Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Клинико-диагностическое значение антимикробных пептидов у больных язвенным колитом

На правах рукописи

ИЛЬЯШЕНКО МАРИЯ ГЕОРГИЕВНА

КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АНТИМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ У БОЛЬНЫХ ЯЗВЕННЫМ КОЛИТОМ

14.01.04 — внутренние болезни

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

19 н:он 2011

Ростов-на-Дону 2014

005550018

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук

Тарасова Галина Николаевиа

Официальные оппоненты: Корочанская Наталья Всеволодовна

доктор медицинских наук, профессор Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Краевая клиническая больница № 2» Министерства здравоохранения Краснодарского края, руководитель гастроэнтерологического центра Павленко Владимир Васильевич доктор медицинских наук, профессор Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ставропольский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующий кафедрой пропедевтики внутренних болезней

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет имени А. И. Евдокимова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится ¿¿/-(i^/^J? 2014 года в /Р ^Часов на заседании диссертационного совета Д 208.082.02 на базе Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29.

С диссертацией можно ознакомиться на сайте http://www/rostgmu.ru и в библиотеке ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России.

Автореферат разослан 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Беловолова P.A.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) носят упорный рецидивирующий хронический характер с чередованием эпизодов обострений и периодов ремиссии, что объясняет постоянный интерес исследователей к изучению патогенетических механизмов трансформации клинического благополучия в обострение симптоматики заболевания (Халиф И.Л. с соавт., 2009; Белоусова Е.А. и соавт., 2010; Баранов A.A. с соавт., 2011; Павленко В.В., 2013). Местные и системные воспалительные реакции стенки кишки провоцируются рядом факторов, в том числе продуктами бактериальной жизнедеятельности (Ливзан М.А., 2012). Контакт с патогенными бактериями активирует «врожденную кишечную защиту» путем экспрессии провоспалитель-ных генов и секреции цитокинов и хемокинов (Агафонов В.Е. с совт., 2011; Окороченков С.А. с соавт., 2012). Сохранность слизистой оболочки (СО), наличие обострения или ремиссии ВЗК зависят от установления баланса между патогенными факторами и компонентами системы защиты (Steinstraesser L., 2010). Эндогенные антимикробные пептиды (АМП) относятся к неспецифическим факторам гуморальной врожденной иммунной системы и обеспечивают защиту против широкого спектра бактерий, грибов и оболочечных вирусов (Алешина Г.М., 2010). Секреция АМП клетками кишечной стенки направлена на активацию врожденных иммунных механизмов (Кулакова Е.В. с соавт., 2012), однако сопряжение их уровней с течением ВЗК, динамичное изменение при лечении остается неясным, что обеспечивает актуальность работ в этом направлении.

Одним из факторов, определяющих состояние барьера СО, является группа протеинов, объединяемых термином «дефензины» (Никитина И.Г. с соавт., 2012). Дефензины представляют собой высоко-потентные естественные антибиотики организма и относятся к группе АМП. В тонкой кишке продуцируются а-дефензины HD5 и HD6, в толстой - многие ß-дефензины (Kim J.Y. et al., 2009). Предполагается, что дефензины образуют «первую линию защиты» СО, которая предохраняет организм от широкого спектра микроорганизмов (Chu H. et al., 2012). Дефензины действуют антибактериально, связываясь с наружной оболочкой бактерий и образуя в ней микропоры, что в итоге нарушает ее целостность и ведет к гибели микроорганизма. Дефензины обезвреживают грамнегативные и грампозитивные бактерии, ки-

слотоустойчивые палочки, грибковые микроорганизмы, вирусы и протозоиды (Будихина А.С. с соавт., 2008). Кроме этого дефензины могут оказывать влияние на процессы воспаления, пролиферации, ранозаживления, продукцию цитокинов, хемотаксис иммунокомпе-тентных клеток в организме человека (Мамчур В.И. с соавт., 2012; Bals R., 2000). Другим функциональным классом иммунозащитных пептидов для кишечного эпителия выступают металлсвязывающие вещества. К ним можно отнести кальпротектин, связывающий цинк, кальций и действующий бактериостатически (Rheenen P.V. et al., 2010). Биологическая функция кальпротектина заключается в регуляции процессов воспаления (привлечение моноцитов), антимикробной активности (локальное ингибирование цинк-зависимых металлопро-теиназ), антипролиферативной активности (индукция апоптоза) (Roon А. С. V., 2007). Фекальный кальпротектин (ФК) у пациентов с ВЗК отражает миграцию лейкоцитов через стенку кишечника (Rheenen P.V. et al., 2010). Однако в настоящий момент раскрыты не все прогностические потенции кальпротектина для характеристики течения ВЗК.

У больных ВЗК в результате исследования уровней АМП в биологических объектах получены малочисленные и весьма противоречивые результаты (Kanmura S. et al., 2009). Повышение содержания а-дефензинов в сыворотке крови, Р-дефензинов в кале у больных с язвенным колитом (ЯК) отмечают Mahida Y.R. et al. (2004), Yamagu-chi N. et al. (2009), Кулакова E.B. с соавт. (2012). Напротив, в работе Bhat S. и Milner S. (2007) авторы обращают внимание на пониженный уровень Р-дефензина в кале, отмечая, что это обстоятельство может способствовать дальнейшему инфицированию и септическому течению воспалительного процесса. Неоднозначность выводов, возможно, связана с тем, что в исследованиях не изучена зависимость между продукцией дефензинов и характеристиками ЯК (тяжесть течения, локализация воспаления в толстой кишке, длительность ремиссии). Дальнейшее изучение роли АМП в этом направлении сможет уточнить компоненты патогенеза ЯК, расширить диапазон диагностических и терапевтических перспектив исследования АМП при ВЗК.

