Автореферат и диссертация по медицине (14.01.14) на тему:Клинико-микробиологические особенности диагностики хронического генерализованного пародонтита

На правах рукописи УДК 616.314.17- 008.1.-07: 579

МАРТИРОСЯН Варвара Георгиевна

КЛИНИКО - МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ДИАГНОСТИКИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕНЕРАЛИЗОВАННОГО ПАРОДОНТИТА

14.01.14 - Стоматология (мед. науки) 03.02.03 - Микробиология (мед. науки)

4859367

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

- з НОЯ 2011

Москва-2011

4859367

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития Российской Федерации Научные руководители: заслуженный врач России,

доктор медицинских наук, профессор АРУТЮНОВ Сергей Дарчоевич доктор медицинских наук, доцент НИКОЛАЕВА Елена Николаевна Официальные оппоненты:

заслуженный деятель науки России, заслуженный врач России, доктор медицинских наук, профессор Максимовский Юрий Михайлович доктор медицинских наук, профессор Ильин Вячеслав Константинович Ведущее учреждение: ФГОУ ДПО Институт повышения квалификации Федерального медико - биологического агенства России

Защита состоится «_»_2011 г. в_часов на заседании диссертационного совета Д 208.041.03 при ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития России по адресу: 127006 Москва ул. Долгоруковская д. 4.

и у

Почтовый адрес: 127473, Москва, ул. Делегатская д. 20 стр.1 с >

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития России по адресу: 127206, г. Москва, ул. Вучетича, д. 10а

Автореферат разослан__2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Ю.А. Гиоева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы

Заболевания пародонта остаются одной из актуальных проблем современной стоматологии [Цепов JI.M., 2006; Loesche W., 2007].

Согласно данным ряда эпидемиологических исследований их частота, в зависимости от региона и социальных групп населения, колеблется от 50 до 95% [Соловьева A.M. и соавт., 2007; Янушевич О.О., 2009].

Несмотря на широкое использование в экономически развитых странах профилактических мероприятий, проведение диспансерных обследований с выявлением и лечением стоматологических заболеваний на ранних этапах развития, распространенность болезней пародонта не уменьшается, а по данным ряда авторов увеличивается [Максимовский Ю.М., Митронин A.B., 2004; Borrell L.N., Papapanou P.N., 2007].

В последние годы выделены различные этиологические факторы и определены отдельные патогенетические механизмы, лежащие в основе развития воспалительных заболеваний пародонта. По мнению многих авторов, ключевую роль в этиопатогенезе заболеваний пародонта играет микробный фактор [Барер Г.М., 1999; Иванов B.C., 2001; Загант В.Ф., 2002; Боровский Е.В., 2004; Грудянов А.И., 2004 - 2011; Царев В.Н., 1996 - 2011], нарушение микроциркуляции в тканях пародонта [Белоусов A.B. и др., 2005; Кречина Е.К. и др., 2001 - 2010), интенсификация перекисного окисления липидов [Воскресенский О.Н., 2001; Сухова Т.В. и др., 2001], генетическая предрасположенность [Новикова B.C., 2004; Царев В.Н., 2007; Laine M. et al., 2000; Kornman K.S., 1997 - 2011; Nibali L. et al., 2010].

Доказана связь между тяжестью заболеваний пародонта и стрессом, связанным с работой, жизненными обстоятельствами и психологическим отношением к событиям [Fedi P.F., Grey J.L., 2007; Renz A.N., Newton J.T., 2009].

Многочисленные исследования свидетельствуют о наличии взаимосвязи тяжести течения воспалительных заболеваний пародонта и степенью потери минеральной плотности костной ткани [Арутюнов С.Д. и др., 2007, 2008; Верткин и др., 2006, 2007; Сафонова А.В. и др., 2010; Megson Е. et al., 2010; Nicopoulou-Karayianni К., 2009; Persson G.R. et al., 2011; Sultan N„ Rao J., 2011; Swoboda J.R. et al., 2008; Zhang X. et al., 2010].

В настоящее время получены новые данные о роли иммунных нарушений в патогенезе пародонтита, способствующих хроническому рецидивирующему и, зачастую, торпидному к терапии течению заболевания [Цепов JI. М. с соавт., 1992 - 2010; Воложин А.И. и др., 1993 - 2008; Мирсаева Ф. 3., 1998 - 2008; Behl Y. et al., 2008; Kinane D.F. et al., 2011].

В процессе активного изучения находятся молекулярные механизмы рецепции компонентов патогенных видов микробов клетками организма, пути передачи сигналов в ядро для активации клеток, участвующих в воспалительно-деструктивных процессах околозубных тканей [Rescala В. et al., 2010].

Накоплен значительный объем экспериментальных и клинических данных, позволяющих по-новому взглянуть на роль факторов врожденного иммунитета в развитии ответа организма человека на пародонтальную биопленку как в норме, так и при патологических процессах [Davey М.Е., Coster-ton J.W., 2006; Krauss J.L. et al., 2010; Kinane D.F. et al., 2011; Sanz M., Winkelhoff A J. van, 2011].

