Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Клинико-иммунологические факторы формирования плацентарной недостаточности

На правах рукописи

005536526

БАРАНОВСКАЯ ЮЛИЯ ПЕТРОВНА

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ФОРМИРОВАНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

14.01.01 — акушерство и гинекология

31 ОКТ 2013

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Иваново-2013

005536526

На правах рукописи

БАРАНОВСКАЯ ЮЛИЯ ПЕТРОВНА

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ФОРМИРОВАНИЯ ПЛАЦЕНТАРНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ

14.01.01 - акушерство и гинекология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Иваново — 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители -

доктор медицинских наук доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО "Ярославская государственная медицинская академия"

Минздрава РФ) Охапкин Михаил Борисович

доктор медицинских наук, профессор (ГБОУ ВПО " Московский государственный медико-стоматологический университет имени А.И.Евдокимова"

Минздрава РФ) Кузьмин Владимир Николаевич

Ведущая организация: Государственное бюджетное учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится "_"_2013 г. в _ часов на заседании

диссертационного совета Д208.028.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 153045, г. Иваново, ул. Победы, 20.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ "Ив НИИ МиД имени В.Н. Городкова" Минздрава РФ.

Автореферат разослан «_» _2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук И.А. Панова

Панова Ирина Александровна Сотникова Наталья Юрьевна

Актуальность проблемы

Плацентарная недостаточность (ПН) одно из наиболее распространенных осложнений беременности и в настоящее время является одной из основных и актуальных проблем практического акушерства. Плацентарная недостаточность -синдром, имеющий мультифакториальную этиологию, который обусловлен морфофункциональными изменениями и адаптационно-гомеостатическими реакциями плаценты и плода, приводящими к нарушению темпов роста и развития плода [Проданова Е.В. и соавт., 2011; Серов В.Н. и соавт., 2012]. Частота ПН колеблется в пределах 24-46%, в структуре причин перинатальных потерь составляет 60-70% [Батырханов М.С, 2007; Семенова М.В., Загребина О.В., 2010].

Патогенетические основы ПН остаются до конца не установленными. К основным звеньям патогенеза ПН относятся нарушения маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровообращения, метаболизма, синтетической функции и состояния клеточных мембран плаценты [Серов В.Н., 2006]. Имеющиеся научные данные свидетельствуют о значимости инфекции и вызванных ею нарушений в развитии плацентарной недостаточности, а также осложнений со стороны матери, плода и новорожденного [Кулаков В.И. и соавт., 2004; Кравченко Е.Н., 2009; Кудряшова А.В. и соавт., 2009]. Важную роль в формировании плацентарной недостаточности играет нарушение иммунного ответа матери на различные патологические воздействия [Girardi G. et al., 2006; Murthi P. et al., 2006; Omoy A., 2007; Zalel Y. et al., 2008; Газиева И.А., Чистякова Г.Н., 2010].

В большинстве случаев нарушение иммунного ответа матери на различные патологические воздействия при ПН сопровождается угнетением продукции факторов роста и нарушением баланса в соотношении про- и анти-апоптотических факторов [Кудряшова А.В., 2006; Arroyo J.A. et al., 2008; Toft J.H., et al., 2008; Semczuk-Sikora A. et al., 2007; Липатов И.С., Тезиков Ю.В., 2011]. Важную роль в защите организма от различных патогенов играют механизмы врожденного иммунитета, инициирующиеся при взаимодействии Toll-like рецепторов (TLR) с патоген-ассоциированными молекулярными образцами (РАМР) микроорганизмов [Макаров О.В. с соавт., 2007]. Взаимодействие РАМР с TLR на поверхности клеток синцитиотрофобласта стимулирует апоптоз клеток плаценты [Chan G., Guilbert .J., 2006], и может изменять уровень продукции факторов роста [Koff J.L. et al, 2008].

Установлена роль взаимодействия То11-подобных рецепторов макрофагов с РАМР в развитии осложнений беременности [Kumazaki, 2004; Chan G., Guilbert .J., 2006; Макаров O.B. с соавт., 2007; Хаитов P.M. и соавт., 2009], однако при плацентарной недостаточности этот вопрос практически не освещен. Остается практически неизученной апоптоз индуцирующая способность клеток макрофагального ряда.

Цель исследования:

Установить новые патогенетические звенья формирования плацентарной недостаточности на основания уточнения медико-биологических факторов риска, выявления функционального состояния клеток макрофагального ряда и продукции ростовых факторов на системном и локальном уровнях.

Задачи исследования:

1.Дать оценку состояния репродуктивного и соматического здоровья, уровня инфицированное™, функционального состояния фето-плацентарной системы, течения беременности и родов, состояния новорожденного у женщин с плацентарной недостаточностью, на основании чего определить медико-биологические факторы риска развития данного осложнения беременности.

2. Установить особенности экспрессии TLR2, TLR4 и FasL клетками макрофагального ряда периферической крови, децидуальной оболочки и ворсинчатого хориона плаценты при плацентарной недостаточности.

3. Оценить влияние LPS-стимуляции на экспрессию TLR2, TLR4 и FasL моноцитами при неосложненном развитии беременности и плацентарной недостаточности.

4.Выявить особенности продукции ангиогенных факторов и их рецепции на системном и локальном уровне при неосложненном развитии беременности и плацентарной недостаточности.

Научная новизна исследования:

В современных условиях получены новые теоретические данные о ранжировании факторов риска развития плацентарной недостаточности. Наиболее значимыми факторами риска развития плацентарной недостаточности являются: курение во время беременности, эндомиометрит и медицинский аборт в анамнезе, во

время беременности - активная хламидийная, уреаплазменная и микоплазменная инфекция, угроза прерывания в 1 триместре, ОРВИ.

Установлено, что развитие плацентарной недостаточности сочетается с изменением экспрессии Toll рецепторов в сторону усиления их экспрессии клетками макрофагального ряда в крови и в децидуальной оболочке плаценты и снижения в ворсинчатом трофобласте, которое зависит от степени тяжести нарушения гемодинамики по данным допплерометрии.

