Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Клинико-иммунологическая эффективность аллергенспецифической иммунотерапии при атопическом дерматите

005010342

На правах рукописи --------------

Фирсова Елена Константиновна

КЛИНИКО-ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ АЛЛЕРГЕНСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ИММУНОТЕРАПИИ ПРИ АТОПИЧЕСКОМ ДЕРМАТИТЕ

14.03.09 —Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

9 ОЕЗ іС12

Челябинск-2012

005010342

Работа выполнена на кафедре иммунологии и аллергологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН

Защита состоится « 29 » Февраля 2012 года в 9.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Автореферат разослан «25» января 2012 г.

Климов Владимир Васильевич

Зима Анастасия Павловна

Пищальников Александр Юрьевич

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л.С. Латюшина

Общая характеристика работы Актуальность темы исследовании. В настоящее время одним из наиболее распространенных хронических рецидивирующих заболеваний кожи является атопический дерматит (АтД).

В эпидемиологическом аспекте 3-5% населения земного шара сталкиваются с проблемами, связанными с АтД. Показатели заболеваемости АтД среди детей в развитых странах колеблется от 4 до 37%. Среди взрослого населения выявлена низкая заболеваемость, которая составляет 0,2-2% в развитых странах [Wuthrich В., 1996]. Все это делает АтД большой медико-социальной проблемой [Хаитов P.M., 2002; Сергеев Ю.В., 2002; Короткий Н.Г., 2003].

В патогенезе АтД одно из ведущих мест отводится иммунологическим нарушениям. В последнее время в литературе стало уделяться много внимания цитокиновой составляющей аллергического воспалительного процесса [Козлов В.А., Сенникова С.В., 2004].

Иммунопатогенез атопического дерматита обусловлен нарушением баланса Thl/Th2 и профилей их цитокинов. В патогенезе АтД принимают участие цитокины с противоположным действием, которые продуцируются антагонистическими субпопуляциями ТЫ и Th2 лимфоцитов и другими регуляторными субпопуляциями (Treg, Trl, Thl7, Th22 и др.) [Chiricozzi А., 2009; Leung D.Y., 1999; Nograles K.E., 2009; Toda М., 2003]. Большое значение стало уделяться исследованию

процессов ремоделирования кожи при АтД - обратимой морфофункциональной перестройке, зависимой от активности разных цитокинов [Cruss C.J., 2003; Guttman-Yassky Е., 2009; Katayama I., 2002].

Как известно, для реализации IgE-зависимого иммунного ответа при АтД и проявления клинических симптомов необходимо воздействие различных неблагоприятных внешних и внутренних факторов, наиболее важное значение из которых имеют аэроаллергены. В большинстве случаев возникает аллергия к домашней пыли. Развитие сенсибилизации

больных АтД к клещам домашней пыли, пыльцевым аллергенам

обосновывает применение аллергенспецифической имуннотерапии (АСИТ) у таких больных. Являясь формой иммунопатологии, АтД требует

и иммунологических подходов в лечении больных, одним из которых является АСИТ причинно-значимыми аллергенами (ПЗА).

В настоящее время проведены многоцентровые плацебо-контролируемые рандомизированные исследования, показывающие эффективность АСИТ при АтД [АК'ажг-Сш^а Е., Во1^ие1 1, Сапошса еЫ. 2006; 01оуегМ.Т., 1992; Werfel Т., 2006]. Публикации, доступные в мировой литературе, в большинстве своем, демонстрируют положительный эффект этого единственного на сегодняшний день патогенетического метода лечения атопических заболеваний как в отношении респираторных симптомов, так и в отношении кожных проявлений у больных АтД. Изучение цитокинов «кожного окна» у пациентов с АтД на фоне АСИТ не проводилось. Большинство цитокинов обладают короткодистантным (аутокринным и паракринным) механизмом действия, поэтому наиболее обоснованным является их исследование на местном уровне.

Целью работы является установление клинико-иммунологичекой эффективности аллергенспецифической иммунотерапии при атопическом дерматите.

Задачи работы:

1. Определить спектр сенсибилизации больных атопическим дерматитом с точки зрения механизмов развития эпикутанной сенсибилизации.

