Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Клинико морфологическое обоснование периодической гипобарической гипоксической стимуляции в терапии атопической бронхиальной астмы у детей

На правах рукописи

ДРЁМОВА ЕКАТЕРИНА НИКОЛАЕВНА

КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ В ТЕРАПИИ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ У ДЕТЕЙ

14.01.08 Педиатрия 03.03.04 Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 7 ОКТ 2011

Оренбург-2011

4858026

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Воляник Маргарита Ннколаевна

з.д.н. РФ, доктор биологических наук, профессор, Стадннков Александр Абрамович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Скачкова Маргарита Александровна

доктор медицинских наук, профессор Ямщиков Николай Васильевич Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образование Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Зашита состоится «16» ноября 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208. 066. 01 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 460000, Оренбург, ул. Советская, 6, зал заседаний Учёного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Оренбургской государственной медицинской академии (460000, г. Оренбург, Парковый проспект, д. 7) и на сайтах Ш:т\ау.о^та.ги; referat_vak@mon.gov.ru

Автореферат разослан« ^^ » 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Т.Н. Соловых

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Во всем мире отмечается тенденция к росту заболеваемости бронхиальной астмой (БА). В настоящее время распространенность БА в России (по данным стандартизированных международных исследований ISAAC-International Study of asthma and Allergology in Childhood) составляет в детской популяции от 5 до 10% (Попова И.В. с соавт., 2004; Мачарадзе Д.Ш. с соавт., 2005). Остается очевидным необходимость дальнейшего активного поиска методов лечения и профилактики данной патологии, что неотделимо от углубления наших представлений о патогенетических механизмах развития и течения БА.

Периодическая гипобарическая гипоксическая стимуляция (ПГГС) является одним из видов немедикаментозных методов лечения больных БА. Показана высокая клиническая эффективность данного метода лечебной коррекции БА (Воляник М.Н., 1993; Дмитриева Т.В., 2006; Воляник О.В., 2008; Алеманова Г.Д., 2010). В тоже время механизм положительного влияния ПГГС на течение БА продолжает изучаться и уточняться. Было установлено, что важными факторами лечебного действия гипобаротерапии у больных БА является увеличение уровня биологически активных глюкокортикоидов в крови и их утилизация тканями (Михайлов A.M., 1982; Воляник М.Н., 1991; Колосова Е.Г., 2003).

Было выявлено наличие заметной связи между лечебным эффектом ПГГС и особенностями гормонального гомеостаза (Колосова Е.Г, 2003). Установлено, что хороший эффект наблюдался при нормализации уровня изучаемых гормонов. В случае, когда не отмечалось клинического улучшения течения БА, не регистрировались и изменения гормонального статуса сразу после проведения ПГГС и в катамнезе.

Накоплены данные по нормализации показателей иммунного гомеостаза под влиянием курса гипобаротерапии (цитокинового профиля -И Л-4, ИЛ-5, ИЛ-18, ИНФа, ИНФу, ФНОа, Г-КСФ, субпопуляций Т-лимфоцитов, ЦИК, IgG, IgM, IgA, IgE, относительного содержания эозинофилов). При этом установлено, что чем больше выражена положительная динамика иммунных показателей в сторону их нормализации, тем более эффективной оказывалась терапия (Воляник О.В., 2008; Алеманова Г.Д., 2010).

Были также получены сведения по влиянию ПГГС на нейрогуморальные факторы, а именно на содержание субстанции Р. При этом наибольшая эффективность гипобаротерапии наблюдалась у тех пациентов, у которых содержание данного нейропсптида достоверно понижалось в ходе терапии (Алеманова Г.Д., 2010).

Все эти данные свидетельствуют не только о положительном лечебном действии изучаемого метода терапии, но и о наличии тесной взаимосвязи

функционирования различных систем организма - иммунной, эндокринной и нервной, а также роли нейроэндокринноиммунной дисрегуляции в формировании и течении изучаемой патологии.

Необходимо отметить, что патологический процесс всегда приобретает генерализованный характер, выходя за пределы первичной локализации (Акмаев И.Г., 2003; Магаева C.B., Морозов С.Г., 2005; Кузнецов С.Л., 2008). Следует полагать, что и атопические заболевании (в том числе и БА) реализуются в повреждении различных органов и систем, и в первую очередь тех, которые представляют нейро-эпдокринно-иммунный комплекс.

В этой связи возникает необходимость в анализе взаимовлияний показателей функционально различных систем в их сочетанном вовлечении в единый патологический процесс. Такое исследование в современной науке осуществимо с помощью экспериментальной животной модели изучаемой патологии. С использованием животной модели становится возможным установление клеточных и тканевых реакций в жизненно важных органах при патологии (бронхиальной астме), что, безусловно, является существенным фундаментом для понимания закономерностей их адаптации, цито- и гистогенеза. Только при помощи экспериментальной модели БА возможно оценить структурно-функциональное состояние бронхолегочной системы во взаимосвязи с изменениями в органах иммуногенеза и центральных звеньях нейроэндокринной регуляции как при формировании патологии, так при лечебном воздействии ПГГС.

До настоящего времени отсутствуют морфологические исследования по изучению влияния ПГГС на структурно-функциональное состояния при БА органов бронхолегочной, иммунной, эндокринной систем, а также центрального звена нейроэндокринноиммунной регуляции - гипоталамо-гипофизарной нейроэндокринной системы (ГГНС).

Отсутствуют также работы по изучению состояния апоптоза клеток-участников аллергического воспаления при БА под влиянием лечения методом ПГГС. Все вышеизложенное явилось основанием для проведения настоящего исследования.

Цель исследования

Целью настоящей работы явилось установление патогенетических механизмов развития и течения бронхиальной астмы в аспектах клинико-экспериментальной оценки лечебного воздействия периодической гипобарической гипоксической стимуляции.

Задачи исследования

Для реализации поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Оценить клиническую эффективность периодической гипобаротерапии в лечении бронхиальной астмы у детей.

2. Определить уровень апоптоза эозинофилов периферической крови детей с БА под влиянием лечения методом ПГГС.

3. Экспериментально-гистологически исследовать морфофункциональ-ное состояние гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы, центральных и периферических органов иммунной системы, органов бронхолегочной системы в условиях моделирования бронхиальной астмы.

4. Установить характер влияния ПГГС на морфофункциональные особенности гипоталамической нейроэндокрипной регуляции и морфологическое состояние бронхолегочной системы у животных с экспериментальной БА.

Научная новизна работы

Впервые с использованием комплекса клинических, экспериментально-гистологических методик, в том числе иммуноцитохимической идентификации апоптоза лимфоцитов и эозинофилов, дано патогенетическое обоснование эффективности применения ПГГС в лечении БА.

Впервые на основании многоуровневых (светооптических, ультраструктурных, молекулярно-генетических) экспериментально-гистологических исследований проведена оценка состояния ГГНС и ГГАКС, центральных и периферических органов иммунной системы, органов бронхолегочной системы с установлением тканеспецифических и цитологических критериев оценки тяжести патологического процесса и его прогноза. Впервые установлена взаимосвязь изменений в ГГНС и ГГАКС с морфофункциональными характеристиками структур бронхов при формировании экспериментального аллергического воспаления и при его лечебной коррекции методом ПГГС.

Теоретическая и научно-практическая значимость

Получены новые данные, подтверждающие наличие дисбаланса неспецифической регуляции иммунных функций со стороны нонапептидергической гипоталамической нейроэндокрипной системы при течении атопической бронхиальной астмы, как усугубляющего механизма ее развития. Продемонстрирована взаимосвязь между уровнем морфофункционапьных изменений в бронхолегочной системе, центральных и периферических органах иммуногенеза и степенью диерегуляции в ГГНС и ГГАКС, что имеет существенное значение для педиатрии, клеточной биологии, цитологии и гистологии.

Высокая клиническая эффективность в реабилитации детей с атопической бронхиальной астмой позволяет рекомендовать данный метод немедикаментозного лечения для клинической апробации.

Установленные в процессе лечения ПГГС позитивные эффекты и гистологическая обоснованность использования ПГГС, касающиеся нормализации работы центральных звеньев нейроэндокринной регуляции, уменьшения степени выраженности аллергического воспаления в бронхах,

имеют клинически важное значение для дальнейшего обоснования новых и более эффективных способов лечебной коррекции данной патологии в педиатрии.