Цель исследования: изучить особенности продукции АМП и их связь с изменениями толстокишечной микробиоты у больных с ЯК, определив их клинико-диагностическое значение.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ шкальной оценки активности и тяжести ЯК, определив эффективность ее применения в клинической практике.

2. Определить содержание антимикробных пептидов (а- и Р-дефензинов, кальпротектина) в разных биологических объектах (сыворотка крови, копрофильтрат) у больных с ЯК в зависимости от фазы заболевания и распространенности воспалительного процесса в толстой кишке.

3. Исследовать динамику продукции антимикробных пептидов (а- и Р-дефензинов, кальпротектина) в разных биологических объектах (сыворотка крови, копрофильтрат) и состояние микробиоты толстой кишки у больных с ЯК в зависимости от клинико-эндоскопических характеристик и длительности базисной терапии заболевания.

4. Определить зависимость между уровнем продукции а- и Р-дефензинов, фекального кальпротектина и клинико-эндоско-пическими критериями активности и тяжести рецидива ЯК, обосновав возможность их использования в качестве неинвазивных диагностических маркеров.

5. Оценить диагностическое и прогностическое значение фагоцитарного потенциала клеток крови для оценки степени активности ЯК.

6. Модифицировать алгоритм диагностики и лечения ЯК с использованием неинвазивных маркеров прогноза риска развития рецидива заболевания.

Научная новизна

Впервые выявлено патогенетическое значение дефензинов и толстокишечной микробиоты у больных ЯК в зависимости от распространенности патологического процесса.

Впервые установлены новые интегральные маркеры оценки эффективности терапии рецидива ЯК, основанные на определении а-дефензина в сыворотке крови, Р-дефензина и кальпротектина в ко-профильтрате.

Впервые установлено влияние стандартной терапии рецидива ЯК на уровень секреции а- и р-дефензинов нейтрофилами.

Впервые, с использованием пограничных уровней а-дефензина в сыворотке крови, Р-дефензина и фекального кальпротектина в копро-фильтрате был разработан и математически обоснован способ про-

гнозирования риска развития рецидива ВЗК (патент № 2517069, публикация в 15 бюллетене от 27.03.14 г.).

Расширен стандартный алгоритм диагностики и лечения ЯК за счет включения комплекса неинвазивных маркеров, дополняющих оценку достижения клинико-эндоскопической ремиссии и прогноз риска раннего рецидива заболевания.

Практическая значимость

Разработаны дополнительные интегральные критерии оценки активности рецидива и достижения полноценной клинико-эндоскопической ремиссии ЯК, которые могут быть использованы в клинической практике для оптимизации курсовой медикаментозной терапии заболевания.

Разработан алгоритм прогнозирования рецидива ЯК, основанный на определении содержания а-дефензина в сыворотке крови, р-дефензина в кале и фекального кальпротектина, активности и интенсивности фагоцитарного звена иммунной системы, коррелирующих с эндоскопической активностью заболевания и площадью вовлечения кишки в воспалительный процесс, позволяющий сформировать группы больных с ЯК с высоким риском раннего рецидива и персонифицировать программы поддерживающей терапии заболевания.

Основные положения работы, выносимые на защиту

У больных с рецидивом ЯК увеличена продукция антимикробных пептидов (а-, р-дефензина, кальпротектина), изменена микро-биота толстой кишки (увеличена пропорция условно-патогенной микрофлоры, при значительном снижении нормобиотических компонентов), зависящие от активности и распространенности воспалительного процесса в толстой кишке, приводящие к снижению муко-зальной защиты СО толстой кишки

У больных с ЯК в период рецидива заболевания при высокой активности воспаления и распространенном и / или тотальном поражении толстой кишки развивается снижение интенсивности фагоцитоза и ограничение функциональных резервов нейтрофилов крови

Определение концентрации а-дефензина в сыворотке крови, Р-дефензина и кальпротектина в копрофильтрате позволяет получить дополнительные неинвазивные интегральные критерии оценки активности заболевания и стадировать течение болезни, оценить достижение полноценной ремиссии и прогнозировать риск раннего рецидива ЯК.

Личный вклад автора. Личное участие автора в получении научных результатов, излагаемых в диссертации, осуществлялось на всех этапах работы и включало: отбор пациентов, проведение полного клинического и эндоскопического обследования, первичную обработку полученного материала, его систематизацию, статистическую обработку и анализ результатов, написание статей в профильных научных журналах, внедрение результатов научного исследования в клиническую практику работы гастроэнтерологического отделения клиники РостГМУ МЗ РФ, амбулаторно-поликлинического отделения МБУЗ КДЦ «Здоровье».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из которых 4 статьи в рецензируемых журналах. Получен патент на изобретение № 2517069 «Способ прогнозирования риска развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника» (публикация в 15 бюллетене от 27.03.14 г.).

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на ежегодной конференции «Диагностической медицинской ассоциации» (ДиаМА) (г. Москва, 1-4 октября 2012 г.), XIII Международном Конгрессе хирургов и гастроэнтерологов (г. Баку, 2013), V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (г. Ростов-на-Дону, 3-5 октября 2013 г.).