2. Исследовать содержание 1Ь-4, Ш^-у, 1Ь-10 и 1Ь-17 в кожных экссудатах при различных формах и в периоды обострения и ремиссии атопического дерматита.

3. Оценить содержание 1Ь-4,1РК-у, 1Ь-10 и 1Ь-17 цитокинов в аспекте ремоделирования кожи при атопическом дерматите.

4. Провести сравнительную оценку содержания 1Ь-4, 1Ш-у, 1Ь-10 и 1Ь-17 в кожных экссудатах до и после проведения аллергенспецифической иммунотерапии.

5. Провести оценку аллергенспецифической иммунотерапии по данным электронной микроскопии кожи при атопическом дерматите.

Научная новизна

Впервые на основании сравнительного исследования с контрольными величинами получены результаты исследования ключевых цитокинов основных адаптивных иммунорегуляторных субпопуляций лимфоцитов при АтД на локальном уровне - в бесклеточной фракции экссудатов «кожного окна» после проведения АСИТ. Анализ результатов исследования подтверждает тот факт, что при АтД на уровне кожи отмечается дисбаланс иммунорегуляторных субпопуляцийТЫ, ТЬ2, ТЬ17 и Тг1 и других клеток, который модифицируется в ходе проводимой терапии. Показано, что в период обострения болезни в экссудатах «кожного окна» наблюдалась динамика к увеличению содержания 1Ь-4 и 1Ь-10 и снижение уровня ШМ-у. Согласно данным электронной микроскопии кожа характеризуется морфологическими изменениями, свидетельствующими о тканевом ремоделировании кожи при данной патологии. После проведения аллергенспецифической иммунотерапии в кожных экссудатах отмечается снижение 1Ь-4 и 1Ь-10, повышение ШМ-у, а на ультраструктурном уровне наблюдается частичное нивелирование признаков ремоделирования кожи.

Теоретическая и практическая значимость

Получены фундаментальные данные, свидетельствующие о модификации иммунорегуляции на локальном уровне в коже у больных АтД в результате АСИТ, и новые сведения о клинико-цитокиновых и клинико-морфологических параллелях у таких больных, дополняющие картину патогенетической роли 1Ь-4, 1Ь-10, 11_-17 и №К-у в развитии данной патологии в зависимости от распространенности кожного процесса в разные периоды заболевания.

Показана целесообразность включения в аллергологическое обследование больных АтД методов, направленных на выявление эпикутанной сенсибилизации. Определение локальных уровней цитокинов в кожном окне наряду с клиническими признаками может служить диагностическими критериями при АтД и терапевтическими критериями эффективности АСИТ.

Экспериментально обоснована возможность использования медицинской технологии «Способ оценки минимальной воспалительной

активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии" (патент на изобретение ФС №2010/217, 2010) для изучения критериев эффективности аллергенспецифической иммунотерапии у пациентов с АтД.

Доказана эффективность и безопасность АСИТ как патогенетически оправданного метода лечения пациентов с АтД, что позволяет включить его в число основных методов и изменить подход к терапии этих пациентов.

Основпые положения, выносимые па защиту:

1. Оценка содержания цитокинов в кожных экссудатах позволяет судить о функционировании иммунорегуляторных субпопуляций при атопическом дерматите на локальном уровне в шоковом органе - в коже.

2. Проведение аллергенспецифической иммунотерапии при атопическом дерматите даёт возможность восстанавливать баланс иммунорегуляторных субпопуляций клеток и на основе такой иммунореабилитации получать клинический эффект при данной патологии.