Анализ данных литературы показал отсутствие в РФ исследований, посвященных оценке роли в патогенезе заболеваний тканей пародонта таких факторов врожденного иммунитета, как антимикробные пептиды и Toll - подобные рецепторы.

Учитывая выше изложенное, более глубокое раскрытие механизмов развития воспалительных заболеваний пародонта, разработка доступных крите-

риев ранней диагностики заболеваний тканей пародонта, в том числе у лиц с сопутствующей патологией, является актуальным направлением развития современной стоматологии и позволит дать практическому врачу научно обоснованный подход к тактике ведения таких пациентов.

Цель исследования Повышение эффективности диагностики хронического пародонтита с учетом взаимодействия микробных факторов и показателей врожденного иммунитета.

Задачи исследования

1. Изучить стоматологический статус и состояние тканей пародонта у пациентов с хроническим пародонтитом, ассоциированным с остеопенией и остеопорозом, и практически здоровых людей с нормальной минеральной плотностью костной ткани.

2. Оценить взаимосвязь тяжести хронического пародонтита, потери минеральной плотности кости и степени нарушения тканевого кровотока в па-родонте у обследуемых пациентов.

3. Определить видовой состав основных пародонтопатогенов (Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermedia, Tannerella forsythia, Ag-gregatibacter actinomycetemcomitans и Treponema denticola) и их ассоциаций с клиническими параметрами больных хроническим пародонтитом и сопутствующими системными заболеваниями с учетом амфихитриальной природы пародонтита.

4. Оценить роль показателей врожденного иммунитета (антимикробных пептидов и Toll - подобных рецепторов на клетках периферической крови) и системной потери минеральной плотности костной ткани в развитии хронического пародонтита.

5. Разработать алгоритм лабораторной диагностики пародонтита, на основе выявления клинических, микробиологических и иммунологических критериев и оценить его эффективность.

Научная новизна

В представленной работе впервые в РФ выявлена зависимость между клиническими и микробиологическими проявлениями воспалительных процессов в тканях пародонта, показателями допплерографии сосудов полости рта и минеральной плотности костной ткани.

Уточнена этиологическая роль A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, Р. intermedict, T. forsythia и T. denticola и установлена степень их участия в развитии хронического воспаления тканей пародонта у больных с различным состоянием минеральной плотности костной ткани.

Изучены взаимосвязи экспрессии факторов врожденного иммунитета человека (антимикробных пептидов (дефензинов), Toll - подобных рецепторов) и бактериальной нагрузки в области зубодесневой борозды у больных хроническим пародонтитом средней степени тяжести и людей со здоровым пародонтом.

Разработан алгоритм комплексной клинико-лабораторной диагностики хронического пародонтита.

Практическая значимость Улучшение квалифицированной помощи пациентам с хроническими воспалительными заболеваниями пародонта за счет более совершенной диагностики и более глубоких теоретических знаний развития и течения воспалительных процессов в пародонте.

Выявлены особенности экспрессии некоторых показателей врожденного иммунитета у больных хроническим пародонтитом с системным снижением минеральной плотности костной ткани и здоровых людей.

Определен видовой состав основных пародонтопатогенов у практически здоровых людей и больных хроническим пародонтитом, ассоциирован-

ным с системной потерей минеральной плотности костной ткани, с учетом амфихиральной природы пародонтита.

Полученный массив показателей может быть использован в качестве контроля для дальнейших исследований данной проблемы.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Существует умеренная корреляционная связь выявления пародонтопа-тогенных видов A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, Т. forsythia и T. denticola со степенью выраженности патологии пародонта у лиц со сниженной минеральной плотностью костной ткани.

2. Хроническое воспаление тканей пародонта, у лиц с системной потерей минеральной плотности костной ткани, сопровождается снижением кровотока в системе гемоциркуляции пародонта.

3. Увеличение содержания дефензинов в десневой жидкости и плазме периферической крови зависит от возраста пациента, состояния гигиены полости рта, увеличения содержания пародонтопатогенных видов бактерий P. intermedia, A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis и может являться прогностическим признаком прогрессирования хронического пародонтита.

4. Разработан алгоритм клинико-лабораторной диагностики пародонтита, на основе выявления клинических, микробиологических и иммунологических критериев и оценена его эффективность.

Личный вклад автора Личный вклад автора заключается в самостоятельном осмотре 257 обследованных больных, организации процесса обследования и дополнительных консультаций всех пациентов. Автор самостоятельно участвовала в инструментально-лабораторном обследовании больных, лично готовила микробиологические препараты, приняла активное участие в проведении моле-кулярно-биологических и иммунологических исследований. Автор самостоя-

тельно анализировала материал и проводила статистическую обработку полученных данных.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в учебный и лечебный процесс клиник кафедры стоматологии общей практики и подготовки зубных техников (отделение профилактики стоматологических заболеваний стоматологической поликлиники ФПДО, ГУ «Стоматологическая поликлиника № 5» УЗ CAO г. Москвы и ГУ «Стоматологическая поликлиника № 7» УЗ ЮЗАО г. Москвы), а также в практику работы кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии, лаборатории молекулярно-биологических исследований НИМСИ ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России. Работа выполнена по плану НИР МГМСУ, номер государственной регистрации 01200700512.