Реализация и внедрение результатов исследования

Результаты исследований используются в учебном процессе Оренбургской государственной медицинской академии при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах детских болезней лечебного факультета; гистологии, цитологии и эмбриологии.

Апробация материала

Основные положения диссертационного исследования были представлены на Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии в педиатрии» (Оренбург, 2003); на II Всероссийском конгрессе по детской аллергологии (Москва, 2003), на 3 Всесоюзной конференции «Современные технологии педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2004), на I Международной (X Всероссийской) Пироговской студенческой научной конференции (Москва 2006); на VI Международной (XV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Высокая клиническая эффективность ПГГС в реабилитации детей с атопической бронхиальной астмой позволяет рекомендовать данный метод немедикаментозного лечения.

2. Периодическая гипобарическая гипоксическая стимуляция способствует повышению апоптозной доминанты эозинофилов крови детей с БА, тем самым способствует их элиминации из очага аллергического воспаления.

3. Выраженность морфологических изменений органов бронхолегочной и иммунной систем в условиях экспериментальной бронхиальной астмы находится в тесной взаимосвязи со степенью структурно-функциональных нарушений важнейших регуляторных систем ГГНС и ГГАКС, что свидетельствует о роли нейроэндокринной дезадаптации в патогенезе развития аллергического воспаления.

4. Применение ПГГС в моделируемых условиях приводит к нормализации функционирования основных звеньев нейроэндокринной регуляции, к корригированию рассогласованности гипофизарно-надпочечникового взаимодействия, оптимизации эффекторного звена ГГАКС, повышению апоптозной доминанты эозинофилов, что позволяет уточнить механизм лечебного эффекта изучаемого метода терапии.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 7 в изданиях рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для защиты кандидатских и докторских диссертаций.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав с описанием собственных исследований, главы обсуждения их результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками, 21 таблицами. Библиография включает 186 отечественных и 121 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Под наблюдением находилось 80 детей с атопической бронхиальной астмой в периоде ремиссии в возрасте от 7 до 15 лет, равнозначное количество мальчиков и девочек, дети как препубертатного, так и пубертатного возраста (42 - 52,5% и 38 - 47,5% соответственно). Средняя продолжительность течения заболевания составила 6,8±3,1 лет, средний возраст начала болезни - 4,2±2,7 года. Преобладающую часть (65,0%) составили дети с легкими формами заболевания, при этом в 62,5% случаев отмечалась легкая персистирующая БА. Тяжелая персистирующая бронхиальная астма наблюдалась у 7 (8,7%) детей (табл. 1). Оценка тяжести течения бронхиальной астмы у детей проводилась по общепризнанной классификации (Национальная программа «Бронхиальная астма у детей. Стратегия лечения и профилактика». - 2008.)

Таблица 1

Характеристика наблюдаемых детей по степени тяжести БА, полу и возрасту

Легкая интермит-тирующая Легкая персистирующая Средней степени персистирующая Тяжелая персистирующая

Все дети (п=80) 2 (2,5%) 50 (62,5%) 21 (26,3%) 7 (8,7%)

Девочки (п=40) 2 (5,0%) 27 (67,5%) 8 (20,0%) 3 (7,5%)

Мальчики (п=40) 0 23 (57,5%) 13(32,5%) 4 (10,0%)

Препубертатный возраст (п=42) 1 (2,4%) 26 (61,9%) 11 (26,2%) 4 (9,5%)

Пубертатный возраст (п= 38) 1 (2,6%) 24 (63,2%) 10(26,3%) 3 (7,9%)

ДПП (п =18) 1 (5,6%) 11 (61,Г/о) 5 (27,7%) 1 (5,6%)

ДП (п =22) 1 (4,5%) 16(72,8%) 3(13,7%) 2 (9%)

МПП (п =24) 0 15(62,5%) 6 (25,0%) |3 (12,5%)

МП (п =16) 0 8 (50,0%) 7 (43,8%) 1 (6,2%)

Большинство (83,4%) детей на фоне проводимого курса ПГТС получали базисную медикаментозную терапию, из них 51,7% получали лечение препаратами кромоглициевой кислоты и 31,7% детей ингаляционные глюкокортикоидные препараты.

Основную группу составили 60 детей (30 девочек и 30 мальчиков), которые получали первичный курс прерывистой гипобарической гипоксии (при условии отсутствия острого или обострения основного или сопутствующих заболеваний на протяжения всего курса) Контрольную группу, сопоставимую с основной по возрасту, полу, стадии основного заболевания, получаемому ранее медикаментозному лечению, составили 20 детей с бронхиальной астмой, не получающие лечение методом ПГГС. При изучении состояния апоптоза эозинофилов периферической крови контрольную группу составили здоровые дети, без признаков какого-либо аллергическою заболевания, без наличия других хронических заболеваний.

Курс лечение методом ПГГС проводился в условиях многоместной медицинской вакуумной установки «Урал-1» по апробированной методике (Методические рекомендации «Лечение больных бронхиальной астмой в барокамере пониженного давления (гипобаротерапия)» Москва, 1991). Технические характеристики многоместной медицинской вакуумной установки «Урал-1»: объем барокамеры - 134 м3, количество посадочных мест - 27, лежачих мест - 5, рабочее давление при проведении процедур -6,1х104 Па (460 мм.рт.ст).

Курс лечения составили 22 сеанса, проводимых 5-6 раз в неделю в утреннее время. Каждый сеанс состоял из подъема, пребывания на «высоте» и спуска. При первом сеансе постепенно снижали барометрическое давление в камере соответственно подъему на высоту 1000 м над уровнем моря, при последующих сеансах прибавлялось по 500 м, доходя до конечной «высоты» 3500 м. На конечной высоте 3500 м над уровнем моря парциальное давление кислорода составляег 460 мм рт.ст. Скорость подъема составляла 3-5 метров в секунду, спуск осуществлялся со скоростью 1-2 метр в секунду.

Всем детям до начала лечения было проведено клинико-лабораторное исследование, включающее тщательный сбор анамнеза жизни, анамнеза заболевания (частота, длительность, тяжесть приступов, сезонность, предшествующие обострению заболевания, купирующие препараты), обследование педиатром, невропатологом, общий анализ крови, общий анализ мочи, показатели вентилометрии («Microplus», Англия), пикфлуометрии (PFM, Clement Clark, Англия). Все исследуемые наблюдались в течение всего курса баротерапии с контрольным обследованием непосредственно после и через год после окончания курса ПГГС.

Полученные результаты статистически оценивали по двустороннему критерию Фишера, t-критерию Стыодента. Вычисления производились с помощью программного пакета «Statistica 6.0». Данные представлены в виде

среднего арифметического по результатам каждого раздела исследования, +/- стандартное отклонение (s), ошибки средних величин (ш), а также медианы с указанием верхнего и нижнего квартиля. Достоверными считались отличия при р < 0,05(95,5%).

Создание экспериментальной модели бронхиальной астмы и реализация лечебной коррекции в эксперименте проводилось на 50 половозрелых особей мышей-самцов линии BALB/c весом 18-20 г. При выполнении исследования соблюдались правила биоэтики, утвержденные приказом МЗ СССР №755 от 12.05.1977, а также принципы гуманности, изложенные в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕЕС) и Хельсинской декларации по защите позвоночных животных, используемых для лабораторных и иных целей.

Подопытные животные были разделены на две группы: 1-я группа - 20 мышей с экспериментальной моделью бронхиальной астмы, не получающие лечение методом ПГГС; 2-я группа - 20 мышей с экспериментальной моделью бронхиальной астмы, получающие лечение методом ПГГС. В качестве контроля использовались 10 интактных животных, находящихся в условиях вивария.

Животные экспериментальных групп сенсибилизировались интраперитонеально двукратным введением 10 мкг овальбумина (Sigma), разведенного в 0,1 мл физиологического раствора, содержащего 2мг А1(ОН)з, на 0 и 14 день эксперимента. С 22 по 45 день эксперимента животные через день подвергались ингаляционному введению аэрозоля 1% раствора овальбумина по 30 минут в день с помощью компрессорного небулайзера (Omron С-28). Для осуществления ингаляций аэрозоля аллергена лабораторные животные помещались в камеру объемом 5 литров. С 22 дня эксперимента животные получали лечение методом периодической гипобарической гипоксической стимуляции в условиях экспериментальной барокамеры.

