опухоли, так и количество РМ «условно связанного» йодида (или продуктов его трансформации), который задерживается в области радиометрического измерения.

4.2. Количественная in vivo оценка включения 5-йод-2'-ЙДУР в ДНК опухолевых клеток. Если наша гипотеза верна, и уровень изменения количества ЙДУР в ДНК опухолевых клеток модельно можно представить через изменение площади под первой экспонентой кривой N/N 0,25 во времени, то необходимо выполнение двух основных условий: первое - значение подинтегралыюй функции не должно существенно меняться в интервале от 0,25 до 72 часов, поскольку не должно существенно меняться количество ЙДУР, включенного в ДНК, на протяжении первых 70 - 80 часов после введения ЙДУР (в дальнейшем возможно увеличение скорости выведения РМ за счет дейодировання ДНК при гибели клеток вследствие облучения); второе - должна существовать зависимость величины коэффициента Wl(d/0) ЙДУР от дозы облучения опухоли аналогичная зависимости уровня синтеза ДНК от дозы облучения.

Рассчитанное значение скорости убывания функции медленной экспоненты для временного участка от 0,25 до 72 часов, равное приращению этой функции (dy/dt=0,2) указывает на то, что в заданном временном интервале скорость убывания является несущественной и будет приближаться к постоянной величине, оставаясь меньше ее. Что касается выполнения второго условия, то здесь прослеживается четкая закономерность снижения коэффициента Wl(d/0) ЙДУР при увеличении подводимой к опухоли дозы. Ниже (Табл. 5) приведены значения доз и соответствующие им значения коэффициентов Wl(d/0), усредненных по 5 экспериментам для рентгеновского облучения, облучения тепловыми нейтронами и комбинации облучения тепловыми нейтронами с введением бор-содержащего соединения 10BSH.

Таким образом, предложенный нами коэффициент Wl(d/0) отвечает двум основным требованиям, предъявляемым к модельным параметрам, характеризующим уровень изменения синтеза ДНК в опухоли. Данные, полученные в результате in vivo измерений, практически идентичны результатам, полученным из выделенной ДНК опухолевых клеток, т.е. значения коэффициентов Wl(d/0) для рентгеновского излучения соответствуют содержанию 1251-ЙДУР в выделенной опухолевой ДНК (Рис.5). Разница же между параметрами Wl(d/0) и количеством ЙДУР в выделенной ДНК для каждой дозы воздействия представляет собой величину, определяемую нами как количество «связанного» йодида.

Таблица 5

Влияние дозы облучения на коэффициент относительного изменения площади ___под медленной экспонентом (\У1(с1/0) __

Мелаиома В-16 Саркома - 180

Рентгеновское Облучение тепло- 'таН-Н Рентгеновское

облучение выми нейтронами Нейтронное облучение

облучение

Доза \У1((1/0) Доза \У1((1/0) Доза \У1((1/0) Доза \У1(с1/0)

(Гр) (%) (Гр) (%) (Гр) (%) (Гр) (%)

2 78,4 ±4,1 0,51 84,66 ± 4,9 0,21 62,41 ± 3,1 2 75,54 ±3,4

1,19 68,20 ± 3,0 0,79 51,32 ± 3,2

10 53,9±3,4 2,04 49,25 ± 3,2 1,09 49,78 ± 1,3 10 51,0±2,3

2,93 41,28 ± 3,8 1,55 44,60 ± 1,4

20 39,6±3,1 5,44 31,47 ± 1,7 2,76 32,23 ± 2,1 20 28,6 ±2,1

8,94 27,79 ± 2,0 5,39 12,38 ± 1,2

40 19,9±1,04 6,07 12,15 ± 1,3

9,62 11,80 ± 0,9

Основываясь на проведенном анализе полученных экспериментальных данных, можно сказать, что предложенный нами параметр W 1(с1/0) связан с количеством ИДУР, включенного в ДНК опухолевых клеток, отражает степень изменения про-лиферативной активности злокачественного новообразования и может рассматриваться как условная характеристика подавления синтеза ДНК индивидуальной опухоли, а зависимость \У1((1/0) от дозы - как зависимость ДОЗА — ЭФФЕКТ.

"/• включения '-"Ч-ГЩУР

Рисунок 5. Зависимость уровня включения 1251-ЙДУР в ДНК меланомы В-16 от дозы рентгеновского облучения

1 - значение параметра \У1((1/0);

2 - выделенная ДНК опухолевых клеток (48 ч после введения ,251-ЙДУР)

дот (Гр)

Поскольку вычисление коэффициента \У1 для экспресс-ответа индивидуальной опухоли на противоопухолевое воздействие достаточно громоздко, целесообразно

найти связь между этим коэффициентом и параметрами, характеризующими суммарный процесс, регистрируемый нами с помощью внешнего детектора. 4.3. Параметры включения ЙДУР для in vivo оценки уровня синтеза ДНК опухолевых клеток. В заданном временном интервале количество РМ, измеряемой в зоне опухоли, может быть выражено как площадь под кривой N,/No, то есть

t2

S=ÍN(t)dt, ti

Зависимость N от t (N= N,/No) в интервале времени 0,25 ч - 48 ч носит экспоненциальный характер, который сохраняется при всех изученных видах облучения опухоли: рентгеновском, облучении тепловыми нейтронами и при сочетанном действии тепловых нейтронов с бор-содержащим препаратом. В таком случае N(t) можно выразить через ее производную по времени [N'] и угловой коэффициент кривой [tg(a)], поскольку в полулогарифмическом масштабе экспонента представляет собой прямую линию с углом наклона к оси абсцисс, равным a. tg(a) = dY/dt = d lnN(t)/dt = l/N*dN(t)/dt = l/N*N'(t) Полученный параметр функционально связан с количеством РМ в зоне опухоли и, кроме того, просто и легко вычисляется в процессе радиометрии по формуле:

tg(a) = [lnN(t,)-lnN(t2)]/(t,-t2), где N(ti) и N(t2) - величина измеряемой радиоактивности для времени 0,25 и соответственно 24 или 48 часов (рис.3). Далее, взяв отношения угловых коэффициентов кривых выведения РМ у животных с облученной опухолью к их контрольным значениям до облучения [tg(a) выведения РМ |251-ЙДУР / tg(a) выведения РМ |3|1-ЙДУР] и обозначив его К, мы получаем параметр, который отражает уровень изменения включения ЙДУР в опухоль при воздействии на нее.

[ln N(t,)-ln N(t2)] (|251-ЙДУР)

К=--(1)

[ln N(ti)-In N(t2)] ( I-ЙДУР)

Графическое исследование корреляционных полей значений параметров Wl(d/0), отражающих степень изменения пролиферативной активности злокачественного новообразования и коэффициента К, который рассчитывается непосредственно по результатам радиометрии in vivo в первые двое суток после введения ЙДУР, выявило, что эти поля концентрируются вокруг линии связи, которая на графике в логарифмическом масштабе - прямая линия и наиболее точно регрессионное уравнение описывается степенной функцией: Wl(d/0) = А* К^" Ь\ где А и

Ь - регрессионные коэффициенты. Степень соответствия индивидуальных значений АУ1(с1/0) и К линии регрессии, определяющаяся коэффициентом корреляции Пирсона (гху), стандартная ошибка оценки (зг), а также расчетные значения коэффициентов регрессии для каждой из указанных доз радиационного воздействия приведены в следующей таблице:

Таблица 6

Коэффициенты уравнений регрессии между коррелирующими признаками \¥1(с1/0) и К для рентгеновского облучения меланомы В-16

Доза (Гр) А Ь коэффициент корреляции l"xv стандартная ошибка оценки sr

2 98,9 -1,96 0,89 0,03

10 102,8 -2,16 0,94 0,05

20 111,9 -2,32 0,98 0,056

40 100,1 -2,26 0,96 0,06

р< 0,05 п= 15+18 наточку Wl(d/0) = А* К("Ь)

Монотонность зависимости факторов, показанных для отдельных животных, как для крайних точек, так и для точек внутри дозового диапазона, позволяет интерполировать данную зависимость на весь изучаемый диапазон. На рисунке 6 представлено корреляционное поле индивидуальных значений ^ЛЩсУО) и К для 64 животных при облучении меланомы В-16 рентгеновским излучением в диапазоне доз от 2 до 40 Гр. Уравнение линии регрессии определяется следующей формулой: \У1((1/0) = 109,9*К("2'37) или 1п \У1(с1/0) = 1п 109,9-2.37 * 1п К.

Рисунок 6. Корреляционное поле индивидуальных значений \У1((1/0) и К = tga(D)/tga(0) при локальном облучении меланомы В-16 привитой мышам С57В1/6, различными дозами рентгеновского излучения;

- линия регрессии

....... доверительные границы

линии регрессии

А , ■ облучение опухоли в дозах 2, 10,20,40 Гр.

Вычисленные коэффициенты уравнений регрессии между коррелированными признаками для рентгеновского, нейтронного и сочетанного бор-нейтронного облучения меланомы В-16, а также для рентгеновского облучения саркомы-180 (Табл. 7) указывают на сильную, близкую к функциональной, связь этих признаков, причем, независимую как от типа радиационного воздействия, так и от штамма опухоли. Уравнение линии регрессии определяется следующей формулой: Wl(d/0) = 113,6*К^ 2,481 Данное выражение получено при анализе 96 пар коррелирующих признаков, коэффициент корреляции гху=0,98 при уровне статистической значимости р< 0,05.