Показано, что для женщин с плацентарной недостаточностью в отличие от женщин с неосложненной беременностью характерно отсутствие ответа моноцитов на стимуляцию липополисахаридом.

Установлено, что для женщин с плацентарной недостаточностью и нарушением гемодинамики II, III степени по данным допплерометрического исследования, характерно угнетение апоптоз индуцирующих свойств моноцитов.

Показано, что развитие плацентарной недостаточности сопровождается изменением корреляционных связей между показателями врожденного иммунитета и показателями инфицирования.

Практическая значимость: Определены наиболее значимые медико-биологические факторы риска развития плацентарной недостаточности у беременных женщин.

Определены факторы риска развития осложнений беременности, родов и перинатальной патологии при плацентарной недостаточности.

Установлены новые патогенетические механизмы развития плацентарной недостаточности, обусловленные нарушением ответа клеток макрофагального ряда на инфекционные агенты через Toll рецепторы.

Положения, выносимые на защиту:

Формирование плацентарной недостаточности сочетается с нарушением взаимодействия РАМР с PRR на клетках макрофагального ряда на системном и локальном уровне, угнетением апоптоз индуцирующей функции моноцитов, дисбалансом синтеза, продукции и рецепции ангиогенных факторов, которые зависят от степени нарушения гемодинамики, отсутствием ответа клеток макрофагального ряда на липополисахарид.

Имеется тесная взаимосвязь между уровнем TLR4+ макрофагов в децидуальной оболочке плаценты и интегральным показателем инфицирования, а также показателем бактериального инфицирования; между уровнем CD95L+ моноцитов и показателем вирусного инфицирования.

Внедрение результатов в практику:

Разработанный способ диагностики плацентарной недостаточности прошел предрегистрационное испытание в акушерской клинике Федерального государственного бюджетного учреждения "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения РФ.

Апробация работы:

Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на III региональном научном форуме «Мать и дитя» (Москва, 2009), на республиканской научно-практической конференции «Современные перинатальные медицинские технологии в решении проблем демографической безопасности» (Минск, 2009г.), на научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 30-летию со дня основания института ФГУ "Ив НИИ МиД им. В.Н. Городкова" Минздравсоцразвития России (г. Иваново, 20 Юг), на конференции молодых ученых (г. Иваново, 2011г).

Публикации: по теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 5 в рецензируемых журналах, включенных в перечень журналов, рекомендованных ВАК РФ.

Личное участие автора:

Диссертационная работа представляет собой самостоятельный труд автора. Автором лично проводился забор материала для диагностических исследований, динамическое наблюдение за пациентами, прослежены исходы беременности у обследованных, заполнялись индивидуальные карты наблюдений, производилась статистико-математическая обработка полученных данных.

Структура и объем диссертации:

Диссертация изложена на 180 страницах машинописного текста, содержит введение, обзор литературы, 2 главы собственных исследований, обсуждение

результатов, выводы и практические рекомендации, список литературы, включающий 248 источников. Работа иллюстрирована 36 таблицами и 9 рисунками.

Содержание работы:

Материал и методы исследования:

Работа выполнена на базе Федерального государственного бюджетного учреждения "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор д.м.н. А.И. Малышкина). Отбор пациенток осуществлялся на базе ФГБУ "Ив НИИ М и Д им. В.Н. Городкова" Минздрава России (отделения патологии беременных, родовые блоки акушерской клиники), 2-ой женской консультации г.Иванова. Лабораторные исследования проводились в лаборатории клинической иммунологии (зав. лаб. д.м.н., профессор Н.Ю. Сотникова), клинической биохимии (зав. лаб. д.м.н., профессор С.Б. Назаров), лаборатории патоморфологии и электронной микроскопии (зав. лаб. д.м.н., профессор Перетятко Л.П.). На каждую пациентку заполнялась специально разработанная "карта беременной женщины", в которую выкопировывались результаты исследований и наблюдений из индивидуальной карты беременной и родильницы, истории родов, истории развития новорожденного.

Основную группу составили 98 беременных женщины в сроке 28-36 недель с плацентарной недостаточностью, которые в зависимости от степени нарушения маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока по данным допплерометрии (классификация Стрижакова А.Н. и соавт., 1989г) были разделены на три подгруппы: в 1 подгруппу вошли 42 женщины с I степенью нарушения гемодинамики, во 2 подгруппу - 32 беременные со II степенью нарушения гемодинамики, в 3 подгруппу — 24 женщины с III степенью нарушения гемодинамики.

При ретроспективном анализе, в зависимости от данных патоморфологического исследования плацент, исследуемые женщины основной группы разделены три на подгруппы: с компенсированной (п=13), субкомпенсированной (п=53) и декомпенсированной плацентарной недостаточностью (п=32).

Контрольную группу составили 35 женщин с неосложненным течением беременности. Группа характеризовалась отсутствием признаков плацентарной недостаточности.

Критериями исключения явились беременные с тяжелой экстрагенитальной патологией, преэклампсией, многоплодной беременностью.

Материалом для исследования служили периферическая кровь из локтевой вены, децидуальная ткань и ткань ворсинчатого хориона зрелой плаценты.

Проводилось общеклиническое обследование, в том числе общепринятое лабораторное и биохимическое обследование. Ультразвуковое и допплерометрическое обследование беременных женщин проводилось на аппарате Aloka Prosound al (Hitachi Aloka Médical, Ltd., 6-22-1, Mure, Mitaka-shi, Tokyo, 1818622, Japan), кардиотокографическое исследование - на аппарате Sonicaid Team саге (Oxford Instruments).

Иммунологические методы:

Выделение из периферической крови общей фракции мононуклеарных клеток, содержащей лимфоциты и моноциты, мононуклеарные клетки из плацентарных тканей осуществляли традиционным методом скоростного центрифугирования при 1500 об/мин в градиенте плотности фиколл-урографина (d-1,078). Клетки, выделенные из ткани ворсинчатого хориона, наслаивали на двойной градиент плотности фиколл-урографина (d-1,060 и d-1,078).