Основные положения диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры стоматологии общей практики и подготовки зубных техников ФПДО; микробиологии, вирусологии, иммунологии ГБОУ ВПО МГМСУ Минздравсоцразвития России. Материалы диссертации используются в процессе обучения студентов, интернов, клинических ординаторов и аспирантов.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на XXXIII Итоговой конференции молодых ученых МГМСУ (Москва, 2011); научно-практической конференции, посвященной 55-летию Самарской областной клинической стоматологической поликлиники (Самара, 2010); VIII Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии» (Москва, 2011); совместном заседании кафедр стоматологии общей практики и подготовки зубных техников; микробиологии, вирусологии, иммунологии лаборатории НИМСИ МГМСУ (протокол № 38 от 10 июня 2011 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано б печатных работ, в том числе 3 работы в журналах из перечня ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, главы «Обзор литературы», главы «Материалы и методы исследования», 2 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 168 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 27 рисунками и содержит 32 таблицы. Список литературы включает 33 отечественных и 127 иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Проведено комплексное стоматологическое обследование 257 больных (137 женщин и 120 мужчин, в возрасте от 31 до 69 лет), обратившихся в отделение профилактики Стоматологических заболеваний кафедры стоматологии общей практики и подготовки зубных техников ФПДО, ГУ «Стоматологическая поликлиника № 5» УЗ CAO г. Москвы и ГУ «Стоматологическая поликлиника № 7» УЗ ЮЗАО г. Москвы, с жалобами на запах изо рта, кровоточивость десен при чистке зубов, боли, дискомфорт и неприятные ощущения в полости рта. Из них, на основании критериев включения, не включения и исключения, были выбраны 145 пациентов в возрасте от 31 до 69 лет (102 женщины и 43 мужчины), которым на основании данных клинического и лабораторного обследования был поставлен диагноз - хронический пародонтит (ХП) (МКБ - 10; КОД - К.005), этиологически ассоциированный с пародон-топатогенными видами бактерий, идентифицированных с помощью методов генодиагностики. По данным анамнеза, анкетирования и заключений общих специалистов у большинства обследованных пациентов в анамнезе имелись сопутствующие соматические заболевания. На основании окончательного

клинического диагноза и показателей минеральной плотности костной ткани пациенты были разделены на две группы: первая - 73 пациента с ХП средней степени тяжести, ассоциированным с остеопенией и вторая - 72 пациента с ХП средней степени тяжести, ассоциированным с остеопорозом. Группу контроля составили 32 практически здоровых человека без признаков воспаления тканей пародонта и потери минеральной плотности костной ткани.

Клиническое обследование включало: выявление жалоб пациентов; оценку гигиенического состояния полости рта по индексам OHI-S (Green J.C., Vermilion J.R., 1960) и API (Lange); оценку интенсивности заболеваний тканей пародонта по индексам РМА (Parma С., 1960) и PI (Russel А.,1956); определение глубины пародонтальных карманов, кровоточивости и наличие гноя с помощью пуговчатого зонда; исследование окклюзионных контактов зубов и зубных рядов с помощью артикуляционной бумаги и компьютерной оценки аппаратом «Т-scan III» (компания Tekscan, США); определение степени атрофии костной ткани и участков деструкции на ортопантомографе с применением рентгеновской пленки и на цифровом аппарате «Orthpralix-9200», в некоторых случаях дополнительно проводили исследование с помощью дентальных снимков или с помощью радиовизиографии.

Все пациенты прошли обследование в кабинете профилактики остео-пороза на кафедре стоматологии общей практики и подготовки зубных техников ФПДО, в рамках программы «Здоровые кости». Оценку состояния минеральной плотности костной ткани (МПКТ) периферического скелета проводили при помощи аппарата-денситометра DTX 200 DXA BONE Osteometer, Дания - США. Для оценки изменений МПКТ по сравнению с нормой использовали критерии Т и Z. По Z - критерию МПКТ пациента сравнивали со среднестатистической нормой для того же возраста, а по Т-критерию - с нормой, соответствующей пику костной массы.

Для исследования гемодинамических характеристик кровотока в микро-циркуляторном русле пародонта использовали ультразвуковую высокочас-

тотную допплерографическую систему «Минимакс-Допплер-К» (ООО «СП Минимакс», Санкт - Петербург).

Маркерные виды пародонтопатогенных бактерий определяли в образцах ДНК, выделенных из участков в четырех квадрантах зубодесневой борозды у каждого обследованного индивида, с помощью набора реактивов "Мультидент - 5" (ООО «НПФ "Генлаб"», Россия) для идентификации ДНК пяти видов пародонтопатогенов I и II порядков - A. actinomycetemcomitans, Т. forsythia, T. denticola, P. intermedia и P. gingivalis с помощью мультиплексной ПЦР и последующей регистрацией синтезированных ампликонов методом электрофореза в 1,6% агарозном геле [Николаева Е.Н., 2011].

Оценку факторов врожденного иммунитета проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа дефензинов HNP 1 - 4 в сыворотке периферической крови и десневой жидкости, отобранной в области зубодесневой борозды или пародонтальных карманов зубов №16, 25, 36 и 45 с помощью бумажных эндодонтических штифтов стандартного размера (№30), используя набор реактивов HUMAN HNP 1-3 (Hycult Biotech, The Netherlands). Результаты ИФА оценивали с помощью иммуноферментного анализатора Stat Fax мод. 3200 Readers (США) при 450 нм.

