Автореферат и диссертация по медицине (14.01.09) на тему:Клинико-лабораторные аспекты сальмонеллеза у взрослых

На правах рукописи

НАЗМУТДИНОВА РИТА ГАЛИЕВНА

4857207

КЛИНИКО - ЛАБОРАТОРНЫЕ АСПЕКТЫ САЛЬМОНЕЛЛЁЗА У

ВЗРОСЛЫХ

14.01.09 - инфекционные болезни 03.02.03 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

1 3 ОКТ 2011

Москва-2011

4857207

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научные руководители:

Доктор медицинских наук Мурзабаева Расима Ткмеряровна

Доктор медицинских наук, профессор Мавзютов Айрат Радикович

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Грачёва Нина Михайловна

Доктор медицинских наук, профессор Пашков Евгений Петрович

Ведущая организация - ГБОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится «28» октября 2011 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 208.114.01 Федерального бюджетного учреждения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благ ополучия человека по адресу: 111123, Москва, ул. Новогиреевская, За.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального бюджетного учреждения науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере прав потребителей и благополучия человека по адресу: 111123, Москва, ул. Новогиреевская, За.

Автореферат разослан « »сентября 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор

Александр Васильевич Горелов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

По данным ВОЗ, ежегодно регистрируется до 275 млн. диарейных заболеваний среди детей и взрослых, занимая второе место по частоте после острых респираторных вирусных инфекций, в Российской Федерации (РФ) - около 1 млн. случаев острых кишечных инфекций (ОКИ). При этом показатель заболеваемости в 2007-2008 гг. составил 509,8-512,3 на 100 тыс. населения и не имеет тенденции к снижению. Сальмоиел-лез в структуре кишечных инфекций составляет 6,96% и 6,97% в 2007, 2008 гг., в его этиологии доминируют Salmonella Enteritidis [Рожнова С.Ш., 2009; Шаханина И.Л., 2005; Brien S.J., 2003].

Особую озабоченность вызывает низкая эффективность профилактических мер при данном заболевании, это связывают с видовым разнообразием сальмонелл, их жизнеспособностью и значительной генетической пластичностью возбудителя, что существенно затрудняет лабораторную диагностику и борьбу с ними. Сохраняется актуальность госпитального сальмонеллеза [Акимкин В.Г., 1998; Труншшна P.A., 2006; Дёмин И.А., 2006], обусловленного антибиотикорезистентными штаммами бактерий [Милютина Л.Н., 2008], наличием R-плазмид [Рожнова С.Ш., 2000; Воробьёв A.A., 2000; Вар-тересяи И.И., 2002]. Однако, в последние годы учёные все чаще высказывают предположения о существовании генетических механизмов изменения патогеиности сальмонелл, которые связывают с циркуляцией между клиническими штаммами энтеробакте-рий мобильных генетических элементов, в том числе «островов» патогеиности, отвечающих за синтез различных факторов патогеиности, что, в свою очередь, даёт микробам селективное преимущество и конкурентоспособность [Бондаренко В.М., 2001; Бухарин О.В., 2000; Домарадский И.В., 1997; Рожнова С.Ш., 2000; Hacker J.,2000; Kaper J.B., 1999; Wood M.W., 1998].

Появились новые данные, указывающие на немаловажную роль липополисаха-ридов (ЛПС) грамотрицательных бактерий, включая Salmonella spp., в патогенезе и модификации иммунного ответа при вызываемых ими заболеваниях [Бондаренко В.М., 2002; Рябиченко Е.В., 2005; Яковлев М.Ю., 2003; Лиходед В.Г., 1996; Конев Ю.В., 2009].

Вышеизложенное послужило основанием для проведения соответствующих исследований.

Цель работы - установить наличие и характер взаимосвязей между частотой встречаемости фраг ментов генов «островов» патогенности энтеробактерий, антибиоти-корезистентностью выделенных штаммов сальмонелл и клиникой заболевания у взрослых, определить липополисахарид-эндотоксинемию в динамике болезни для разработки дополнительных критериев оценки тяжести, прогноза и рационального подхода к терапии сальмонеллеза.

Задачи исследования

1. Установить клинико-лабораторные особенности сальмонеллеза с учётом степени тяжести заболевания.

2. Определить концентрацию лилополисахарида (ЛПС) в сыворотке крови больных сальмонеллёзом в двух возрастных группах и установить взаимосвязи между уровнем ЛПС и показателями периферической крови в динамике болезни.

3. Молекулярно-генетическая детекция фрагментов генов «островов» патогенности, ассоциируемых с патогенностыо Е. coli, у клинических штаммов сальмонелл (гены, кодирующие гемолизины - hly (hlyA и hlyB) и адгезины - sfa (sfaA и sfaG)) и характеристика взаимосвязей между частотой их обнаружения и особенностями клинического течения сальмонеллеза.

4. Установить взаимосвязи между фрагментами генов «островов» патогемности, кодирующими гемолизины - hly (hlyA и hlyB) и адгезины - sfa (sfaA и sfaG), и анти-биотикорезистентностыо выделенных культур. Выявить влияние фактора полирезистентности к антибактериальным препаратам на тяжесть течения сальмонеллеза.

5. Установить характер взаимосвязей между молекулярно-генетическими и фе-нотипическими особенностями клинических штаммов S. Enteritidis и клинико-лабораторными показателями сальмонеллеза в двух группах сравнения (первая - гемолизины и вторая - адгезины).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Липополисахарид-эндотоксинемия, нарастающая в динамике болезни, определяет клинико-лабораторные особенности сальмонеллеза в зависимости от возраста больных.

2. Клинические штаммы сальмонелл в 97,3%, в том числе S. Enteritidis в 97,1% случаев, обнаруживают фрагменты генов «островов» патогенности (ФГОП), ассоциируемые с патогенностыо Е. coli, кодирующие гемолизины - hly (hlyA и hlyB) и адгезины - sfa (sfaA и sfaG).

3. Наличие у клинических штаммов сальмонелл генетических детерминант (hly,

sfa), ассоциируемых с патогенностыо Е. coli, коррелирует со степенью тяжести

сальмонеллеза и антибиотикорезистентностыо возбудителя.

Научная новизна исследования

Впервые установлены клинические особенности сальмонеллеза у взрослых, обусловленные наличием у 97,1% штаммов S. Enteritidis различных сочетаний фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП), ассоциируемых с патогенлостью Е. coli, определяющих способность синтезировать фимбрии типа S (sfaG и sfaA) и «-гемолизины (hlyA и hlyB). Выявлены корреляционные связи между фрагментами генов «островов» патогенности (ФГОП), степенью тяжести заболевания и антибиотикорезистентностыо культур.

Впервые при сальмоиеллёзе показана корреляция между молекулярно-генетическими характеристиками возбудителей и клинико-лабораторными показателями в группах сравнения, разделённых по признаку содержания генов гемолизинов и ад-гезинов у выделенных штаммов сальмонелл.

Впервые была определена концентрация липополисахарида (ЛПС) в сыворотке крови у больных сальмонеллёзом в двух возрастных группах и установлены взаимосвязи между уровнем ЛПС - эндотоксинемии и показателями периферической крови в динамике болезни.

Практическая значимость работы

Показано, что фрагменты генов «островов» патогенности: sfaG, sfaA, hlyA, hlyB, ассоциируемые с патогенностыо Е. coli, могут выступать в качестве маркеров патогенности клинических штаммов сальмонелл. Наличие указанных детерминант у возбудителей коррелирует с рядом особенностей течения заболевания, клинико-лабораторными показателями, антибиотикорезистентностыо сальмонелл, степенью тяжести, прогнозом заболевания, и их определение может применяться при лабораторной диагностике сальмонеллеза и выборе рационального лечения.

Указанные генетические маркеры могут использоваться при оценке роли возбудителя в эпидемическом процессе, а в сочетании с результатами определения антибио-тикорезистентности сальмонелл позволяют повысить эффективность этиотропной терапии.

Выявленная в ходе исследования ЛПС-эндотоксинемия, нарастающая в динамике болезни, определяет тактику ведения больных сальмонеллёзом - включение в схемы

лечения средств, снижающих уровень интоксикации (сорбенты, дезинтоксикационная терапия).