Выделение фракции моноцитов/макрофагов из суспензии лейкоцитов производили методом позитивной магнитной сепарации с использованием Dynabeads М-280 sheep anti-mous IgG (Dynal Biotech ASA, Норвегия).

Для анализа неспецифического окрашивания использовали Simultest Control (мышиные IgGl-FITC + IgG2a-PE) ("Becton Dickinson", США). Для наложения оптимального окна дискриминации (гейта) для моноцитов/макрофагов на точечном графике прямого и бокового светорассеяния клетки метили aHTH-CD45-FITC и aHTH-CD14-PE мАТ ("Becton Dickinson", США). Исследование содержания моноцитов/макрофагов, спонтанно экспрессирующих TLR2, TLR4 и CD95L, и после стимуляции LPS in vitro, производили методом проточной цитофлюориметрии на приборе FACScan (Becton Dickinson, США). В работе использовали моноклональные антитела к TLR2 и TLR4

меченные FITC (Hycult biotech, Нидерланды). В каждом образце анализировали не менее 10000 клеток. Анализ результатов проводили в программе "Cell Quest Pro".

Стимуляцию периферических мононуклеарных клеток осуществляли LPS Escherichia coli Kl 2 (MP Biomedicals, США). Выбор дозы LPS для стимуляции клеток in vitro в эксперименте осуществляли в соответствии с рекомендациями Ferrara G. с соавт. (2008), Sattahaporn S. с соавт. (2008), Selkirk G.A с соавт. (2009), Semeraro F. с соавт. (2009), Xu Z.X. с соавт. (2008). Выделенные из периферической крови лейкоциты в концентрации 2 х 106 кл/мл помещали в среду RPM1-1640, содержащую 10% FCS и LPS в концентрации 1 мкг/мл. Культивирование клеток проводили в течение 24 часов при 37°С и 5% С02. В качестве контроля использовали клетки, инкубировавшиеся в аналогичных условиях в среде RPMI-1640 с 10% FCS без ЛПС. Подсчет концентрации и жизнеспособности клеток до и после инкубации показал, что гибель клеток во всех случаях составила менее 8%.

Для определения экспрессии мРНК VEGF и гена домашнего хозяйства р2-микроглобулина моноцитами/макрофагами периферической крови, децидуальной оболочки плаценты и ткани ворсинчатого хориона использовали количественный метод RT-PCR в реальном времени.

Определение количества копий-пар мРНК VEGF и р2-микроглобулина в 5 мкл образца проводили на прибор iCycler (BIO-RAD, США) с использованием тест-систем изготовленных ЗАО «Синтол» (Россия) по протоколу фирмы-разработчика. В каждом образце одновременно определялось количество копий-пар специфической мРНК VEGF (SQ VEGF) и гена домашнего хозяйства - р2-микроглобулина (SQ ß2-микроглобулина), используемого в качестве внутреннего контроля. Затем, уровень экспрессии мРНК VEGF нормализовался относительно экспрессии мРНК внутреннего контроля р2-микроглобулина.

Методом ELISA на микропланшетном ридере Multiscan EX Labsystems (Финляндия) в сыворотке периферической крови и в экстрактах плацентарных тканей определяли содержание VEGF (Cytimmune, США, чувствительность тест-системы от 18,6 пг/мл) и его рецепторов VEGFRI (BioSource, США, чувствительность тест-системы от 0,1 нг/мл), VEGFRII (R&D Systems, США, чувствительность тест-системы от 1 пг/мл).

В сыворотке периферической крови исследовали содержание специфических антител (AT) к возбудителям урогенитальных инфекций. Методом ИФА определяли: наличие IgM AT к вирусу простого герпеса 1,2 типов, цитомегаловирусу, токсоплазме гондии, хламидии трахоматис и IgA к микоплазме хоминис и уреаплазме уреалитикум; уровень и авидность IgG к вирусу простого герпеса 1,2 типов, цитомегаловирусу; содержание и титр IgG к хламидии трахоматис, микоплазме хоминис, уреаплазме уреалитикум. В работе использовали тест-системы ЗАО «Вектор-Бест». Результаты регистрировались на микропланшетном ридере Multiscan EX Labsystems (Финляндия).

Для расчета интегрального показателя активности инфекции использовали метод экспертной оценки. По результатам опроса специалистов (иммунологов, патоморфологов, акушеров-гинекологов), определили значимость вируса простого герпеса, цитомегаловируса, хламидии трахоматис, микоплазмы хоминис, уреаплазмы уреалитикум, токсоплазмы гондии в развитии акушерской и перинатальной патологии в 3 триместре беременности с учетом остроты процесса и титра антител по данным ИФА. На основании проведенного исследования была составлена сводная таблица показателя интенсивности инфекции.

Биохимические методы: Определение фактора роста плаценты проводили набором фирмы «Bioserv» (Германия) методом ИФА. на автоматическом ридере EL-808 (BIO-ТЕК INSTRUMENTS INC., USA)

Патоморфологические методы: Макроскопическое исследование последов; световая микроскопия (окраска гематоксилином и эозином); морфометрия плацент по стандартизированной методике А.П. Милованова и А.И.Брусиловского; иммуногистохимическое исследование плацент с первичными антителами к VEGF. Для объективизации результатов иммуногистохимического исследования использовали полуколичественный метод и индекс экспрессии VEGF, который вычисляли по формуле:

ИЭ = £ P(i)-i/100,

где ИЭ - индекс экспрессии; i - интенсивность окрашивания в баллах от 0 до 3; P(i) - процент клеток, окрашенных с различной степенью интенсивности.

Математическая обработка полученных результатов исследования проводилась по общепринятым методам вариационной статистики после проверки рядов данных на нормальность распределения. Описание выборки производилось с помощью подсчета медианы (Me) и интерквартального размаха в виде 25 и 75 процентилей (С25-С75). Достоверность различий между показателями независимых выборок оценивалась по непараметрическому критерию U (Манна-Уитни) и по t-критерию (М±ш). Статистический анализ осуществляли в пакете прикладных лицензионных программ "Statistica 6.О.", "Microsoft Office 2007", "GenStat", "MedCalk" и "Open Epi".