Экспрессию TLR2 и TLR4 рецепторов на основных субпопуляциях Т -лимфоцитов (CD3+), В - лимфоцитов (CD19+), моноцитах (CD14+) и грануло-цитах (CD45 dim) периферической крови пациентов с ХП и здоровых людей определяли методом иммунофенотипирования лейкоцитов с последующей оценкой на проточном цитометре FACS Canto 2 [Хаитов Р.В. и др., 2009]. Содержание TLR2 и TLR4 рецепторов на клетках десневой жидкости определяли методом иммунофенотипирования лейкоцитов с последующей оценкой под люминесцентным микроскопом ECLIPSE 50i (Nicon, Япония) при увеличении хЮОО.

Статистическую обработку полученных цифровых данных проводили с помощью критерия Стьюдента и представляли в виде M ± A, M - средняя

арифметическая, а А - половина доверительного интервала. Достоверность различий в частоте встречаемости ДНК пародонтопатогенов рассчитывали с помощью непараметрического критерия хи -квадрат (%2) с поправкой Yates на непрерывность выборки. В необходимых случаях, когда в группе сравнения было менее 5 наблюдений, использовали двусторонний точный критерий Фишера. Анализ связи (корреляции) нескольких признаков проводили, применяя непараметрический метод Спирмена. Различия считали статистически значимо достоверным при р < 0,05. Все расчеты проводили с помощью пакета программ STATISTICA 7.0 [Реброва О.Ю., 2006].

Результаты исследования и их обсуждение Клиническое обследование. При комплексном стоматологическом обследовании на момент осмотра у 95% пациентов обеих групп гигиена полости рта была неудовлетворительной. Среднее значение индекса Green-Wermillion составило 2,3±0,3. У 23 (31,5%) человек 1 группы и у 32 (44,4%) человек 2 группы гигиена полости рта соответствовала плохому уровню. Индекс OHI-S у пациентов 1 группы был статистически достоверно выше в 3,4 раза по сравнению со средними значениями у представителей контрольной группы. У пациентов 2 группы он был почти в пять раз выше, чем у людей в контрольной группе и статистически достоверно выше в 1,5 раза, чем у пациентов 1 группы. Индекс PMA у пациентов 1 группы также был статистически достоверно выше в 2,4 раза, чем у представителей контрольной группы, но в 1,3 раза меньше, чем у пациентов 2 группы (р < 0,05). Различия между группами пациентов с ХП по индексу API были незначительными (70,42±7,36 и 75,66 ± 10,6). При этом у больных ХП индекс API был статистически достоверно выше в 1,4-1,5 раза, чем у людей в контрольной группе. Средние значения глубины пародонтальных карманов у пациентов с ХП обеих обследованных нами групп соответствовали средней степени тяжести пародонтита и статистически достоверно не отличались друг от друга (табл.1).

Таблица 1.

Результаты индексной оценки состояния гигиены полости рта и тканей пародонта, _(M ± А)_

Показатель Группа

Контрольная 1 2

КПУ 14,78±4,09 16,86±1,97 16,29±3,17

OHI-S 0,88±0,15 3,00±0,50* 4,36±0,42**

РМА 23,29±3,95 56,41±7,60* 72,4±4,66**

API 50,14± 10,00 70,42±7,36* 75,66± 10,63

PI 0,99±0,15 3,20±1,64* 3,29±0,31

Глубина пародонтального кармана 3,30 ±0,26 5,00 ±0,19 5,00 ± 0,28

Примечание: здесь и в табл. 2 - 4 - M - средняя арифметическая, А - половина доверительного интервала, * - статистически значимо достоверная разница, по сравнению с контрольной группой, ** - статистически значимо достоверная разница, по сравнению с 1 группой при р < 0,05.

У лиц контрольной группы средняя глубина зубодесневого соединения (3,30 ± 0,26 мм) соответствовала норме и статистически достоверно отличалась от значений у пациентов с ХГП (р < 0,05). На рентгенологических снимках выявили образование костных карманов, деструкцию межальвеолярных перегородок на Ул-Уг длины корней. Кариес диагностирован у всех обследованных пациентов. Высокий уровень интенсивности КПУ зубов отмечен у 27 (36,9 %) человек 1 группы и 27 (37,5%) пациентов во 2 группе. У 14 (43,3%) пациентов контрольной группы уровень распространенности и интенсивности кариеса соответствовали низкому и у 18 (56,6%) очень низкому уровню.

При оценке взаимосвязей между стоматологическими показателями у пациентов обследованных нами групп с помощью корреляционного анализа Спирмена была выявлена статистически достоверная сильная корреляционная связь между формой заболевания (ХП, ассоциированный с остеопенией или остеопорозом) и возрастом пациентов (R = 0,7615). Умеренные статистически достоверные корреляционные связи выявлены между стадией заболевания и глубиной пародонтального кармана (R = 0,4746), индексами OHI-S (R = 0,3359), PMA (R = 0,3691), PI (R = 0,5140) и API (R = 0,4640). Также умеренные статистически достоверные корреляционные связи выявлены ме-

жду индексами OHI-S и PMA (R = 0,6086), OHI-S и API (R = 0,4029), OHI-S и PI (R = 0,5748), OHI-S и глубиной пародонтального кармана (R = 0,3915), а также слабая корреляционная связь между OHI-S и КПУ (R = 0,1536).