Таблица 7

Коэффициенты уравнений регрессии меледу коррелирующими признаками __ Wl(d/0) и К__

Вид излучения Диапазон доз (Гр) А b коэффициент корреляции г1у стандартная ошибка оценки sr

Рентгеновское (меланома В-16) 2 -МО 109,9 -2,4 0,98 0,054

Нейтронное (меланома В-16) 0,51 -ь 8,9 112,3 -2,1 0,99 0,059

10BSH + нейтронное (меланома В-16) 0,21 + 9,5 120,9 -2,6 0,98 0,085

Рентгеновское (саркома -180) 2 -5- 20 103,6 -2,1 0,96 0,08

р< 0,05 Wl(d/0) = А* К(*Ь)

Использование аппроксимации и уменьшение числа экспериментальных точек, безусловно, несколько снижает точность конечных результатов по сравнению с результатами, получаемыми при использовании предложенного нами ранее модельного параметра Wl(d/0), но такое упрощение позволяет довольно быстро и просто получить необходимые сведения для расчетов количественной оценки реакции опухоли на облучение.

Взаимосвязь параметров Wl(d/0) и К при некоторых допущениях может быть представлена функциональной зависимостью. Поскольку изменение уровня радиоактивности N(t) в интервале времени 0,25 ч - 72 ч носит экспоненциальный характер, то: N(t)d =А*е'а1 (|251-ЙДУР), N(t)0 =AV" (1311-ЙДУР), а отношение угловых коэффициентов К = ad/an- Тогда, исходя из того, что площадь под медленной экс-понентой Siwyp(l) = А/а *(е "а*0'25 - е"а*72), параметр Wl(d/0) = S(l)d / S(l)0 и обо-

значив I = 0,25 ч - через 0, а I = 72 ч - через Т , мы получаем следующее уравнение: XV 1 (ё/0) = [Аа*а0 / А0*аа] * [(1 - е-3"1'1) / (1 - е'а0*т)] (2)

Поскольку значение Т велико, то различие между значениями е'аа*т и е"ао*т будет мало, вследствие чего второй член уравнения (2) примерно равен 1, т.е. [(1 - е"а(1*т) / (1 - е~а0*т)] = 1. Приняв эти условия, уравнение (2) будет выглядеть так: \У1(с1/0)=[А1,*а0 / А0*аи]= (А„ / А0) * (1/К) (3)

Или: 1п \У 1(11/0) = 1п (Ай / А0) - 1п К, что согласуется с уравнением линии регрессии, полученной при исследовании корреляционных полей.

Таким образом, нами определена количественная взаимосвязь параметра \¥1(с1/0), отражающего степень изменения пролиферативной активности злокачественной опухоли с коэффициентом К, который рассчитывается непосредственно по результатам радиометрии с помощью внешних детекторов в первые двое суток после введения ЙДУР. Кроме того, независимость параметров корреляционного уравнения между \У1(<1/0) и К от типа облучения позволяет сделать вывод, о возможности применения коэффициента К при любом противоопухолевом воздействии, поскольку фактически отражает сохранившийся уровень синтеза ДНК опухолевых клеток.

Глава 5 посвящена практическому использованию разработанных параметров для прогнозирования динамики роста опухоли после терапевтического воздействия.

Для оценки реакции опухоли на лучевое воздействие были изучены закономерности роста опухоли в зависимости от дозы рентгеновского, нейтронного и комбинации нейтронного облучения с 10В8Н для меланомы В-16 и для различных доз рентгеновского облучения саркомы-180. Усредненные данные некоторых экспериментов по динамике роста опухоли (У(/У0) во времени для различных доз исследуемых излучений представлены на рисунке 7.

5.1. Влияние облучения на параметры роста опухолей. Кинетика роста опухоли является важным показателем как для диагностики, так и для процесса лечения в ходе терапии опухолевых новообразований. От нее в значительной степени зависит эффективность терапевтических методов лечения и, в том числе, эффективность лучевой терапии. Для оценки реакции опухоли на лучевое воздействие достаточно часто используются такие параметры как продолжительность задержки роста опухоли Т(3) и время дорастания опухоли до двойного объема Т(Дор).

В) VyV0

время (сут)

Рисунок 7. Динамика роста опухоли от момента ее облучения:

облучение меланомы В-16 тепловыми нейтронами - (А);

облучение меланомы В-16 тепловыми нейтронами в сочетании с '"BSH (Б); рентгеновское облучение саркомы - 180 - (В). YV'Vq (%) - отношение объемов опухоли в момент времени t к ее объему на момент облучения; время (сутки) рассчитано от начала облучения.

0 В 16 24

время (еут)

При использовании этих критериев строятся кривые в координатах доза - время дорастания до определенного объема или время задержки роста опухоли. Форма полученных кривых дает возможность судить об относительной радиочувствительности субпопуляций клеток в опухоли и, вместе с тем, служит для оценки данных биологической эффективности излучений. Кроме того, для характеристики доли объема опухоли, клетки которой сохранили способность к пролиферации после лучевого воздействия, нами был разработан параметр М=[\уУ0 (О)] / [\уУо (0)].

Параметр М и его оценка.

Параметр М представляет собой отношение нормированных к начальным величинам объемов (облученных [У/Уо (Э)] и необлученных [У1/У0(0)]) опухолей на экспоненциальных участках кривых возобновленного после облучения роста опухолей. Он характеризует долю объема опухоли, клетки которого сохранили способность к пролиферации после облучения (условно говоря, доля «выжившего» после облучения объема опухоли). К этому утверждению приводят следующие рассуждения:

Полный объем экспоненциально растущей опухоли после однократного облучения можно описать уравнением:

V = Уо (1- е "аС). е"а + Уо е "а0 . е ф1 , где (4)

Уо - объем опухоли на момент облучения; Б - поглощенная доза; I - время от начала облучения;

а - коэффициент, характеризующий зависимость между дозой и объемом опухоли, клетки которого сохранили способность к пролиферации после облучения; Уо (1- е "а0) - объем опухоли, клетки которого получили нерепарируемые повреждения, будут гибнуть и выбывать из опухоли;

е - коэффициент, характеризующий скорость уменьшения объема опухоли за счет клеток, потерявших способность к пролиферации после облучения; Ф - коэффициент, характеризующий скорость увеличения объема опухоли за счет прироста количества клеток, сохранивших способность к пролиферации после облучения;

Уое"аС - объем опухоли, клетки которого сохранили способность к пролиферации и с которого возобновляется рост опухоли после облучения («выживший» объем).

Первый член уравнения (4) характеризует объем опухоли, связанный с убыванием клеток, потерявших способность к пролиферации в результате облучения. Второй член уравнения (4) характеризует объем опухоли, связанный с приростом клеток, сохранивших способность к пролиферации после облучения. Через некоторое, зависящее от дозы время, когда процесс роста опухоли значительно превалирует над процессом выведения погибших клеток влияние процесса убыли клеток на общий объем опухоли, т.е. первый член уравнения (4), снижается до величин, которыми можно пренебречь. С этого момента кривая роста опухоли будет характеризоваться вторым членом уравнения (4). Для определения объема опухоли клетки которого после облучения сохранили способность к пролиферации, или объема опухоли с которого возобновляется ее рост после облучения, достаточно определить показатель ф. Поскольку показатель ф - угловой коэффициент экспоненциальной кривой возобновленного после облучения роста опухоли - является угловым коэффициентом кривой роста, построенной в полулогарифмических координатах (по оси ординат - объем опухоли), то на практике определить этот объем

можно путем экстраполяции экспоненциального участка кривой до пересечения с полулогарифмической осью ординаты. Отрезок, отсекаемый на оси ординат, и будет характеризовать объем опухоли, клетки которого остались жизнеспособными после облучения. Наиболее удобно такие расчеты проводить по кривым, построенным для нормированных к начальным величинам объемов. Тогда отсекаемая на ординате величина указывает долю объема, клетки которого сохранили способность к пролиферации после облучения. Эта доля «выжившего» объема опухоли фактически соответствует доле выживших после облучения клеток (Рис.8).

Рисунок 8. Динамика роста мелаиомы В-16 после ее рентгеновского облучения.

У/Уц (%) - отношение объемов опухоли в момент времени 1 к ее объему на момент облучения; время (сутки) рассчитано от начала облучения.

Для определения предложенным способом доли «выжившего» объема опухоли не требуется построение кривой роста контрольных (необлученных) опухолей. Достаточно знать объем опухоли на момент облучения данной дозой. Однако в этом случае не будут учтены возможные влияния различных факторов, связанных с проведением экспериментов в разное время, на разных группах животных, с использованием опухоли от разных пассажей и т.п.

Для того чтобы нивелировать ошибки, обусловленные вышеперечисленными факторами, при определении доли «выжившего» объема опухоли мы использовали отношения объемов облученных опухолей, нормированных к начальным величинам объемов в контроле: [У,/У0(В)]/[\7У0(0)] (5), и назвали это отношение параметром «М». В случае равенства скоростей роста опухолей в контроле и возобновленного роста опухолей после облучения, эти отношения на экспоненциальном участке кривых роста постоянны для данной дозы и не зависят от времени. Величину М для каждой дозы вычисляли из экспериментально найденных отношений [У,/У0 (В)]/р/,/У0 (0)] как среднее значение для не-

время (сут)

скольких временных точек на участках экспоненциального роста опухолей. Эту величину в дальнейшем использовали для построения кривой ДОЗА—ЭФФЕКТ.