Каждый сеанс гипобаротсрапии состоял из подъема, пребывания на «высоте» и спуска. При первом сеансе постепенно снижали барометрическое давление в камере соответственно подъему па высоту 1000 м над уровнем моря, при последующих сеансах прибавлялось по 500 м, доходя до конечной «высоты» 3500 м. На конечной высоте 3500 м над уровнем моря парциальное давление кислорода составляет 460 мм рт.ст. Скорость подъема составляла 3-5 метров в секунду, спуск осуществлялся со скоростью 1-2 метр в секунду. Курс лечения состоял из 24 сеансов (22^15 дни эксперимента). Все сеансы проводились ежедневно в одно и то же утреннее время суток.

На 14, 21, 45 сутки после начала эксперимента по 5 животных из каждой группы выводились из опыта путем декапитации под нембуталовым наркозом. Для исследования проводился забор фрагментов гипоталамуса, аденогипофиза и нейрогипофиза, надпочечников, тимуса, трахеи, бронхов и

легочных структур. Данный материал от экспериментальных и контрольных животных был подвергнут стандартной однотипной гистологической обработке.

Морфофункциональные методы исследования

Для идентификации клеток с признаками апоптоза применяли иммуно1\итохимические реакции с моноклональными антителами: на определение экспрессии проапоптического белка р53 и каспазы 3. Кусочки тканей фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали и заливали в парафин. Исследование проводили на серийных парафиновых срезах толщиной 5-6 мкм. Срезы инкубировали с моноклональными антителами к р53 (фирма «Дако», Дания) в рабочем разведении 1:50, каспазы-3 (фирма BioGenex, США) в рабочем разведении 1:50. Для выявления иммунного окрашивания использовали стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод («Дако», LSAB-kit, Дания), затем осуществляли докрашивание ядер водным гематоксилином Майера.

Материалом для исследования состояния апоптоза у детей послужила периферическая кровь (мазки крови на специальных предметных стеклах для иммуноцитохимических исследований). Для идентификации клеток крови (эозинофилы) с признаками апоптоза применяли определение уровня экспрессии проапоптотического протеина р53 и выявление интрануклеосомной фрагментации ДНК методом TUNEL. Определение белка р53 производилось с помощью моноклональных антител (фирма «Дако», Дания). Для визуализации позитивного (р53) иммунного окрашивания клеток применяли стрептавидин-биотиновый пероксидазный метод с последующим докрашиванием ядер гематоксилином Майера. Для идентификации внутриядерной фрагментации ДНК использовали набор реактивов «Apoptag plus peroxidase in situ apoptosis detection kit» (фирма INTEGREN, Канада) с докрашиванием ядер 0,5% раствором мстиленового зеленого. Во всех случаях подсчитывали процент окрашенных клеток на 1000 клеток в случайно выбранных полях зрения.

Для светооптических исследований материал фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, спирт-формоле, жидкости Буэна, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заливали целлоидин-парафином. Приготовление серийных срезов толщиной 5-6 мкм осуществляли на ротационном микротоме МПС-2. Депарафинированные срезы окрашивали гематоксилином Майэра и эозином. Идентифицировали гликозаминогликаны - толуидиновым синим при значении рН 2,7-3,0, рибонуклеопротеиды - метиленовым зеленым и пиронином «G» по Браше. Гликоген и нейтральные мукополисахариды (гликопротеиды) определяли с помощью перйодат-Шифф реакции по Мак-Манусу. Гистохимические реакции сопровождались соответствующими ферментативными контролями (Пирс Э., 1962).

Для электронномикроскопических исследований материал фиксировали при +4°С в 2,5%-м растворе глютарового альдегида на S-коллединовом буфере (pH 1,2-1,А). Постфиксацию проводили в четырехокиси осмия по прописи G.Millonig (1961). Материал обезвоживали при комнатной температуре в ацетоне возрастающей концентрации и помещали в смолу ЭПОН-812. Полимеризацию объектов проводили при +60°С в течении 2 суток. С каждого блока на ультратоме LKB-5 (Sweden-Bromma) получали полутонкие (1мкм) и ультратонкие (40-60 нм) срезы. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим и основным фуксином по прописи M.Sato et E.Shamoto (1973). Полутонкие срезы использовали при подготовке блоков к заточке перед изготовлением ультратонких срезов, а также для анализа тканей и клеточной организации на световом уровне.

Ультратонкие срезы подвергали двойному контрастированию насыщенным спиртовым раствором уранилацетата при температуре +37°С в течение 20 минут и цитрате свинца по Reynolds (1963). Срезы изучали на электронном микроскопе ЭМВ 100АК, фотографирование структур проводили при увеличении от х5400 до х40000.

Морфометрическое исследование выполняли на препаратах с использованием стандартной окулярной сетки Автандилова Г.Г. (1990), а также винтового окуляр-микрометра МОВ-1-15хУ4,2. Вычисление площади поверхности ультраструктур осуществляли наложением на электронограмму точечной или квадратной сетки (Стропус P.A. с соавт., 1976; Якубов A.C., ЬГац В.А., 1984). Снятие морфометрических параметров проводили путем подсчета точек, попавших на структурные профили.

Полученные результаты статистически оценивали по двустороннему критерию Фишера, t-критерию Стьюдента. Вычисления производились с помощью программного пакета «Statistica 6.0». Данные представлены в виде среднего арифметического по результатам каждого раздела исследования, +/- ошибки средних величин (гп). Достоверными считались отличия при р < 0,05(95,5%).

Результаты собственного исследования и их обсуждение

В результате проведенных исследований было установлено, что наследственная предрасположенность к аллергическим болезням в анамнезе отмечалась у 47 (58,8±5,5%) детей, близкие родственники которых страдали тем или иным аллергическим заболеванием. Осложненное течение беременности и родов имели 62 (77,5±4,6%) матери наблюдаемых детей.

Оценивая спектр сенсибилизации у детей было выявлено, что среди причинно-значимых, первостепенное значение имеют аллергены домашней пыли и клещей домашней пыли семейства Dermatophagoides (41,2±5,5%). Большую долю в структуре сенсибилизации составили также пыльцевые (32,5±5,2%) и эпидермальные (18,7±4,4%) аллергены. Сопутствующие

аллергические заболевания у детей отмечались в виде проявлений атопического дерматита у 24 (30,0±5,1%), поллиноза у 26 (32,5±5,2%), отека Квинке у 8 (10,0±3,4%), крапивницы у 10 (12,5±3,7%) детей.

Среди факторов, способствующих формированию БА у детей, важное место принадлежит респираторно-вирусным инфекциям (Иллек Я.Ю., Зайцева Г.А. с соавт., 2008). У 61,2±5,4% детей манифестация БА произошла в период течения острой респираторной вирусной инфекции (ОРВИ). 53,8±5,6% детей относились к группе часто и длительно болеющих детей. У 18,8±4,4% детей частота ОРВИ в период манифестации БА превышала 10 случаев за календарный год.

У детей выявлена высокая частота различной сопутствующей патологии. Заболевания желудочно-кишечного тракта регистрировались у 61,2±5,4% пациентов, а заболевания ЛОР-органов, таких как хронический тонзиллит, аденоидиты, синуситы у 43,8±5,5% детей. Характерно, что частота сопутствующей патологии выше в старшей возрастной группе (пубертатный период).

При оценке клинической эффективности ПГТС было установлено, что использование метода ПГГС в комплексной терапии наблюдаемых пациентов позволило значимо снизить частоту симптомов заболевания, потребность в короткодействующих бронхолитических препаратах, достоверно повысить долю детей с контролируемым течением БА (табл. 2).

Таблица 2

Характеристика некоторых признаков БА у наблюдаемых детей до и через год после лечения методом ПГГС

Признак М±т

Симптомы астмы за месяц Исходно 10,8±0,9

Через год ПГГС 6,5±0,7

Р 0,001

Потребность в быстродействующих бронхолитиках в неделю Исходно 1,9±0,1

Через год ПГГС 1,2±0,1

Р 0,001

Достижение контроля (% пациентов) Исходно 65±6,2

Через год ПГГС 91,6±3,6

Р 0,001

Отмечалось (рис. 1) повышение доли детей с легкой интермиттирующей БА с 3,3% до 30% (р=0,0001), понижение доли детей со средней степени тяжести персистирующей Б А с 26,7% до 6,7% (р=0,001), уменьшение доли пациентов с тяжелой персистирующей астмой с 8,3 до 3,3% (р=0,2).