Внедрение результатов работы в практику. Материалы и результаты исследования применяются в учебном процессе на кафедре пропедевтики внутренних болезней, факультете повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов РостГМУ (кафедра гастроэнтерологии и эндоскопии с курсом клинической фармакологии). Результаты работы внедрены в практику работы отделения гастроэнтерологического клиники РостГМУ МЗ РФ, амбулаторно-поликлинического отделения МБУЗ КДЦ «Здоровье». Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, содержит 78 таблиц, иллюстрирована 11 рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Указатель литературы включает в 247 источников, из них 87 отечественных и 160 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В основу работы легли результаты открытого мультиэтапного проспективного клинического исследования 63 больных с ЯК.

На первом этапе проводился скрининг больных с ЯК и включение их в программу исследования в соответствии с критериями включения и исключения. Критерии включения: пациенты обоего пола любой расы в возрасте от 16 до 45 лет; верифицированный диагноз ЯК с длительностью заболевания не менее 1 года и наличием не менее 2 рецидивов в анамнезе (анализ частоты рецидивов проведен по данным медицинской документации); информированное согласие пациента. Критерии исключения: беременные, кормящие грудью женщины; наличие злокачественных новообразований в настоящее время или анамнестические указания; клинически значимые отклонения от нормы, включая тяжелую патологию печени, сердечно-сосудистой системы, легких и почек.

В зависимости от локализации воспалительного процесса в кишечнике и активности заболевания были сформированы 3 группы:

1 группа — 18 (29%) пациентов с дистальной формой ЯК, протекающей в виде проктосигмоидита со средней степенью активности;

2 группа - 24 (38%) пациента с левосторонней локализацией патологического процесса и средней степенью активности; 3 группа -21 (33%) пациент с тотальной формой ЯК и средней степенью активности. В 1 группе число мужчин было 10 (55,6%), женщин - 8 (44,4%). Во 2 группе больные мужского пола составили 12 (50%), женщины - 12 (50%). В 3 группе количество мужчин 10 (47,6%), женщин - 11 (52,4%). Возраст больных 1 группы в среднем составил 34,5±1,3 лет, во 2 группе - 33,7±1,5 лет, в 3 группе - 33,1 ±1,4 года. Контрольная группа сформирована из 25 здоровых добровольцев (11 (44%) мужчин и 14 (56%) женщин), в возрасте от 18 до 30 лет (средний возраст 26,7±1,2 лет), у которых после полного клинического обследования не выявлено клинических признаков заболеваний органов пищеварения.

На втором этапе исследования проводилось специальное лабораторное обследование, включающее определение факторов врожденного антимикробного иммунитета, фагоцитарной активности ней-трофилов, количественного определения содержания кальпротектина

в кале (ФК). После проведения специального лабораторного обследования больным назначалась терапия, регламентируемая стандартом специализированной медицинской помощи (Пр. МЗ и CP РФ от 08.06.2007 г. № 406 «Об утверждении стандарта медицинской помощи больным с язвенным колитом (при оказании специализированной помощи»).

Оценка эффективности курсового лечения проводилась на 4, 8 и 12 неделе с использованием комплекса клинических и эндоскопических индексов активности, позволяющих оценить степень тяжести заболевания, определить фазу клинической, клинико-эндоско-пической и эндоскопической ремиссии ЯК. При достижении клини-ко-эндоскопической ремиссии заболевания больным повторно проводилось специальное лабораторное обследование, позволяющее оценить влияние стандартной терапии на систему врожденного антимикробного иммунитета, фагоцитарную активность нейтрофилов, продукцию кальпротектина.

На третьем этапе - аналитическом, проводилась комплексная оценка клинико-эндоскопических маркеров активности ЯК, результатов динамического специального лабораторного обследования с использованием корреляционно-регрессионного и факторного анализов. С помощью ROC-анализа выявлялись диагностические точки разделения для АМП, которые были использованы в качестве интегральных критериев прогноза раннего рецидива заболевания.

Диагноз ЯК, фазу активности, распространенность воспалительного процесса в толстой кишке верифицировали с использованием балльной методики, определяя клиническую составляющую индексов Truelove S.C., Witts L.J. (1955), Rachmilewitz D. (1989). Эндоскопическое исследование толстой кишки проводилось по общепринятой методике с использованием видеоинформационных систем EVIS EXERA II «OLYMPUS» (Япония) и PENTAX (ЕРК-1000). В процессе видеоколоноскопии проводился прицельный забор колонобиоптатов для последующего патогистологического исследования. Полуколичественная оценка активности ЯК проводилась перед включением больных в настоящее исследование, а также через 4, 8 и 12 недель курсового лечения. С этой целью использовались индексы эндоскопической активности (Rachmilewitz D. and Intern. St. Gr., 1989), редуцированный и полный индекс Mayo (Schroeder K.W. et al., 1987).

Состояние толстокишечной микробиоты оценивалось с использованием отраслевого стандарта диагностики дисбактериоза кишечника «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» (ОСТ 91500.11.0004-2003, утвержден Пр. МЗ РФ №231 от 09.06.2003).

Оценка функциональной и метаболической активности фагоцитов проводилась стандартным методом по процентному количеству нейтрофилов и моноцитов с поглощенными частицами латекса и фагоцитарному числу, по оценке их способности поглощать нитросиний тетразолий (НСТ-тест) в спонтанном и активированном состояниях. Лабораторная оценка маркеров синдрома системной воспалительной реакции включала определение количества лейкоцитов крови, СОЭ, содержание фибриногена и С-реактивного белка в сыворотке крови. Количественное определение содержания ФК проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) (ELISA) стандартными наборами Buhlmann (Швейцария). Содержание дефензинов в биологических объектах, также определяли с помощью ИФА. Содержание а-дефензина в сыворотке крови определяли с использованием набора реагентов для определения а.-дефензина 1-3 (НВТ, Нидерланды). Контролем служил HNP-1 (human neutropil peptide-1). Количественное определение р- дефензина в образцах стула проводили ИФА (ELISA) с помощью стандартного набора (ВСМ Diagnostics, США).