Результаты исследования и их обсуждение:

Возраст обследованных беременных женщин колебался от 15 до 40 лет. Сравниваемые группы практически не отличались по среднему возрасту, который составил 28,4+1,06 лет в контрольной группе и 27,3+0,56 лет в основной (р>0,05). Женщины основной группы чаще по сравнению с контролем были рабочими (31,6% против 11,4%; относительный риск 2,77; 95% ДИ 1,05-7,28, р<0,05), реже служащими (38,8% в основной группе против 65,7%, р<0,01). Среди вредных привычек у женщин основной группы чаще по сравнению контрольной выявлялось табакокурение (29,6% против 29,9%; относительный риск 10,36; 95% ДИ 1,47-73,2, р<0,01). Полученные результаты совпадают с данными других авторов, свидетельствующими о том, что курящие женщины составляют группу повышенного риска на развитие ПН [Кулаков В.И. и соавт., 2004; Пересада O.A., 2004; Жданова Я.В. и соавт., 2009].

Среди гинекологических заболеваний у женщин основной группы чаше, по сравнению с контролем, встречался эндометрит (25,5% против 2,9%; относительный риск 8,93; 95% ДИ 1,26-65,45, р<0,01), аднексит (24,5% против 8,6%, р<0,05). Анализ данных о предыдущих беременностях показал, что у женщин основной группы достоверно чаще чем в контрольной отмечены артифициальные аборты (37,8% против 14,3%, относительный риск 2,64; 95% ДИ 1,13-6,19, р<0,05), самопроизвольные выкидыши (24,5% против 8,6%, р<0,05). Полученные нами данные согласуются с литературными данными о том, что группу повышенного риска по ПН при беременности составляют пациентки с наличием в анамнезе воспалительных заболеваний гениталий, медицинских абортов, при которых на фоне хронического

воспалительного процесса происходят изменения в системе иммунитета, что может приводить к нарушению процесса плацентации, инвазии и развития хориона и к развитию ПН [Namba F. et al., 2010; Puchner К. et al., 2011].

При анализе течения беременности установлено, что у женщин с ПН достоверно чаще, чем в контроле беременность осложнилась угрозой прерывания в первом триместре (55,1% против 28,6%, относительный риск 1,93, 95% ДИ 1,11-3,35, р<0,01), анемией (44,9% случаев против 25,7% в контроле, р<0,05). Признаки угрозы прерывания, особенно в ранние сроки беременности, являются отражением иммунологического неблагополучия в организме беременной [Suzuki S., 2002; Paradisi R., 2003]. Именно угроза прерывания может приводить к дефектам плацентации с нарушением инвазии трофобласта в стенку спиральных артерий, что в последующем, по мнению многих авторов, способствует развитию фетоплацентарной недостаточности [Bjercke S., 1999; Myatt L., 2002], что подтверждено и нашими исследованиями.

Обращает на себя внимание высокая частота острых респираторных заболеваний во время беременности у женщин основной группы (60,2% против — 34,3% группы контроля, относительный риск 1,76, 95% ДИ 1,1-2,86, р<0,01), что согласуется с литературными данными о роли инфекции в формировании ПН [Краснопольский В.И. и соавт., 2006; Жданова Я.В., 2009; Буранова Ф.Б., 2011].

Проведен сравнительный анализ характера ПН у беременных в зависимости от степени нарушения гемодинамики. Развитие ПН с нарушением гемодинамики II и III степени характеризовалось ранним началом (26-27 недель беременности), развитием ЗРП на 3-4 и более недель (р<0,05 в обоих случаях).

Анализ исходов беременности у обследованных женщин показал, что в основной клинической группе в 51% случаев беременность завершилась преждевременными родами (р<0,001), что согласуется с данными литературы о том, что ПН является фактором риска преждевременных родов [Кулаков В.И. и соавт, 2004; Макаров О.В. и соавт., 2009]. По нашим данным при ПН риск преждевременных родов в сроки 28-32 недели повышен в 7,9 раза по сравнению с группой контроля (21,4% против 0,0% группы контроля, относительный риск 7,93, 95% ДИ 1,11-56,85, р<0,02). Частота преждевременных родов в сроки 33-35 и 36-37 недель была также выше в основной группе (р<0,02 в обоих случаях). Путем операции кесарево сечение

закончились 58,2% родов. Основным показанием к оперативному родоразрешению в основной группе была декомпенсация плацентарной недостаточности (26,5% против 0,0% группы контроля, относительный риск 9,82,95% ДИ 1,38-69,76, р<0,001).

Средняя масса новорожденных в группе контроля составила 3429,72±67,72 грамма, в группе с ПН 2181,89±75,72 грамма (р<0,001). Рождение маловесных детей при плацентарной недостаточности различной степени согласуется с данными литературы [Ремнева О.В. и соавт., 2008]. В состоянии асфиксии родились 76,5% детей основной группы (р<0,001), при этом чаще рождались дети в асфиксии средней (32,6% против 5,7% у женщин контроля, относительный риск 5,7, 95% ДИ 1,442-22,62, р<0,01) и тяжелой степени (13,68% против 0% в контроле, р<0,05).

В структуре перинатальной патологии в основной группе чаще диагностированы ЗРП всех степеней (81,1% против 0% в контроле, относительный риск 30,0, 95% ДИ 4,33207,8, р<0,001), ишемические (82,1% против 14,3% в контроле, относительный риск 5,75; 95% ДИ 2,54-13,01, р<0,001) и геморрагические (42,2% против 0% в контроле, относительный риск 16,4; 95% ДИ 2,34-114,6, р<0,001) перинатальные поражения ЦНС, инфекционно-воспалительные заболевания (15,8% против 2,9% в контроле, р<0,02), что согласуется с мнением ведущих ученых [Липатов И.С. и соавт., 2008; Семенова М. В., ЗагребинаО. В., 2010].