Кривые ДОЗА — ЭФФЕКТ по параметру Т(з) для трех вышеуказанных типов излучения представлены на рисунке 9. Кривые достаточно хорошо описываются линейной зависимостью (г=0,92-0,96). Из сравнения этих зависимостей в рабочем диапазоне доз 2 9,5 Гр находим, что биологический эффект воздействия тепловых нейтронов в сравнении с рентгеновским излучением составляет 3,7 + 3,8, тогда как тепловых нейтронов в сочетании с 10В8Н - 4,5 + 4,7.

Различия в 1,5-2 раза в степени воздействия рентгеновского излучения на сар-кому-180 по сравнению с меланомой В-16 отражает представленная на том же рисунке зависимость Т(), от дозы облучения, такое различие вполне характерно для саркомы, как более резистентной опухоли.

ДОЗА (Гр.) ••T(,„)=l,71 *D + 3,U77 п=30 г=0,97

2.T(„|=1,4SS*D +1,28 п=29 1=0,96

3.T(1„,=0J) *D +0,36 n=")0 r=0,95

4.T„„,=0,163*D + 1,43 n=72 r=0,92

Рисунок 9. Зависимость T(1M| от дозы локального облучения мелаиомы В-16 (1,2,3) и саркомы-180 (4)

1. Тепловые нейтроны в сочетании с '0BSIl (3-5 мкг В/г опухоли)

2. Тепловые нейтроны (1,2-Ю8 н/см2 сек)

3. Рентгеновское излучение (200 кВ)

4. Рентгеновское излучение (200 кВ)

0,00

0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 5( ДО)Л(Гр.)

1.TW-I,410 Ч> + 3,567 п=30 г-0,85

2.Twl=l,I48 »D +3.242 n=29 r=(>,87

3. Тс,,,,, -0,452 *D + 3,333 n-90 r-0,89

4. Tg,,,, =0,259 *D +3,448 n-72 r=0,9

Рисунок 10. Зависимость Т(лор) от дозы локального облучения меланомы В-16 (1,23) и саркомы-180 (4)

1. Тепловые нейтроны в сочетании с l0BSH (3-5 мкг В/г опухоли)

2. Тепловые нейтроны (1,2-108 н/см2 сек)

3. Рентгеновское излучение (200 кВ)

4. Рентгеновское излучение (200 кВ)

Кривые ДОЗА — Т(дор)(рис. 10) тех же животных также имеют вид линейных зависимостей (г = 0,85-0,90). Биологический эффект действия облучения на опухоль в

том же диапазоне доз 2 + 9,5 Гр по отношению к рентгеновскому излучению для тепловых нейтронов составляет 3,03 + 3,3, и действия тепловых нейтронов в сочетании с |0В8Н - 4,2 - 4,0.

Предложенный ранее параметр М может быть показателем жизнеспособности опухоли, поскольку, как уже отмечалось, на участке экспоненциального роста опухоли после ее облучения этот параметр характеризует долю объема опухоли, клетки которого сохранили способность к пролиферации. В таком случае кривая ДОЗА — 1п М в сущности соответствует кривой ДОЗА — доля выживших клеток.

Как видно из представленных на рисунке 11 графиков, параметр М для каждого типа излучения зависит от дозы. При облучении тепловыми нейтронами (2) и в сочетании тепловых нейтронов с '"ВБН (1) эта зависимость носит практически линейный характер, а кривая выживаемости не имеет плеча. Это отражает влияние излучения с высокой линейной потерей энергии и указывает на то, что клетки ме-ланомы В-16 не восстанавливаются от сублетальных повреждений при этих видах облучения. Кривая выживаемости в этом случае представляется простым экспоненциальным уравнением М(Б) = е При рентгеновском облучении кривая выживаемости имеет плечо и представляет зависимость вида: М(Э) = 1 - (1- е "кп'[>)"; где к„ - постоянная инактивации каждой из п мишеней, которые все должны быть поражены, чтобы убить клетку.

Рисунок 11. Зависимость М от дозы локального облучения меланомы В-16, привитой мышам С57В1/6, рентгеновским излучением, тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в сочетании с '"ВЙН

1. Тепловые нейтроны в сочетании с '"ВвН (3-5 мкг В/г опухоли)

2. Тепловые нейтроны (1,2-Ю8 п/с.м2 сек)

3. Рентгеновское излучение (200 кВ)

Параметр М = [У1/У0ф)|/[У1/У0(0)| - отношение нормированных на начальные величины объемов облученных опухолей к таковым без облучения на экспоненциальном участке роста опухоли после воздействия.

2. М=е п=29 г=0,89

3.М=1-(1-е "■"")''' п=69 г-О.ОЗ

Среднюю инактивирующую дозу О0 (величина обратная к) для каждого типа излучения находили из соответствующих дозовых кривых М — поглощенная доза. При

рентгеновском облучении М(О) = 1 - (1- е "0,°6*с>)1''; при облучении тепловыми нейтронами Мф) = е ~0,25'0; при облучении тепловыми нейтронами в сочетании с 10В8Н М(О) = с -°'36,в

Значения 0(1, найденные из решения уравнений кривых ДОЗА — 1пМ для каждого вида излучения, составили:

рентгеновское излучение 16,6 Гр

тепловые нейтроны 4,0 Гр

тепловые нейтроны + 10В8Н 2,8 Гр

Путем сравнения величин Оп определили биологический эффект действия облучения на опухоль. Так, для тепловых нейтронов и тепловых нейтронов с 10В8Н по отношению к рентгеновскому излучению значения биологического эффекта составили 4,2 и 6, соответственно.

Влияние различных доз облучения опухоли на изменение предложенного в главе 4 параметра К проиллюстрировано на рисунке 12, где представлены усредненные кривые изменения значения К при действии на опухоль трех видов излучения.

к

3,00 2,50 2,00 1,50 1,00

ш

Г1 ы ы

ы

г

Рисунок 12. Зависимость К=

от дозы локального облучения меланомы

В-16 (1,2,3) и саркомы-180 (4)

1. Тепловые нейтроны в сочетании с "'В8Н (3-5 мкг В/г опухоли)

2. Тепловые нейтроны (1,2-108 и/см2 сек)

3. Рентгеновское излучение (200 кВ)

4. Рентгеновское излучение (200 кВ)

0,00 10,00 20,00

ДОЗА (Гр.)

1. К-1 л *0 11=30 г=0,92

2. К-1,209 ЮМ п-29 г=0,97

3. К-0,902 •и ЮМ »-90 г-0,97

4. К=0,98 *0 и,14 п-72 г=0,94

30,00 40,00

50,

Анализ полученных данных показал, что: 1. в исследуемых нами диапазонах доз отношение угловых коэффициентов К от дозы наиболее точно описывается степенной зависимостью К = С*ЭГ; 2. значения коэффициента Г идентичны таковым для рентгеновского облучения меланомы В-16, облучения тепловыми нейтронами и тепловыми нейтроны в сочетании с |0В8Н. Определенный по этому пара-

метру биологический эффект действия на опухоль облучения тепловыми нейтронами составил по отношению к рентгеновскому излучению 3,15+3,5 и действия тепловых нейтронов в сочетании с 10BSH - 5,5 •*■ 6,0.

По приведенным в этом разделе данным видно, что биологический эффект облучения опухоли варьирует в достаточно широких пределах в зависимости от способа оценки. Кроме того, при бинарной терапии, например при облучении опухоли тепловыми нейтронами в присутствии бор-содержащего соединения, на биологический эффект будет влиять химическая структура и внутриклеточная локализация применяемого соединения.

5.2. Взаимосвязь роста опухоли и параметров выведения ЙДУР.

В данном разделе рассматривается возможность использования параметров, связанных со скоростью выведения радиоактивного ЙДУР из опухоли, в качестве показателей, характеризующих ответ индивидуальной опухоли на облучение.

В качестве показателя изменения уровня радиоактивности ЙДУР во времени ранее нами был принят параметр К= [In N(ti)-ln N(t2)] / (trt2). С его помощью можно дать количественную оценку эффективности применения лучевой терапии для индивидуальных животных. Для этого с помощью регрессионного анализа определили количественную взаимосвязь между параметрами, характеризующими реакцию опухоли на облучение (Т(3) или Т(ДОр)), с параметром, характеризующим скорость выведения РМ ЙДУР из зоны опухоли (К). Графическое исследование корреляционных полей значений Т(Л0р), Т(]) и К показало, что наиболее точно условия связи параметров отражает уравнение в виде экспоненциальной функции. Соответствие индивидуальных значений К и Т(дор) линии регрессии определялась корреляционным коэффициентом Пирсона. При высокой степени соответствия (г = 0,93-Ю,95 при 95% достоверности) регрессионные зависимости для рентгеновского и нейтронного облучения практически не различаются, что еще раз указывает на показатель К, как па параметр, связанный с изменением опухолевой реакции при любом типе облучения.

На рисунке 13 приведено корреляционное поле индивидуальных значений Т(1) и К для 198 животных с опухолью меланома В-16, подвергнутой локальному рентгеновскому облучению, облучению тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в сочетании с l0BSH, а также при рентгеновском облучении саркомы-180.

Очевидно, что несмотря на вариабельность полученных индивидуальных

показателей, для большинства варьирующих признаков (примерно 96% всех точек

на графике) существует значительная корреляция (г= 0,92+0,98).