Внедрение результатов в практику

Результаты исследования широко используются в учебном процессе на кафедре иммунологии и аллергологии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации. Апробация работы

Материалы диссертации были доложены и обсуждены на научнопрактических конференциях: «Аллергология и клиническая иммунология - междисциплинарные проблемы» (Москва, 2008 г.); «Дни иммунологии в Сибири - 2008» (Томск, 2008 г.); на X Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», Томск, 2009 г.; наУН Российской Конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010 г.) и заседании проблемной комиссии «Клиническая иммунология и инфекционные болезни» СибГМУ (Томск, 2011 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 8 статей в изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов работ соискателей учёной степени кандидата наук, и 1 медицинская технология "Способ оценки минимальной воспалительной активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии" ФС №2010/217 от 10.06.2010.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, результатов исследования, заключения, выводов. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами, 17 рисунками. Список литературы включает 184 источника, из них 40 - отечественных и 144 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования. Основную группу

обследованных составили 105 пациентов (50 мужчины и 55 женщин) в возрасте от 18 до 54 лет с установленным диагнозом АтД. Диагностика АтД включала сбор жалоб, анамнеза жизни и заболевания. Диагноз АтД устанавливался на основании классических диагностических критериев J. Hanifin и G. Rajka [HanifinJ. М., 1980]. В соответствии с рабочей классификацией АтД учитывались: стадии заболевания, клинико-

морфологические формы, распространенность процесса на коже [Хаитов Р. М., 2002]. Степень тяжести заболевания оценивалась с учетом индекса SCORAD [Денисов Ю.М., 1999]. Аллерготестирование проводилась с использованием диагностических аллергенов производства ОАО

«Биомед» им И.И. Мечникова и лечебно-диагностических аллергенов производства Филиала ФГУП НПО «Микроген» (ФГУП «Аллерген», г. Ставрополь).

Все пациенты предварительно дали письменное согласие на участие в проводимом исследовании, которое было разработано биоэтическим комитетом Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и

социального развития Российской Федерации согласно Хельсинкской

декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации", утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. № 266.

В работе использовался метод «кожного окна» по J. Rebuck и J. Crowley [Фримель Г., 1987] в модификации В.В. Климова. На первом этапе исследование проводилось у пациентов с АтД в разные периоды заболевания, а затем у пациентов до и после АСИТ. В экссудатах «кожного окна» определялись цитокины, для которых характерны короткодистантные варианты аутокринного и паракринного действия на клетки-мишени - IFN-y, IL-4, IL-10 и IL-17. Для определения продукции данных цитокинов были использованы наборы для иммуноферментного анализа (ЗАО «Вектор-Бест», г. Новосибирск). Постановку ИФА проводили в соответствии с методическими рекомендациями производителя.

Для исследования методом трансмиссионной электронной микроскопии в качестве материала были использованы биоптаты кожи, взятые у пациентов в разные стадии АтД (табл. 1). В период обострения участок кожи иссекался с пораженного элемента, а в период ремиссии - с клинически здорового участка кожи.

Контрольную группу составили 20 практически здоровых доноров-добровольцев в возрасте 17-24 лет (табл. 1).

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с помощью пакета статистических программ «SPSS». Для представления количественных данных, не подчиняющихся нормальному закону распределения, применялись непараметрические критерии Краскал-Уолиса и Манна - Уитни. Различие двух сравниваемых величин считалось достоверным с надежностью Р>0,95. Анализ качественных данных проводился с помощью критерия у\ Анализ взаимосвязей для данных, не подчиняющихся нормальному закону распределения, проводился с помощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена [Гланц С., 1999; Наследов А., 2008].

Таблица 1

Общий объём проведённых исследований

Исследование Пациенты с АтД (п=105) Здоровые добровольцы(п=20)

Оценка по БСОКАБ 105 -

Кожное аллергологическое тестирование 105 20

Определение концентраций 1Ь-4, №N-7,1Ь-10 и 1Ь-17 в экссудате «кожного окна» 59 10

Электронная микроскопия кожи 5 1

Результаты исследования и их обсуждение.

После проведенного аллерготестирования у пациентов с АтД установлена сенсибилизация к аллергенам домашней пыли у 100% обследованных, а к аллергену DermatopIгagoidespteronissinus - у 93,3%, что подчёркивало её эпикутанный характер в популяции взрослых пациентов с АтД (табл.2).

Проведен анализ клинико-анамнестических данных по многим показателям: возраст пациента; пол; период начала заболевания; клиникоморфологическая форма АтД; степень тяжести и распространенность кожного процесса.