Неблагоприятное влияние инфекционного фактора на течение гестационного процесса и состояние плода хорошо изучено и связано с реализацией патогенных свойств возбудителей инфекций в организме матери и плода [Луценко М.Т., 2008; Кудряшова A.B. и соавт., 2009; Кравченко Е. Н., 2009]. По данным Michael Y Divon [2013] инфекции, которые развиваются на ранних сроках беременности имеют наибольшее влияние на дальнейший ход беременности, в том числе они являются фактором риска развития ПН и ЗРП. При обследовании женщин на наличие урогенитальной инфекции методом ИФА установлено, что пациентки основной группы имели высокий уровень урогенитального инфицирования (64,4% против 37,5%, р<0,01) с преобладанием хламидийной, уреаплазменной и микоплазменной инфекций (36,8% против 15,6% в контрольной группе, относительный риск 2,35; 95% ДИ 1,01 — 5,51, р<0,05). Об этом свидетельствовало повышение интегрального показателя инфицирования (р<0,01) и показателя бактериального инфицирования (р<0,01) в

группе с ПН по сравнению с контролем; максимальное повышение показателя бактериального инфицирования отмечено при нарушении гемодинамики II степени (р<0,01 при сравнении с контролем).

При патоморфологическом исследовании плацент женщин с различными стадиями ПН установлено, что в группе женщин с компенсированной плацентарной недостаточностью степень инфицированное™ составляет 85,7%, с субкомпенсированной - 93%, с декомпенсированной - 95,6% наблюдений. В плацентах всех групп выявлены морфологические признаки продуктивного васкулита, базального децидуита, склероза сосудов стволовых, промежуточных ворсин, вирусной трансформации децидуальных клеток, диффузной лейкоцитарной инфильтрации, фибриноидный некроз.

Выявление причин плацентарной недостаточности очень важно в каждом конкретном наблюдении, поэтому во многих странах мира применяется стратегия выделения факторов риска с учетом социальных и медицинских факторов в разных категориях беременных женщин. По нашим данным наиболее значимыми факторами риска развития плацентарной недостаточности являются: курение (ОР=Ю,4), эндометрит (ОР=8,9) аборты (ОР=2,6) в анамнезе, во время беременности - угроза прерывания в первом триместре (ОР=2,6), ОРВИ (ОР=1,8), активная хламидийная, уреаплазменная и микоплазменная инфекция (ОР= 2,4).

Защита организма против инфекций осуществляется с помощью работы врожденной и адаптивной систем иммунитета. То11-подобные рецепторы являются наиболее древними патоген-распознающими рецепторами и играют центральную роль в инициации врожденного иммунного ответа на патоген. При взаимодействии TLR с РАМР (патоген-ассоциированные молекулярные образы) микроорганизмов фагоциты секретируют провоспалительные факторы, развивается воспалительная реакция, направленная на элиминацию патогена [Макаров О.В. и соавт., 2007; Хаитов P.M. и соавт., 2009]. Высокая частота выявления маркеров инфекционного процесса у женщин с плацентарной недостаточностью, по-видимому, вызывает изменение функционального состояния клеток макрофагального ряда, обеспечивающих реакции врожденного иммунитета.

Нами проводилось исследование содержания моноцитов периферической крови и макрофагов плаценты, экспрессирующих TOLL-рецепторы 2 и 4 типов, а также

FasL, в группах женщин с плацентарной недостаточностью в зависимости от степени гемодинамических нарушений по данным допплерометрии.

Проведенные исследования показали достоверное увеличение содержания моноцитов крови, экспрессирующих TOLL-рецепторы 2 типа в группах женщин с нарушением гемодинамики I и III степени по сравнению с группой контроля (р<0,05 и р<0,02, соответственно). При сравнении содержания TLR2+ моноцитов в зависимости от уровня урогенитального инфицирования было выявлено, что уровень данного показателя был достоверно выше в группе женщин с наличием антител к урогенитальным инфекциям по сравнению с таковым в группе контроля без маркеров инфицирования (р<0,01). Нами был проведен ROC-анализ содержания TLR2+ моноцитов в контрольной группе и в группе женщин с ПН. На основании полученных данных был разработан критерий диагностики плацентарной недостаточности. При уровне TLR2+ моноцитов более 63,5% диагностируют ПН с точностью 61,9% (специфичность 83,3%). Содержание TLR4+ моноцитов при ПН не изменялось (р>0,05).

В децидуальной оболочке плаценты содержание TLR2+ макрофагов в группе с ПН, а также при нарушении гемодинамики II и III степени было достоверно выше, чем в контроле (р<0,05, р<0,05 и р<0,01, соответственно). Содержание макрофагов, экспрессирующих TLR4 повышалось только при нарушениях гемодинамики II и III степени (р<0,05 в обоих случаях).

В ворсинчатом хорионе плаценты содержание TLR2+ макрофагов достоверно снижалось в группах со II и III степенью нарушения гемодинамики по сравнению с показателями группы контроля (р<0,02 и р<0,05, соответственно). Содержание TLR4+ макрофагов в ворсинчатом хорионе снижалось только в группе с III степенью нарушения гемодинамики по сравнению с показателями группы контроля (р<0,05).

Вероятно, повышение в периферической крови и в децидуальной оболочке плаценты содержания клеток, экспрессирующих Toll рецепторы 2 типа, а также повышение содержания макрофагов, экспрессирующих TLR рецепторы 4 типа, в ДО определялось отмеченным нами высоким уровнем инфицирования при ПН. При этом активация TLR2 вызывает усиление продукции провоспалительных медиаторов и способствует развитию хронического воспаления [Darville Т. В et al., 2003; Макаров

O.B. и соавт, 2007; Киселева Е.П., 2011]. Снижение содержания макрофагов, экспрессирующих Toll-рецепторы, на уровне ворсинчатого хориона при тяжелых нарушениях маточно-плацентарного кровообращения, могло усиливать восприимчивость к инфекциям и определять отмеченное нами повышение частоты инфекционных заболеваний у новорожденных.