Рисунок 13. Корреляционное поле индивидуальных параметров задержки роста опухоли Т(1ал) и К = tga(D)/tga(0) при локальном облучении меланомы В-16 привитой мышам С57В1/6, различными дозами рентгеновского излучения, тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в сочетании с 10В8И, а также при рентгеновском облучении саркомы-180

- линия регрессии

------- доверительные границы

линии регрессии

Т(„| =0,15» е "" " 11= 198 1=0,95

Используя коэффициент К и его функциональную связь с параметром \*/1(с1/0), можно определить степень подавления синтеза ДНК опухоли (гл.4). Кроме того, коэффициент К связан с параметром М, который, как уже отмечалось, характеризует долю «выжившего» после облучения опухоли объема. Поскольку М(Е>) = е-1"*0, К(О) = С*БГ при одних дозах облучения, то мы получаем следующее уравнение: 1п М = - ш/С.К "г. Таким образом, параметр К, характеризующий скорость выведения РМ из опухоли в первые двое суток после введения радиоактивного ИЛУР, может быть использован в качестве показателя индивидуального ответа опухоли на облучение по параметрам Т(з), Т(дор)1 \У1(с1/0), или М. Ниже приведена сводная таблица (Табл.8) определения по коэффициенту К ряда показателей индивидуального ответа опухоли на облучение: процент включения ЙДУР в ДНК опухолевых клеток; степень подавления пролиферативной активности; доля объема опухоли, клетки которого сохранили после облучения способность к пролиферации; ожидаемую задержку роста опухоли. Данные приведены для меланомы В-16 при ее облучении рентгеновским излучением, тепловыми нейтронами и облучении тепловыми нейтронами в присутствии введенного |0В8Н, а также для рентгеновского облучения саркомы-180.

Т„„, (сут)

Показатели индивидуального ответа опухоли на облучение, определенные по параме

К \\'на/о) % Подавление пролнфе-ратнвноп активности (%) меланома В-16

рентгеновское облучение тепловые нейтроны '"ВвН + тепловые нейтроны

Доза (Гр) М % Т(зад.) сут Доза (Гр) М % Т(зад.) сут Доза (Гр) М % Т(зад.) сут

1 100 0 0 100 0 0 100 0 0 100

1,1 89,2 26,8 2,1 88,3 1,2 0,6 85,6 2,2 0,2 92,0 3,

1,2 71,9 44,1 3,2 82,5 1,6 1,0 78,7 2,7 0,4 87,7 3,

1,3 59,0 55,7 4,8 75,0 2,2 1,4 69,9 3,4 0,6 82,0 3,

1,4 49,1 64,1 7,0 65,9 3,1 2,1 59,5 4.3 0,8 74,8 4,

1,5 41,3 71,3 9,8 55,5 4,2 2,9 48,1 5.6 1,1 66,1 4,

1,6 35,2 77,5 13,6 44,3 5,6 4,0 36,4 7.2 1,6 56,3 5,

1,7 30,3 82,9 18,3 33,3 7,5 5,5 25,4 9.3 2,2 45,8 5,

1,8 26,3 87,5 24,4 23,1 9,8 7,3 16,2 12.0 2,9 35,3 6,

1,9 23,0 91,5 32,0 14,7 12,8 9,5 9,2 15.3 3,8 25,5 7,

2 20,3 94,9 41,4 8,4 16,5 12,3 4,6 19.4 4,9 17,0 9,

2,1 17,9 97,8 52,8 4,2 20,9 15,7 2,0 24.4 6,3 10,4 12,

2,2 16,0 100,4 66,6 1,8 26,3 19,9 0,7 30.5 7,9 5,8 15,

ВЫВОДЫ

1. В процессе исследования кинетики выведения радиоактивной метки в контрольных и облученных группах, при введении радиоактивного ЙДУР после облучения опухоли, достоверно установлена зависимость радиометрических параметров от дозы облучения для разных видов излучения - рентгеновского, тепловых нейтронов и тепловых нейтронов в сочетании с 10В8Н.

2. Кинетика выведения радиоактивной метки в контрольных и облученных группах, при введении радиоактивного ЙДУР до облучения опухоли, достоверно не различается в течение 6-9 дней. Это не отвечает задаче ранней оценки ответа опухоли на терапевтическое воздействие.

3. Разработаны параметры количественной неинвазивной оценки реакции индивидуальной опухоли на облучение с использованием меченного различными изотопами йода ЙДУР:

модельный параметр АУЦё/О), связанный с количеством ЙДУР, включенного в ДНК опухолевых клеток, и отражающий степень изменения пролиферативной активности в индивидуальной опухоли;

- коэффициент К, который рассчитывается непосредственно по данным радиометрии с помощью внешних детекторов в первые двое суток после введения ЙДУР.

4. Определена количественная взаимосвязь параметра №^((1/0) с коэффициентом К.

Показана независимость параметров между \У1(с1/0) и К от типа облучения, что позволяет сделать вывод о возможности применения коэффициента К при любом противоопухолевом воздействии, поскольку фактически он отражает сохранившийся уровень синтеза ДНК опухолевых клеток.

5. Установлена связь коэффициента К с параметрами роста опухоли (меланома В-16 и саркома-180), с дозой облучения опухоли при рентгеновском облучении, облучении тепловыми нейтронами и облучении тепловыми нейтронами в сочетании с |0В8Н. Эта зависимость служит количественной мерой индивидуального ответа опухоли на противоопухолевое воздействие.

6. Для оценки эффективности облучения разработан критерий М, связанный с тем объемом опухоли, клетки которого сохранили пролиферативную активность. Он позволяет нетравматично получать оценку реакции опухоли на облучение.

7. В результате проведенного комплекса исследований научно обоснована, разработана и внедрена в экспериментальную практику система раннего индивидуального прогностического количественного мониторинга эффективности лучевого воздействия на опухоль с использованием параметров выведения меченого ЙДУР. Метод позволяет уже через 48 часов прогнозировать реакцию опухоли при лечении онкологических больных.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

статьи

1. |Ь[-ноддезоксиуридин в реакции экспериментальных опухолей на облучение/ Р.А.Спрышкова, А.И.Севастьянов, М.Г.Найденов, Н.Г.Серебряков, Е.Ю.Григорьева// Медицинская радиология. - 1989. - № 9. - С.40-45.

2. The use of 5-iodo-2-deoxyuridine for evaluation of individual tumour in response to irradiation to biological models/ R.A.Spryshkova, E.Yu.Grigoryeva, M.G.Naidenov, A.S.Yagoubov// Лабораторные животные. - 1991. - т.1- №3. - С. 53-57.

3. 5-йод-2-дезоксиуридин в оценке индивидуальной реакции экспериментальных опухолей на облучение/ Р.А.Спрышкова, Е.Ю.Григорьева, В.А. Братцев, А.И.Севастьянов, М.Г.Найденов// Вопросы онкологии. - 1992. - № 9. - С.327-334.

4. Аналитические характеристики набора ИРМА АФП для определения альфа-фетоиротеина человека/ А.В. Андреев, А.И.Гусев, Е.Ю.Григорьева// Клиническая лабораторная диагностика. - 1993. - №3. - С.54-58.

5. Настоящее положение бор-нейтроннозахватной терапии опухолей/ Р.А.Спрышкова, А.С.Ягубов, Е.Ю.Григорьева, Е.Ю.Колдаева// Вопросы онкологии. - 1995. - т.41,- № 2.- С.106-107.

6. Biological efficacy of BSH-thermal neutron irradiation estimated with different methods on the model of B-16 melanoma/ R.A.Spryshkova, E.Yu.Grigorieva, M.G.Naidenov, G.I.Borisov// Frontiers in Neutron Capture Therapy, Chemistry and

Biology. - Eds. B.Larsson, J.Crawford, R.Weinreich, 1997. - Vol.2. - P. 563-567.

7. Methodological principles for the use of 5-iodo-2-deoxyuridine labelled with radioactive iodine for in vivo evaluation of individual tumour response to irradiation/ E.Yu.Grigorieva, R.A.Spryshkova// Frontiers in Neutron Capture Therapy, Chemistry and Biology. - Eds. B.Larsson, J.Crawford, R.Weinreich, 1997. - Vol.2. -P. 557-562.

8. Вариант моноклонального радиоиммунологического анализа альфа-феггопротеина/ А.В. Андреев, Е.Ю.Григорьева// Клиническая лабораторная диагностика. -1998. - №2. - С. 43-45.

9. Синтез бис (диалкиламинометил) -о - и -т- карборанов и исследование их в качестве возможных препаратов для боронейтронозахватной терапии/Л.И. Захаркнн, В.А. Ольшевская, Р.А. Спрышкова, ЕЛО. Григорьева, В.И. Рябкова, Г.И. Борисов// Химико-фармацевтический журнал. - 2000. - т.34. - №6. - С. 21-23.

10. About radiotherapy of the thyroid gland cancer with use of alpha-emitter radionuclides: prognosis of the 211 At radiation dose in the organs and whole patent body calculated on the base the laboratory investigation data on the pharmacokinetic of "Astatine chloride, 21 lAt" with rats/ A.V.Tultaev, O.A.Yuminov, R.A.Spryshkova, E.Yu.Grigorieva at.all// Preprint INP MSU 2000. - 31/635. - Moscow: Lmonosov Moscow state university Skobeltsyn institute of nuclear physics, 2000. - 15 P.