В данной выборке заболевание встречалось у мужчин и женщин примерно в равном соотношении. Средний возраст пациентов составил 30,7±2,6 лет. У подавляющего большинства пациентов болезнь стартовала в детском возрасте, причём чаще всего - до 3 лет (61,9%), что отражает наличие в основе данной патологии атопической конституции как особого полигенно наследуемого состояния.

В выборке преобладали эритематозно-сквамозная форма (56,2%) и эритематозно-сквамозная с лихенификацией (40,0%). При распределении пациентов в зависимости от распространённости процесса на коже, выяснилось, что наиболее часто встречалась ограниченно-локализованная

Таблица 2

Результаты скарификационного кожного тестирования у больных АтД

Вид аллергена Число больных (гг=105)

++++ +++ ++ + Всего

Dermatophagoidespteronissinus 24 44 28 2 98 (93,3%)

Домашняя пыль 24 49 26 6 105 (100%)

Библиотечная пыль 11 16 23 1 51 (48,6%)

Перо подушек 6 10 16 2 34 (32,4%)

Эпидермальные аллергены 3 6 11 3 23 (21,9%)

Пыльца деревьев 1 1 5 4 11 (10,5%)

Пыльца злаковых трав 2 1 8 4 15(14,3%)

Пыльца сорных трав 2 2 8 3 15 (14,3%)

Пищевые аллергены - 1 3 3 8 (6,7%)

форма АтД (66,7%). Чаще встречались больные со средне-тяжёлой (48,6%) и лёгкой формой болезни (32,4%). В среднем индекс 5 СОЯ А О в остром периоде составил 35,43 ± 9,27 баллов.

Было проведено исследование клинической эффективности АСИТ у пациентов с АтД. Из всех исследованных пациентов с АтД, находящихся в стадии ремиссии, методом случайной выборки было отобрано 18 человек в возрасте от 18 до 25 лет для проведения АСИТ (группа наблюдения). При оценке степени тяжести индекс 8С(ЖАЭ в этой группе больных находился в пределах от 2,9 до 15,4 и в среднем составлял 6,12 ± 1,1. Также методом случайной выборки было отобрано 20 пациентов — группа сравнения, в которой АСИТ не проводилась. По большинству клинических характеристик она была сопоставима с группой наблюдения. Индекс БССЖАВ у этих больных колебался в пределах 2,7-14,9 и в среднем составлял 6,07 ± 1,0. 18 пациентов с АтД проведён курс АСИТ, но полный курс прошли только 16 человек, так как при проведении лечения у 2 человек возникли обострения основного заболевания. АСИТ проводилась ПЗА согласно спектру сенсибилизации.

Клиническая эффективность АСИТ у больных АД нами оценивалась по ряду показателей: по динамике клинической картины (исчезновению

клинических проявлений заболевания или уменьшению их интенсивности), стабильности ремиссии, индексу БСОК/М). Величина этого индекса оценивалась до начала проведения АСИТ и на 30 сутки после выхода на поддерживающую дозу. Таким образом видно, что значение индекса БСОЯАО достоверно (р<0,05) снижается и составляет в среднем до начала терапии 6,12 + 1,1, а после лечения - 2,36 ± 0,18. В группе сравнения индекс ЗССЖАО достоверно не менялся (табл. 3).

Таблица 3

Изменение индекса БСОЯАО у пациентов с атопическим дерматитом до и после проведения специфической иммунотерапии (Х±т)

Группы Индекс БСОЯЛО

Группа наблюдения (больные, которым проводилась АСИТ) Группа сравнения (больные, которым не проводилась АСИТ)

До проведения АСИТ 6,12 ±1,1 6,07 ± 1,0

После проведения 2,36 ±0,18 5,05 ± 1,0

АСИТ 43 Л о о р>0,05

В катамнезе ремиссия в группе наблюдения длилась в среднем 12,5 ± 1,2 месяца, а в группе сравнения - только 6,3 ± 0,5 месяца (р<0,05).