Таким образом, для индексов гигиены и состояния тканей пародонта характерны умеренные статистически достоверные прямые корреляционные связи.

Гемодипамические характеристики кровотока в микроциркулятор-ном русле тканей пародонта. При заболеваниях пародонта происходят нарушения кровотока в тканях десны [Козлов В.А. и др., 2000; Кречина Е.К. и др., 2008; Develioglu H. et al., 2006; Morozumi T. et al., 2004]. Мы регистрировали состояние кровотока методом ультразвуковой допплерографии при помощи датчика с частотой сигнала 25 МГц, который позволял оценить гемодинамику на глубине до 5,0 мм на границе между прикрепленной десной и переходной складкой в 4 точках, в области зубов 16, 25, 36 и 45. У обследованных пациентов 1 группы среднее значение максимальной систолической скорости кровотока (Vas), характеризующего величину скорости тканевого кровотока в тканях десны, было выше, чем у пациентов 2 и контрольной групп (табл. 2).

Таблица 2.

Данные УЗДГ гемомикроциркуляции в тканях пародонта, (M ± Л)

Группа Показатель"^^^^^ Контрольная Первая Вторая

Vas 0,491 ± 0,08 0,665 ± 0,065* 0,507 ± 0,06

Vam 0,190 ±0,05 0,213 ±0,033 0,166 ±0,03

Qas 0,213 ± 0,04 0,313 ±0,031 0,239 ± 0,03

Qam 0,090 ± 0,02 0,099 ±0,016 0,077 ± 0,02

Vakd 0,190 ±0,05 0,212 ±0,034 0,173 ±0,04

PI 1,16 4± 0,13 1,464 ±0,107 1,140 ±0,14

RI 0,653 ± 0,04 0,713 ± 0,020 0,619 ±0,04

Средние объемные характеристики кровотока <3ат и (^ай у пациентов 1 группы были выше, чем у больных 2 группы, а индекс пульсации Р1 на 21%

был статистически достоверно ниже нормы, что могло свидетельствовать о снижении упруго-эластических свойств микрососудов и их структурных изменениях. Эти показатели статистически достоверно отличались от значений гемомикроциркуляции в тканях пародонта здоровых людей [Кречина Е.К. и др., 2008]. Индекс периферического сопротивления кровотока RI не отличался от нормы. При этом выявлены слабые статистически достоверные корреляционные связи между показателями гемодинамики и пародонтальными индексами.

Состояние минеральной плотности костной ткани периферического скелета. Отклонения от нормальных значений минеральной плотности костной ткани были зарегистрированы у 145 пациентов с ХП: у 73 (100%) пациентов 1 группы данные денситометрии соответствовали остеопении, а у 72 (100%) обследованных людей 2 группы - остеопорозу. Результаты костной денситометрии не выявили снижения минеральной плотности костной ткани у лиц контрольной группы.

Видовой состав основных пародонтопатогенов. Характерной чертой ХП является то, что не все участки зубного ряда подвержены повреждению в одинаковой степени. Поэтому с целью изучения амфихитриальной природы пародонтита в содержимом пародонтальных карманов зубов 16, 25, 37 и 45 у пациентов с ХП и в области этих зубов у людей со здоровым пародонтом мы исследовали состав пародонтопатогенной микрофлоры I и II порядков [Царев В.Н. и др., 2008] методом мультиплексной ПЦР.

Установлено, что ДНК пародонтопатогенов были выявлены у людей со здоровым пародонтом с минимальной частотой от 3% до 5%. ДНК Р. gingiva-lis у людей со здоровым пародонтом не была выявлена ни у одного человека. В содержимом пародонтальных карманов больных ХП, ассоциированным с системной остеопенией или остеопорозом, относительная частота выявления пародонтопатогенов была высокой и превышала значения в контрольной

группе от 7 до 50 раз. При этом P. intermedia в пародонтальных карманах пациентов 2 группы выявили статистически достоверно в 1,6 раза чаще, чем у пациентов 1 группы; A. actinomycetemcomitans в 1,8 раза, а P. gingivalis в 1,9 раз чаще, р < 0,005. Разница в частоте выявления T. forsythia и T. denticola у пациентов обеих групп была незначительной и статистически не достоверной. Частота выявления данных видов микробов в изучаемых участках различных зубов значительно варьировала. ДНК P. intermedia чаще всего была выявлена в области зуба 45 как у людей со здоровым пародонтом, так и у пациентов 1 группы, а у пациентов 2 группы - в области зуба 25 (рис. 1).