При оценке динамики степени тяжести болезни нами установлено, что у 33 (55,0%) детей основной группы через год после баролечения степень тяжести астмы была пересмотрена на более легкую, соответственно был изменен объем базисной терапии (одна ступень вниз), у 28 (45,0%) тяжесть заболевания не изменилось.

Эти данные свидетельствуют о том. что у большинства детей наступило улучшение в течение заболевания, уменьшилась потребность в бронхолитических препаратах. и была пересмотрена базисная ингаляционная терапия.

70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% -

0%

61.7%

.30,0%........_L

3,3%

60,0%

26.7%

.......R70/ 8.3%............

Т • Т......3,3%

IV

| □ до баротерапии □ после баротерапии

Рис 1. Динамика степени тяжести БА у детей основной группы до и после баротерапии

Примечание: I - легкая интермиттирующая бронхиальная астма; II - легкая персистирующая бронхиальная астма: III - средней степени персистирхющая астма: IV - тяжелая персистирующая астма

Для удобства оценки эффективности гипобаротерапии мы раздели детей до и после лечения на две группы: дети с легкой интермиттирующей и легкой персистирующей степенью тяжести бронхиальной астмы (группа 1) и дети со среднетяжелой и тяжелой БА (группа 2). Производилась оценка соотношения числа детей с легкой и среднетяжелой/тяжелой БА до и после лечения в зависимости от пола и возраста пациентов (табл. 3). Во всех подгруппах детей отмечалось достоверное повышение доли детей с легкими формами БА через год после курса ПГГС по сравнению с данными для изучаемых подгрупп до лечения.

Достоверной разности в уровне эффективности гипобаротерапии детей в зависимости от возраста (между детьми пубертатного и препубертатного возраста), а также в зависимости от пола не было выявлено (р>0,05).

Таблица 3

Динамика степени тяжести БА в результате гипобаротерапии

До гипобаротерапии 11осле гипобаротерапии Достоверность разницы соотношений долей до и после ПГГС*

Легкие формы БА Средней степени и тяжелая персисти-рующая БА Легкие формы БА Средней степени и тяжелая персисти-рующая БА

Основная группа (п=60) 39 (68,3%) 21 (31,7%) 54 (90,0%) 6 (10,0%) р=0,001

Девочки (п=30) 22 (16,7%) ОО о4 29 (93,3%) 1 (6,7%) р=0,01

Мальчики (п=30) 17 (20,0%) 13 (80,0%) 25 (83,3%) 5 (16,7%) р=0,05

Препубертатный возраст (п =31) 20 (62,9%) 11 (37,1%) 28 (85,7%) 3 (14,3%) р=0,02

Пубертатный возраст(п =29) 19 (68,0%) 10 (32,0%) 26 (96,0%) 3 (4,0%) р=0,05

Контрольная группа (п=20) 13 (65,0%) 7 (35.0%) 14 (30,0%) 6 (30,0%) р=1,0

* - расчеты производились с использованием критерия / для таблицы сопряженности 2x2 с поправкой Йейтса, а также двусторонний точный критерий Фишера

Потребность в назначении детям в качестве базисного лечения гормональных ингаляционных препаратов достоверно уменьшилась (р=0,01) с 31,6% до 10,0% детей (рис. 2).

100,00% 90.00% 80.00% 70,00% 60.00% 50.00% 40,00% 30,00% 20.00% 10.00% 0.00%

68.40%

31.6%

г

90,0%

10.0%

65,0%

35,0%

70%

30.0%*

!а

[б

Па

Нб

□ без базисной терапии, кромоны

□ ИГКС; комбинация ИГКС+бронходилататоры; ИГКС+теофиллины

Рис. 2. Изменение базисной терапии основной и контрольной групп в течение года наблюдения

Примечание: 1а - основная группа до баротерапии; 16 - основная группа через год после баротерапии; На - контрольная группа в начале наблюдения; Пб - контрольная группа через год от начала наблюдения *-р=0,01 **-р=0,75

У детей основной группы через год после проведения курса ПГГС по сравнению с детьми контрольной группы была установлена достоверно более низкая доля детей, которые получали в качестве медикаментозной базисной терапии гормональные ингаляционные препараты (10,0% против 30,0%; р=0,04).

После проведенного лечения методом ПГГС в течение календарного года с 15,0% до 1,7% детей уменьшилась необходимостью применения инфузионной терапии с использованием системных гормональных препаратов при обострении БА. У детей основной группы в течение года более не возникало ситуаций, потребовавших введение в схему лечения пероральных гормональных препаратов.

Для уточнения механизма лечебного эффекта ПГГС нами было произведено изучение состояние апоптоза эозинофилов периферической крови (табл. 4). Было выявлено, что у детей с БА в период ремиссии по сравнению со здоровыми детьми отмечалось достоверно значимое снижение уровня программированной гибели эозинофилов в периферической крови как по уровню экспрессии проапоптотического протеина р53, так и по признакам внутриядерной фрагментации ДНК. Увеличение продолжительности жизни активированных эозинофилов поддерживает аллергическое воспаление в слизистой оболочки бронхов, способствует его прогрессированию и хронизации (AkuthotaP. et al., 2011).

В тоже время известно, что р53 может подавлять активность NF-kB через прямое или косвенное взаимодействие с рядом клеточных белков (Ravi R. et al., 1998; Webster G.A. et al., 1999; Ryan K.M., 2000). Снижение ингибируюшего влияния р53 приводит к повышению активности NF-kB -одного из ключевых механизмов воспаления при БА, запускающего синтез широкого спектра провоспалительных медиаторов и антиапоптотических эффекторов (Yang, L. et al., 1998; Christman, J. W. et al., 2000; Pantano С. et al., 2008). Полученные данные согласуются с результатами предыдущих работ, указывающих на сохранение активности аллергического воспаления в период ремиссии у детей с атопической БА (Воляник О.В., 2008, Алеманова Г.Д., 2010).

Под влиянием лечения методом ПГГС происходило значимое повышение интенсивности апоптоза эозинофилов в периферической крови, достигающее значения аналогичных показателей группы контроля (табл. 4).

Индукция программированной гибели эозинофилов, как основных участников аллергического воспаления, наблюдаемая нами после лечебного воздействия ПГГС, способствовала элиминации воспалительно-активных клеток из очага поражения, снижала степень выраженности воспаления, тем самым оказывала лечебный эффект на течение атопической БА. Учитывая способность изучаемого транскрипционного фактора р53 подавлять экспрессию NF-kB (Ravi R. et al., 1998; Webster G.A. et al„ 1999; Ryan K.M., 2000), регулирующего синтез провоспалительных медиаторов, было сделано

предположение, что значимое повышение экспрессии р53, наблюдаемое нами под влиянием периодической гипобарической стимуляции, свидетельствовало о снижении воспалительной активности исследуемых клеток.

Таблица 4

Содержание эозинофилов (%) в мазках периферической крови детей с признаками экспрессии протеина р53 и деградации ДНК (Apoptag-пoзитивныe клетки)

Группа детей Эозинофилы с экспрессией р53 (М±ш) Apoptag-пoзитивныe эозинофилы (М±ш)

Здоровы дети 34,7±2,1 38,9±1,9

Дети основной группы (с БА) до лечения 21,4±0,9* 22,3±1,0*

Дети основной группы (с БА) после лечения 39,4±1,7** 40,8±1,6**

* - р<0,05 по сравнению с группой здоровых детей

** - р<0,05 по сравнению с группой детей с БА до лечения

Проведенное нами гистологическое исследование бронхов экспериментальных животных начиная с 14 суток после начала эксперимента, выявляло комплекс морфологических признаков, отражающих хронический воспалительный аллергический процесс. При этом ведущими из них являлись: обструкция бронхов, бронхоспазм, формирование слизистых пробок, существенная структурно-функциональная реорганизация слизистой оболочки и подслизистой основы бронхов (особенно бронхиол). Отмечалось значительное расширение сосудов микроциркуляторного русла, увеличение секреции экзокриноцитов бронхиальных желез с возрастание мукоидного компонента секреторного продукта, отек и дискомплектация клеточных элементов мышечной пластинки слизистой оболочки бронхов. В зонах дискомплектированных миоцитов наблюдались явления значительной десквамации эпителиальных пластов. Существенно возрастала численность эозинофилов, а также их дегрануляция. В стенках бронхов (особенно бронхиол) увеличивалось количество нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов. Нередко мы наблюдали плоскоклеточную метаплазию эпителия слизистой оболочки бронхов.