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на Российской научно - практической конференции «Инфекционные болезни: актуальные вопросы в клинике и эксперименте» (Махачкала, 2008); Российской научно - практической конференции «Актуальные вопросы клинической медицины: инфекционных и неинфекционных болезней в клинике и эксперименте» (Махачкала, 2009); I, И, III Всероссийском Ежегодном Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2009, 2010, 2011); Российской научно -практической конференции «Национальные лабораторные дни» (Москва, 2010); Республиканской научно - практической конференции, посвященной 100-летию муниципального учреждения инфекционной клинической больницы №4 г. Уфы (Уфа, 2010). Работа апробирована на межкафедральном заседании сотрудников кафедры инфекционных болезней с курсами дерматовеиерологиии и косметологии ИПО, лабораторной диагностики ИПО, фундаментальной и прикладной микробиологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.

Внедрение результатов работы в практику

Материалы диссертации опубликованы в печати. Данные, полученные в результате проведённых исследований, дополняют знания о возбудителях сальмонеллёза и о патогенезе вызываемого ими заболевания. Результаты исследований внедрены в работу КИБ №4 г. Уфы, используются в педагогическом процессе кафедр инфекционных болезней с курсами дерматовенерологиии и косметологии ИПО, лабораторной диагностики ИПО и фундаментальной и прикладной микробиологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 3 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», трёх глав собственных результатов, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы. Работа изложена на 164 страницах машинописного текста, содержит 40 таблиц, 8 рисунков. Список литературы включает 216 источников: 105 - отечественных и 111 - зарубежных авторов.

Материалы и методы исследований

Работа основана на анализе клинического наблюдения и лабораторного обследования 112 взрослых больных сальмонеллёзом гастроинтестинальной формы, находившихся на стационарном лечении в городской клинической иифекционной больнице №4 г. Уфы и г. Октябрьского в 2007-2008 гг.

Критерием включения в исследование были больные, от которых выделены клинические штаммы S. Enterifidis. Критериями исключения из исследования были пациенты, у которых выявлялись микробные ассоциации сальмонелл с условно-патогенной флорой, шигеллами, ротовирусами и др.

Изучение клинических симптомов и лабораторных данных проводилось с учётом степени тяжести заболевания. Больные сальмонеллёзом по полу были представлены 64 (61%) женщинами и 41 (39%) мужчиной разных возрастов. Большее количество пациентов было в возрасте от 20 до 29 лет - 36 (34,3%).

Группу контроля составили 33 практически здоровых человека, сопоставимых по возрасту (р > 0,684) и полу (р > 0,158) с пациентами основной группы.

Помимо общеклинпческих методов обследования, у 17 больных сальмонеллёзом, была определена концентрация липополисахарида (ЛПС) в сыворотке крови по концентрации ЛПС хромогенным методом по конечной точке с применением ЛАЛ -реактива (Hbt LAL, Голландия) в динамике: на 1-2, 3-4 и 10-11 дни болезни.

Сбор коллекции клинических штаммов сальмонелл проводили бактериологическим методом с использованием питательных сред отечественного производства. Биохимическую идентификацию культур осуществляли при использовании сред Гисса и систем для ускоренной идентификации (СИБ, ПБДЭ и др.) отечественного («Диагностические системы», Россия) и импортного («Chemapol», Чехия) производства. В случае низкой или атипичной биохимической активности выделенных культур их идентификацию проводили с использованием видоспецифических бактериофагов.

Определение чувствительности клинических штаммов сальмонелл к ампициллину, карбенициллину, гентамицину, амикацину, доксициклину, левомицетину, ци-профлоксацину, цефазолину, цефотаксиму, цефтриаксону, цефалексину и сальмонел-лёзному и интести - фагам осуществляли общепринятым дискодиффузионным методом. Оценку резистентности к антибиотикам проводили в соответствии со значениями задержки зоны роста [Скала Л.3., 2004].

Тотальную бактериальную ДНК выделяли из суточной агаровой культуры с использованием стандартных наборов «ДНК-сорбА» («Интерлабсервис», Россия). ПЦР проводилась в амплификаторе МС-16 «Терцик» («ДНК-технология», Россия). Для вы-

полнепия работы использовали праймеры к ряду генов, обнаруженных в составе «островов» патогенности у Е. coli, определяющих способность бактерий синтезировать фимбрии типа S (sfa А и sfa G) и гемолизины (hlyA и hlyB) отечественного производства («Синтол», Россия). Продукты амплификации (20 мкл) анализировали электрофоре-тически в 1,5% горизонтальных агаровых гелях в постоянном электрическом поле (10В/см). ДНК окрашивали бромидом этидия и визуализировали при освещении ультрафиолетовыми лучами (304 им) на траисиллюминаторе «Флуоскоп-2» («Биоком», Россия). Документирование результатов реакции осуществляли фотографированием на цифровую видеокамеру. В качестве маркеров использовали ДНК фага /., рестрициро-ванную Bst Е2 (М 1), и 123 п.н. - лестница «Promega» (М 2).

Статистическая обработка полученных результатов проводилась в соответствии с технологией современного компьютерного анализа на IBM - современном персональном компьютере с использованием приложений Microsoft Excell пакета Office ХР и Statistica (Stat Soft) версии 6.0 [Реброва О.Ю., 2002; Зайцев В.И, 2006; Гареев Е.М., 2009]. При проведении анализа определялись: среднее значение признака (М), стандартное отклонение признака (S), стандартная ошибка среднего (т), медиана (Ме), верхний (Qi), нижний квартили (Q3), для оценки силы влияния факторов (if) проводился частотный дисперсионный анализ. Для оценки различий количественных признаков при распределении отличном от нормального применяли критерий Маина-Уитни (U), Вилкоксона (W), при множественных сравнениях — с соответствующими поправками; при оценке различий качественных признаков - непараметрические критерии - Пирсона, Фишера (F). Для оценки взаимосвязей между признаками определялись коэффициенты ранговой корреляции Спирмена (rs), линейной корреляции Пирсона (г), канонической корреляции (г ). Статистические гипотезы считались подтвержденными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Клииико-лабораторная характеристика больных сальмонсллёзом

Среди пациентов, госпитализированных в инфекционный стационар с диагнозом «острая кишечная инфекция», в 37,1% случаев подтверждался сальмонеллёз. Из них под нашим наблюдением находилось 105 больных с гастроинтестиналыюй формой сальмонеллёза в возрасте от 18 до 70 лет, от которых были выделены S. Enteritidis в монокультуре. Клинически преобладал гастроэнтеритический вариант заболевания (83%). Женщины составили 61% (64), мужчины - 39% (41). Преобладающая часть пациентов была в возрасте от 18 до 40 лет - 70 (66,7%). Средний возраст женщин и мужчин соста-

вил 35,1±2,28 и 34,9±2,85 лет (р>0,05), соответственно. У больных сальмонеллёзом среди сопутствующих заболеваний чаще рег истрировались болезни органов пищеварения - у 35 (33,3%), каждый пятый ранее перенёс аппендэктомию - 21 (20%).

У 24 (22,9%) пациентов диагностирована лёгкая форма, у 63 (60%) - среднетя-жёлая и у 18 (17,1%) — тяжёлая форма болезни. Достоверных различий по тяжести течения заболевания среди женщин и мужчин не выявлено (х2=2,44, р>0,295).

У больных тяжёлой формой сальмопеллёза отмечались слабость (100%), головные боли (83,3%), головокружение (50%) и отсутствие аппетита (94,4%). Температура тела на высоте подъема достигала 39,0°С и выше (94,4%) и сохранялась до 7 дней и дольше - у 55,6% пациентов. На тошноту жаловались 44,4% пациентов, рвота была многократной (до 10 раз) у 72,2% и более - у 11,1% больных. У трети (33,2%) пациентов рвотный симптомокомплекс сохранялся до 7 дней и более. Боли в животе отмечались у всех больных с тяжёлой формой заболевания, из них у 94,4% сохранялись свыше 3 дней. Жидкий стул имел место в 100% случаев, носил преимущественно водянистый характер (88,9%). В кале определялись патологические примеси в виде зелени (50%), слизи (55,6%), прожилок крови (22,2%). При тяжёлых формах чаще диагностировался гастроэнтероколитический вариант сальмонеллёза (44,4%), осложнения развивались в 8 (72,7%) случаях из 11 (инфекциоино—токсический шок - 1 случай, гиповолемический шок - 3, аппендицит - 1, желудочное кровотечение — 1 и обострение хронической патологии органов пищеварения - 2 случая). При среднетяжёлой форме болезни осложнения выявлены у 3 (27,3%) пациентов: у 1 - аппендицит и у 2 - обострение хронической патологии органов пищеварения. При лёгкой форме сальмонеллеза осложнения не наблюдались. Летальных случаев среди анализированных больных не было.