Статистический анализ результатов исследования проводился с помощью программы STATISTICA 7.0 (StatSoft Inc., США). Для расчета чувствительности и специфичности диагностических тестов, нахождения диагностических точек разделения использовался ROC-анализ (Receiver Operating Characteristic) с помощью программы MedCalc (версия 9.3.5.0).

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Известно, что от активности фагоцитоза зависит функция разрушения и выведения иммунных комплексов из организма, активно образующихся при ВЗК (Плеханова Н.Г. с соавт., 2011). При этом важно, чтобы возможности фагоцитов к захвату антигенов были адекватны возросшему количеству бактериальных и тканевых антигенов при ЯК, но при этом не вызывали повреждения собственного эпителия толстой кишки (Ливзан М.А. с соавт., 2013).

Фагоцитарная активность нейтрофилов у больных с язвенным колитом в зависимости от фазы заболевания и локализации воспаления

Показатель Фаза ЯК Контрольная группа (п=25) 1 группа (п=18) 2 группа (п=24) 3 группа (п=21)

Активность фагоцитоза, % Рецидив 74,5± 1,13 87,3±2,5* 75,1 ±2,1* 52,2± 1,7*'°

Ремиссия 76,4±1,8** 80,б±1,8 61,3± 1,4*,**

Интенсивность фагоцитоза, шт Рецидив 7,3±0,3 4,5±0,4* 4,4±0,3* 3,2± 0,2*'°

Ремиссия 6,1±0,3*,** 5,2±0,2*,** 3,8± 0,4*

HCT спонт., % Рецидив 46,6±1,33 67,8±1,6* 55,2±1,7*' 59,3± 1,3*'

Ремиссия 56,2± ] ** 46,3±1,4** 50,4± 1,6**

HCT стим., % Рецидив 65,3±1,88 78,1±1,5* 66,4±1,4* 62,5± 2,1*

Ремиссия 82,4±1,8* 76,8± 2,0*,** 60,3± 1,9

Коэффициент стимуляции, у.е. Рецидив 1,41±0,002 1,18±0,03* 1,22±0,02* 1,05± 0,01**

Ремиссия 1,47±0,02** 1,66± 0,06*,** 1,18± 0,03*,**

Примечание: * — достоверные различия по сравнению с контрольной группой; " - по сравнению с 1 группой; ° — по сравнению со 2 группой, ** — достоверные различия по сравнению с рецидивом заболевания при р<0,05.

Результаты исследования показали, что активность и интенсивность фагоцитоза, а также значения спонтанного и стимулированного НСТ-теста у больных с рецидивом ЯК характеризовались дискор-дантными изменениями: зарегистрировано снижение интенсивности фагоцитоза на 38,4%, 39,7% и 56,2% и увеличение спонтанного НСТ теста на 45,5%, 18,5% и 27,3% соответственно по сравнению со значениями в группе здоровых добровольцев (р<0,05) (табл. 1).

При наступлении ремиссии ЯК у больных всех групп повышение активности и интенсивности фагоцитоза, расширение метаболического резерва в стимулированном НСТ-тесте свидетельствовали об активации фагоцитарной функции клеток крови.

У больных с рецидивом ЯК и здоровых волонтеров в кале изучался уровень чувствительного и специфического маркера воспаления кишечника — ФК. Содержание ФК у больных ЯК в зависимости от фазы заболевания, локализации и активности воспаления представлено в таблицах 2-3.

Таблица 2

Содержание фекального кальпротектина у больных язвенным колитом в зависимости от фазы заболевания и локализации воспаления

Показатель Фаза ЯК Контрольная группа (п=25) 1 группа (п=18) 2 группа (п=24) 3 группа (п=21)

Фекальный кальпротек-тин, мкг/г Рецидив 38,4±1,9 320,8± 9,3* 404,0± 7,0*' 401,3± 8,4*'

Ремиссия 145,4± 6,2*,** 112,3± 7 2* **" 137,5± 2 |* **о

Примечание: * — достоверные различия по сравнению с контрольной группой; * — по сравнению с 1 группой; ° — по сравнению со 2 группой, ** — достоверные различия по сравнению с рецидивом заболевания при р<0,05.

Результаты исследования продемонстрировали наличие прямой зависимости между увеличением концентрации ФК и активностью заболевания: в 1 группе при минимальной и умеренной эндоскопической активности концентрация ФК увеличивалась в 6,5 и 8,8 раза соответственно (р<0,001). Во 2 и 3 группах зарегистрированы аналогичные изменения: увеличение концентрации ФК колебалось в интервале в 9,8-10,6 раза при минимальной и умеренной активности, в то время как при высокой активности зарегистрирован максимальный прирост ФК, превышавший значения группы здоровых волонтеров в среднем в 11,7 раз (р<0,001). Также была выявлена зависимость между увеличением ФК и протяженностью воспаления в толстой кишке. Так, у больных 2 и 3 групп концентрация ФК превышала в среднем в 1,26 раза значения в 1 группе (р<0,05) (табл. 3).