Все выявленные и описанные структурно-функциональные изменения бронхолегочной системы животных свидетельствовали о том, что в нашем эксперименте действительно была создана модель аллергического поражения слизистой бронхов мышей.

Светооптические и электронномикроскопические исследования супраоптических и паравентрикулярных ядер гипоталамуса, а также нейрогипофиза показало, что через 14-22 суток эксперимента отмечалась резкая функциональная активация нонапептидергических нейросекреторных клеток (НСК) (рис. 3). Это выражалось в возрастании объемов ядер и ядрышек НСК, особенно «светлых» функционально активных элементов.

При этом увеличивалось относительное содержание пикноморфных и дистрофически измененных НСК в составе исследованных ядер гипоталамуса. Данные ультраструктурные изменения следует расценивать как показатель локального внутриклеточного повреждения цитоплазмы НСК, развивающегося в состоянии их функционального напряжения.

При проведении морфометрического анализа состояния аксонов НСК на уровне нейрогипофиза оценивалось соотношение количества пептидергических секреторных гранул к числу «пустых» пузырьков (секреторные гранулы в состоянии опустошения). Обнаружено, что у мышей экспериментальной группы происходило значительное накопление заполненных нейропептидами гранул на уровне аксовазальных контактов нейрогипофиза (рис. 4).

Рис. 3. Нейросекреторные клетки паравентрикулярного ядра гипоталамуса мыши с экспериментальной бронхиальной астмой.

Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: паральдегид-фуксин по Гомори-Габу (модификация А.Л. Поленова). Ув. об.90, ок. 10.

Рис. 4. Блокировка высвобождения секреторных гранул в аксонах нейросекреторных клеток гипоталамуса. Ув. х 28000.

Подобная картина дает возможность высказать предположение либо о блокаде эвакуации пептидных гормонов из аксонов ИСК в общий кровоток, либо о существенном превышении уровня их продукции над экструзией, даже если последняя и подвергалась возрастанию.

Наши результаты не позволяют ответить на вопрос, в какой мере мобилизация нейросекреторных центров ГГНС при моделируемой патологии однонаправлено реализуется на периферии в виде количественных изменений содержания нейрогормонов (окситоцин, вазопрессин и другие нейропептиды) в крови и ликворе. Однако они позволяют сделать достаточно определенное заключение о том, что в данной ситуации у животных возникает выраженная разбалансировка (дипропорция) между уровнем продукции нонапептидов и уровнем их высвобождения из терминалей аксонов НСК, что, в конечном счете, приводит к ультраструктурным повреждениям (вплоть до дегенеративных) НСК в виде нарастания содержания крупных лизосом, аутофагосом как в аксонах НСК, так и в питуицитах. Последнее является признаком «изнашивания» системы и ограничения ее адаптивных возможностей.

При анализе клеточных особенностей аденогипофиза были получены данные об активации цитофизиологических процессов у кортикотропоцитов, проявляющейся усиленным накоплением в них секреторных гранул, гипертрофией комплекса Гольджи и канальцев эндоплазматического ретикулума. Существенно, что усиление активности кортикотропоцитов у данных животных не только не сопровождалось адекватной реакцией соответствующих зон надпочечников, но, напротив, оно протекало на фоне морфологической редукции органа ГГАКС: отмечалось достоверное уменьшение протяженности клубочковой и особенно пучковой зон, при отсутствии существенных изменений сетчатой зоны (табл. 5).

Таблица 5

Протяженность (мкм) зон коры надпочечников у животных (М±т)

Клубочковая зона Пучковая зона Сетчатая зона

Интактные мыши 47,6 ±0,8 157,8 ±11,2 38,8 ± 8,1

Модель БА без баротерапии 32,1 ± 1,2* 102,2 ±2,3* 42,1 ±4,1

Модель БА при баротерапии 51,8 ± 1,8** 124,8 ±4,1** 41,0 ±3,8

* - р<0,05 - по сравнению с группой интактных мышей ** - р<0,05 - по сравнению с группой мышей без баролечения

Иными словами, будучи эффекторным звеном ГГАКС, надпочечники не проявили структурных особенностей, свидетельствующие об их усилении функционирования, несмотря на очевидное возрастание активности кортикотропоцитов, продуцирующих АКТГ. Такое положение может свидетельствовать либо о затруднении выведения кортикотропина из аденогипофиза в общий кровоток, либо о потере чувствительности кортикоцитами надпочечников к аденогипофизарному влиянию, либо о сочетании обоих механизмов. Но в любом случае эти изменения в надпочечниках означали явное нарушение функционирования ГГАКС у мышей (особенно в отдаленные сроки наблюдений).

Нами была показана активизация функциональной деятельности тимуса у животных с экспериментальной БА (особенно в корковом веществе и среди тучных клеток интерстиция). Особо следует отметить, что количество тучных клеток было повышенным в 5 раз (по сравнению с интактными животными). При этом преобладающими среди них были недегранулированные клеточные формы. Размеры долек органа возрастали в 2,5-3 раза (за счет толщины коркового слоя).

В селезенке отмечалось выраженное полнокровие трабекулярных и пульпарных сосудов, резкое увеличение лимфоидных фолликулов. Увеличение массы белой пульпы органа у данных животных происходило за счет возрастания в 2,5-3 раза территории В-зон лимфоидных фолликулов. У исследованных животных нами было обнаружено увеличение размеров как подкожных, так и мезентериальных лимфатических узлов. Они становились резко полнокровными, в них существенно увеличивались лимфоидные фолликулы.

Оценивая морфологическое состояние крупноклеточных ядер гипоталамуса и структур гипофиза у мышей, получавших баролечение мы также отмечали усиление секреторной активности П НС и кортикотропоцитов аденогипофиза. Это проявлялось в увеличении размеров ядер и ядрышек «светлых» НСК, как супраоптических так и паравентрикулярных ядер гипоталамуса, набухании митохондрий, расширении канальцев эндоплазматического ретикулума и цистерн комплекса Гольджи. В нейрогипофизе отмечалось выраженное (в 5 раз по сравнению с нелеченными животными) уменьшение содержания нейросекреторного материала в терминалях аксонов НСК, расширение синусоидных капилляров, увеличение числа фенестр эндотелиоцитов. Аксоны были резко расширены и имели просветленную цитоплазму, характерным являлось увеличение количества «пустых» пузырьков («остаточных гранул»). Вместе с тем следует констатировать, что доля элементарных гранул оставалась повышенной относительно интактных мышей.

Для кортикотропоцитов аденогипофиза у описываемых животных мы также получили данные, свидетельствующие об их активации. Клетки

увеличивались в размерах, становились более отростчатыми. У них гипертрофировался комплекс Гольджи, канальцы эндоплазматической сети, митохондрии. Секреторные гранулы с характерной электрониоплотной сердцевиной локализовались как в области пластинчатого комплекса Гольджи, так и линейно вблизи плазматической мембраны. Количество секреторных гранул у данных мышей по сравнению с нелеченными животными уменьшалось, что свидетельствовало об активной экструзии секреторного материала.

У этой группы экспериментальных животных по данным морфометрического анализа было установлено возрастание функционирования коры надпочечников не только по сравнению с нелеченными мышами, но и по сравнению с интактными животными. Увеличивалась протяженность клубочковой и пучковой зон коры надпочечников.

Особо следует подчеркнуть то обстоятельство, что на уровне нейрогипофиза мы наблюдали ультраструктурную картину, свидетельствующую о регрессии ультраструктурных признаков повреждения аксонов НСК, наблюдаемых у нелеченных мышей. Это проявлялось в том, что соотношение количества пептндергических гранул и «пустых» пузырьков приближалось к таковому, характерному для интактных мышей (табл. 6).