В острый период болезни в периферической крови выявлена тенденция к повышению уровня гемоглобина, что в среднем составило 140±6,61 г/л при тяжёлой, 132,6±2,38 г /л - при среднетяжёлой и 129,7±2,80 г/л - при лёгкой форме сальмонеллеза; также количества эритроцитов - 4,6±0,24х10|2/л; 4,3±0,16х10|2/л и 4,17±0,07х10|2/л, соответственно. В лейкоформуле выявлено нарастание показателей нейтрофилов, что в среднем составило 81,3±4,85% при тяжелой, 71,3±4,25% - при среднетяжелой, 67,5±4,02% - при легкой форме болезни, что может отражать активацию клеточного звена иммунитета. При всех вариантах течения сальмонеллеза определялась тенденция к снижению показателей тромбоцитов: до 192,5±11,1х109/л - при тяжелой; до 198,5±7,78х10ч/л - при среднетяжёлой и до 195,0±10,4х109/л - при лёгкой форме заболевания, что согласуется с данными других авторов [Каган Ю.Д., 1992] и, по-видимому, указывает на выраженность токсикоза. У 33,3% больных с тяжёлой и у 22,2% со сред-

нетяжёлой формой сальмонеллёза в моче выявлялся белок, тогда как при легкой форме болезни протеинурии не было. При тяжёлом течении заболевания отмечалась выраженная гипостенурия, её значения в отдельных случаях достигали 1004, при выписке из стационара в среднем составили - 1010±1,27. Выявленное снижение удельной плотности мочи указывало на поражение почек, что могло быть следствием токсического действия ЛПС на эндотелий почечных сосудов [Харланова Н.Г., 2004].

Определение липополисахарида в сыворотке крови у больных сальмонел-лёзом среднетяжёлой формы в динамике болезни

Концентрация липополисахарида (ЛПС) определялась в сыворотке крови в динамике на 1-2, 3-4, 10-11 дни болезни у 17 больных сальмонеллёзом среднетяжёлой формы, которые составили основную группу и 33 практически здоровых лиц из группы контроля. Основная группа была разделена по возрасту на две группы сравнения. В первую группу вошли больные от 18 до 50 лет (п=9), во вторую - от 50 лет и старше (п=8). В крови лиц из группы контроля средняя концентрация ЛПС составила (Ме, СЫ-0?5) 0,22 (0-0,60) Ед/мл (табл. 1).

Таблица 1 - Концентрация липополисахарида в сыворотке крови у больных сальмонел-

лёзом среднетяжёлой формы в динамике болезни (Ме, С?25"075)

Группы Концентрация липополисахарида (ЕД/мл), (дни болезни) Темп роста уровня ЛПС в динамике (в 3 и 1 сыворотках)

1 сыворотка (1-2 день) 2 сыворотка (3-4 день) 3 сыворотка (10-11 день)

I группа (п=9) 1,70 (0,59 -2,36)* 1,50 (0,76-2,36)* 3,03 (1,63 3,60)* 1,8

II группа (п=8) 0,71 (0,38 -1,08)* 1,50 (0,29-2,28) 1,90 (0,78 3,47)*, ** 2,7

Контрольная группа(п=33) 0,22 (0 - 0,60)

Примечание: * - различия достоверны при сравнении с контролем (р<0,001) по методу Крускала-Уоллиса, с последующим множественным сравнением по (и) Критерию Манна-Уитни с поправкой Данна, ** - различия достоверны (р<0,01) при сравнении с показателем при поступлении по критерию Фридмана с последующим критерием множественного сравнения (ЛУ) Вилкоксона с поправкой Бонферони.

Средние показатели ЛПС в обеих возрастных группах во все периоды болезни были достоверно выше, чем в контроле (р<0,001), кроме 2-й сыворотки в группе больных старшего возраста. Концентрация ЛПС в группах сравнения нарастала в динамике болезни. Так, в соответствующие сроки в I группе показатели составили 1,70 (0,592,36)*; 1,50 (0,76-2,36)*; 3,03 (1,63-3,60)* Ед/мл, темп увеличения уровня ЛПС на фоне лечения (в 3 по сравнению с 1 сывороткой) составил 1,8 раза. Во II группе показатель

достоверно возрос с 0,71 (0,38-1,08)*до 1,90 (0,78-3,47)*, ** Ед/мл (р<0,01), темп роста составил 2,7 раза, что в 1,5 раза больше, чем в первой группе. Большее повышение концентрации ЛПС (в 2,7 раза) у лиц старшего возраста в динамике болезни может отражать, в силу инволюционных процессов, недостаточность и быстрое истощение систем, связывающих и нейтрализующих эндотоксин грамотрицательных бактерий в организме [Конев Ю.В., 2009].

Сопоставление клинико-лабораторных данных в группах сравнения выявило различия. Температура до 39°С и выше была у всех 9 больных первой группы против 7 из 8 - во второй группе, температура до 38°С свыше 3 дней, была только у больных II группы - у 4 из 8. Среди больных II группы частота рвоты была больше - у 5 из 8 против 3 из 9 пациентов I группы, продолжительная диарея также чаще встречалась среди больных старшей возрастной группы - у 7 из 8 против 3 из 9 пациентов первой группы.

Результаты исследования крови у пациентов в группах сравнения выявили более высокие показатели сегментоядерных нейтрофилов в крови больных первой группы (Ме, С^-СЫ - 51,0 (44,0 - 62,0)% против 49,5 (40,0 - 65,5)%, (р<0,001) в острый период болезни, что может указывать на более выраженную ответную реакцию иммунной системы у лиц молодого возраста. Показатели тромбоцитов в острый период болезни снижались в обеих группах, но больше во второй (Ме, (Ь5-С?75) - 121,0 (106,5 - 137,0)х10'/л против 152,0 (137,0 - 165,0)х109/л - в первой (р<0,043) и в стадии выздоровления оставались низкими - во второй группе - 158,5 (130,5 - 191,0)х 109/л, по сравнению с первой - 235,0 (191,0 - 254,0)х10ч/л (р<0,009), что могло быть также связано с ограниченными резервами эндотоксинсвязывающих систем организма у пожилых людей и большим разрушением клеток крови, участвующих в связывании эндотоксина [Конев Ю.В., 2009; Яковлев М.Ю., 2003].

Сравнительный анализ показателей периферической крови больных основной группы (п=17) и группы контроля (п=33) выявил статистически значимые различия до и после лечения. Так, в острый период в основной группе пациентов были достоверно выше, чем в контроле количество лейкоцитов (р<0,026), палочкоядерных нейтрофилов (р<0,001), СОЭ (р<0,001), эритроцитов (р<0,018), достоверно ниже - показа гели эози-нофилов (р<0,013), лимфоцитов (р<0,001) и тромбоцитов (р<0,001). В стадии выздоровления отмечено достоверное увеличение количества моноцитов (р<0,001), высокий уровень СОЭ (р<0,001) и снижение сегментоядерных нейтрофилов (р<0,002), сохранялась тромбоци гонения (р<0,046) в крови больных основной группы в сравнении со здоровыми лицами из группы контроля. Выявленные изменения в гемограммах у пациентов сальмонеллёзом могут указывать на наличие воспалительного процесса в организме

и выраженность эндотоксинемии (в частности тромбоцитопения), оказывающей дозо-зависимое влияние на клетки миелоидного ряда и иммунной системы (активирующее -при малых дозах и подавляющее - при больших дозах ЛПС) [Dinarello С.А., 2007; Silvester Н. et al., 1990; Платонов А.Е., 1999; Мешков М.В., 2005].

С целью выявления ЛПС-опосредованных изменений в организме и определения взаимосвязей между концентрацией ЛПС в сыворотке крови и показателями периферической крови у больных сальмонеллёзом проводился статистический анализ, который выявил при поступлении в стационар статистически значимую, прямую, средней силы корреляционную связь (по коэффициенту Пирсона) между уровнем ЛПС и моноцитов (г=0,65; р<0,005). При выписке больных определилась достоверная прямая корреляционная зависимость средней силы между уровнем ЛПС и показателями эозино-филов (г=0,51; р<0,037). В остальных случаях имела место незначимая корреляция средней силы - между уровнем ЛПС и лейкоцитов (г=0,41; р>0,104), обратная зависимость между уровнем ЛПС и показателями моиоцитов (г=-0,30; р>0,236). Изменения картины периферической крови в разные периоды болезни, по-видимому, объясняются дозозависимым влиянием (активизирующим или подавляющим) ЛПС на клетки крови [Dinarello С.А., 2007; Яковлев М.Ю., 2003].