Содержание фекального кальпротектина (мкг/г) у больных с рецидивом язвенного колита в зависимости от эндоскопической активности по Мауо-8сЬгое(кг

Эндоскопическая активность ЯК Контрольная группа, п=25 1 группа, п=! 8 2 группа, п=24 3 группа, п=21

Минимальная (п,=5, п2=5) 38,4±1,9 249,4±5,2° 377,8±2,3°" ~

Умеренная (П|=13, П2=18, п3=18) 339,2±9,5°* 406,7±8,6°*' 403,8±9,3°"

Выраженная (п2=1, п3=3) - 448 453,2±1,6°**

Примечание: ° - достоверные различия по сравнению с контрольной группой, *- достоверные различия по сравнению с минимальной активностью, ** - по сравнению с умеренной активностью, *- по сравнению с 1 группой.

При достижении клинико-эндоскопической ремиссии констатировано снижение концентрации ФК в 1, 2 и 3 группах на 54,7%, 72,2% и 65,7% соответственно (р<0,001). Таким образом, выявленная прямая зависимость между активностью ЯК, площадью поражения толстой кишки и продукцией ФК позволяет использовать указанный показатель в качестве дополнительного неинвазивного критерия клинической и эндоскопической активности ЯК.

Известно, что дефензины способны быстро и эффективно уничтожать клетки патогенных микроорганизмов, обладают широким спектром антибактериального действия, активны в отношении штаммов, резистентных к классическим антибиотикам, участвуют в формировании многих клинически значимых патологических процессов, включая ВЗК (Rapista A. et al., 2011, Мамчур В.И. с соавт., 2012).

В настоящем исследовании изучалось содержание дефензинов в биологических объектах у больных ЯК в зависимости от фазы заболевания и локализации воспаления (табл. 4).

Содержание дефензинов у больных с язвенным колитом в зависимости от фазы заболевания и локализации воспаления

Показатель Фаза болезни Контрольная группа (п=25) 1 группа (п=18) 2 группа (п=24) 3 группа (п=21)

а-дефензин в крови, нг/мл Рецидив 71,7±3,8 471,8± 9,9* 853,5± 19,5*' 479,3± 16,8*°

Ремиссия 170,6± 4 5* ** 164,7± 5 7* ** 177,5± 8,6*,**

Р-дефензин в кале, нг/г Рецидив 32±3,7 218,5± 8,2* 210,8± 4,3* 261,7± 9,2*'°

Ремиссия 60,4± 8,5*,** 100,2± 7 **• 87± 4 3* ***

Примечание: 0 — достоверные различия по сравнению с контрольной группой, *— достоверные различия по сравнению с минимальной активностью, ** — по сравнению с умеренной активностью, *— по сравнению с 1 группой.

Результаты исследования показали, что у здоровых волонтеров содержание а-дефензина в сыворотке крови колебалось в интервале от 45 до 93 нг/мл, при среднем значении 71,7±3,8 нг/мл. Концентрация Р-дефензина в кале варьировала от 4 до 72,5 нг/г, средний уровень составил - 32±3,7 нг/г. У больных 1 группы в фазе рецидива ЯК уровень а-дефензина в сыворотке крови в 6,6 раз превышал релевантные значения нормы. Концентрация Р-дефензина в кале составила 218,5±8,2 нг/г, что в 6,8 раз превышало значения в группе здоровых волонтеров (р<0,001). У больных 2 группы уровень а-дефензина в сыворотке крови колебался в широких пределах: от 459 до 1248 нг/мл, составив в среднем - 853,5± 19,5 нг/мл, что в 11,9 раз превышало релевантные значения нормы (р<0,001). Средний уровень Р-дефензина в кале составил 210,8±4,3 нг/г, что в 6,6 раз превышало значения группы контроля (р<0,001). У больных в 3 группе при рецидиве ЯК констатированы аналогичные изменения АМП. Так, среднее значение концентрации а-дефензина в сыворотке крови составило 479,3±16,8 нг/мл и в 6,7 раз превышало контрольную величину. Концентрация р-дефензина в кале составила 261,7±9,2 нг/г, что в 8,2 раза (р<0,001) превышало значения в группе здоровых волонтеров. Результаты внутригруппового анализа показателей АМП в зависимо-

сти от степени эндоскопической активности ЯК, оцениваемой по индексу Мауо-8с11гоес1ег, представлены в таблице 5.

Таблица 5

Содержание антимикробных пептидов в сыворотке крови и кале у больных с рецидивом язвенного колита в зависимости от эндоскопической активности по Мауо-БсИгоескг

Группа Эндоскопическая активность по Мауо-БсИгоескг

Минимальная (п,=5, п2=5) Умеренная (п,=13,П2=18,П3=18) Выраженная (п2=1, п3=3 )

а-дефензин в крови, нг/мл

Контрольная группа, п=25, 71,7±3,8

1 группа 456,5±9,0° 491,8±8,4*° -

2 группа 527,3±8,3° 853,5±19,5*° 1012

3 группа - 479,3±13,5° 768,4±11,9**°

В-дефензин в кале, нг/г

Контрольная группа, п-25, 32±3,7

1 группа 111,5±7,9° 218,5±8,0*° -

2 группа 148,4±5,0° 210,8±4,8*° 250

3 группа - 251,7±10,1° 361,7±12,1 **°

Примечание: ° - достоверные различия по сравнению с контрольной группой, *- достоверные различия по сравнению с минимальной активностью, ** - по сравнению с умеренной активностью