11. Biodistribution study of novel dodecaborate-phtalocyanines in the B-16 mouse melanoma/ E. Grigorieva, R. Spryshkova, V. Riabkova, K. Zhizhin, at.all.// Frontiers in Neutron Capture Therapy. - Ed. M.F. Hawthorhe, K. Shelly, R.J. Wiersema - Kluwer Academic: plenum Publishers, NY.2001. - Vol.2. - P.1027-1032.

12. Радионуклидная терапия рака щитовидной железы с использованием альфа-эмиттеров: прогноз значений поглощенной дозы излучения (экспериментальное исследование)/ А.В.Тултаев, О.А.Юминов, Р.А.Спрышкова, Е.Ю.Григорьева// Медицинская радиология и радиационная безопасность. - 2001. - т.46. - С. 11-17.

13. Колпчественноеопределсние моноклональных антител с помощью твердофазного конкурентного радиоиммуноанализа с использованием нативного антигеии/ А.В.Андреев, Е.Ю.Григорьева// Иммунология. -^2001. - № 1. - С.60-63.

14. Na210Bi2H|iSH (BSH) - препарат для нейтронозахватной терапии: биораспределение и влияние на клеточный цикл меланомы В-16/ E.IO. Григорьева, Т.Г. Николаева, ЕЛО. Колдаева, М.Г. Найденов, Р.А. Спрышкова// Российский Биотерапевтический Журнал. - 2005. - № 3. - С.30-33.

15. Экспериментальные подходы к количественному мониторингу терапии злокачественных опухолей/ Е.Ю.Григорьева, Е.Ю Колдаева, М.Г. Найденов// Российский Биотерапевтический Журнал. -2007. - № 3. - С. 60-66.

16. Нейтронозахватная терапия меланомы мышей при использовании линзы Ку-махова/ Е.Ю.Григорьева, Е.Ю Колдаева, М.Г. Найденов, Г.И.Борисов, К.Ю.Жижин// Российский Биотерапевтический Журнал. - 2007. - №4. С.13-16.

Тезисы докладов

17. The use of 5-iodo-2-deoxyuridine for evaluation of individual tumour response to irradiation/ R.A.Spryshkova, E.Yu.Grigoryeva, M.G.Naidenov, A.S.Yagoubov //

Abstracts XI International Symposium on Laboratory Animals and Experimental medicine, Riga, 2-4 October 1990. - Riga, 1990. - P. 85.

18. Современное состояние нейтронозахватной терапии опухолей/ Р.А. Спрышкова, Е.Ю. Григорьева, А.С. Ягубов, Е.Ю. Колдаева// Материалы Всероссийского Съезда Онкологов, Ростов - на-Дону, 10-12октября 1995.

19. Перспективы 10В-нейтронозахватной терапии опухолей/ Р.А. Спрышкова, Е.Ю. Григорьева, Е.Ю.Колдаева//Медицинская физика, техника, биология, клиника. -1995. -№ 2. С.54.

20. Biological efficacy of BSH-thermal neutron irradiation estimated with different methods on the model of B-16 melanoma/ R.A.Spryshkova, E.Yu.Grigorieva, G.I.Borisov// Seventh International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer, Zurich, Switzerland, 4-7 September 1996. Programme and Abstracts the International Society for NCT. -Zurich, 1996. - В 26. -P.43.

21. Methodological principles for the use of 5-iodo-2-deoxyuridine labelled with radioactive iodine for in vivo evaluation of individual tumour response to irradiation/ E.Yu.Grigorieva and R.A.Spryshkova// Seventh International Symposium on Neutron

Capture Therapy for Cancer, Zurich, Switzerland, 4-7 Septemberl996. Programme and Abstracts the International Society for NCT. -Zurich, 1996. - В 25. - P.44.

22. Pharmacokinetic study of novel dodecaborate-phthalocyanines in the B-16 mouse melanoma model/ R.Spryshkova, E.Yu.Grigorieva, V.Riabkova, K.Zhizhin, E.Malinina// Eighth International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer. 13-18 September 1998, La Jolla, California, U.S.A. Program and Abstracts. - La Jolla, California, U.S.A., 1998.-E-12.-P.43.

23. Chemistry, Biological Studies and Medical Application of Boron Compounds/ R.Spryshkova, E.Yu.Grigorieva, V.Riabkova, M.G.Naidenov G.I.Borisov, E.V.Egorov// XY1 Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Санкт-Петербург, 25-29 мая 1998г.: Научная сессия по проектам INTAS в области химии. Программа. -Санкт-Петербург, 1998. - С.153.

24. At alpha-emitter in isotonic solution as a valuable tool for cancer therapy/ O.V.Fotina, A.V.Tultaev, E.Yu.Grigorieva, R.A.Spryshkova, at.all// Seventh International Radiopharmaceutical Dosimetry Symposium, 17-19 april 2002. The Department of Radiology and Radiological Sciences of Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN - P.55.

25. Neutron capture therapy (NCT) of melanoma in mice using new boron carriers and neutron capillary optics/ G.I.Borisov, M.G.Naidenov, E.Yu.Koldaeva, E.Yu. Grigorieva// Second Int. Conference on X-Ray and Neutron Capillary Optics, Zvenigorod, Russia, 2226 September 2004. Program and Abstracts. - Zvenigorod, 2004,- P.15-16.

26. Фармакокинетика натриевой, магниевой и кальциевой солей поликарборани-ленпроизводного бета-аланина - носителей бора для нейтронозахватной терапии/ Е.Ю. Григорьева, Е.Ю. Колдаева, Е.А. Барышникова, Г.И. Борисов и др.// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 17-19 марта 2004.- Российский Биотерапевтический Журнал.- 2004. -№ 2. - С. 21.

27. Кинетика клеточной популяции меланомы В-16 при действии BSH - препарата для нейтронно-захватной терапии/ Е.Ю.Григорьева, Т.Г.Николаева, Е.Ю. Колдаева, В.Н.Братцкв// Материалы Всероссийской научно-практической конференции

«Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 16-18 марта 2005. - Российский Биотерапсвтичсский Журнал. - 2005. -№1. - С.23.

28. Количественное определение бора в процессе нейтронно-захватной терапии/ Е.Ю.Григорьева, М.Г. Найденов, Г.И.Борисов, ЕЛО. Колдаева// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 16-18 марта 2005. - Российский Биотерапевтический Журнал. - 2005. -№ 1. - С.26.

29. Нейтронозахватная терапия (НЗТ) меланомы мышей на новых носителях бора с использованием капиллярной нейтронной оптики/ М.Г. Найденов, ЕЛО. Колдаева, Е.Ю. Григорьева и др.// Материалы Всероссийской конференции «Радиобиологические основы лучевой терапии», Москва, 19-20 апреля 2005. Программа. - Москва, 2005. - с.48.

30. Параметры оценки индивидуального ответа опухоли на облучение/ Е.Ю.Григорьева, Е.Ю. Колдаева, М.Г. Найденов// Материалы VI Всероссийского съезда онкологов, Ростов-на-Дону, 2005. Современные технологии в онкологии.-Ростов-на-Дону, 2005. - т.П. - С.295-296.

31. Сравнительное изучение трех новых отечественных бор-содержащих соединений для нейтронозахватной терапии рака/ Е.Ю. Колдаева, Е.Ю. Григорьева, М.Г. Найденов, Ю.В. Стукалов, В.А. Братцев, Г.И. Борисов// Материалы VI Всероссийского съезда онкологов, Ростов-на-Дону, 2005. Современные технологии в онкологии.- Ростов-на-Дону, 2005. - т.Н. - С.294.

32. Биораспределение борированного гсма - носителя бора при нейтронозахватной терапии (НЗТ)/ Е.Ю. Колдаева, Е.Ю. Григорьева, М.Г. Найденов, Ю.В. Стукалов, В.А. Ольшевская, A.B. Зайцев, Рами Аюб// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 21-24 марта 2006. - Российский Биотерапевтический Журнал. - 2006. - № 1. -С.36.

33. Общая токсичность карборан-производных порфиринового ряда - препаратов для нейтронозахватной терапии (НЗТ)/ Е.Ю. Колдаева, ЕЛО. Григорьева, A.C. Масько, В.А. Ольшевская, Л.В. Зайцев, Рами Аюб// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты»,

Москва, 21-24 марта 2006. - Российский Биотерапевтический Журнал.- 2006.- № 1. - С.37.

34. Нейтронозахватная терапия (НЗТ) меланомы мышей В-16 с использованием новых препаратов 10В и линзы Кумахова/ Е.Ю Колдаева, М.Г. Найденов, Е.Ю. Григорьева, Г.И. Борисов, Н.Т.Кузнецов, К.Ю. Жижин// Материалы IV съезда онкологов и радиологов СНГ, Баку, 28.09-01.10, 2006.

35. BSH - В10- carrier for neutron capture therapy: influence on cell cycle of melanoma В-16/ E.Yu.Grigorieva, E.Yu. Koldaeva, T.G. Nikolaeva// Twelth International Symposium on NeutronCapture Therapy for Cancer, Tokio, Japan, 4-7 October 2006. Programme and Abstracts the International Society for NCT. - Tokio, 2006. - E 60. -P.84.

36. The study of ultrastructural alterations in the melanoma B-16 cells after administration of 10B-compounds to mice/ E.Yu.Grigorieva, E.Yu. Koldaeva, I.P. Shabalkin// Twelth International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer, Tokio, Japan, October 2006. Programme and Abstracts the International Society for NCT. - Tokio, 2006. - E 60. - P.84.