Таблица 6

Соотношение количества пептидергических гранул к количеству пустых пузырьков в терминалях аксонов НСК гипоталамуса (в %) у мышей

(М±ш)

Интактные животные Мыши с моделью БА без баротерапии Мыши с моделью БА после баротерапии

0,84 ±0,11 12,6 ± 1,22* 2,6 ±0,14**

Примечание: использование сетки (палетки) на электроннограш<е при снятии морфометрических параметров по A.C. Якубов. В.А. Кац. 1984. * - р<0,05 - по сравнению с группой интактных мышей ** - р<0,05 - по сравнению с группой мышей без баролечения

Было установлено, что при бароадаптации в селезенке происходило уменьшение размеров лимфоидных фолликулов и реактивных центров почти в 2 раза по сравнению с нелеченными животными.

Морфологический анализ легких у экспериментальных животных выявил, что бароадаптация вызывала понижение воспалительных реакций в органе. Уменьшалась сосудистая реакция, экстравазация плазмы. Величина периваскулярных, полиморфно-клеточных, плазмоцитарных инфильтратов

уменьшалась, хотя и не ликвидировалась полностью. Важно отметить, что в этих условиях в слизистой оболочке бронхов отмечалось уменьшение суммарного числа эозинофильных лейкоцитов с 31,6 ± 2,2% до 12 4 ± 0 7% (р<0,05).

Было также выявлено, что формирование экспериментальной БА сопровождалось нарушением регуляции апоптоза эозинофилов и лимфоцитов непосредственно в очаге аллергического воспаления (табл. 7).

Примечательно, что выявленные нарушения имели разнонаправленный характер: интенсивность апоптоза лимфоцитов при БА возрастала, тогда как эозинофилы, напротив, демонстрировали повышенную устойчивость к индукции программированной гибели. Лечение животных методом ПГГС нормализовало выявленные изменения: способствовало снижению программированной гибели лимфоцитов и усилению апоптоза эозинофилов (табл. 7).

Таблица 7

Экспрессия синтеза протеинов р53 (А) и каспазы 3 (Б) у клеток слизистой оболочки бронхов мышей (%)

А Б

Лимфоциты Эозинофилы Лимфоциты Эозинофилы

Контрольная группа 0,9 ±0,01 12 ± 1,01 0,6 ±0,01 1,1 ±0,02

Мыши с Б А без баролечения 12,7 ± 1,08* 0,7 ±0,01* 9,7 ± 0,03* 0,8 ± 0,03

Мыши с БА, получившие баролечение 3,2 ±0,07** 1,7 ±0,02** 2,9 ± 0,04** 1,9 ±0,03**

* - р<0,05 по сравнению с интактными животными

** - р<0,05 по сравнению с группой животных без лечения

Анализируя результаты собственного исследования, мы берем на себя ответственность утверждать, что выраженность морфофункциональных изменений в легких и органах иммуногенеза при БА зависит от степени выраженности дисрегуляторных нарушений в ГГНС и ГГАКС. Коррекция рассогласованности гипоталамической нейросекреции, гипофизарио-адренокортикального взаимодействия способствует уменьшению воспаления в бронхах и реактивных изменений в органах иммунной системы. Выявленные данные свидетельствуют о значимости состояния нейроэндокринной регуляции при течении БА и важности ее коррекции для достижения лечебного эффекта.

Выводы

1. Периодическая гипобарическая гипоксия оказывает благоприятное влияние на течение бронхиальной астмы у детей, проявляющееся переходом на более легкую степень тяжести заболевания у 55,0% детей через год после баролечения, уменьшением потребности в бронхолитических препаратах, изменением объема базисной терапии.

2. Периодическая гипобарическая гипоксическая стимуляция повышает программированную гибель эозинофилов периферической крови детей с бронхиальной астмой.

3. Воспроизведение модели экспериментальной бронхиальной астмы происходит на фоне нарушений адаптивных реакций двух важнейших регуляторных систем: гипоталамо-гипофизарной нейроэндокринной и гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной систем, а именно на фоне разбалансировки процессов продукции и высвобождения нейросекрета в крупноклеточных ядрах гипоталамуса, а также на фоне признаков морфологической редукции коры надпочечников, несмотря на явное усиление активности кортикотропоцитов аденогипофиза.

4. Воздействие периодической гипобарической гипоксической стимуляции уменьшает выраженность воспалительных изменений в бронхах и органах иммунной системы, нормализует состояние апоптоза эозинофилов и лимфоцитов при экспериментальной бронхиальной астме.

5. Терапевтическое действие периодической гипобарической гипоксической стимуляции связано с нормализацией процессов продукции и высвобождения нейросекрета крупноклеточных ядер гипоталамуса, корригированием рассогласованности гипофизарно-адренокортикального взаимодействия и стимуляцией функциональной активности коры надпочечников.

Практические рекомендации

1. Лечение методом адаптации к периодической гипобарической гипоксии является высокоэффективным методом реабилитации больных бронхиальной астмой.

2. Совокупность экспериментально-гистологических данных, подтверждающих положительное действие периодической гипобарической гипоксической стимуляции, а также сведения о высокой клинической эффективности гипобаротерапии у детей с БА, позволяют рекомендовать данный метод немедикаментозного воздействия для клинического применения в педиатрии.

3. Полученные в настоящем исследовании сведения о влиянии гипобаротерапии на состояние программированной гибели эозинофилов

позволяет рекомендовать использование определения апоптоза эозинофилов в клинической практике в качестве доказательного метода оценки эффективности применения периодической гипобарической гипоксической стимуляции в терапии атопической бронхиальной астмы.

4. Полученные в ходе настоящей работы сведения указывают на значимость нарушений нейроэндокринной регуляции в формировании и прогрессировании аллергической бронхиальной астмы, что расширяет наши представления о патогенезе изучаемой патологии и открывает новые пути ее успешной лечебной коррекции.

5. Установленная взаимосвязь между уровнем морфофункциональных изменений в бронхолегочной системе, центральных и периферических органах иммуногенеза со степенью дисрегуляции в гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе и гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системе имеет существенное значение для фундаментальной нейроэндокринологии особенно в тех ее разделах, которые касаются аспектов биологии нейросекреторных клеток.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Кирбятьева, E.H. Изменение уровня интерферона-у и фактора некроза опухоли-а у детей, больных бронхиальной астмой после курса баротерапии / О.В. Воляник, E.H. Кирбятьева, Л.А. Сергиенко, И.В. Пере-всртова, А.Т. Багаутдинов, А.К. Екимов// Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии в педиатрии. Материалы российской научно-практической конференции. - Оренбург, 2003. - С. 28-30.

2. Кирбятьева, E.H. Изменение некоторых компонентов комплемента как бароадаптация детей с бронхиальной астмой / Е.В. Еремина, А.Т. Багаутдинов, А.К. Екимов, E.H. Кирбятьева // Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии в педиатрии. Материалы российской научно-практической конференции. - Оренбург, 2003. - С. 36-37.

3. Кирбятьева, E.H. Роль апоптоза в патогенезе аллергических заболеваний / E.H. Кирбятьева, О.В. Воляник // Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии в педиатрии. Материалы российской научно-практической конференции. - Оренбург, 2003. - С. 77-79.

4. Кирбятьева, E.H. Влияние адаптации к периодической гипоксической стимуляции на цитокиновый ответ при бронхиальной астме / Г.Д. Але-мапова, Т.В. Дмитриева, О.В. Воляник, E.H. Кирбятьева, В.А. Зейферт, Н.С. Огородова У/ 15 национальный конгресс по болезням органов дыхания. Москва, 28 ноября - 2 декабря 2005. - С. 303.

5. Кирбятьева, E.H. Роль апоптоза в патогенезе аллергических заболеваний / С.Н. Стрижкова, E.H. Кирбятьева // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2003. - №3 (21). -С. 146-150.

6. Кирбятьева, E.H. Влияние адаптации к периодической гипобарической гипоксической стимуляции (АПГГС) на цитокиновый профиль у мальчиков препубертатного возраста больных бронхиальной астмой / М.Н. Воляник, Т.В. Дмитриева, Г.Д. Алеманова, О.В. Воляник, E.H. Кирбятьева // Тезисы II Всероссийского конгресса по детской аллергологии. -М.: Медпрактика. - 10-11 декабря 2003. - 240 с. (С. 36-37).