T. forsythia чаще выявляли в области зуба 36 и 45 у пациентов 1 группы, а у пациентов 2 группы - в области зуба 25 и 36; P. gingivalis в области зуба 16 и 45 у пациентов 1 группы и у пациентов 2 группы - в области зуба 36 и 45. ДНК A. actinomycetemcomitans была выявлена с одинаковой минимальной частотой во всех исследуемых участках зубов у представителей контрольной группы. Разница в частоте выявления этого вида микробов у пациентов 1 и 2 групп была статистически не достоверна, за исключением зуба 45. Вклад контрлатеральных проявлений T. denticola в содержимом пародонтальных карманов был сильнее, чем ипсилатеральных (у_2 = 29,4, г) = 3, р = 0,014). Суммарно в области зуба 16 у пациентов 1 группы ДНК пародонтопатоген-ных видов бактерий были выявлены в 1,2 раза реже, чем у пациентов 2 группы, в области зуба 25 - в 1,73 раза, зуба 36 - в 1,5 раза и зуба 45 в - 1,2 раза, р < 0,05. Больше всего пародонтопатогенов было выявлено в области нижней челюсти, причем характер обсемененности зубов у людей со здоровым пародонтом и пациентов 2 группы имел похожую тенденцию. У пациентов этих групп больше всего микробов было выявлено в обследуемых участках зуба 36, а у пациентов 1 группы - в области зуба 45. Нами установлено, что не более, чем у 20% людей со здоровым пародонтом в области зубодесневой борозды можно выявить один или два вида пародонтопатогенов и только в одном из квадрантов. У пациентов с ХП, ассоциированным с остеопенией, в

70% участков, а у пациентов с ХП, ассоциированным с остеорозом, в 80% участков зубодесневой борозды (пародоитальных карманов), можно выявить с помощью молекулярно-биологических методов исследований ассоциации двух - пяти видов пародонтопатогенных видов бактерий 1 и И порядков.

«

CS

Б 2

100 50 0

16 36

зуб

I контрольн ая группа ! J -я группа

□ 2-я группа

100

Р. intermedia

100 50

0 -I

16

36

зуб

■ контрольна

я группа □ I -я группа

а 2-я группа

P. gingivalis

я о

Л о

S 2 50 н й о Я н

Uli

16 36 зуб

I контроль ная группа И-я группа

T. forsythia

I контроль ная

группа 11-я группа

T. denticola

2

я «

M О

I S

К о

3 о

О се

» S< н О

40

20

0 ™

JLI. Â Â

16 25 36 45 зуб

■ контрольная

группа 0 1 -я группа

□ 2-я группа

А. асИпотусе1етсоткап5

Рис. 1 Относительная частота выявления ДНК пародонтопатогеиов в содержимом пародоитальных карманов больных ХП и в области зубодесневой борозды людей со здоровым пародонтом.

Наличие пародоитопатогенов в пародонтальиых карманах умеренно коррелирует как с клиническими проявлениями пародонтита, так и некоторых системных заболеваний (сердечно - сосудистые заболевания и остеопо-роз).

Показатели врожденного иммунитета. Нами установлено, что содержание антимикробных пептидов HNP 1-3 в десневой жидкости обследованных людей было в 4 - 5 раз выше, чем в плазме как у лиц с интактным па-родонтом, так и у пациентов с ХП. Концентрация HNP 1-3 в десневой жидкости у людей со здоровым пародонтом варьировала в пределах 10 - 4000 ng/ml, в среднем - 1047,0 ± 285,5 ng/ml; у пациентов 1 группы - 1 - 4000 ng/ml, в среднем - 1079,0 ± 241,0 ng/ml; у пациентов 2 группы - 575 - 14000 ng/ml, в среднем - 5534,1 ± 915,6 ng/ml. Содержание альфа - дефензинов в десневой жидкости у представителей контрольной группы и пациентов 1 группы статистически достоверно не отличалось, но оно было в 5 раз меньше, чем у пациентов 2 группы. Следует отметить, что у 7 (22%) представителей контрольной группы с помощью ПЦР была выявлена ДНК одного - двух видов пародоитопатогенов. При этом именно у них были выявлены повышенные уровни содержания альфа - дефензинов. При выделении людей, не имеющих пародоитопатогенов в области зубодесневой борозды, в отдельную подгруппу, было установлено, что у них среднее содержание альфа - дефензинов в десневой жидкости составило 536,2 ± 222,8 (313,4 - 758,9) ng/ml, то есть было в 1,95 раз ниже, чем в целом по группе. Показано наличие умеренной статистически достоверной корреляции между содержанием HNP 1-3 в десневой жидкости и наличием в пародонтальиых карманах P. gingivalis (R = 0,567), Т. denticola (R = 0,598), T. forsythia (R = 0,654), количеством видов в ассоциациях (R = 0,4317) и количеством инфицированных участков (R = 0,384); количеством кариозных поверхностей (R = 0,495), пародонтальным индексом PI (R = 0,380), API (R = 0,258), глубиной пародонтальиых карманов (R = 0,389) и возрастом (R = 0,405); показателями МПКТ - ВМС (R = - 0,2542), BMD (R

= - 0,3924) и Т - критерия (R = - 0,5178); слабой отрицательной корреляции с показателями гемомикроциркуляции. Количество антимикробных пептидов HNP 1-3 в плазме здоровых людей было статистически достоверно в 2 раза ниже, чем у пациентов с ХП и системной остеопенией и в 5 раз меньше, чем у пациентов с ХП, ассоциированным с остеопорозом. При этом у пациентов 2 группы содержание альфа - дефензинов в плазме периферической крови было статистически достоверно выше, чем у пациентов 1 группы. Корреляция с основными показателями, определяющими МПКТ была не такая явная как для показателей десневой жидкости.