37. Острая токсичность и биораспределение роданододекабората натрия - препарата для нейтронозахватной терапии (НЗТ)/ Е .Ю. Колдаева, Е.Ю.Григорьева, В.А. Братцев, Дж.Моррис, А.С. Масько, Г.И. Борисов, Р.А.// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 24-26 марта 2007. - Российский Биотерапевтический Журнал. -2007.-№ 1.-С.46.

38. Нейтронозахватная терапия мышиной меланомы В-16 на новых носителях 10В/ Е.Ю.Григорьева, Е.Ю Колдаева, М.Г. Найденов, Ю.С. Стукалов и др.// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 24-26 марта 2007,- Российский Биотерапевтический Журнал. - 2007. -№ 1. - С.82.

39. Взаимосвязь роста опухоли и параметров выведения йод-дезоксиуридина/ Е.Ю.Григорьева, Е.Ю Колдаева, М.Г. Найденов, А.С. Масько// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 24-26 марта 2007.- Российский Бибтерапевтический Журнал. -2007.-№ 1. - С.82.

40. Биораспределение производного клозо-борат-аниона - носителя бора (ПКА) при нейтронозахватной терапии (НЗТ) в организме мышей С57В1/6 с трансплантированной меланомой В-16/ ЕЛО Колдаева, Е.Ю.Григорьева М.Г. Найденов и др.//, Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 17-19 марта 2008. - Российский Биотерапевтический Журнал. - 2008. - №1. - С.58.

41. Субклеточное распределение производного клозо-борат-аниона - препарата для нейтронозахватной терапии/ Е.Ю.Григорьева, ЕЛО Колдаева, М.Г. Найденов

и др.// Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты», Москва, 17-19 марта 2008.- Российский Биотерапевтический Журнал. - 2008. - № 1. С.57.

42. Сравнительная токсикология вновь разработанных конструкций на основе дендримеров нового класса в таргетной терапии злокачественных опухолей/ Е.Ю. Григорьева, Ю.В. Стукалов, Е.Ю. Колдаева// Материалы VI симпозиума «Биологические основы терапии онкологических заболеваний», Москва, 29-31 января 2009.- Онкогематология. - 2008.-№ 4. - С. 42-43.

Подписано в печать 27.02.09 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

_Тираж 100 экз. Заказ № 389_

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Актуальность проблемы

Современная онкология располагает большим арсеналом средств, позволяющих в зависимости от гистологии, темпов роста опухоли, иммунологического и гормонального статусов выбрать оптимальные способы лечения злокачественных новообразований. Среди этих способов одним из основных является лучевое лечение. Примерно 70% от общего числа больных с онкологическими заболеваниями назначают, лучевую терапию либо в виде самостоятельного курса лечения, либо в сочетании с другими методами лечения.

Эффективность лучевой терапии во многом зависит от возможности раннего прогнозирования реакции опухоли на воздействие. Важным аспектом проведения терапии является также наличие методов, способных обеспечить оптимальное индивидуальное планирование и контроль за ее проведением. Кроме того, для выработки оптимального индивидуального плана лечения злокачественных опухолей и коррекции ранее намеченной схемы в процессе курса терапии большое значение имеет возможность ранней оценки реакции опухоли на облучение. Однако в клинической практике нет метода, с помощью которого можно было бы быстро получить надежную количественную информацию.

Разработка методов прогнозирования на основе цитокинетических параметров (общего числа клеток, фракции роста, распределения клеток по фазам клеточного цикла), а также таких биологических параметров, как скорость пролиферации, репопуляции, фракции выживших клеток и др., позволяющих осуществлять количественную оценку и прогнозирование ответа опухоли на воздействие в экспериментальной радиобиологии, в клинических условиях затруднено в силу различных причин. Большая вариабельность данных параметров даже для опухолей одного и того же типа, а также необходимость частых биопсий в процессе лечения практически не позволяют использовать эти важные параметры для раннего прогноза реакции опухоли.

Применяющиеся в клинике рентгенологические, томографические, эндоскопические и другие методы позволяют получить ответ о реакции опухоли на терапевтическое воздействие лишь через некоторое время после курса лечения, когда оптимальное индивидуальное планирование уже исключено. Таким образом, терапевтическое воздействие на организм больного продолжают даже тогда, когда оно не приносит никакого положительного эффекта (в силу радио - или химиорезистентности опухоли), но приводит к тяжелым побочным эффектам. В этой связи создание, в первую очередь, раннего, простого, нетравматичного, информативного метода получения надежных количественных параметров, характеризующих ответ опухоли на воздействие, является актуальной задачей современной онкологии. Мы считаем весьма перспективным для оценки эффективности лучевой терапии использование радионуклидных методов. В частности, применяя йод-дезоксиуридин (ИДУР), меченный гамма-излучающими изотопами йода, можно с помощью внешних детекторов неинвазивно проследить за включением радиоактивной метки (РМ) в опухоль и оценить уровень синтеза ДНК в ответ на противоопухолевое воздействие. Основанием для использования скорости выведения ЙДУР из опухоли в качестве прогностического показателя эффективности терапии послужили особенностим фармакокинетики ЙДУР, который включается в ДНК активно пролиферирующих клеток, претерпевает в основном все биохимические превращения в течение 15 минут после введения и покидает эти клетки

О 1 1 только после их гибели. В отличие от иных маркеров ( Н-тимидина, С

I О тимидина, F-тимидина, бромдезоксиуридина), при использовании ЙДУР после гибели меченой клетки происходит быстрое дейодирование и выделение продуктов распада ДНК, что ограничивает реутилизацию радиоактивности другими клетками. Измерение включения ЙДУР в ДНК опухоли, т.е. количественная оценка пролиферативной активности опухоли неинвазивным способом, может стать инструментом для подбора оптимальных схем лечения опухолевых больных и обеспечить более раннюю и, возможно, более точную оценку реакции опухоли на проводимую терапию, а также предоставить информацию для составления клинического прогноза.

Цель представленной работы — повышение эффективности лучевой терапии на основе индивидуального количественного прогнозирования реакции опухоли на противоопухолевое воздействие.

Задачами работы являются:

1. Оценка эффективности лучевой терапии с использованием ЙДУР, меченного радиоизотопами йода.

- оценка уровня потери, включившегося I-ИДУР в опухолевые клетки (перевиваемая опухоль мышей меланома В-16 и культура клеток HeLa), после рентгеновского облучения;

- оценка влияния локального рентгеновского излучения на уровень включения в опухоль (перевиваемые опухоли мышей меланома В-16 рг и и саркома

180) "Ч-ИДУР после ее облучения.

2. Разработка параметров количественной оценки реакции опухоли индивидуального животного на облучение с использованием меченного различными изотопами йода ИДУР.

Для этого:

- на перевиваемой опухоли мышей меланома В-16 методами радиометрии провести сравнительное изучение параметров выведения 1251-ЙДУР из зоны опухоли при различных дозах ее локального рентгеновского облучения, облучения тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в присутствии введенного Na2,0B12HnSH (10BSH);

- на перевиваемой опухоли мышей меланома В-16 методами радиометрии провести сравнительное изучение параметров выведения из зоны опухоли 1311-ЙДУР, введенного до облучения опухоли, и 1251

ЙДУР, введенного тому же животному после рентгеновского облучения опухоли;

- на перевиваемой опухоли мышей меланома В-16 методами радиометрии провести сравнительное изучение параметров выведения

125 И- 125

I-Na I" и 1-ИДУР из зоны опухоли после ее локального облучения в различных дозах рентгеновского излучения;

- разработать количественные параметры, характеризующие включение ЙДУР в ДНК опухолевых клеток на основе анализа кинетических кривых выведения радиоактивной метки ЙДУР из меланомы В-16 и саркомы-180;

- определить количественную зависимость между изменением параметров включения ЙДУР в опухоль и уровнем изменения синтеза ДНК опухоли при ее локальном рентгеновском облучении, при облучении тепловыми нейтронами и тепловыми нейтронами в присутствии введенного ,0BSH;

3. Оценка эффективности использования разработанной модели для раннего индивидуального неинвазивного мониторинга лучевой терапии опухоли. Для этого:

- оценить противоопухолевый эффект (меланома В-16 и саркома-180) действия рентгеновского излучения, тепловых нейтронов и тепловых нейтронов в присутствии введенного 10BSH;

- определить количественную взаимосвязь между разработанными параметрами включения ЙДУР, параметрами роста опухоли и дозой облучения опухоли для отдельных животных;

- разработать схему оценки индивидуального количественного прогноза эффективности лучевого воздействия на опухоль с использованием параметров выведения меченого ИДУР.

Научная новизна

Все исследования выполнены в нашей стране впервые, часть исследований выполнена впервые в мире.

• Разработаны критерии ранней неинвазивной оценки эффективности лучевой терапии индивидуальных опухолей на основе параметров,

I о 1 ^ характеризующих скорость выведения из опухоли I-ИДУР, введенного в

125 организм до облучения опухоли, и I-ИДУР, введенного тому же животному после облучения опухоли.

• Определены количественные параметры зависимости включения ИДУР в опухолевые клетки и уровнем изменения синтеза ДНК опухоли при ее локальном рентгеновском облучении в различных дозах, а также при облучении тепловыми нейтронами и облучении тепловыми нейтронами в присутствии с ,0BSH - Wl(d/0).