Молекулярно-генетическая оценка клинических штаммов сальмонелл, выделенных от взрослых больных гастроинтестиналыюй формой сальмонеллёза

Исследование клинических штаммов сальмонелл на наличие ДНК-фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП), специфичных известным генам кластеров па-тогенности Е. coli, определяющих способность бактерий синтезировать фимбрии типа S (sfaA и sfaG) и а-гемолизин (hlyA и hlyB), выявило присутствие генетических детерминант у 109 (97,3%) из 112 клинических штаммов сальмонелл (табл. 2).

Таблица 2 - Частота встречаемости фрагментов генов «островов» патогенности у клинических штаммов сальмонелл, выделенных от больных сальмонеллёзом (абс., %)

№ п Штаммы сальмонелл hlyA п (%) hlyB п(%) sfaG п (%) sfaA п (%) Итого генов П (%)

1. S. Enteritidis (п=102) 50 (92,6%) 54 (90%) 57 (96,6%) 29 (100%) 190 (94,1%)

2. S. Typhimurium (п=5) 3 (5,6%) 4 (6,7%) 1 (1,7%) 0 8 (4,0%)

3. S-редких групп (п=2) 1 (1,8%) 2 (3,3%) 1 (1,7%) 0 4 (1,9%)

Всего: 109 54 (100%) 60 (100%) 59 (100%) 29 (100%) 202 (100%)

Непосредственно в исследование были включены только S. Enteritidis (105 шт.). У 102 (97,1%) из них выявлены искомые гены, в отдельности и в различных комбинациях по 2, 3 и 4, общим числом 190. Причём у 40 (39,2%) штаммов выявлено по одному гену: sfaA - у 2, sfaG - 18, hlyA - 7, hlyB - 13; у 40 (39,2%) - шесть сочетаний по 2 гена: hlyA+sfaA - у 2, hlyB+sfaA - 9, hlyB+sfaG - 8, hlyA+sfaG -11, hlyA+hlyB - 8, sfaA+sfaG - 2; y 18 (17,6%) штаммов - rio три: hlyA+sfaA+sfaG - y 6, hlyA+hlyB+sfaA -4, hlyA+hlyB+sfaB — 8. И четыре (3,9%) штамма несли одновременно все четыре искомых гена.

Проведённый анализ частоты встречаемости ФГОП у клинических штаммов сальмонелл показал, что от лиц 20-29 лет, которые количественно преобладали, было выделено большее количество возбудителей - 36 (35,3%), которые одновременно несли искомые ФГОП числом 61 (32,1%), что выше, чем в других возрастных группах.

От пациентов, в зависимости от пола, чаще выделялись сальмонеллы, несущие генетические детерминанты sfaG в отдельности (п=18), которые определялись одинаково часто у микробов, выделенных от мужчин и женщин - по 9 (50%).

Нами был проведён анализ влияния каждой генетической детерминанты (hlyA, hlyB, sfaA, SfaG) в отдельности, в сочетании с другими генами и всей совокупности генов данной генетической детерминанты на тяжесть течения сальмоиеллёза. Частотный дисперсионный анализ показал, что наибольшее влияние на тяжесть болезни оказывало наличие генетической детерминанты hlyB как в отдельности (rf =36%, F=10,2, р<0,003), так и его комбинации с другими генами (ц2 =24%, F=18,9, р<0,001) и всей совокупности генов в целом (rf =25%, F=26,7, р<0,001). В то время как другие генетические детерминанты только в сочетании с другими генами и всей совокупности генов в целом отражали степень тяжести сальмоиеллёза: hlyA (rf=23%, F=18,9; р<0,001 и ц2=16%, F=14,0; р<0,001); sfaA (if =28%, F=14,9; р<0,001 и ir=31%, F=18,7; р<0,001); sfaG 0i2=18%, F=12,8; p<0,001 и ц2=\0%, F=9,3; p<0,001).

Для оценки влияния отдельных групп генетических детерминант (гемолизины и адгезины) на тяжесть течения болезни, клинические штаммы сальмонелл были разделены на две группы. В первую группу вошли культуры, несущие генетические детерминанты гемолизинов А и В в отдельности и в различных комбинациях с другими генами, общим числом п=104, во вторую - бактерии, содержащие гены адгезинов А и G в отдельности и в различных сочетаниях, всего п=86 генетических детерминант. Наибольшее влияние ФГОП на тяжесть заболевания выявлено в первой группе (гемолизинов) во всех случаях, как в отдельности (г)2 =20, F=7,0; р<0,002), так и в случае сочетания генетических детерминант hly с другими генами (г)2 =24, F=38,3; р<0,001) и всей

совокупности генов в целом (т]2 =20, Р=39,7; р<0,001). Во второй группе (адгезинов), наибольшее влияние выявлено в случае сочетания генов вГа с другими генами (г|2 =22, Р=27,1; р<0,001) и совокупности генов в целом (г|2=15, Р=23,3; р<0,001).

Для оценки влияния количества фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП) в геноме клетки возбудителя на тяжесть течения сальмонеллёза был проведен частотный дисперсионный анализ (табл. 3).

Таблица 3 - Зависимость тяжести течения сальмонеллёза от количества фрагментов ге-

нов «островов» патогенности

Количество фрагментов генов «островов» патогенности Легкая Среднетяжёлая Тяжёлая Итого 7 (%) Р

абс. (%) % абс. (%) % абс. (%) % абс. (%) %

1 фрагмент генов «островов» патогенности (100%) 15 (37,5) 62,5 20 (50) 33,3 5 (12,5) 28 40 (100,0) 39,2 11 7,2*

2 фрагмента генов «островов» патогенности (100%) 7 (17,5) 29,2 25 (62,5) 41,7 8 (20,0) 44 40 (100,0) 39,2 19 13,9 *

3-4 фрагмента генов «островов» патогенности (100%) 2 (9,0) 8,3 15 (68,0) 25 5 (23,0) 28 22 (100,0) 21,6 29 12,7 *

Всего 24 100 60 100 18 100 102 100

Примечание: г| - сила влияния фактора, Р - критерий Фишера, * - уровень значимости

(р<0,001).

Изучение влияния количества генетических детерминант на тяжесть заболевания показало, что штаммы, выделенные от больных с лёгкой формой сальмонеллёза, несли преимущественно один из фрагментов генов «островов» патогенности. Тогда как штаммы, выделенные от больных с тяжёлым течением болезни, отличались наличием одновременно сразу нескольких искомых генетических детерминант, которые оказывали статистически значимое влияние на тяжесть течения сальмонеллёза. Сила влияния составила 11% при наличии одного ФГОП (112=11; р<0,001), 19% - при двух ФГОП (г)2=19; р<0,001) и 29% при наличии 3-4 ФГОП (г|2=29; р<0,001). Взаимосвязь между признаками оказалась средней силы во всех трех группах (г*=0,33; г*=0,44; г*=0,54).

Антибиотикорезистентность клинических штаммов 8. ЕгиегШсНв и фрагменты генов «островов» патогенности

Учитывая то, что патогенность определяется совокупным эффектом различных свойств возбудителя, правомерными являются представления об адаптивной перестройке метаболизма бактерий при изменившихся условиях их существования [Гаши-мова Д.Т., 1998; Петровская В.Г., 1994]. Это может происходить в результате межвидового генетического обмена в микробных сообществах, в результате которого утрачиваются или приобретаются свойства, обеспечивающие микроорганизмам селективные преимущества. Наглядно это видно на примере формирования устойчивости к действию противомикробных препаратов, в первую очередь, антибиотиков [Рожнова С.Ш., 2000]. Информация, касающаяся типов лекарственной устойчивости микроорганизмов, выявления у них новых детерминант резистентности (R - плазмид), важна не только для выработки рациональной стратегии и тактики применения антимикробных препаратов, но может быть использована в качестве своеобразных эпидемиологических маркёров возбудителей [Рожнова С.Ш., 2000; Вартересян И.И., 2002, Воробьёв A.A., 2000]. Использование таких маркёров позволило доказать, что в течение 14 лет наблюдений (с 1994 по 2008 гг.) среди S. Enteritidis появились штаммы, устойчивые к 6 препаратам и более, т.е. полирезистентные, которые составили треть всех изученных культур. Показано, что сальмонеллёз, вызванный такими штаммами, отличается тяжёлым течением, в частности у детей старшего возраста, поражением толстой кишки, вплоть до геморрагического колита [Милютина Л.Н., 2008].