Как следует из данных, представленных в таблице 5, у больных с рецидивом ЯК зарегистрирована прямая зависимость между эндоскопической активностью заболевания и уровнем а- и р-дефензинов. Так, при дистальном поражении толстой кишки при минимальной и умеренной эндоскопической активности ЯК констатировано увеличение а-дефензина в сыворотке крови в 6,4 и 6,9 раза превышавшее уровень в группе контроля (р<0,001). Во 2 группе больных констатированы аналогичные изменения: содержание а-дефензина сыворотки крови при минимальной, умеренной и выраженной активности в 7,4, 11,9 и 14,1 раза соответственно превышало контрольные значения. В 3 группе, при умеренной и выраженной эндоскопической активности ЯК, зарегистрировано увеличение концентрации а-дефензина в 6,7 и 10,7 раза превышавшее значения в группе здоровых волонтеров (р<0,001). При изучении концентрации р-дефензина в копрофильтра-те выявлена аналогичная зависимость. Так, в 1, 2 и 3 группах при

минимальной и умеренной эндоскопической активности ЯК зарегистрировано увеличение концентрации Р-дефензина в 3,5, 6,8 и 7,8 раза (р<0,001). При увеличении активности до выраженной степени зарегистрирована максимальная концентрация Р-дефензина в копро-фильтрате, которая в 7,8 и 11,3 раза превышала значения группы контроля (р<0,001).

При достижении клинико-эндоскопической ремиссии на фоне курсовой терапии ЯК в 1, 2 и 3 группах зарегистрировано снижение средних величин а-дефензина в сыворотке крови: 170,6±4,6 нг/мл, 164,7±5,7 нг/мл и 177,5±8,6 нг/мл соответственно, что в 2,7, 2,8 и 5,2 раза ниже значений в фазе рецидива заболевания. Однонаправленные изменения были констатированы при изучении продукции Р-дефензина. Так, во всех группах, при достижении клинико-эндоскопической ремиссии ЯК, концентрация Р-дефензина в копро-фильтрате снизилась в 1 группе с 218,5±8,2 нг/г до 60,4±8,5 нг/г, во 2 группе с 210,8±4,3 нг/г до 100,2±7,5 нг/г и в 3 группе больных с ЯК с 261,7±9,2 нг/г до 87±4,3 нг/г, что было в 3,6, 3 и 2,1 раза ниже уровня, определяемого при рецидиве заболевания (р<0,001).

С целью уточнения состояния толстокишечной микробиоты, ее влияния на базовые характеристики рецидива ЯК, показатели врожденного иммунитета и продукцию АМП проведено изучение бактериологического профиля толстой кишки. При проведении корреляционного анализа выявлены дискордантные изменения (табл. 6). Между содержанием основных компонентов толстокишечной нормобиоты (бифидо-, лактобактерии), индексами активности ЯК и эндоскопическими маркерами толстокишечного воспаления зарегистрирована обратная зависимость: -г=0,58, -г=0,52, -г=0,47, -г=0,55, -г=0,56, -г=0,51, -г=0,46, -г=0,53, соответственно (р<0,05). В свою очередь, между титрами условно-патогенных микроорганизмов (клостридии, энтерококки, грибы рода Candida) и а-дефензином в сыворотке крови установлена высокая положительная зависимость: г=0,75, г=0,71, г=0,73. Аналогичные взаимосвязи, также, зарегистрированы между продукцией Р-дефензина, содержанием кальпротектина и титрами клостри-дий, энтерококков, грибов рода Candida, протея, клебсиелл: г=0,82, г=0,84, г=0,75, г=0,71, г=0,78, г=0,80, г=0,78, г=0,62, г=0,61, соответственно (р<0,05).

Корреляционная матрица между содержанием толстокишечной микробиоты, эндоскопическими характеристиками язвенного колита, антимикробными пептидами и кальпротектином у больных с рецидивом

заболевания

Показатель Инд. Rachmi lewitz Инд. Мауо-Schroed er Ранимость СО Поражение СО а-дефен-зин в крови Р- дефен-зин в кале ФК

Бифидобак- -0,58* -0,52* -0,47* -0,55* -0,13 -0,25 -0,15

терии

Лактобакте- -0,56* -0,51* -0,46* -0,53* -0,24 -0,35 -0,19

рии

Клостридии 0,76* 0,78* 0,65* 0,74* 0,75* 0,84* 0,82*

E.coli 0,68* 0,66* 0,57* 0,62* 0,62* 0,77* 0,71*

типичные

Стафило- 0,52* 0,48* 0,41* 0,38 0,54 0,69* 0,67*

кокки

Энтерококки 0,63* 0,71* 0,60* 0,66* 0,71* 0,75* 0,71*

Грибы рода Candida 0,59* 0,62* 0,56* 0,68* 0,73* 0,78* 0,80*

Протей 0,44 0,37 0,33 0,41 0,45 0,78* 0,72*

Клебсиеллы 0,42 0,39 0,40 0,39 0,43 0,62* 0,61*

Конкордантная зависимость выявлена между титрами клостри-дий, энтерококков, грибов рода Candida, индексами активности ЯК (Rachmilewitz и Mayo-Schroeder) и эндоскопическими характеристиками воспаления СО толстой кишки: г=0,76, г=0,78, г=0,65, г=0,74, г=0,63, г=0,71, г=0,6, г=0,66, 1=0,59, г=0,62, г=0,56, г=0,68, соответственно (р<0,05). Выявленные корреляционые взаимоотношения свидетельствуют о влиянии АМП на профиль толстокишечной микробиоты и степень воспалительной реакции СО толстой кишки.