Нами была исследована апоптоз индуцирующая способность моноцитов и макрофагов по экспрессии ими молекул CD95L (FasL). По нашим данным в периферической крови беременных с ПН отмечалось сниженное содержание CD95L+ моноцитов в группах с нарушением гемодинамики II и III степени по сравнению с показателями контроля (р<0,05 и р<0,02, соответственно). Так как взаимодействие FasL с молекулой Fas запускает Fas-зависимый путь апоптоза [Сотникова Н.Ю. и соавт., 2005], можно предположить, что при ПН нарушается процесс естественной элиминации активированных клонов иммунных клеток. Это косвенно подтверждается увеличением количества моноцитов, находящихся на поздних этапах апоптоза у беременных с ЗРП [Сотникова Н.Ю. и соавт., 2005], что может приводить к нарушению завершенности апоптоза активированных моноцитов и способствовать развитию воспалительных и аутоиммунных реакций.

Несмотря на то, что большинство исследователей отмечали усиление апоптоза клеток различных плацентарных структур при ПН [Сотникова Н.Ю. и соавт., 2005; Макаров О.В. и соавт., 2007; Elmore S. 2007; Abrahams V.M., 2009; Липатов И.С., Тезиков Ю.В., 2011], нам не удалось выявить изменений в содержании FasL-позитивных макрофагов в децидуальной ткани и ворсинчатом хорионе при ПН (р>0,05). Можно предположить, что при ПН макрофаги не играли значительной роли в индукции апоптоза клеток плаценты по Fas-FasL зависимому пути.

Для оценки возможного влияния инфекционного фактора на функциональное состояние макрофагальных клеток при ПН был проведен эксперимент по оценке влияния стимуляции клеток липополисахаридом (LPS) на содержание моноцитов/макрофагов, экспрессирующих TLR2, TLR4 и CD95L in vitro. При ПН LPS не влиял на уровень CD95L+ и TLR4+ моноцитов во всех исследуемых группах (р>0,05 во всех случаях). Однако в контрольной группе после стимуляции LPS достоверно возрастало количество TLR2+ моноцитов (р<0,05). Возможно, это было

обусловлено максимальным уровнем стимуляции клеток при ПН. Выявленное нами нарушение ответа на стимуляцию LPS при ПН может обуславливать нарушение элиминацию патогена фагоцитами при инфицировании, что подтверждается литературными данными. По мнению ряда авторов угнетение противовирусной и противобактериальной защиты организма является одной и важнейших причин развития ПН [Кулаков В.И., 2004; Тютюник B.JL, 2006].

Существует мнение о том, что в третьем триместре, когда сосудистая сеть плаценты сформирована, защиту эндотелиальных клеток плаценты от апоптоза и повышение их выживаемость обеспечивают различные ангиогенные факторы, в том числе VEGF и PLGF [Соколов Д.И. и соавг., 2008].

Для того чтобы оценить вклад периферических клеток макрофагального ряда в продукцию факторов, регулирующих ангиогенез, нами проводилось изучение особенностей экспрессии мРНК VEGF моноцитами. Выявлено достоверное ее усиление в общей группе с ПН и в группе с I степенью нарушения гемодинамики по сравнению с таковым в контроле (р<0,05), в группах со II и III степенью нарушения гемодинамики была выявлена тенденция к повышению данного показателя (р>0,05). Синтез мРНК VEGF макрофагами децидуальной оболочки плаценты имел тенденцию к снижению в основной группе по отношению к контролю (р>0,05), а при нарушении гемодинамики III степени уровень данного показателя был достоверно ниже, чем в контроле (р<0,02). Экспрессия мРНК VEGF макрофагами ворсинчатого хориона плаценты в группе женщин с ПН, а также при I степени нарушения гемодинамики была достоверно выше, чем в контроле (р<0,05 в обоих случаях).

Как показали наши исследования, в сыворотке периферической крови беременных женщин содержание VEGF было крайне незначительным, ниже детектируемых методом ИФА значений. Однако, сывороточное содержание плацентарного фактора роста (PLGF) в группе женщин с ПН и при нарушении гемодинамики И и III степени уровень PLGF было достоверно ниже, чем в контроле (р<0,01, р<0,01 и р<0,001, соответственно). Полученные нами данные согласуются с результатами других исследователей, которые также отмечали снижение содержания PLGF в сыворотке крови беременных с ЗРП [Semczuk-Sikora А. et al., 2007; Erez О. et al., 2008]. Отмеченное нами снижение содержания PLGF в сыворотке крови

беременных при ПН, максимально выраженное при III степени нарушения гемодинамики, может приводит к развитию эндотелиальной дисфункции, которая в значительном ряде случаев сопровождает ПН [Липатов И.С., Тезиков Ю.В., 2011].

Как известно VEGF осуществляет свое действие через два основных рецептора: VEGFR1 (Flt-1) и VEGFR2 (Flk-1) [Soker S. et al., 1998; Gluzman-Poltorak Z. et al.,2001], a PLGF конкурирует с VEGF за Flt-1 рецептор [Errico M. et al., 2004]. Установлено, что через VEGFR2 проводятся сигналы, стимулирующие усиление ангиогенеза, васкуляризации и вазодилятации [Ferrara N. et al., 2003], a VEGFR1, напротив, блокирует VEGF-зависимую функцию эндотелия [Gille Н. et al., 2000; Zeng Н. et al., 2001]. По нашим данным содержание VEGF в экстрактах децидуальной оболочки плаценты в группе с ПН по отношению к показателям контрольной группы было достоверно выше (р<0,05). Содержание VEGFR1 в периферической крови у женщин с ПН было достоверно ниже, чем в группе контроля (р<0,01). Было выявлено также достоверное снижение содержания VEGFR2 в общей группе с ПН по сравнению с таковым в контроле (р<0,05). Хотя наши данные не согласуются с результатами ряда авторов, которые показали повышение уровня VEGFR1, в сыворотке и плазме крови при ЗРП [Semczuk-Sikora A. et al., 2007; Stepan Н. et al., 2007; Erez O. et al., 2008], отмеченное нами снижение сывороточного уровня VEGFR1 представляется вполне логичным, и, вероятно, отражает развитие при ПН компенсаторных реакций, способствующих пролонгированию беременности. В то же время, можно предположить, что снижение уровня VEGFR2 в децидуальной оболочке ограничивает компенсаторные возможности действия VEGF при ПН.