Проведенные нами исследования показали, что чувствительность клинических штаммов сальмонелл к 13 наиболее широко используемым антибактериальным препаратам (ампициллин, гентамицин, доксициклин, цефазолин, амикацин, ципрофлоксацин, цефотаксим, цефтриаксон, цефалекснн, левомицетин, карбеиициллип и интести - и сальмонеллёзный бактериофаги) варьирует. Установлено, что 68 (66,7%) микробов были резистентны к антибактериальным препаратам (АБП), из них 35 (51,5%) - к 1-3 препаратам, 27 (39,7%) - к 4-5, 6 (8,8%) - к 6 и более АБП одновременно. Наиболее часто устойчивость возбудителей имела место к ампициллину (52%), доксициклину (40,2%), левомицетину (34,3%), цефазолину (30,4%) и карбенициллину (28,4%). Меньшая резистентность сальмонелл определялась к цефалексину (10%), амикацину (8,8%), гентами-цину (6,8%), цефтриаксону (3,9%), цефотаксиму (2,9%), ципрофлоксацину (2,9%) и бактериофагам (1,0%).

Наибольшая устойчивость клинических штаммов S. Enteritidis выявлена к 5 антибиотикам - ампициллину, доксициклину, цефазолину, левомицетину и карбенициллину. При этом у микробов, проявивших наибольшую резистентность к ним, чаще других определялись сочетания генетической детерминанты hlyA с фрагментами следую-

щих генов: ЫуА+ЫуВ; ЫуА+вГаО; ЫуЛ+ЫуВ+БГаО; ЫуА+вГаА+зЕаС. Причём, при наличии сочетания детерминант ЫуА+ЫуВ выявлено сильное влияние, статистически значимое (г|2=27, ¥=3,2, р<0,025) на устойчивость микробов к 5 вышеперечисленным антибиотикам и связь между ними оказалась средней силы, тогда как в остальных случаях влияние было слабее и незначимое.

Увеличение количества фрагментов генов «островов» патоген ности (ФГОП) в геноме клинических штаммов сальмонелл оказывало статистически значимое влияние средней силы на резистентность к цефазолину (т|2 =11%, Р=5,4; р<0,006) и слабое - к ампициллину (т^=4%, Р=3,51; р<0,032), в то же время на устойчивость к доксициклину (гр=4%, Р=2,26; р>0,109), левомицетину (ц2=4%, Р=2,13; р>0,124) и карбенициллину (П -5%, Р=2,39; р>0,098) — оно было слабым и незначимым. Коэффициент канонической корреляции выявил связь средней силы (г*=0,33) между количеством генетических детерминант и резистентностью к цефазолину, а к ампициллину, доксициклину, левомицетину и карбенициллину - очень слабую (г*=0,2; 0,2; 0,2; 0,22; соответственно).

Также установлено, что с увеличением количества ФГОП достоверно уменьшается количество чувствительных к АБП штаммов (т12=9%, Р=4,84, р<0,009), выявлена связь средней силы между изучаемыми признаками (г*= 0,31).

Анализ связей между фактором резистентности к АБП сальмонелл и степенью тяжести заболевания показал, что устойчивые к АБП микробы чаще встречались при тяжёлых формах сальмонеллёза - 13 (72,2%) против 5 (27,8%) - при лёгких формах. Таким образом, можно предположить, что устойчивость к антибактериальным препаратам оказывает влияние на степень тяжести заболевания, что согласуется с мнением других авторов, рассматривающих лекарственную резистентность к АБП у сальмонелл в качестве эпидемически значимого маркёра их патогенности [Милютина Л.Н., 1998; Рожно-ва С.Ш., 1999; Бухарин О.В., 2000]. В ходе исследования нами выявлены достоверные различия в группах микроорганизмов с различной устойчивостью к АБП (1 группа - к 1-3 АБП, 2 - к 4 АБП и более) (х2=7,145; ¿Г=2; р<0,028).

Сравнение двух групп микроорганизмов с различной резистентностью к АБП, выявило, что в группе микроорганизмов, устойчивых к 1-3 антибактериальным препаратам (п=35), сила влияния данного признака на степень тяжести сальмонеллёза была слабой, но статистически значимой (г|2=6%, Я ==3,37, р<0,038, г*=0,24). Среди нолирези-стентных микроорганизмов (п=33), устойчивых к 4 АБП и более, выявлено сильное влияние, статистически значимое между анализируемыми признаками (г)2=32%, Р=22,8, р<0,001) и установлена корреляционная связь средней силы (г*=0,57).

Полученные результаты свидетельствуют о том, что полирезистентные к АБП сальмонеллы, а именно S. Enteritidis, оказывают более выраженное влияние на тяжесть течения заболевания, что согласуется с данными других исследователей [Милютина Л.Н., 2008].

С «островами» патогенности связывают различные функции микробов: патоген-ность, адаптация, симбиоз, деградация биополимеров, метаболизм, лекарственная устойчивость, секреторная функция [Бондаренко В.М., 2001; Kaper J.B., 1999]. В этой связи можно предположить, что выявленные нами фрагменты генов «островов» патогенности (ФГОП) имеют отношение к формированию устойчивости к ряду антибиотиков, в частности, генетические детерминанты гемолизинов (hlyA+hlyB) - к формированию устойчивости к ампициллину, цефазолину, доксициклину, левомицетину, карбе-нициллину.

Связь между фенотипическими и гснотнпическимн характеристиками культур и клиническими проявлениями сальмонеллёза в двух группах сравнения

Для выяснения патогенетической роли генетических детерминант (hlyA, hlyB) и (sfäA, sfäG) в развитии клинических проявлений сальмонеллёза были выделены две группы пациентов. В первую группу вошли больные, от которых были изолированы сальмонеллы, несущие генетические детерминанты гемолизинов (п=28) и во вторую группу - пациенты, от которых были выделены штаммы бактерий, несущие гены адге-зинов (п=22). Установлено, что сравниваемые группы были сопоставимы по возрасту (Х2=4,117; df=5; р>0,324), полу (р>0,828), срокам лечения (р>0,762) и по локализации поражения отделов желудочно-кишечного тракта (х2=0,055; df=l; р>0,615).

В клинических проявлениях сальмонеллёза в сравниваемых группах были выявлены отличия. В первой группе больных заболевание начиналось остро, с выраженных проявлений интоксикации. Температура тела (38,1° - 39°С) была у 36,4% человек против 23,5% в группе сравнения (р>0,366). Их беспокоила тошнота - 39,3% против 3,6%, (р<0,049), рвота - у 53,6% против 41% (р>0,366), которая продолжалась в течение 3 дней - у 73,3% пациентов против 22,2%. У 89,3% больных 1 группы наблюдался жидкий стул, что достоверно чаще, чем во второй группе - 77,3% (р<0,006). У половины пациентов первой группы стул был до 10 раз за сутки и диарея проходила быстрее, в течение 7 дней.

Установлено, что секреция гемолизина у адгезироваиных штаммов эшерихий вызывает выделение медиаторов из полиморфноядериых лейкоцитов, участвующих в индукции воспаления, сопровождающегося, как правило, увеличением сосудистой про-

ницаемости [Бондаренко В.М., 1988]. Непосредственные диареегенные механизмы гемолизинов не до конца ясны. Но показано наличие у а-гемолитических Е. coli, выделенных при диарее, в 0,6% присутствие гена hly и в 1,1% - сочетание генов hly и cnfl (кодирующий цитотоксический некротизирующий фактор 1).

Инфекционно - воспалительный тип диареи был воспроизведен на модели изолированной петли кишечника кролика при инфицировании штаммами бактерий, содержащими ген hly, и продемонстрировано, что гемолизин способен провоцировать диарею, по мнению авторов, через образование каналов в мембране энтероцитов. Каналы нарушают ионное равновесие в клетке, увеличивается внутриклеточный Ca2'1', образуются метаболиты арахидоновой кислоты, которые нарушают секрецию ионов и формируют воспалительную реакцию [Elliott S.J. et al., 1998]. Есть исследования, в которых показано тесное сцепление hly-генов с детерминантами, контролирующими синтез маннозорезистентных адгезинов [Бондаренко В.М., 1988]. Можно предположить, что у исследованных нами пациентов, от которых были изолированы сальмонеллы, несущие фрагменты генов «островов» патогенности, кодирующие гемолизины (hly), наблюдался воспалительный тип диареи.