7. Кирбятьева, E.H. Влияние баротерапии на уровни интерферона-у и фактора некроза опухоли-а у детей больных бронхиальной астмой / М.Н. Воляник, О.В. Воляник, E.H. Кирбятьева // Тезисы II Всероссийского конгресса по детской аллергологии. - М.: Медпрактика. - М., 10-11 декабря. 2003. - 240 с. (С. 37-38).

8. Кирбятьева, E.H. Влияние бароадаптации на показатели аллергического воспаления у детей с бронхиальной астмой / М.Н. Воляник, Е.В. Еремина, Т.В. Дмитриева, Г.Д. Алеманова, О.В. Воляник, E.H. Кирбятьева, А.Т. Ба-гаутдинов, А.К. Екимов // Современные технологии педиатрии и детской хирургии. 3 Всесоюзная конференция. - М., 2004. - С. 310.

9. Кирбятьева, E.H. Экспериментальная модель бронхиальной астмы / E.H. Кирбятьева //Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2006. - № 2(49). - С. 287.

10. Дрёмова, E.H. Влияние гипобаротерапии на морфофункциональные нарушения нейроэндокринной и иммунной систем при экспериментальной бронхиальной астме / E.H. Дрёмова // Вестник Российского государственного медицинского университета. - 2011. -№ 1 - С. 170.

11. Дрёмова, E.H. Изучение нейроэндокринной регуляции в формировании экспериментальной бронхиальной астмы / A.A. Стад-ников, E.H. Дрёмова, М.Н. Воляник // Морфологические ведомости. -2009. -№3.- С. 282-283.

12. Дрёмова, E.H. Состояние нейроэндокринной регуляции при формировании бронхиальной астмы и при лечебном воздействии периодической гипоксической гипобарической стимуляции / A.A. Стадников, E.H. Дрёмова// Фундаментальные исследования. -2011.-№ 9-С. 299-303.

13. Дрёмова, E.H. Состояние апоптоза лимфоцитов и эозинофилов при формировании экспериментальной бронхиальной астмы и ее лечебной коррекции / A.A. Стадников, М.Н. Воляник, E.H. Дрёмова, A.A. Смотрова // Военно-медицинский журнал. - 2011. - Т.332. -№ 7. - С. 60-61.

14. Дрёмова, E.H. Клинико-морфологические особенности бронхиальной астмы при баротерапии / E.H. Дрёмова, О.В. Воляник, A.A. Стадников, М.Н. Воляник, З.А. Ишмухаметова// Российский аллергологический журнал.-2011.-№4, вып. 1.-С. 113-114.

Список сокращений

АКТГ адренокортикотропный гормон

БА бронхиальная астма

ГГНС гипоталамо-гипофизарная нейросекреторная система

ГГАКС гипотапамо-гипофизарно-адренокортикальная система

Г-КСФ гранулоцитарный колониестимулирующий фактор

ДП девочки пубертатного возраста

ДПП девочки препубертатного возраста

ИНФ интерферон

ИЛ интерлейкин

МП мальчики пубертатного возраста

МПП мальчики препубертатного возраста

ИСК нейросекреторные клетки

ПВЯ паравентрикулярные ядра гипоталамуса

ПГГС периодическая гипоксическая гипобарическая стимуляция

ЦИК циркулирующие иммунные комплексы

ФНОа фактор некроза опухоли а

ОТ-кВ нуклеарный фактор кВ

ДРЁМОВА ЕКАТЕРИНА НИКОЛАЕВНА

КЛИНИКО-МОРФОЛОГИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ПЕРИОДИЧЕСКОЙ ГИПОБАРИЧЕСКОЙ ГИПОКСИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ В ТЕРАПИИ АТОПИЧЕСКОЙ БРОНХИАЛЬНОЙ АС ГМЫ У ДЕТЕЙ

Автореферат диссертации на соискаиие ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 12.10.2011 г. Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Уел печ. л. 1,6. Тираж 150 экз. Заказ № 6672 Отпечатан в типографии ООО «Агентство «Пресса». 460035, Оренбург, ул. Комсомольская, 45.

Актуальность проблемы

Во всем мире отмечается тенденция к росту заболеваемости бронхиальной астмой (БА). В настоящее время распространенность БА в России (по данным стандартизированных международных исследований ISAAC-International Study of asthma and Allergology in Childhood) составляет в детской популяции от 5 до 10% (Попова И.В. с соавт., 2004; Мачарадзе Д.Ш. с соавт., 2005). Остается очевидным необходимость дальнейшего активного поиска методов лечения и профилактики данной патологии, что неотделимо от углубления наших представлений о патогенетических механизмах развития и течения БА.

Периодическая гипобарическая гипоксическая стимуляция (ПГГС) является одним из видов немедикаментозных методов лечения больных БА. Показана высокая клиническая эффективность данного метода лечебной коррекции БА (Воляник М.Н., 1993; Дмитриева Т.В., 2006; Воляник О.В., 2008; Алеманова Г.Д., 2010). В тоже время механизм положительного влияния ПГГС на течение БА продолжает изучаться и уточняться. Было установлено, что важными факторами лечебного действия гипобаротерапии у больных БА является увеличение уровня биологически активных глюкокортикоидов в крови и их утилизация тканями (Михайлов A.M., 1982; Воляник М.Н., 1991; Колосова Е.Г., 2003).

Было выявлено наличие заметной связи между лечебным эффектом ПГГС и особенностями гормонального гомеостаза (Колосова Е.Г, 2003). Установлено, что хороший эффект наблюдался при нормализации уровня изучаемых гормонов. В случае, когда не отмечалось клинического улучшения течения БА, не регистрировались и изменения гормонального статуса сразу после проведения ПГГС и в катамнезе.

Накоплены данные по нормализации показателей иммунного гомеостаза под влиянием курса гипобаротерапии (цитокинового профиля - ИЛ-4, ИЛ-5,

ИЛ-18, ИНФа, ИНФу, ФНОа, Г-КСФ, субпопуляций Т-лимфоцитов, ЦИК, . IgG, IgM, IgA, IgE, относительного содержания эозинофилов). При этом установлено, что чем больше выражена положительная динамика иммунных показателей в сторону их нормализации, тем более эффективной оказывалась терапия (Воляник О.В., 2008; Алеманова Г.Д., 2010).

Были также получены сведения по влиянию ПГГС на нейрогуморальные факторы, а именно на содержание субстанции Р. При этом наибольшая эффективность гипобаротерапии наблюдалась у тех пациентов, у которых содержание данного нейропептида достоверно понижалось в ходе терапии (Алеманова Г.Д., 2010).

Все эти данные свидетельствуют не только о положительном лечебном действии изучаемого метода терапии, но и о наличии тесной взаимосвязи функционирования различных систем организма — иммунной, эндокринной и нервной; а также роли нейроэндокринноиммунной дисрегуляции в формировании и течении изучаемой патологии.

Необходимо отметить, что патологический процесс всегда приобретает генерализованный характер, выходя заъ пределы первичной локализации (Акмаев И.Г., 2003; Магаева C.B., Морозов С.Г., 2005; Кузнецов*С.Л., 2008). Следует полагать, что и атопические заболевании! (в том числе и БА) реализуются в повреждении различных органов и систем, и в первую очередь тех, которые представляют нейро-эндокринно-иммунный комплекс.

В этой связи возникает необходимость в анализе взаимовлияний показателей функционально различных систем в их сочетанном вовлечении в единый патологический процесс. Такое исследование в современной науке осуществимо с помощью экспериментальной животной модели изучаемой патологии. С использованием животной модели становится возможным установление клеточных и тканевых реакций в жизненно важных органах при патологии (бронхиальной астме), что, безусловно, является существенным фундаментом для понимания закономерностей их адаптации, цито- и гистогенеза. Только при помощи экспериментальной модели БА возможно оценить структурно-функциональное состояние бронхо легочной системы, во взаимосвязи с изменениями в органах иммуногенеза и центральных звеньях нейроэндокринной регуляции как при формировании патологии, так при лечебном воздействии ПГГС.