Таким образом, проведение АСИТ приводит к стабилизации клинической ремиссии, уменьшению индекса ЗСОИАБ, а значит и улучшает качество жизни пациентов с АтД. Полученные положительные клинические результаты подтверждают высокую эффективность данного метода АСИТ и соответствуют данным официального документа ВОЗ (2007).

На следующем этапе работы проводилось исследование цитокинов «кожного окна» у пациентов в разные периоды заболевания, а также пациентов групп сравнения и наблюдения до и после АСИТ.

У всех пациентов в остром периоде камеры устанавливались на поражённые участки кожи. Полученные результаты отражены в таблице 4.

Таблица 4

Содержание 1Ь-4, №N-7,11.-10 и 1Ь-17 в экссудате «кожного окна» у здоровых лиц и пациентов с АтД в динамике процесса, Ме ((}1-()3)

Группа 1Ь-4 1ТО-у 1Ь-10 1И7

(пг/мл) (пг/мл) (пг/мл) (пг/мл)

Контроль 0,45 (0,4-0,7) п=10 46 (35,5-51,75) п=10 7 (3,5-13,5) п=10 23 (7,75-34,55) п=8

Больные АтД, период обострения 0,85 (0,4-1,2) п=31 р1 36 (20-65,7) п=36 27 (10-60,5) п=24 Р1 15,5 (7-29) п=32

Больные АтД, период ремиссии 0,8 (0,4-0,97) п=13 Р1 15,5 (10,3—41,5) п=13 р1,р2 27 (20-35) 11=10 Р1 24 (13,5-36,7) п=17

Ме - медиана,

01 - первый квартиль,

<33 - третий квартиль,

р1 - достоверность различий в сравнении с контрольной группой (р<0,05), р2 — достоверность различий в сравнении с периодом обострения АтД(р<0,05)

При анализе данных, полученных в период обострения АтД, было отмечено, что ведущими изменениями в цитокиновом профиле, на локальном уровне, у пациентов можно считать достоверное повышение содержания 1Ь-4 и 1Ь-10 в экссудатах «кожного окна» по отношению к контрольным величинам (р<0,05). В отношении ключевых цитокинов ТЫ-клеток и ТЫ7-клеток, была обнаружена тенденция к снижению уровней №N-7 и 1Ь-17 в экссудатах «кожного окна» у пациентов с АтД, но данные имели недостоверный характер различий в сравнении с контролем.

Наблюдающаяся тенденция к снижению уровней №N-7 и ГЬ-17 в период обострения и одновременное повышение уровней 11,-4 и 1Ь-10 в экссудатах «кожного окна» в этот же период может свидетельствовать о том, что происходит подавление функциональной активности ТЫ и

Thl 7 - лимфоцитов на фоне повышения функциональной активности Th2 и Tr 1 -клеток. Повышение уровня 1L-4 в период обострения можно объяснить тем, что этот цитокин относится к основным пусковым медиаторам атопического воспаления, регулируемого Т112-клетками и выполняет ключевую роль в продукции lgE.

Со стороны Thl звена отмечается тенденция к снижению продукции IFN-y. Так как Thl- и Th2-лимфоциты находятся в реципрокных отношениях, и преимущественная активация одного звена угнетает функциональную активность другого, то в период обострения АтД выявляется недостаточная активность Thl-клеток и снижение продукции ими IFN-y.

Динамика ключевых цитокинов Thl- и ТЬ2-клеток свидетельствует о дисбалансе иммунных реакций в сторону избыточной активации ТЬ2-пути, что соответствует классическим представлениям об иммунопатогенезе атопического воспаления [Leung D.Y., 2004].

В отношении концентрации 1L-10 в период обострения АтД у пациентов двух исследуемых групп отмечено увеличение данного показателя по сравнению с контролем. Известно, что IL-10 продуцируется другой иммунорегуляторной субпопуляцией Т-клеток - Тг1, а также дендритными клетками, ТЬ2-лимфоцитами и др. [Lan R.Y., 2005; Mocellin S., 2003]. Полученные результаты отражают повышенную активность Trl-клеток, что, возможно, связано с их участием в регуляции аллергического воспаления в коже.