В отличие от первой группы, клиника заболевания у больных второй группы отличалась более выраженным поражением желудочно-кишечного тракта, что и определяло степень тяжести сальмонеллеза. В этой группе было больше пациентов с тяжелым течением болезни. - 27,3% против 10,7% в 1 группе (р>0,166). Больных чаще беспокоили боли в животе - в 68,2% случаев против 50% (р>0,203), и у большего количества пациентов (66,7% против 26,7%) была продолжительная рвота до 7 дней (р<0,007). Обильная диарея, до 20 раз в сутки и более, встречалась чаще у этой группы больных -у 27,3% против 11,1% (р>0,168), стул был и более продолжительным, более 7 дней, - у половины (50%) пациентов против 28,6% в первой группе (р>0,140). Из патологических примесей в кале чаще обнаруживалась слизь - в 40,9% случаев против 25% в группе сравнения (р>0,269), примесь зелени - в 36,4% случаев против 10,7% (р<0,034), а примесь крови в кале выявлялась только у больных 2 группы - в 18,2% случаев.

Во второй группе чаще встречались осложнения заболевания (3-13,6%) в виде инфекционно-токсического и гиповолемического шока, чем в первой (1-3,6%) (р<0,005). Можно предположить, что в организме больных второй группы, от которых были изолированы сальмонеллы, несущие генетические детерминанты, кодирующие адгезины, развивается более выраженный воспалительный процесс. Полученные результаты согласуются с исследованиями, где показано, что штаммы, экспрессирующие S фимбрии, высоковирулентны в моделях на животных [Finlay В.В., 1997].

Исследования периферической крови в динамике болезни в группах сравнения показали, что количество лейкоцитов у больных 2 группы при поступлении в стационар было больше, чем у больных 1 группы (р>0,05), в динамике болезни показатели лейкоцитов во второй группе пациентов статистически достоверно снизились по сравнению с острым периодом (р<0,034). Это отчасти подтверждает предположение о том, что в организме пациентов 2 группы развивается более выраженный воспалительный процесс, о чём свидетельствуют и описанные выше симптомы болезни (продолжительная рвота, выраженная затяжная диарея) и воспалительные изменения в испражнениях (чаще выявлялись патологические примеси в кале в виде слизи, зелени и прожилок крови).

У больных первой группы показатели гемоглобина в динамике болезни достоверно снизились (р<0,023). Полученные результаты согласуются с мнением исследователей, которые показали, что гемолизины, вызывая гемолиз эритроцитов, обеспечивают возбудителю доступ к свободному железу Fe3' [Cavalieri S.G., 1984]. Показатели тромбоцитов в крови пациентов обеих групп в период выздоровления, после снижения в разгар болезни, достоверно возросли, но больше в 1 группе (р<0,001), чем во 2 (р<0,045).

В первой группе больных, чаще, чем во второй, встречались изменения в анализах мочи, а именно, снижение удельной плотности до 1009±1,26 к выписке из стационара против 1015±0,94 в острый период болезни, чаще определялся белок в моче. Полученные данные согласуются с мнением других авторов о том, что гемолизины принимают участие во внекишечных поражениях, в том числе в поражении почек и нижних отделов мочевыводящей системы [Cavalieri S.J., 1984].

Анализ влияния генетических детерминант hly и sfa в двух группах сравнения (I - гемолизины и 2 - адгезины) на фактор полирезистентности практически не выявил взаимосвязей между изучаемыми признаками (г*=0,10; р>0,05 и г*=0,26; р>0,05, соответственно). Но в первой группе (гемолизинов) количество полирезистентных (устойчивых к 4 АБП и более) штаммов достоверно значительно больше, чем во второй группе (адгезинов) - 11 (39,3%) против 3 (13,6%), (р <0,05).

Проведенное исследование позволяет предположить, что фрагменты генов «островов» патогенное™ hly и sfa, кодирующие а-гемолизины и адгезины, обнаруженные у клинических штаммов сальмонелл, влияют на формирование таких основных симптомов болезни, как интоксикация, лихорадка, тошнота, рвота, боли в животе, диарея, патологические примеси в кале и устойчивости к отдельным антибиотикам.

Таким образом, изучение связей между фенотипическими и генотипическими характеристиками культур в двух группах сравнения и клиникой сальмонеллёза, вы-

явило статистически значимые различия по некоторым позициям. Наличие у сальмонелл генов hly (первая группа) и множественной устойчивости к антибактериальным препаратам определили особенности клиники и тяжесть заболевания, которые проявились выраженной интоксикацией, высокой и продолжительной лихорадкой, частой регистрацией тошноты, жидким стулом, изменениями в анализах крови - большей тром-боцитопенией в острый период болезни и снижением показателей гемоглобина в период выздоровления. В то же время, наличие адгезинов у возбудителей от больных второй группы определило более выраженное поражение желудочно-кишечного тракта с частыми болями в животе, с продолжительной рвотой и диареей, с патологическими примесями в стуле, а в анализах крови - более высокие цифры лейкоцитоза. В этой группе пациентов достоверно чаще регистрировались осложнения в виде инфекционно -токсического и гиповолемического шока (р<0,05).

Полученные результаты способствуют расширению знаний о патогенезе саль-монеллёзной инфекции, позволяют установить значение факторов патогенности (гемолизинов, адгезинов, ЛПС - эндотоксинемии и антибиотикорезистентности) для оценки степени тяжести, прогнозирования особенностей течения болезни и повышения эффективности терапии гастроинтестинальной формы сальмонеллёза.

ВЫВОДЫ

1. Установлена взаимосвязь между выявленными фрагментами генов «островов» патогенности (hlyA, hlyB, sfaA и sfaG), ассоциируемых с патогенностью Е. coli, у клинических штаммов сальмонелл, с особенностями и тяжестью течения болезни, апти-биотикорезистентностью возбудителя, определена липополисахарид-эндотоксинемия в дииамике, что в совокупности может быть использовано в качестве критериев оценки тяжести и прогноза заболевания.

2. Среди пациентов, госпитализированных в инфекционный стационар с диагнозом «острая кишечная инфекция», в 37,1% случаев подтверждался сальмонеллез. Заболевание чаще регистрировалось у лиц молодого возраста — до 40 лет (66,7%), женского пола (61%). Клинически заболевание протекало в гастроинтестинальной форме с преобладанием гастроэнтеритического варианта сальмонеллеза (83%), среднетяжёлой формы (60%). Специфические осложнения развивались в 10,8% случаев.

3. Уровни липополисахаридов в крови больных сальмонеллёзом среднетяжёлой формы в двух возрастных группах (от 18 до 50 лет и от 50 лет и старше) повышаются в

динамике болезни - в 1,8 и 2,7 раза (в третьей по сравнению с первой сывороткой), соответственно, что отражает особенности клинического течения заболевания, коррелирует с показателями периферической крови в виде сегментоядерного нейтрофилеза (р<0,001) в острый период болезни в первой группе и более выраженной тромбоцито-пении (р<0,043) во второй группе пациентов.

4. Клинические штаммы S. Enteritidis в 97,1% случаев содержали фрагменты генов «островов» патогенное™ (hlyA, hlyB, sfaA и sfaG), ассоциируемые с патогенностыо Е. coli. Генетические детерминанты «островов» патогенности встречались в отдельности и различных комбинациях по 2, 3 и 4, общим числом 190, увеличение их количества в геноме у клинических штаммов сальмонелл коррелирует с тяжестью заболевания.

5. 66,7% клинических штаммов сальмонелл резистентны, из которых 48,5% - полирезистентны к 13 антибактериальным препаратам. Множественная устойчивость возбудителей к антибактериальным препаратам оказывает достоверно сильное влияние на степень тяжести сальмоиеллёза (г)2=32%, р<0,001), а наличие у них сочетания генетических детерминант (hlyA+hlyB) - статистически значимое сильное влияние на резистентность к ампициллину, доксициклину, цефазолину, левомицетину и карбеницилли-ну (т\'—27%, F=3,2, р<0,024, г*=0,52). Увеличение количества различных фрагментов генов «островов» патогенности в геноме S. Enteritidis коррелирует с резистентностью к цефазолину (р<0,006), ампициллину (р<0,032) и уменьшением количества чувствительных к антибактериальным препаратам сальмонелл (р<0,009).

6. Наличие у клинических штаммов сальмонелл фрагментов генов «островов» патогенности гемолизинов (hlyA и hlyB) сочетается с полирезистеитностью к антибактериальным препаратам (р<0,05), выраженностью у пациентов синдрома интоксикации, тромбоцитопенией в острой стадии болезни (р<0,001) и снижением уровня гемоглобина крови в реконвалесцентном периоде (р<0,023), тогда как наличие фрагментов генов «островов» патогенности адгезннов (sfaA и sfaG) - с более тяжелым кишечным синдромом, лейкоцитозом в начале заболевания (р<0,034) и более частыми осложнениями в виде инфекционно-токсического и гиповолемического шока (р<0,05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для оценки патогенного потенциала сальмонелл, тяжести течения и прогноза заболевания, помимо общепринятых методов исследования, целесообразно определение фрагментов генов «островов» патогенности - hlyA, hlyB, sfaA и sfaG молекулярно -генетическим методом ПЦР.