До настоящего времени отсутствуют морфологические исследования по изучению влияния ПГГС на структурно-функциональное состояния при БА органов бронхолегочной; иммунной, эндокринной систем, а также центрального звена нейроэндокринноиммунной- регуляции; — гипоталамо-гииофизарной нейроэндокринной системы (ГГНС).

Отсутствуют также работы по изучению состояния апоптоза клеток-участников аллергического воспаления при БА под влиянием лечения методом ПГГС. Все вышеизложенное явилось основанием для проведения, настоящего исследования.

Цель исследования

Целыо настоящей работы: явилось установление патогенетических механизмов" развития и течения бронхиальной астмы в аспектах клинико-эксперимеитальной оценки . лечебного воздействия периодической гипобарической гипоксической стимуляции.

Задачи исследования.

Для реализации поставленной цели были сформулированы следующие задачи: . .

1. Оценить, клиническую эффективность периодической гипобаротерапии в лечении бронхиальной астмы:у. детей.

2. Определить уровень апоптоза эозинофилов периферической крови детей с Б А под влиянием лечения-методом ПГГС.

3. Экспериментально-гистологически исследовать морфофункциональ-ное состояние гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы, центральных и периферических органов иммунной системы, органов бронхолегочной системы в условиях моделирования бронхиальной астмы.

4. Установить характер влияния 111 ГС на морфофункциональные особенности гипоталамической нейррэндокриннойрегуляции и морфологическое состояние бронхолегочной системы у животных с экспериментальной БА.

Научная новизна работы

Впервые с использованием комплекса клинических, экспериментально-гистологических методик, в том числе иммуноцитохимической идентификации апоптоза лимфоцитов и эозинофилов, дано патогенетическое обоснование эффективности применения ПГГС в лечении БА.

Впервые на основании многоуровневых (светооптических, ультраструктурных, молекулярно-генетических) экспериментально-гистологических исследований г проведена оценка состояния ГГНС и ГГАКС, центральных и периферических органов иммунной системы, органов бронхолегочной системы с установлением тканеспецифических и цитологических критериев оценки тяжести патологического процесса и его прогноза. Впервые установлена взаимосвязь изменений в ГГНС и ГГАКС с морфофункциональными . характеристиками структур" бронхов' при. формировании экспериментального аллергического воспаления и при. его лечебной коррекции методом ПГГС.

Теоретическая и; научно-практическая значимость

Высокая клиническая эффективность в реабилитации детей с атопйческой бронхиальной астмой позволяет рекомендовать данный метод немедикаментозного лечения для клинической апробации;

Получены новые данные, подтверждающие наличие дисбаланса неспецифической регуляции иммунных функций со стороны нонапептидергической гипоталамической нейроэндокринной системы при течении атопйческой бронхиальной астмы, как усугубляющего механизма ее развития. Продемонстрирована взаимосвязь между уровнем морфофункциональных изменений в бронхолегочной системе, центральных и периферических органах иммуногенеза и степенью диерегуляции в ГГНС и

ГГАКС, что имеет существенное значение для педиатрии, клеточной биологии, цитологии и гистологии.

Установленные в процессе лечения ПГГС позитивные эффекты и гистологическая обоснованность использования ПГГС, касающиеся нормализации работы центральных звеньев нейроэндокринной регуляции, уменьшения степени выраженности аллергического воспаления в бронхах, имеют клинически важное значение для дальнейшего обоснования новых и более эффективных способов лечебной коррекции данной патологии в педиатрии.

Реализация и внедрение результатов исследования

Результаты исследований используются в учебном процессе Оренбургской государственной медицинской академии при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах детских болезней лечебного факультета; гистологии, цитологии и эмбриологии.

Апробация материала

Основные положения диссертационного исследования были представлены на Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии в педиатрии» (Оренбург, 2003); на II Всероссийском конгрессе по детской аллергологии (Москва, 2003), на 3 Всесоюзной конференции «Современные технологии педиатрии и детской хирургии» (Москва, 2004), на I Международной (X Всероссийской) Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2006); на VI Международной (XV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Высокая клиническая эффективность ПГГС в реабилитации детей с атопической бронхиальной астмой позволяет рекомендовать данный метод немедикаментозного лечения.

2. Периодическая гипобарическая гипоксическая стимуляция способствует повышению апоптозной доминанты эозинофилов крови детей с

БА, тем самым способствует их элиминации из очага аллергического воспаления.

3. Выраженность морфологических изменений органов бронхолегочной и иммунной систем в условиях экспериментальной бронхиальной астмы находится в тесной взаимосвязи со степенью структурно-функциональных нарушений важнейших регуляторных систем ГГНС и ГГАКС, что свидетельствует о роли нейроэндокринной дезадаптации в патогенезе развития аллергического воспаления.

4. Применение ПГГС в моделируемых условиях приводит к нормализации функционирования основных звеньев нейроэндокринной регуляции, к корригированию рассогласованности гипофизарно-надпочечникового взаимодействия, оптимизации эффекторного звена ГГАКС, повышению апоптозной доминанты эозинофилов, что позволяет уточнить механизм лечебного эффекта изучаемого метода терапии.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 работ, из них 7 по перечню, рекомендованного ВАК Минобрнауки РФ для защиты кандидатских и докторских диссертаций.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 149 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав с описанием собственных исследований, главы обсуждения их результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 24 рисунками, 21 таблицами. Библиография включает 186 отечественных и 121 зарубежных источников.

выводы

1. Периодическая гипобарическая гипоксия оказывает благоприятное влияние на течение бронхиальной астмы у детей, проявляющееся переходом на более легкую степень тяжести заболевания у 55,0% детей через год после баролечения, уменьшением потребности в бронхолитических препаратах, изменением объема базисной терапии.

2. Периодическая гипобарическая гипоксическая стимуляция повышает программированную гибель эозинофилов периферической крови детей с бронхиальной астмой.

3. Воспроизведение модели экспериментальной бронхиальной астмы происходит на фоне нарушений адаптивных реакций двух важнейших регуляторных систем: гипоталамо-гипофизарной нейроэндокринной и гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной систем, а именно на фоне разбалансировки процессов продукции и высвобождения нейросекрета в крупноклеточных ядрах гипоталамуса, а также на фоне признаков морфологической редукции коры надпочечников, несмотря- на явное усиление активности кортикотропоцитов аденогипофиза.

4. Воздействие периодической гипобарической гипоксической стимуляции уменьшает выраженность воспалительных изменений в бронхах и органах иммунной системы, нормализует состояние апоптоза эозинофилов и лимфоцитов при экспериментальной бронхиальной астме.

5. Терапевтическое действие периодической гипобарической гипоксической стимуляции связано с нормализацией процессов продукции и высвобождения нейросекрета крупноклеточных ядер гипоталамуса, корригированием рассогласованности гипофизарно-адренокортикального взаимодействия и стимуляцией функциональной активности коры надпочечников.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Лечение методом адаптации к периодической гипобарической гипоксии является высокоэффективным методом реабилитации больных бронхиальной астмой.

2.Совокупность экспериментально - гистологических данных, подтверждающих положительное действие периодической гипобарической гипоксической стимуляции, а также сведения о высокой клинической эффективности гипобаротерапии у детей с БА, позволяют рекомендовать данный метод немедикаментозного воздействия для клинического применения в педиатрии.

3. Полученные в настоящем исследовании сведения о влиянии гипобаротерапии на состояние программированной гибели эозинофилов позволяет рекомендовать использование определения апоптоза эозинофилов в клинической практике в качестве доказательного метода оценки эффективности применения периодической гипобарической гипоксической стимуляции в терапии атопической бронхиальной астмы.

4. Полученные в ходе настоящей работы сведения указывают на значимость нарушений нейроэндокринной регуляции в формировании и прогрессировании аллергической бронхиальной астмы, что расширяет наши представления о патогенезе изучаемой патологии и открывает новые пути ее успешной лечебной коррекции.

5. Установленная взаимосвязь между уровнем морфофункциональных изменений в бронхолегочной системе, центральных и периферических органах иммуногенеза со степенью дисрегуляции в гипоталамо-гипофизарной нейросекреторной системе и гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системе имеет существенное значение для фундаментальной нейроэндокринологии особенно в тех ее разделах, которые касаются аспектов биологии нейросекреторных клеток.