При иммуногистохимической оценке экспрессии VEGF в группах с различной степенью компенсации плацентарной недостаточности выявлено, что индекс экспрессии VEGF в контрольной группе составил 1,49±0,08 у.е. в децидуальных клетках базальной пластинки и 1,02±0,02 у.е. в синцитиотрофобласте терминальных ворсин. При компенсированной ПН данный показатель составил 1,52±0,04 у.е. в децидуальных клетках базальной пластинки и 1,02±0,02 у.е. в синцитиотрофобласте терминальных ворсин (р>0,05). При субкомпенсированной ПН отмечено достоверное повышение индекса экспрессии VEGF как в децидуальных клетках (1,64±0,06 у.е.), так и в синцитиотрофобласте терминальных ворсин (1,37±0,03у.е.) по сравнению с

группами контроля и компенсированной ПН (р<0,01, в обоих случаях). При декомпенсированной ПН экспрессия VEGF отчетливо выявилась в децидуальных клетках (индекс экспрессии 1,97±0,06) и синцитиотрофобласте терминальных ворсин (индекс экспрессии 1,7±0,04), при этом уровень экспрессии VEGF был достоверно выше, чем в контроле, при компенсированной и субкомпенсированной ПН (р<0,01 во всех случаях). По-видимому, выявленное нами повышение содержания VEGF в экстрактах децидуальной ткани, определялось его продукцией именно децидуальными клетками. В то же время, в плодовой части плаценты высокий уровень VEGF при ПН мог определяться не только усилением его продукции синцитиотрофобластом терминальных ворсин, но и усилением синтеза VEGF макрофагами ворсинчатого хориона.

Для уточнения роли инфекционного фактора в развитии ПН нами был проведен анализ корреляционных связей между иммунологическими показателями и показателями инфицирования. Было выявлено, что для женщин с плацентарной недостаточностью характерно наличие отрицательной корреляционной связи между уровнем CD95L+ моноцитов и интегральным показателем вирусного инфицирования, а также положительных связей между уровнем TLR4+ макрофагов в децидуальной оболочке плаценты с интегральным показателем инфицирования и показателем бактериального инфицирования. Только для нарушения гемодинамики II степени характерно наличие отрицательных связей между уровнем TLR4+ моноцитов и интегральным показателем инфицирования, а также между уровнем TLR2+ макрофагов децидуальной оболочки и CD95L+ макрофагов трофобласта.

Таким образом, в патогенезе ПН имеет место нарушение взаимодействия Toll рецепторов клеток макрофагального ряда с патогеном на системном и локальном уровнях, угнетение апоптоз индуцирующей функции моноцитов, дисбаланс синтеза, продукции и рецепции ангиогенных факторов, которые зависят от степени нарушения гемодинамики в системе мать-плацента-плод.

Выводы:

1. Медико-биологическими факторами риска, влияющими на развитие плацентарной недостаточности являются курение во время беременности

(0р=10,4), эндомиометрит (ОР=8,9) и медицинский аборт (ОР=2,6) в анамнезе, во время беременности — активная хламидийная, уреаплазменнвя, микоплазменная инфекции (ОР=2,4), ОРВИ (ОР=1,8) и угроза прерывания беременности в первом триместре (ОРИ,9). Наличие ПН при беременности повышает риск преждевременных родов в сроке 28-32 недели (ОР=7,9), риск рождения недоношенных детей (ОР=17,5), риск оперативного родоразрешения при декомпенсации ПН у женщин с данной (ОР=9,8), риск рождения детей в состоянии средней асфиксии (ОР=5,7), риск рождения детей с ЗРП (ОР=ЭО), риск рождения детей с ишемическим перинатальным поражением ЦНС (ОР= 5,8), риск геморрагического перинатального поражения ЦНС (ОР=16,4).

2. При нарушении гемодинамики I степени по данным допплерометрии отмечается повышение содержания TLR2+ моноцитов, при II степени -повышение содержания TLR2+ и TLR4+ макрофагов в децидуальной оболочке плаценты и снижение TLR2+ макрофагов в ворсинчатом хорионе, при III степени — повышение TLR2+ моноцитов, TLR2+ и TLR4+ макрофагов в децидуальной оболочке и их снижение в ворсинчатом хорионе плаценты.

3. Стимуляция in vitro мононуклеарных клеток липополисахаридом ведет при неосложненной беременности к увеличению количества TLR2+ моноцитов, а при плацентарной недостаточности не влияет на экспрессию Toll рецепторов моноцитами при всех степенях нарушения гемодинамики по данным допплерометрии.

4. Для женщин с плацентарной недостаточностью и нарушением гемодинамики по данным допплерометрии II и III степени характерно снижение уровня CD95L+ моноцитов.

5. При плацентарной недостаточности отмечается снижение сывороточного уровня PLGF, максимально выраженное при II и III степени нарушения гемодинамики по данным допплерометрии, усиление экспрессии мРНК VEGF моноцитами максимально выраженное при I степени. В плаценте наблюдается повышение содержания VEGF в экстрактах децидуальной оболочки и усиление иммуногистохимического окрашивания на VEGF в

децидуальных клетках базальной пластинки и синцитиотрофобласта терминальных ворсин на фоне снижения экспрессии мРНК УЕйР в макрофагах децидуальной оболочки при III степени и повышения мРНК УЕвР в макрофагах ворсинчатого хорионе при I степени нарушения гемодинамики.

6. При плацентарной недостаточности содержание УЕОРШ снижается на системном уровне, а количествоУЕСР112 уменьшается в экстрактах децидуальной оболочки плаценты.

7. Для женщин с плацентарной недостаточностью характерно наличие отрицательной корреляционной связи между уровнем С095Ь+ моноцитов и показателем вирусного инфицирования, а также положительных связей между уровнем ТЬЯ4+ макрофагов в децидуальной оболочке плаценты с интегральным показателем инфицирования и показателем бактериального инфицирования. Только для нарушения гемодинамики II степени характерно наличие отрицательных связей между уровнем ТЬЯ4+ моноцитов и суммарным показателем инфицирования, а также количеством ТЫ12+ децидуальных макрофагов и С0951> макрофагов трофобласта.