• Показано, что отношения угловых коэффициентов (К) начального участка (до 48 часов) кривых, построенных по регистрируемой над зоной

131 ^ 125т опухоли радиоактивности после введения I-ИДУР до облучения и Iо

ИДУР после облучения опухоли одному и тому же животному, коррелируют с параметрами роста опухоли

• Определены функциональные зависимости между параметрами выведения радиоактивной метки ЙДУР (К), параметрами роста опухоли и дозой облучения для отдельных животных.

• Для оценки биологической эффективности разработаны в наших экспериментах и применены биологические критерии: параметр К, рассчитываемый по скорости выведения из опухоли о радиоактивной метки введенного в организм ИДУР, регистрируемой внешним детектором над зоной опухоли и функционально связанный с показателем Wl(d/0), характеризующим зависимый от дозы облучения уровень синтеза ДНК в опухоли после ее облучения; параметр М, характеризующий зависящую от дозы долю объёма опухоли, клетки которого сохранили пролиферативную активность после облучения. Он вычисляется на основании анализа закономерностей роста опухоли в ответ на облучение, позволяет нетравматично получать оценку реакции опухоли на облучение и заменить во многих случаях сложный метод изучения выжившей после облучения фракции опухоли клеток.

Научно-практическая значимость работы

Разработана система индивидуального количественного прогноза I эффективности лучевого воздействия на опухоль с использованием параметров выведения меченного гамма-излучающими радиоактивными изотопами ЙДУР, что позволяет неинвазивно прогнозировать эффективность как лучевого воздействия на опухоль, так и других видов консервативного лечения в онкологии в течение первых двух суток.

Практическая значимость экспериментальных результатов заключается в возможности получить дополнительные сведения об индивидуальной чувствительности опухоли на терапевтическое лучевое воздействие с элементом предсказания дальнейшего развития опухоли, и, соответственно, позволит более точно выбирать для каждого пациента оптимальный режим облучения. Результаты данного исследования могут быть инструментом, дающим возможность обеспечить более раннее распознавание ответа опухоли на проводимую терапию, т.е. позволяют количественно оценить индивидуальную чувствительность опухоли и прогнозировать эффективность лучевого воздействия на нее через 48 часов после облучения Принципиально важно отметить, что разработанная и предлагаемая методика может быть использована не только при оценке лучевого воздействия, но и при других видах противоопухолевой терапии. Публикации и апробация работы

По материалам выполненных исследований опубликованы 43 научнае работы. Результаты работы были представлены и докладывались на следующих международных и отечественных конференциях и совещаниях:

- XI International Symposium on Laboratory Animals and Experimental medicine (Riga, 2-4 October, 1990);

- Всероссийский съезд онкологов (Ростов-на-Дону, 10-12 октября 1995);

- 2-я Национальная конференция «Медицинская физика-95 с международным участием» (г. Москва, 4-8 декабря, 1995);

- Совещание с международным участием «Применение нейтронов ядерных реакторов в лучевой терапии, состояние и перспективы» (г. Обнинск, 17-19 октября, 1995);

- Seventh International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer (Zurich, Switzerland, 4-7 September, 1996);

- Сателлитный симпозиум «Актуальные вопросы радиобиологии нейтронов и нейтронной терапии» в рамках 3 Съезда по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность), г. Обнинск, 16 октября, 1997;

- Международный коллоквиум по проблеме INTAS (Москва, ИОНХ РАН, 4 июня 1998); Международное совещание по проблеме INTAS-96-1114 (г.Обнинск, 14 ноября 1998);

- Eighth International Symposium on Neutron Capture Therapy for Cancer (13-18 September 1998, La Jolla, California, U.S.A.);

- XY1 Менделеевский съезд по общей и прикладной химии, «Научная сессия по проектам INTAS» (25-29 мая 1998г., Санкт-Петербург);

- Seventh International Radiopharmaceutical Dosimetry Symposium (April 17-19, 2002, The Department of Radiology and Radiological Sciences of Vanderbilt University Medical Center, Nashvilli, TN);

- Second Int. Conference on X-Ray and Neutron Capillary Optics (22-26.09 2004, Zvenigorod, Russia;

- III-й съезд онкологов и радиологов СНГ (Минск, 24-28.05 2004);

- Семинар «Радионуклидные технологии в физике и медицине» (Москва, ГУ РНЦ «Курчатовский институт», 28 октября, 2004г);

- IV Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 16-18 марта, 2005);

- Всероссийская конференция «Радиобиологические основы лучевой терапии» (Москва, 19-20 апреля, 2005);

- VI Всероссийская научно-практическая конференция «Отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 24-26 марта, 2007).

Отдельные разделы настоящих исследований вошли в работы, отмеченные премией имени И.В. Курчатова за лучшую научную работу 2004 года и премией ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в области клинической онкологии за лучшую прикладную научную работу (2005 г.). На защиту выносятся:

1. Разработка метода оценки уровня включения радиоактивного ЙДУР в ДНК опухолевых клеток на основе анализа кинетических кривых выведения РМ ЙДУР из опухоли, измеренной внешним детектором.

2. Результаты анализа кинетических кривых выведения радиоактивной метки (РМ) йодида натрия и ЙДУР, меченного 1251 и 13'i, из опухоли и нормальных тканей для индивидуальных животных в норме и при различных видах облучения (рентгеновское, тепловые нейтроны, комплексное воздействие тепловых нейтронов с 10BSH)

3. Корреляционный анализ и расчет аналитического выражения, отражающего взаимосвязь между параметрами включения радиоактивного ЙДУР в ДНК опухолевых клеток, отношением угловых коэффициентов кривых выведения РМ из облученной опухоли к ее контрольному уровню и параметрами роста опухоли для различных видов облучения.

4. Система индивидуального неинвазивного количественного прогноза эффективности лучевого воздействия на основе критериев, характеризующих скорость выведения из опухоли 1311-ЙДУР, введенного до облучения опухоли, и I-ИДУР, введенного тому же животному после облучения опухоли.

Структура и объем работы

Диссертационная работа изложена на 210 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, методов и техники экспериментов, трех глав, содержащих собственные экспериментальные данные с обсуждением их результатов, заключения, выводов и указателя цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 267 наименований отечественных и иностранных источников. Диссертация иллюстрирована 27 рисунками, фотографиями и 11 таблицами.

ВЫВОДЫ

1. В процессе исследования кинетики выведения радиоактивной метки в контрольных и облученных группах, при введении радиоактивного ЙДУР после облучения опухоли, достоверно установлена зависимость радиометрических параметров от дозы облучения для разных видов излучения - рентгеновского, тепловых нейтронов и тепловых нейтронов в сочетании с 10BSH.

2. Кинетика выведения радиоактивной метки в контрольных и облученных группах, при введении радиоактивного ЙДУР до облучения опухоли, достоверно не различается в течение 6 — 9 дней. Это не отвечает задаче ранней оценки ответа опухоли на терапевтическое воздействие.

3. Разработаны параметры количественной неинвазивной оценки реакции индивидуальной опухоли на облучение с использованием меченного различными изотопами йода ЙДУР:

- модельный параметр Wl(d/0), связанный с количеством ЙДУР, включенного в ДНК опухолевых клеток, и отражающий степень изменения пролиферативной активности в индивидуальной опухоли;

- коэффициент К, который рассчитывается непосредственно по данным радиометрии с помощью внешних детекторов в первые двое суток после введения ЙДУР.

4. Определена количественная взаимосвязь параметра Wl(d/0) с коэффициентом К. Показана независимость параметров между Wl(d/0) и К от типа облучения, что позволяет сделать вывод о возможности применения коэффициента К при любом противоопухолевом воздействии, поскольку фактически он отражает сохранившийся уровень синтеза ДНК опухолевых клеток.

5. Установлена связь коэффициента К с параметрами роста опухоли (меланома В-16 и саркома-180), с дозой облучения опухоли при рентгеновском облучении, облучении тепловыми нейтронами и облучении тепловыми нейтронами в сочетании с I0BSH. Эта зависимость служит количественной мерой индивидуального ответа опухоли на противоопухолевое воздействие.

6. Для оценки эффективности облучения разработан критерий М, связанный с тем объемом опухоли, клетки которого сохранили пролиферативную активность. Он позволяет нетравматично получать оценку реакции опухоли на облучение.

7. В результате проведенного комплекса исследований научно обоснована, разработана и внедрена в экспериментальную практику система раннего индивидуального прогностического количественного мониторинга эффективности лучевого воздействия на опухоль с использованием параметров выведения меченого ИДУР. Метод позволяет уже через 48 часов прогнозировать реакцию опухоли при лечении онкологических больных.

174

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время в клинической практике не существует раннего, простого, нетравматичного, информативного метода получения надежных количественных параметров, характеризующих ответ опухоли на воздействие и способного обеспечить оптимальное индивидуальное планирование и контроль за проведением лечения. Решению этой важной проблемы и был посвящен комплекс проведенных исследований.

В соответствии с поставленной задачей в диссертационной работе решен круг взаимосвязанных вопросов, относящихся к разработке системы индивидуального количественного оперативного контроля эффективности лучевой терапии. С этой целью изучена возможность использования ЙДУР для оценки ответа опухоли индивидуального животного на облучение тремя типами излучений: рентгеновским, тепловых нейтронов и тепловых нейтронов в сочетании с 10В-содержащим препаратом.