2. Выявленное влияние увеличения количества фрагментов генов «островов» патогенное™ в геноме S. Enteritidis и фактора полирезистентности к антибиотикам на степень тяжести сальмонеллеза определяют тактику лечения (необходимость назначения антибиотиков широкого спектра действия и проведения интенсивной дезинтокси-кационной терапии).

3. Учитывая полученные нами данные о нарастающей в динамике болезни липо-полисахарид - эндотоксинемии, необходимо включать в схемы лечения больных саль-монеллезом средства, снижающие уровень интоксикации (сорбенты, дезинтоксикаци-онная терапия).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Особенности современного сальмонеллеза / Р.Г. Назмутдинова, Р.Т. Мурзабаева, Д.А. Валишин [и др.] Н Инфекционные болезни: актуальные вопросы в клинике и эксперименте: сборник научных трудов 13 Российской научно-практической конференции. - Махачкала, 2008. - С. 85-88.

2. Мурзабаева, Р.Т. Генетические маркеры патогенности возбудителя и клинические проявления сальмонеллеза / Р.Т. Мурзабаева, Р.Г. Назмутдинова., А.Р. Мав-зютов // Инфекционные болезни. - 2009. - Т. 7, прил. 1: Материалы 1 Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - С. 147-148.

3. Мурзабаева, Р.Т Генетические маркеры патогенности и их взаимосвязь с анти-биотикорезистентностью выделенных сальмонелл у взрослых / Р.Т. Мурзабаева, Р.Г. Назмутдинова, А.Р. Мавзютов // Инфекционные болезни. - 2009. - Т. 7, прил. 1: Материалы I Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - С. 148.

4. Генетические маркеры патогенности и влияние биологических свойств возбудителя на клинические проявления сальмонеллеза у взрослых / Р.Г. Назмутдинова, Р.Т. Мурзабаева, А.Р. Мавзютов [и др.] // Актуальные вопросы клинической медицины: инфекционных и неинфекционных болезней в клинике и эксперименте: сборник научных трудов 14 Российской научно-практической конференции. -Махачкала, 2009. - Т. 1. - С. 123-127.

5. Сравнительная характеристика острых кишечных инфекций различной этиологии /Д.А. Валишин, Р.Т. Мурзабаева, А.П. Мамон, Н.В. Антонова, Д.Н. Дубровская, Р.Г. Назмутдинова // Актуальные вопросы клинической медицины: инфекционных и неинфекционных болезней в клинике и эксперименте: сборник науч-

ных трудов 14 Российской научно-практической конференции. - Махачкала,

2009.-Т. 1.-С. 114-118.

6. Мавзютов, А.Р. Генетические механизмы биоразнообразия Salmonella Enteritidis и клинические особенности сальмонеллёза / А.Р. Мавзютов, Р.Т. Мурзабаева, Р.Г. Назмутдинова // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. -

2010. - № 5. - С. 70-73.

7. Генетические маркёры патогенности Salmonella spp. и антибиотикорезиетент-иость / И.А. Мирсаяпова, Р.Г. Назмутдинова, А.Р. Мавзютов, Р.Т. Мурзабаева // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2010. - Т. 12, № 2, прил. 1. - С. 39.

8. Клинико-генетические параллели при сальмонеллезе у взрослых / Р.Т. Мурзабаева, А.Р. Мавзютов, Р.Г. Назмутдинова, И.А. Мирсаяпова // Инфекционные болезни. - 2010. - Т. 8, прил. 1: Материалы И Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - С. 214.

9. Генетические маркеры патогенности Salmonella spp. и клинические особенности сальмонеллеза у взрослых / А.Р. Мавзютов, Р.Т. Мурзабаева, Р.Г. Назмутдинова, И.А. Мирсаяпова // Инфекционные болезни. - 2010. - Т. 8, прил. 1: Материалы II Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - С. 182183.

10. Мурзабаева, Р.Т. Клинико-патогенетическое значение определения липополиса-харид-эндотокеинемии при сальмонеллезе / Р.Т. Мурзабаева, Р.Г. Назмутдинова, А.Р. Мавзютов // Инфекционные болезни. - 2011. - Т. 9, прил. 1: Материалы III Ежегодного Всероссийского Конгресса по инфекционным болезням. - С. 254255.

11. Характер изменений уровня липополисахарид-связывающего белка при различных инфекционных процессах и дисбиозах / А.Р. Мавзютов, Г.А. Мавзютова, K.M. Бондарей ко, С.Е. Сендерович, Р.Г. Назмутдинова [и др.] //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2011. - № 2. - С. 66-72.

12. Назмутдинова, Р.Г. Взаимосвязь генетических маркеров патогенности S. Enteritidis с антибиотикорезистеитностью культур и особенностями течения заболевания / Р.Г. Назмутдинова, Р.Т. Мурзабаева, А.Р. Мавзютов // Медицинский вестник Башкортостана. - 2011. - № 5. - С. 15-17.

НАЗМУТДИНОВА РИТА ГАЛИЕВНА

КЛИНИКО - ЛАБОРАТОРНЫЕ АСПЕКТЫ САЛЬМОНЕЛЛЁЗА У

ВЗРОСЛЫХ

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Отпечатано ООО «Макси-Принт» Заказ №271 , тираж 100 шт. Тел./факс.: (347)274-81-39, (347)273-18-72

Актуальность вопроса

По данным ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется до 275 млн. диарей-ных заболеваний среди детей и взрослых, занимая второе место по частоте после острых респираторных вирусных инфекций. В Российской Федерации (РФ) ежегодно регистрируется около 1 млн. случаев острых кишечных инфекций (ОКИ), при этом показатель заболеваемости в 2007 -2008 гг. составил 509,8 - 512,3 на 100 тыс. населения и не имеет тенденции к снижению [32]. В структуре кишечных инфекций удельный вес сальмонеллеза составил 6,96% -6,97% в 2007-2008 гг. В последние годы наиболее часто выявлялись Salmonella Enteritidis [32, 77]. Всё это наносит существенный вред здоровью людей и экономический ущерб обществу [98; 119].

В условиях повсеместного распространения и многолетней тенденции к росту заболеваемости особую озабоченность вызывает низкая эффективность профилактических мер при данной инфекции, это связывают с видовым разнообразием сальмонелл, высокой' их жизнеспособностью и значительной'генетической пластичностью, что существенно затрудняет лабораторную диагностику и борьбу с ними. Сохраняется актуальность госпитального сальмонеллеза [3, 27, 88], обусловленного антибиотикорезистентными штаммами бактерий [99], наличием R-плазмид [39, 75]. Однако, в последние годы учёные все чаще высказывают предположения о существовании генетических механизмов изменения патогенности сальмонелл, которые связывают с циркуляцией между клиническими штаммами энтеробактерий- мобильных генетических элементов, в том числе «островов» патогенности, отвечающих за синтез различных факторов патогенности, что, в свою очередь, даёт микробам селективное преимущество и конкурентоспособность [6, 16, 28, 75, 147, 158, 165].

Появились новые данные, указывающие на немаловажную роль липо-полисахаридов (ЛПС) грамотрицательных бактерий, включая Salmonella spp., в патогенезе и модификации иммунного ответа при вызываемых ими заболеваниях [9, 38, 45, 80, 104].

Всё изложенное выше послужило основанием для проведения соответствующих исследований.

Цель работы - установить наличие и характер взаимосвязей между частотой встречаемости фрагментов генов «островов» патогенности" энтеро-бактерий, антибиотикорезистентностью выделенных штаммов сальмонелл и клиникой заболевания у взрослых, определить липополисахарид-эндотоксинемию в динамике болезни для разработки дополнительных критериев оценки тяжести, прогноза и рационального подхода к терапии сальмо-неллеза.

Задачи исследования

1. Установить клинико-лабораторные особенности сальмонеллеза с учётом степени тяжести заболевания.

2. Определить концентрацию липополисахарида (ЛПС) в сыворотке крови больных сальмонеллёзом. в двух возрастных группах и установить взаимосвязи между уровнем ЛПС и показателями периферической крови в динамике болезни.