Результаты курсовой 12 недельной терапии больных с ЯК показали наличие несоответствия между частотой клинической и эндоскопической ремиссии заболевания. Так, на фоне 8-недельной базисной терапии, у больных 1 группы клиническая ремиссия ЯК по индексам Rachmilewitz, Truelove и Witts была достигнута в 11 (61,1%) случаях. Эндоскопическая ремиссия через 8 и 12 недель курсовой терапии была зарегистрирована в 9 (50%) и 18 (100%) случаях соответ-

ственно. Во 2 группе наблюдения через 8 недель лечения констатировано достижение клинической ремиссии заболевания с использованием аналогичных индексов в 6 (25%) и 7 (29,2%) случаях, а эндоскопической ремиссии лишь в 4 (16,7%) случаях, соответственно. Через 12 недель лечения, при использовании эндоскопических индексов Rachmilewitz и Mayo, констатировано наступление клинико-эндоскопической ремиссии заболевания во всех случаях. У больных 3 группы с тотальным поражением толстой кишки через 8 недель курсовой терапии уровень клинической ремиссии по индексам Rachmilewitz, Truelove и Witts был достигнут только в 2 (9,5%) и 3 (14,3%) случаях, а эндоскопическая ремиссия - в 1 (4,8%) наблюдении, соответственно. Выявленная особенность диктует необходимость динамического эндоскопического мониторинга с использованием комплексной шкальной оценки клинических и эндоскопических индексов (Rachmilewitz, Truelove and Witts, Mayo-Schroeder, полный индекс Mayo), позволяющего получить в фазе рецидива ЯК дополнительные критерии оценки тяжести течения, а в период медикаментоз-но-индуцируемой ремиссии стадировать наступление клинической и клинико-эндоскопической ремиссии заболевания.

С целью уточнения взаимосвязей между клинико-эндоско-пическими характеристиками ЯК, лабораторными показателями системной воспалительной реакции (СОЭ, СРБ), АМП и микробиологическим профилем толстокишечной микробиоты был проведен корреляционный анализ. Результаты анализа показывают наличие высокой корреляции между индексами, отражающими активность заболевания и лабораторными маркерами воспаления. Так, коэффициенты корреляции между клиническим индексом Rachmilewitz, уровнем лейкоцитов, СРБ и СОЭ составили: г=0,72, г=0,77, г=0,72 (р<0,05). Между клиническим индексом Truelove, Witts, СРБ, кальпротектином, а-дефензином в сыворотке крови и ß-дефензином в кале зарегистрирована высокая корреляция: г=0,68, г=0,78, г=0,73, г=0,61, г=0,60. Аналогичная прямая высокая зависимость была выявлена между эндоскопическим индексом Rachmilewitz, кальпротектином и ß-дефензином: г=0,82, г=0,85, соответственно (р<0,05).

Результаты корреляционного анализа явились основанием для разработки с помощью метода множественной регрессии математической модели, позволяющей рассчитать вероятность развития раннего рецидива ЯК по содержанию в сыворотке крови и кале эндогенных

АМП и фекального кальпротектина. Формула расчета представлена следующим выражением:

р= (0,0005*аД + 0,0014*РД + 0,002*ФК-0,4) *100%,

где р - вероятность развития рецидива ЯК в %; аД - содержание а-дефензина в крови в нг/мл; РД - содержание р-дефензина в кале в нг/г; ФК - содержание кальпротектина в кале в мкг/г.

Использование разработанной модели позволило выявить критерии вероятности раннего рецидива. В качестве точки разделения раннего рецидива была принята вероятность равная 50%. Величины равные или превышающие указанное значение свидетельствовали о наличии высокого риска раннего рецидива ЯК. В случаях более низких значений вероятности (< 50%), риск раннего рецидива был минимальным и состояние больного расценивалось как стойкая ремиссия заболевания.

С учетом результатов корреляционного анализа и с целью прогноза риска раннего рецидивирования ЯК был дополнительно проведен КОС-анализ с выделением диагностических точек разделения для а-дефензина, р-дефензина и кальпротектина. Результаты 110С-анализа позволили определить диагностические точки разделения: содержание а-дефензина в сыворотке крови - более 312 нг/мл (диагностическая чувствительность - 71%, диагностическая специфичность - 88%), р-дефензина в кале более 213 нг/г (диагностическая чувствительность - 78%, диагностическая специфичность - 85%) и кальпротектина в кале - более 232 мкг/г (диагностическая чувствительность - 82%, диагностическая специфичность - 89%). Вероятность развития раннего рецидива ЯК при достижении указанных диагностических точек разделения АМП и кальпротектина составила 50%. При превышении уровней сразу трех АМП в биологических объектах диагностическая чувствительность увеличивалась до 87%, а диагностическая специфичность составила 92%.

Таким образом, полученные в процессе исследования результаты демонстрируют важное значение продукции а- и Р-дефензинов, кальпротектина в инициации и поддержании воспаления в СО толстой кишки, что служит обоснованием целесообразности использования их в качестве дополнительных параметров, определяющих эффективность базисной медикаментозной терапии и прогнозирующих риск раннего рецидива ЯК.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что комплексное использование шкальных клинических и эндоскопических индексов (Rachmilewitz, Truelove and Witts, Mayo-Schroeder, полный индекс Mayo) расширяет возможности оценки тяжести рецидива ЯК, констатации наступления клинической, клинико-эндоскопической ремиссии заболевания на фоне курсовой базисной терапии заболевания.