Основой для разработки данного подхода послужили работы по изучению свойств ЙДУР [62,104,197,198,199,225], который, во-первых, будучи аналогом тимидина, вместо него встраивается избирательно в ДНК пролиферирующих клеток во время S-фазы и, во-вторых, использование ЙДУР, меченного гамма-излучающими изотопами йода, дает возможность следить за его количественными изменениями в организме с помощью внешних детекторов. Изучение динамики накопления и выведения

1 ГУ С радиоактивной метки 1-ИДУР (in vitro) на протяжении 10 суток из различных тканей показало, что уже в первые сутки обнаруживается преимущественное накопление ЙДУР в опухоли. Анализ изменения уровня радиоактивности in vivo указывает также на наличие в зоне опухоли задержки РМ в интервале времени 24-80 ч, аналогичный участок интактной лапки того же животного РМ не задерживает. Количество ИДУР в выделенной ДНК составило приблизительно 93% общей радиоактивности опухоли и оставалось неизменным с 24 до 96 ч.

Метаболическое поведение ИДУР позволяет оценить эффективность лучевой терапии с помощью двух подходов:

- В первом случае облучение опухоли проводят через несколько дней с после введения в организм радиоактивного ИДУР и регистрируют в динамике потерю РМ из зоны опухоли. Уровень потери радиоактивности в опухоли после ее облучения может служить мерой гибели опухолевых клеток в ответ на противоопухолевое воздействие. о

- Во втором случае радиоактивный ИДУР вводят в организм после облучения опухоли и регистрируют уровень включения РМ в опухоль. Снижение радиоактивности в зоне опухоли в ответ на облучение будет характеризовать уровень подавления синтеза ДНК.

Полученные нами при 1-м подходе результаты не позволяют достоверно судить о различиях в выведении РМ из опухоли в контрольных и облученных группах. Кроме того, в силу ряда факторов, РМ, высвобождающаяся из погибших раковых клеток, не всегда быстро удаляется из места гибели клетки и достоверно судить о различиях в выведении ИДУР из опухоли в контроле и при облучении опухоли можно лишь через 6-9 дней, что не отвечает задаче ранней оценки ответа опухоли на терапевтическое воздействие.

При введении ЙДУР животным после облучения опухоли, мы показали возможность оценки эффективности лучевой терапии с использованием меченого ИДУР по уровню его включения в опухоль. Было установлено наличие зависимости радиометрических параметров от дозы облучения как для разных видов излучения - рентгеновского, тепловых нейтронов и тепловых нейтронов в сочетании с 10BSH, так и для двух различных по радиочувствительности опухолей - меланомы В-16 и саркомы-180. и

Достоверное различие скоростей выведения ИДУР из зоны опухоли при локальном радиационном воздействии на нее позволило использовать ИДУР как маркер степени изменения ответа опухоли и предопределило возможность установления количественной связи между величиной скорости выведения РМ ЙДУР и дозой облучения.

Для индивидуальной оценки эффективности лучевого воздействия была использована схема с комбинированным применением препаратов ИДУР, меченных двумя различными изотопами иода

1311 и I). Предварительно было установлено, что различие в массовых числах изотопов 1311 и 1251 не влияет на результаты in vivo измерений и показана идентичность поведения 1311-ЙДУР и 1251-ЙДУР в организме мышей-самцов линии C57BL/6. Последовательное применение ЙДУР, меченного двумя различными радиоизотопами йода, введенного одному и тому же животному до и после облучения, позволило оценить реакцию опухоли на облучение для каждого отдельного животного.

На основании полученных данных можно заключить, что применение ЙДУР, меченного двумя различными радиоизотопами йода, позволяет оценить реакцию опухоли на облучение для каждого отдельного животного, то есть индивидуальную реакцию организма. При этом методика прижизненного определения параметров, характеризующих кинетику выведения меченного радиоизотопами йода ИДУР, при воздействии различными дозами облучения обладает удовлетворительной разрешающей способностью:

1. Отсутствие достоверных различий между параметрами кривых выведения

РМ "Ч-ИДУР и I-ИДУР из зоны опухоли у необлученных животных позволяет считать их поведение в организме идентичным.

2. Достоверность различий параметров РМ 1311 (контроль до облучения)

1 лг и РМ I (постоблученный параметр) у животных с облученной опухолью, дает возможность определения изменения уровня ИДУР в опухолевой зоне индивидуальных животных при противоопухолевом воздействии.

Одной из возможностей дальнейшего развития и совершенствования данного метода оценки эффективности лучевой терапии явилась разработка математических закономерностей (параметров), адекватно описывающих поведение РМ ЙДУР в опухоли и включающей в себя интересующие исследователя параметры.

В главе 4 диссертационной работы приведен вариант модели, основанной на оценке степени изменения количества меченого ЙДУР по относительному изменению площади (W) под кривой выхода РМ ЙДУР из зоны опухоли во времени. Поскольку результаты измерения РМ in vivo отражают совокупный процесс - выведение продуктов метаболизма ЙДУР главным образом йодида) и включение ИДУР в опухолевые клетки -необходимо было разделить эти процессы и определить параметры последнего. Анализ данных, полученных в экспериментах как с Nal так и с

125т

ИДУР, меченных 1, позволил нам охарактеризовать кривую выведения РМ ЙДУР из зоны опухоли суперпозицией трех основных процессов: а) выведение свободного йодида, б) метаболически связанного йодида и в) с включенного в ДНК опухолевых клеток ИДУР. Как мы показали, предложенный нами параметр Wl(d/0) (относительное изменение площади под медленной экспонентой при облучении опухоли в определенной дозе к соответствующей площади контроля), отражает уровень изменения количества ЙДУР в ДНК опухоли при действии рентгеновского излучения, тепловых нейтронов или при бинарном действии тепловых нейтронов в сочетании с 10BSH. Данные, полученные в результате in vivo измерений, практически идентичны in vitro результатам, полученным из выделенной ДНК опухолевых клеток, т.е. значения коэффициентов

10S w

Wl(d/0) для рентгеновского излучения соответствуют содержанию 1-ИДУР в выделенной опухолевой ДНК и, таким образом, может служить условной характеристикой подавления синтеза ДНК в индивидуальной опухоли.

Поскольку вычисление коэффициента Wl(d/0) достаточно громоздко, было целесообразно найти связь между этим коэффициентом и параметрами, характеризующими процесс непосредственной регистрации внешним детектором суммарной РМ. Для этой цели нами был определен коэффициент К, который является отношением угловых коэффициентов кривых выведения РМ у животных с облученной опухолью к их контрольным значениям до облучения, то есть функционально связан с количеством РМ в измеряемой зоне и достаточно просто вычисляется в первые сутки после радиационного воздействия. Полученные нами аналитические выражения для различных видов излучения отражают взаимосвязь параметров Wl(d/0) и К и указывают на независимую от вида ионизирующего излучения связь этих признаков. Данный факт дает основание рассматривать коэффициент К как возможный критерий оценки при любом противоопухолевом воздействии, поскольку фактически отражает сохранившийся уровень синтеза ДНК опухолевых клеток.

Глава 5 посвящена вопросам практического использования разработанной модели для ранней индивидуальной неинвазивной оценки эффективности лучевой терапии опухоли.

На перевиваемых опухолях меланома В-16 и саркома-180 был изучен противоопухолевый эффект действия рентгеновского излучения, тепловых нейтронов и тепловых нейтронов в присутствии введенного 10BSH. Установлено, что коэффициент К коррелирует с параметрами роста опухоли Т(3) и Т(ДОр.) с высокой степенью соответствия (г= 0,96-Ю,98 при 95% достоверности) и может быть использован в качестве показателя индивидуального ответа опухоли на облучение.

Для оценки биологической эффективности действия на опухоль используемых видов излучения наряду с принятыми критериями Т(3) и Т(Дор,) были применены разработанные в наших экспериментах биологические критерии — уже упомянутый К и параметр М.

Параметр М характеризует зависящую от дозы долю объема опухоли, клетки которого сохранили пролиферативную активность после облучения. Вычисляется он на основании анализа закономерностей роста опухоли в ответ на облучение и позволяет получать in vivo оценку реакции опухоли на облучение, заменив во многих случаях сложный метод изучения фракции выживших клеток после облучения опухоли.

В итоге, на примере меланомы В-16 и саркомы-180 показана возможность получения ответа опухоли отдельного животного для каждого из трех видов ионизирующего излучения (рентгеновского, тепловых нейтронов и комбинированного воздействия тепловых нейтронов с 10BSH), когда по известному значению параметра К и уравнению линии регрессии с учетом ее доверительной зоны, может быть определена ожидаемая величина Т(з), Т(ДОр.) или вычислить через Wl(d/0) степень подавления синтеза ДНК опухолевых клеток, или по параметру М — долю «выжившего» после облучения опухоли объема.

Таким образом, в результате проведенного комплекса исследований, разработана система индивидуального количественного прогноза эффективности лучевого воздействия на опухоль с использованием параметров выведения меченного гамма-излучающими радиоактивными изотопами ИДУР, что позволяет неинвазивно прогнозировать эффективность лучевого воздействия на опухоль в течение первых двух суток.

Практическая значимость проведенных исследований заключается в возможности получения дополнительных сведений об индивидуальной чувствительности опухоли на терапевтическое лучевое воздействие с элементом предсказания дальнейшего развития опухоли, что позволит более точно выбирать для каждого пациента оптимальный режим облучения. Данный метод может быть инструментом, дающим возможность обеспечить более раннее (в первые 48 ч) распознавание ответа опухоли на проводимую терапию.

Принципиально важно отметить, что разработанная и предлагаемая методика может быть использована не только при оценке лучевого воздействия, но и при других видах противоопухолевой терапии.

172