Показатель IL-17 в период обострения АтД у пациентов основной группы и группы сравнения имел тенденцию к снижению. Уменьшение уровня данного цитокина в экссудатах «кожного окна», вероятно, может быть связано с антагонистическим влиянием цитокинов Th2-лимфоцитов.

В период ремиссии АтД в основной группе и группе сравнения были отмечены достоверно более высокие уровни IL-4 и IL-10 и достоверно более низкая концентрация IFN-y по отношению к контролю (р<0,05). Колебания уровня IL-17 в периоде ремиссии, как и в периоде обострения, достоверно не отличались от контроля.

Низкий уровень IFN-y совпадает с высоким уровнем IL-4, что указывает на сохраняющийся дисбаланса Thl/Th2 в сторону избыточной активации ТЬ2-клеток в период ремиссии. Данный факт может

свидетельствовать о том, что у пациентов даже при отсутствии клинических проявлений АтД в: коже присутствует резидуальная воспалительная активность, регулируемая ТЪ2-лимфоцитами.

Это соответствует современной концепции о минимальной воспалительной активности в коже, сохраняющейся в период ремиссии АтД в участках видимо неизмененной кожи [Leung D. Y., 2000].

Далее, для исследования зависимости концентраций цитокинов от конкретных участков кожи (условно здорового или лихенифицированного), на которые устанавливали камеру, сделан анализ, (табл. 5), учитывающий данные по содержанию цитокинов кожного экссудата в разных местах установки камеры.

Таблица 5

Содержание IL-4, IFN-y,IL-10 и IL-17 в экссудате «кожного окна» у здоровых лиц и пациентов с АтД в периоде ремиссии в зависимости от места установки камеры, Me (Q1-Q3)

Группа IL-4 IFN-y IL-10 IL-17

(пг/мл) (пг/мл) (пг/мл) (пг/мл)

Контроль 0,45 46 7 23

(0,4-0,7) (35,5-51,75) (3,5-13,5) (7,75-34,55)

п=10 п=10 п=10 п=8

Здоровый участок 0,5 27,6 11,6 22

кожи в периоде (0,14-0,97) (22-44) (10-22) (11,5-36,7)

ремиссии п=7 п=6 п=5 п=7

Участок 0,95 31 37,5 15

лихенификации в (0,4-1,2) (10,3-65,7) (30-65,5) (7-29)

периоде ремиссии п=6 п=7 п=5 п=10

Pt Pi pl,p2

Ме - медиана,

01 - первый квартиль,

С?3 - третий квартиль,

р1 - достоверность различий в сравнении с контрольной группой (р<0,05), р2 - достоверность различий в сравнении со здоровым участком кожи в периоде ремиссии (р<0,05)

Как видно из таблицы, место установки камеры влияет только на IL-10, содержание которого существенно возрастает в очагах лихенификации по сравнению со здоровыми участками кожи. Это согласовывается с особенной ролью IL-10 в аллергических процессах. IL-10 вырабатывается многими видами клеток (Th2, Trl, дендритные клетки и др.) и, по-видимому, многие из них вовлечены в процессы ремоделирования кожи.

Таким образом, в периоде ремиссии АтД отмечается повышение IL-4 и снижение IFN-y - изменения, характерные также для острого периода болезни и отражающие атопический характер патологии с поляризацией в сторону Th2. В очагах лихенификации по сравнению со здоровыми участками кожи отмечается повышение содержания IL-10, что может свидетельствовать о важной роли данного цитокина в процессах ремоделирования кожи при АтД.

Для оценки влияния АСИТ на содержание цитокинов в кожных экссудатах проведено исследование у тех же пациентов, у которых оценивались клинические параметры: в группе наблюдения (п=16) и группе сравнения (п=20). Результаты отражены в табл. 6.

Как видно из таблицы, проведение АСИТ приводило к снижению содержания IL-4, повышению содержания IFN-y и снижение IL-10. Изменения IL-17 были недостоверными, хотя отмечалась тенденция к повышению IL-17 после АСИТ.