3. Молекулярно-генетическая детекция фрагментов генов «островов» патогенности, ассоциируемых с патогенностью Е. coli (гены, кодирующие а-гемолизины - hly (hlyA и hlyB) и адгезины - sfa (sfaA и sfaG)), у штаммов S. Enteritidis, выделенных от больных гастроинтестинальной формой сальмо-неллёза, с целью выявления дополнительных маркёров патогенности сальмонелл.

4. Выявить устойчивость к антибактериальным препаратам у клинических штаммов сальмонелл и установить взаимосвязи между антибиотикорезистентностью и тяжестью течения сальмонеллеза.

5. Установить клинико-лабораторные особенности в двух группах пациентов, от которых выделены штаммы S. Enteritidis, содержащие в геноме бактериальной клетки фрагменты генов «островов» патогенности hlyA и hlyB Е. coli, кодирующие гемолизины (первая группа) и фрагменты генов «островов» патогенности sfaA и sfaG Е. coli, кодирующие адгезины (вторая группа).

Основные положения, выносимые на.защиту

1. Динамика ЛПС-эндотоксинемии при гастроинтестинальной форме сальмонеллёза среднетяжёлого течения имеет отличие в различных возрастных группах.

2. Клинические штаммы сальмонелл в 97,3% случаев, в том числе S. Enteritidis - в 97,1%, характеризует наличие фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП), ассоциируемых с патогенностью E.coli (а-гемолизины - hly (hlyA и hlyB) и адгезины - sfa (sfaA и sfaG)).

3. Тяжёлые формы сальмонеллёза отличает более частое выделение возбудителей с множественной резистентностью к антибактериальным препаратам.

Научная новизна исследования

Показано наличие у 97,1% клинических штаммов S. Enteritidis, выделенных от взрослых больных гастроинтестинальной формой сальмонеллёза, фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП), ассоциируемых с патогенностью Е. coli, определяющих способность последних синтезировать фимбрии типа S (sfaA и sfaG) и а-гемолизины (hlyA и hlyB). Выявлены корреляционные связи между количеством фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП) в геноме бактериальной клетки и степенью тяжести заболевания. Установлено, что при обнаружении у S. Enteritidis фрагментов ДНК, гомологичных генетическим детерминантам гемолизинов Е. coli (hlyA и hlyB), чаще встречаются резистентные к антибактериальным препаратам штаммы возбудителя.

Показана взаимосвязь между частотой выявления генетических детерминант а-гемолизина E.coli у клинических штаммов сальмонелл и некоторыми особенностями клинического течения заболевания, лабораторными показателями (тромбоцитопения в острой стадии болезни (р<0,001) и снижение уровня гемоглобина крови в период реконвалесценции (р<0,023)); также между наличием генетических детерминант адгезинов Е. coli у возбудителя и развитием более выраженного кишечного синдрома и осложнений в виде инфекционно-токсического и гиповолемического шока (р<0,05), лейкоцитозом в анализе крови в начале заболевания (р<0,034).

Практическая значимость работы

Показано, что наличие фрагментов генов «островов» патогепности: sfaG, sfaA, hlyA, hlyB, ассоциируемых с патогенностью Е. coli, у клинических штаммов сальмонелл может выступать в качестве интегрированного маркера их патогенности. Частота обнаружения указанных генетических детерминант у возбудителей коррелирует с рядом особенностей течения сальмонеллёза, клинико-лабораторными показателями, степенью тяжести, прогнозом заболевания, их определение может использоваться при маркировании сальмонелл и выборе рационального лечения.

Указанные генетические маркёры могут использоваться при оценке роли возбудителя в эпидемическом процессе, а в сочетании с результатами определения антибиотикорезистентности сальмонелл позволяют повысить эффективность этиотропной терапии.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на Российской научно — практической конференции «Инфекционные болезни: актуальные вопросы в клинике и эксперименте» (Махачкала, 2008); Российской научно — практиче ской конференции «Актуальные вопросы клинической медицины: инфекционных и неинфекционных болезней в клинике и эксперименте» (Махачкала, 2009); I, II, III Всероссийском Ежегодном Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2009, 2010, 2011); Российской научно - практической конференции «Национальные лабораторные дни» (Москва, 2010); Республиканской научно - практической конференции, посвящённой 100 - летию муниципального учреждения инфекционной клинической больницы №4 г. Уфы (Уфа, 2010).

Работа апробирована на межкафедральном заседании сотрудников кафедры инфекционных болезней с курсами дерматовенерологии и косметологии НПО, лабораторной диагностики ИПО, фундаментальной и прикладной микробиологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.

Внедрение результатов работы в практику

Материалы диссертации опубликованы в.печати. Данные, полученные в результате проведённых исследований, дополняют знания о возбудителях сальмонеллёза и о патогенезе вызываемого ими заболевания. Результаты исследований внедрены в работу клинической инфекционной больницы №4 г.Уфы, используются в педагогическом процессе кафедр инфекционных болезней с курсами дерматовенерологии и косметологии ИПО, лабораторной диагностики ИПО, фундаментальной и прикладной микробиологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них 3 статьи -в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», трёх глав собственных результатов, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 39 таблиц, 8 рисунков. Список литературы включает 216 источников: 105 - отечественных и 111 - зарубежных авторов.

выводы

1. Среди пациентов, госпитализированных в инфекционный стационар с диагнозом «острая кишечная инфекция», в 37,1% случаев подтверждался сальмонеллез. Заболевание чаще регистрировалось у лиц в возрасте до 40 лет (66,7%), женского пола (61%). Клинически сальмонеллез протекал в гастро-интестинальной форме с преобладанием гастроэнтеритического варианта заболевания (83%), среднетяжёлой формы (60%). Специфические осложнения развивались в 10;8% случаев.

2. Концентрации липополисахарида в крови больных сальмонеллсзом среднетяжёлой формы в двух возрастных группах (от 18 до 50 лет и от 50 до 70 лет) повышались в динамике болезни — в 1,8 и 2,7 раза, соответственно, что отражалось на особенностях клинического течения заболевания и показателях периферической крови в виде сегментоядерного нейтрофилеза (р<0,001) в острый период болезни в первой группе и более выраженной тромбоцитопении (р<0,043) во второй группе пациентов.

3. У клинических штаммов S. Enteritidis в 97,1% случаев обнаруживались фрагменты генов «островов» патогенности (гены, кодирующие а-гемолизины — hly (hlyA и hlyB) и адгезины - sfa (sfaA и sfaG)), ассоциируемые с патогенностью Е. coli, которые выявлялись в геноме бактериальной клетки по отдельности и в различных комбинациях по 2, 3 и 4 генетических детерминант одновременно. Увеличение их количества в геноме S. Enteritidis коррелирует со степенью тяжести сальмонеллёза.

4. Установлено, что 68 (66,7%) клинических штаммов S. Enteritidis резистентны к антибактериальным препаратам, из них 35 (51,5%) - к 1-3 препаратам, 27 (39,7%) микробов - к 4-5, 6 (8,8%) - к 6 и более препаратам одновременно. Выявлена корреляционная связь средней силы и статистически достоверное сильное влияние на степень тяжести сальмонеллёза в группе возбудителей с множественной устойчивостью к антибактериальным препаратам (г*=0,57, Г|2=32%, F=22,8, р<0,001).

5. Частота выявления у клинических штаммов сальмонелл фрагментов генов, гомологичных фрагментам ДНК «островов» патогенности hlyA и hlyB Е. coli, коррелирует с множественной резистентностью культур к антибактериальным препаратам (р<0,05), тяжестью синдрома интоксикации у пациентов, тромбоцитопенией в острой стадии болезни (р<0,001) и снижением уровня гемоглобина в периоде реконвалесценции (р<0,023), а наличие у сальмонелл фрагментов генов, гомологичных sfaA и sfaG Е. coli, - с тяжестью кишечного синдрома, лейкоцитозом в начале заболевания (р<0,034) и частотой развития инфекционно-токсического и гиповолемического шока (р<0,05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В качестве молекулярных маркеров патогенности клинических штаммов сальмонелл, коррелирующих с тяжестью течения и прогноза заболевания, рекомендуется определение фрагментов генов «островов» патогенности ЫуА, Ь1уВ, sfaA и эГав, ассоциированных с патогенностью Е.соН.

2. Выявленные корреляционные связи между увеличением количества фрагментов генов «островов» патогенности (ФГОП) в геноме 8. ЕгйегШсИз, множественной резистентностью к антибактериальным препаратам и степенью тяжести сальмонеллеза определяют изменения в тактике ведения больных (назначение антибиотиков широкого спектра действия, проведение интенсивной дезинтоксикационной терапии).