Таким образом, увеличение содержания альфа - дефензинов HNP 1-3 в десневой жидкости и плазме периферической крови зависит от возраста пациента, состояния гигиены полости рта, увеличения содержания пародонто-патогенных видов бактерий P. gingivalis, T. denticola, T. forsythia, наличия кариозных поверхностей, сопутствующих заболеваний и других признаков.

Так как десневая жидкость - это легкодоступная жидкость, которую можно отбирать неиивазивным способом, определение в ней АМП можно использовать для измерения и контроля риска заболевания ХП.

По данным зарубежных авторов распознавание РАМР пародонтопатоге-нов происходит при участии TLR - 2 и TLR - 4 [Burns Е. et al., 2006; Flemmig T.F., Beikler T., 2011; Mahanonda R, Pichyangkul S., 2007].

Для выявления состояний, связанных с нарушением функционирования системы TLR необходимы адекватные и надежные методы оценки компонентов системы TLR, которые могут быть воспроизведены в условиях стандартной клинической лаборатории. Мы оценили экспрессию Toll - подобных рецепторов врожденного иммунитета TLR - 2 и TLR - 4 на клетках из содержимого зубодесневой борозды. При микроскопии было показано, что клетки десневой жидкости, большую часть которых составляют лейкоциты, экспрес-сируют с различной интенсивностью рецепторы врожденного иммунитета TLR - 2 и TLR - 4. Однако, выделяемого из десневой жидкости количества

клеток было недостаточно для проведения исследований с помощью проточной лазерной цитометрии, удовлетворяющих критериям доказательной медицины, которые в дальнейшем можно было бы применить в клинической диагностике. Поэтому для получения дополнительных данных далее мы провели исследования на клетках периферической крови (по 10 человек из каждой группы).

Экспрессия ТЬЯ - 2 и ТЫ1 - 4 на лейкоцитах периферической крови у разных субъектов варьировала от 0 % до 100 %. У людей со здоровым паро-донтом на не стимулированных клетках периферической крови (нейтрофи-лах, моноцитах, лимфоцитов) она не превышала 1%. У больных ХП, ассоциированным с остеопенией и остеопорозом, экспрессия ТЫ12 и ТЫ14 на нейтрофилах была снижена в 1,5 - 2,8 раза; на моноцитах у пациентов с остеопенией □ увеличена в 1,5 (ТЬЯ2) -15 (ТЫ14) раз, но снижена у пациентов с остеопорозом в 1,7 (Т1Л14) и 10 (ТЫ12) раз; на лимфоцитах эксперессия ТЬИ2 снижена в 3-4 раза, а ТЬИ4 увеличена в 1,5 - 3,0 раза у пациентов обеих групп (табл. 3, 4).

Следовательно, у больных ХП, ассоциированным с остеопенией или остеопорозом под воздействием пародонтопатогенов I и II порядков происходят разнонаправленные изменения экспрессии Т1Л12 и ТЫ14 на лейкоцитах периферической крови, что может быть связано с воспалительными процессами полости рта.

В настоящее время пародонтит диагностируется на основе ряда клинических показателей, включая глубину при зондировании, клиническую потерю прикрепления, кровоточивость при зондировании, пародонтальный индекс, радиографические изменения. Однако показатели глубины пародон-тального кармана, потери клинического прикрепления и рентгенологические уровни костной ткани дают информацию уже о состоявшейся деструкции костной ткани и не раскрывают текущее состояние активности заболевания и не предсказывают его будущего развития.

Таблица 3.

Экспрессия CD 282 (TLR 2) на лейкоцитах периферической крови

Группа контрольная Ед. изм. Экспрессия CD 282 (TLR 2)

Нейтрофилы Моноциты Лимфоциты

% 0,34 ± 0,04 0,65 ±0,11 1,06 ±0,45

абс., млн/л 18,15 ±2,16 34,45 ±5,71 56,24 ±24,12

1 % 0,12 ±0,01* 0,91 ± 0,43* 0,35 ±0,01*

абс., млн/л 6,13 ±0,93* 43,72± 5,34* 18,82 ±0,93*

2 % 0,08 ±0,01* 0,065 ± 0,028 0,26 ± 0,05*

абс., млн/л 2,67 ± 3,05* 2,48 ± 1,12* 9,91 ± 1,91*

Таблица 4.

Экспрессия CD 284 (TLR 4) на лейкоцитах периферической крови

Группа Ед. изм. Экспрессия CD 284 (TLR 4)

Нейтрофилы Моноциты Лимфоциты

контрольная % 0,35 ± 0,05 0,145 ±0,003 0,26 ±0,12

абс., млн/л 18,25 ±3,11 7,6 3± 1,51 13,52 ±6,50

1 % 0,275 ± 0,083* 2,17 ± 0,18* 0,73 ±0,13*

абс., млн/л 14,79 ± 1,78 117,02 ±3,8* 39,06 ±2,79*

2 % 0,21 ± 0,07* 0,085 ± 0,038* 0,31 ±0,11

абс., млн/л 8,05 ± 2,67* 3,39 ±2,67* 11,81 ±4,19*

Поэтому, полученные данные могут быть полезны для определения вклада локальных или системных этиологических факторов на чувствительность организма к заболеванию и могут иметь значение для клинической диагностики, что позволит повысить эффективность патогенетического лечения воспалительных заболеваний пародота.