2. Выявлено увеличение показателей а-дефензина, ß-дефензина и фекального кальпротектина в биологических объектах в период рецидива ЯК, находящееся в прямой зависимости от степени активности и распространенности воспалительного процесса в толстой кишке. Курсовая 12 недельная терапия ЯК сопровождается более чем 2-кратным снижением содержания а-дефензина в сыворотке крови, ß-дефензина в копрофильтрате и фекального кальпротектина.

3. У больных с рецидивом ЯК выявлена высокая прямая корреляционная зависимость между изменениями содержания разнообразия толстокишечной микробиоты, продукцией АМП и клинико-эндоскопическими критериями активности заболевания.

4. При рецидиве ЯК зарегистрировано снижение активности и интенсивности фагоцитоза, коррелирующее с распространенностью воспаления в толстой кишке и степенью тяжести заболевания.

5. При проведении ROC-анализа установлено, что при увеличении содержания а-дефензина в сыворотке крови более 312 нг/мл, ß-дефензина в копрофильтрате более 213 нг/г и кальпротектина в кале более 232 мкг/г риск рецидива ЯК повышается (диагностическая чувствительность 87%, диагностическая специфичность 92%). У пациентов с дистальным поражением толстой кишки реципрокное увеличение а-дефензина в сыворотке крови и ß-дефензина в копрофильтрате свидетельствует о прогрессировании заболевания и дальнейшим распространении воспалительного процесса в толстой кишке.

6. Использование определения концентрации АМП на этапе медика-ментозно-индуцированной ремиссии ЯК является надежным инструментом, позволяющим модифицировать диагностический стандартный алгоритм с целью определения уровня достижения полноценной ремиссии и прогноза раннего рецидива заболевания.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При обследовании больных с ЯК необходимо использовать комплексную шкальную оценку клинических и эндоскопических индексов (Rachmilewitz, Truelove and Witts, Mayo-Schroeder, полный индекс Mayo), позволяющую в фазе рецидива получить дополнительные критерии активности воспаления, а в период медикаментозно-индуцируемой ремиссии детально стадировать клиническую и кли-нико-эндоскопическую ремиссию заболевания.

2. Определение уровня ß-дефензина и кальпротектина в кале целесообразно использовать в качестве дополнительных неинвазивных критериев полноценности ремиссии и прогноза течения ЯК (патент на изобретение № 2517069 «Способ прогнозирования риска развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника», публикация в 15 бюллетене от 27.03.14 г.).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ильяшенко, М.Г., Тарасова Г.Н., Гусева А.И. Эпдогенные антимикробные пептиды и их клинпко-патогенетнческая значимость при воспалительных заболеваниях кншечника // Современные проблемы науки н образования. - 2012. - № 2; URL: www.science-education.ni/102-5922.

2. Ильяшенко, М.Г., Тарасова Г.Н., Федотова E.H., Чумакова Е.А. Фагоцитарная активность нейтрофильных гранулоцнтов у больных с воспалительными заболеваниями кишечника в зависимости от клинических характеристик заболевания // Практическая медицина. - 2012. - Т. 62. - № 7. - С. 170-173.

3. Бурцев, Д.В., Максимов А.Ю., Ильяшенко М.Г., Тарасова Г.Н. Многоэтапная система диагностики воспалительных и опухолевых заболевании толстой кишки. // Фундаментальные исследования. - 2012. - № 7 (часть 1). - С. 54-57.

4. Ильяшенко, М.Г., Абоян И.А., Ханамирова JI.3., Фролова Г.В. Функции эндогенных антимикробных пептидов и их патогенетическая и диагностическая значимость при воспалительных заболеваниях кишечника // Материалы ежегодной конференции ДиаМА «Актуальные проблемы деятельности консультативно-диагностических центров». Москва. — 2012. — С. 333—336.

5. Ильяшенко, М.Г., Тарасова Г.Н., Бурцев Д.В. Клиническая информативность содержания альфа- и бета-дефензннов в бно-

логических средах у больных язвенным колитом // Журнал экспериментальной и клинической гастроэнтерологии. -2013.-№9.-С. 29-33.

6. Ильяшеико, М.Г., Тарасова Г.Н. Содержание антимикробных пептидов в биологических средах у больных неспецифическим язвенным колитом в зависимости от распространенности процесса // Материалы XIII Международного Конгресса хирургов и гастроэнтерологов. Баку. -2013. -С.178.

7. Тарасова, Г.Н., Ильяшенко М.Г. Диагностическая значимость иммунозащитных пептидов у больных язвенным колитом для прогнозирования обострения заболевания // Материалы V Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины». Ростов-на-Дону. -2013.-С. 124-125.

8. Абоян, И.А., Ильяшенко М.Г., Ханамирова Л.З., Гуськова E.H. Фагоцитарная активность нейтрофильных гранулоцитов у больных с воспалительными заболеваниями кишечника // Современные диагностические технологии на службе здравоохранения. Омск. -2013.-С. 338-342.

9. Патент на изобретение «Способ прогнозирования риска развития рецидива воспалительных заболеваний кишечника» (№ 2517069, публикация в 15 бюллетене от 27.03.14 г.).

Список сокращений

АМП — антимикробные пептиды

ВЗК - воспалительные заболевания кишечника

HCT - нитросиний тетразолий

СО - слизистая оболочка

ФК - фекальный кальпротектин

ЯК - язвенный колит

Подписано в печать 29.04.2014. Сдано в печать 29.04.2014. Формат 60x84'/к,. Бумага офсетная. Тираж 100. Зак. 24.

Отпечатано в типографии ГБОУ ВПО РостГМУ Минздрава России. 344022, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29.