Полученные нами результаты не противоречат данным других исследователей. Так, по наблюдениям авторов [Шубич М. Г., 1997], на 15 и на 90 день после проведения ускоренного курса АСИТ уменьшается число клеток, экспрессирующих мРНК IL-4 при стимуляции клеток in vitro. Повышение содержания IFN-y в кожных экссудатах можно объяснить одним из известных механизмов АСИТ. В основе этого механизма лежит то, что в результате проведения АСИТ происходит смещение равновесия от ТЬ2-клеток в сторону Thl-клеток, а соответственно изменяется и наработка цитокинов этих клеток, то есть происходит увеличение IFN-y [Цветкова Л.Н., 2000].

Не исключено, что АСИТ оказывая тормозящее влияние на вызванную аллергеном продукцию цитокинов воспаления, а именно IL-4,

способствует активации иммунорегуляторных субпопуляций другого уровня: ТЫ 7 и Т1т22.

Таблица 6

Содержание 1Ь-4, №N-7,1Ь-10 и 1Ь-17 в кожных экссудатах до и после

асит, ме (д1-дз)

Группа 1Ь-4 гга-у 1Ь-10 11Л7

(пг/мл) (пг/мл) (пг/мл) (пг/мл)

Контроль 0,45 (0,4—0,7) 11=10 46 (35,5-51,75) п=10 7 (3,5-13,5) 11=10 23 (7,75-34,55) п=8

Группа наблюдения: - до АСИТ п=15 0,95 (0,9-1,2) Р1 п=15 31 (16,25-35,5) Р1 п=8 27 (19-34) Р1 п=14 24 (13,3-35,6)

- после АСИТ 0,6 (0,4-1,0) 44 (34-57) р2 13 (9-21) р2 29,5 (17,62-44,7)

Группа сравнения: - до лечения 11=10 0,91 (0,8-1,3) Р1 п=10 32 (16,3-36,5) Р1 п=7 26 (20-33) Р1 11=7 24 (13,1-36,6)

- после лечения 0,66 (0,26-0,8) 31 (34,5-37,8) р1> рЗ 27 (20-35) р1,рЗ 25 (15,1-38,2)

Ме - медиана,

<31 - первый квартиль,

<33 - третий квартиль,

р1 - достоверность различий в сравнении с контрольной группой (р<0,05), р2 - достоверность различий в сравнении с периодом обострения АтД(р<0,05) рЗ - достоверность различий в сравнении с периодом ремиссии АтД (р<0,05)

Это находит подтверждение в том факте, что нами наблюдалась тенденция к увеличению содержания в кожных экссудатах 1Ь-17 после проведения АСИТ.

Наблюдаемое нами снижение содержания IL-10 после АСИТ может быть объяснено нивелированием процессов ремоделирования кожи, т.к. известно, что цитокины семейства IL-10 (включая IL-22) являются важными факторами процессов ремоделирования [Boniface К., 2005; Rich В.Е., 2001; Sa S.M., 2007].

Таким образом, выявленное в кожных экссудатах повышение IFN-y, снижение IL-10 и тенденция нарастания IL-17 после проведения АСИТ может быть отражением перестройки работы соответствующих иммунорегуляторных клеток, направленной на индукцию толерантности к ПЗА и нивелирование ремоделирования кожи.

Электронная микроскопия проведена у 5 пациентов с АтД в динамике воспалительного процесса и после проведения АСИТ и у 1 здорового лица.

При обострении АтД реактивные изменения клеточных форм характеризуются существенными отличиями от контроля. Отмечается уменьшение количества клеточных слоев рогового слоя и пластов межклеточных липидов, следствием чего является резкое увеличение трансэпидермальной потери воды, что клинически, как известно, проявляется истончением, сухостью и ксерозом кожи. Отмечается инфильтрация мононуклеарными лейкоцитами дермы и базальных слоев эпидермиса. Под электронным микроскопом обнаруживаются активированные формы мононуклеаров, характеризующиеся наличием лопастного ядра с глубокими инвагинациями кариолеммы, многочисленных микроворсинок на поверхности клетки, первичных и вторичных лизосом в цитоплазме.