ВЫВОДЫ

1. Стоматологический статус и состояние тканей пародонта у пациентов с хроническим пародонтитом средней степени тяжести (МКБ - 10; КОД -К.005), ассоциированным с остеопорозом, характеризуются умеренным прогрессированием воспалительно-деструктивных процессов, сопровождающихся ухудшением показателей гигиены полости рта (OHI-s и РМА), по сравнению с больными хроническим пародонтитом средней степени, ассоциированным с остеопенией.

2. Хроническое воспаление тканей пародонта, у лиц с системной потерей минеральной плотности костной ткани, остеопения или остеопороз, сопровождается снижением кровотока в системе гемомикроциркуляции пародонта.

3. Существует умеренная корреляционная связь выявления пародонтопато-генных видов A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia и T. denticola со степенью выраженности патологии пародонта у лиц со сниженной минеральной плотностью костной ткани.

4. Изменения в системе врожденного иммунитета, проявляющиеся на уровне экспрессии антимикробных пептидов и Toll - подобных рецепторов TLR2 и TLR4 связаны с системной потерей минеральной плотности костной ткани и развитием хронического пародонтита.

5. Разработан алгоритм лабораторной диагностики пародонтита, на основе выявления клинических, микробиологических и иммунологических критериев и оценена его эффективность.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для выявления этиологических факторов риска развития воспалительных заболеваний полости рта и с целью профилактики у лиц со здоровым па-родонтом рекомендуется скрининговое определение пародонтопатоген-ных бактерий I и II порядков в 4 квадрантах зубодесневой борозды.

2. С целью повышения эффективности этиологической диагностики хронического пародонтита, ассоциированного с остеопенией и остеопорозом, и изучения роли пародонтопатогенной флоры при системных заболеваниях организма человека рекомендуется определение пародонтопатогенных бактерий I и II порядков не менее, чем в 4 квадрантах зубодесневой борозды с использованием набора реактивов "Мультидент - 5".

3. Наличие в пародонтальных карманах пигментообразующих видов бактерий P. intermedia, T. forsythia и P. gingivalis в трех - четырех квадрантах

зубодесневой борозды или Т. с1еп1юо1а и А. асипотусеГетсоткапз в одном квадранте является показанием для назначения дополнительных исследований состояния системы врожденного иммунитета (определение НЫР 1-3 в десневой жидкости) и показателей минеральной плотности костной ткани с целью профилактики и выявления факторов риска системных заболеваний и прогрессирования воспалительных заболеваний паро-донта по алгоритму:

Рис. 2. Алгоритм клинико-лабораторной диагностики иародонтита, ассоциированного с остеопенией и остеопорозом

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Унанян A.A., Мартиросян В.Г., Арутюнов Д.А., Артёмова В.О., Ваганова JI.K. Обоснование применения стоматологических биопленок, содержа-

щих клиндамицин и галавит, в комплексном лечении хронического генерализованного пародонтита // Актуальные вопросы стоматологии: сборник научных работ, посвященный 55-летию Самарской областной клинической стоматологической поликлиники. - Самара: Рядовой бланк, 2010. -С. 274-275.

2. Арутюнов С.Д., Царев В.Н., Николаева E.H., Унанян A.A., Мартиросян В.Г. Применение стоматологических биопленок, содержащих клиндамицин и галавит, в комплексном лечении хронического генерализованного пародонтита // Российский стоматологический журнал - М., - 2011. -№ 1. - С. 23-26.

3. Царев В.Н., Николаева E.H., Арутюнов С.Д., Унанян A.A., Мартиросян В.Г. Оценка амфихиральной природы распространения пародонтопатоген-ных бактерий у больных хроническим генерализованным пародонтитом // Российский стоматологический журнал. - М., - 2011. - № 2 - С. 29 -31.

4. Унанян A.A., Мартиросян В.Г. Применение стоматологических биопленок, содержащих клиндамицин и галавит, в комплексном лечении хронического генерализованного пародонтита // DENTAL FORUM - М., -2011.-№ 3-С. 131-132

5. Николаева E.H., Мартиросян В.Г., Царев В.Н., Арутюнов С.Д. Изучение экспрессии эндогенных антимикробных пептидов у больных хроническим пародонтитом // DENTAL FORUM - М., - 2011. - № 4- С. 17 - 21.

6. Мартиросян В.Г., Николаева E.H., Царев В.Н., Арутюнов С.Д. Экспрессия альфа-дефензинов в биологических жидкостях пациентов с хроническим пародонтитом // Сборник научных трудов VIII Всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии».-М.,-2011.-С. 190-191.

Отпечатано в РИО МГМСУ 127473, г. Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1. Заказ № 934. Тираж 100 экз.