Практические рекомендации:

1. В группу риска на развитие плацентарной недостаточности следует относить курящих женщин, страдающих эндометритом, имеющих в анамнезе медицинский аборт, с острым бактериальным инфицированием во время беременности, угрозой прерывания беременности в первом триместре и перенесших ОРВИ во время беременности.

2.Дополнительно к стандарту обследования беременных с ПН рекомендуется оценивать экспрессию ТЫ12 моноцитами. При значении содержания Т1Л12+ моноцитов > 63,5% диагностируется плацентарная недостаточность.

3. При проведении морфологического исследования плацент степень иммуногистохимического окрашивания на УЕОР можно использовать в качестве дополнительного критерия, позволяющего диагностировать степень плацентарной недостаточности.

Список опубликованных работ по теме диссертации:

Публикации в журналах, включенных в перечень изданий рекомендованных ВАК РФ:

1. Довгалюк Ю.П. (Барановская Ю.П.), Сотникова Н.Ю., Кудряшова A.B., Панова И.А. Экспрессия FasL периферическими моноцитами и децидуальными макрофагами при фетоплацентарной недостаточности различной степени // Вестник Российской военно-медицинской академии (Приложение).- 2009. - Ч.1.- №1(25).-С.287-288

2. Панова И.А., Довгалюк Ю.П. (Барановская Ю.П.) Содержание VEGF, P1GF, VEGFR1 И VEGFR2 в периферической крови и плаценте при плацентарной недостаточности // «Вестник уральской медицинской академической науки» - 2010.-№2/1(29).-С. 183-184

3. Сотникова Н.Ю., Панова И.А., Довгалюк Ю.П. (Барановская Ю.П.) Экспрессия различных типов паттерн-распознающих рецепторов (PRR) макрофагальными клетками при беременности, осложненной плацентарной недостаточностью // Российский иммунологический журнал.- 2010. - Т4 (13), № 4,- С.402-403

4. Барановская Ю.П., Панова И.А., Сотникова Н.Ю. Роль факторов врожденного иммунитета в патогенезе плацентарной недостаточности // Медицинская иммунология. - Т. 13, №4-5.- 2011,- С.418.

5. Панова И.А., Сотникова Н.Ю., Довгалюк Ю.П. (Барановская Ю.П.), Кудряшова A.B. Характер экспрессии TOLL-подобных рецепторов моноцитами периферической крови при беременности осложненной плацентарной недостаточностью // Проблемы репродукции (специальный выпуск по материалам IV международного конгресса по репродуктивной медицине) - Москва.- 2010.- С. 106-107.

Публикации в журналах, сборниках, материалах конференций и тезисы

докладов:

1. Кудряшова A.B., Панова И.А., Довгалюк Ю.П. (Барановская Ю.П.) Характеристика паттернраспознаюших рецепторов моноцитов при плацентарной недостаточности // Журнал теоретической и клинической медицины - 2010.- №5.- С.83-86.- Узбекистан, Ташкент.

2. Проценко Е.В., Довгалюк Ю.П. (Барановская Ю.П.), Перетятко Л.П., Панова И.А. Морфология адаптивных и компенсаторный процессов в плацентах у женщин с внутриутробной инфекцией // Материалы III Регионального научного форума «Мать и дитя» - М., 2009,- С.223-224

3. Сотникова Н.Ю., Кудряшова A.B., Панова И.А., Довгалюк Ю.П. (Барановская Ю.П.) Особенности экспрессии мембранной формы FasL периферическими моноцитами и децидуальными макрофагами при СЗРП // Сборник научных трудов и метериалов республиканской научно-практической «Современные перинатальные медицинские технологии в решении проблем демографической безопасности» -Минск.-2009.- С.147-151

4. Проценко Е.В., Барановская Ю.П., Перетятко Л.П., Панова И.А. Клинические факторы и иммунологическая характеристика плаценты при хронической плацентарной недостаточности // Научно-практический журнал Врач-аспирант. -2011. - №4.2(47). -С.403-407

5. Барановская Ю.П., Панова И.А. Факторы риска развития плацентарной недостаточности // Бюллетень ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова. — Санкт-Петербург. - 2011.

- С.15

6. Сотникова Н.Ю., Панова И.А., Барановская Ю.П. Характеристика синтеза VEGF моноцитами периферической крови и макрофагами плаценты при плацентарной недостаточности // Бюллетень ФЦСКЭ им. В.А. Алмазова. - Санкт-Петербург. - 2011.

- (приложение 4). - С. 111.

7. Проценко Е. В., Барановская Ю. П., Перетятко Л. П. Иммуноморфологические особенности плацент при хронической плацентарной недостаточности // Актуальш питания педаатрн, акушерства та гшекологп. - Украина, Тернопшь. — 2013. - № 1. — С.196-198.

Список условных сокращений:

CD - молекулы дифференцировки лимфоидных клеток

РАМР - патоген-ассоциированные молекулярные образцы микроорганизмов (ПАМП) PCR - полимеразная цепная реакция

P1GF - плацентарный фактор роста, фактор роста плаценты (PLGF)

PRR - паттернраспознающие рецепторы (ПРР)

TLR - толл-подобный рецептор

TNF- фактор некроза опухоли

VEGF- васкуло-эндотелиальный фактор роста

АГ - антиген

AT - антитело

АФП - альфа- фетопротеин

ВУИ - внутриутробное инфицирование

ДО - децидуальная оболочка

ЗРП - задержка развития плода

ИФА - иммуноферментный анализ

OR - относительный риск

ПМП - противомикробные пептиды

ПН - плацентарная недостаточность

ПОНРП - преждевременная отслойка нормально расположенной плаценты

ПР- преждевременные роды

УЗИ - ультразвуковое исследование

ФПС - фетоплацентарная система

Подписано в печать 17.10.2013г. Формат 60x84 1/16 Печать цифровая. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Заказ №8146

ФГБУ "Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства им. В.Н. Городкова" Министерства здравоохранения Российской Федерации

Отпечатано в ООО «Арт Виста» г. Иваново, ул. 8 Марта, 32А