Имеет место увеличение количества тканевых базофилов в сосочковом и сетчатом слоях, особенно по ходу кровеносных капилляров. Нередки дегранулирующие клетки. Ультраструктурная организация фибробластов характеризуется выраженным лизосомальным аппаратом. Часть описываемых клеток можно отнести к стареющим, дегенерирующим, а часть, вероятно, являются фиброкластами, судя по наличию в их цитоплазме фагосом с коллагеном. Активно синтезирующих фибробластов практически нет, большинство клеток отличаются низким содержанием белоксинтетических органелл. Коллагеновые волокна утолщены, гомогенизированы в сосочковом слое, у некоторых утрачена

поперечная нсчерченность, но значительная часть из них сохраняет нормальную ультраструктуру.

Описанные электронномикроскопические в стадию обострения АтД признаки совпадают с данными литературы [Белоусова, Т.А., Горячкина, М.В., Филиппова, В.А., 2009; Chamlin S.L., Као J., Frieden IJ. et al., 2002; Zhang X., 2010].

Таким образом, в период обострения АтД под электронным микроскопом определяются признаки выраженного воспалительного процесса в коже: отёк соединительной ткани, уменьшение количества клеточных слоев рогового слоя и пластов межклеточных липидов, наличие активированных форм мононуклеаров с лопастным ядром, повышение числа тканевых базофилов в сосочковом и сетчатом слоях, преобладание фибробластов с высоким содержанием лизосом и низким числом белоксинтетических органелл.

При электронной микроскопии эпидермиса пациентов с АтД в стадии ремиссии наблюдаются уменьшение количества клеточных слоев рогового слоя и пластов межклеточных липидов. Отмечаются выраженные проявления акангоза. Эпидермис утолщен и формирует тяжи в сосочковый слой. В базальном и шиповатом слоях отмечается некоторое расширение межклеточных пространств. В большинстве клеток видны многочисленные тонофибриллы. В тонких клеточных отростках вблизи десмосом нередко обнаруживается мелко гранулярный материал, возможно являющийся следствием деструктивных процессов.

В значительной части эпителиоцитов росткового слоя наблюдается вакуолизация цитоплазмы, которая чаще всего возникает в результате деструкции митохондрий. В базальном и шиповатом слоях удаётся наблюдать клетки Лангерганса.

В соединительной ткани дермы на полутонких срезах обнаруживаются отечные изменения, хотя и менее выраженные, чем в период обострения. Коллагеновые волокна утолщены, гомогенизированы в сосочковом слое.

Под электронным микроскопом видно, что коллагеновые фибриллы изменены: большая часть из них утрачивает характерную поперечную исчерченность.

Характерно, что изменения со стороны коллагеновых фибрилл более выражены, чем в периоде обострения. На некоторых участках сосочкового слоя и базальной мембраны имеют место явления фиброза и гиалиноза.

В клеточном составе дермы наблюдаются изменения, проявляющиеся умеренной лимфоцитарной инфильтрацией, особенно на границе сосочкового и сетчатого слоев. Отмечается увеличение стареющих форм фибробластов, которые отличаются пикноморфными изменениями в виде повышенной базофилии и электронной плотности цитоплазмы и ядра, деформацией, сморщиванием клеточного тела и отростков.

Описанные электронномикроскопические в стадию ремиссии АтД признаки совпадают с данными литературы [Белоусова Т.А., Горячкина М.В., Филиппова В.А., 2009; Chamlin S.L., Као J., Frieden I.J. et al., 2002; Schafer Т., 2000].

Таким образом, у пациентов в периоде ремиссии во внешне здоровом участке кожи на ультраструктурном уровне описываются следующие особенности, характеризующие ремоделирование кожи при АтД: выраженный акантоз, изменение коллагеновых фибрилл с утратой ими поперечной исчерчениости, умеренная лимфоцитарная инфильтрация, увеличение стареющих форм фибробластов с пикноморфными изменениями в виде повышенной базофилии и электронной плотности цитоплазмы и ядра, фиброз и гиалиноз сосочкового слоя и базальной мембраны.

У пациентов, которым проводилась АСИТ, в кератиноцитах базального и шиповатого слоев зарегистрированы отчетливая редукция ядрышек, уменьшение площади цитоплазмы, деструктивные нарушения части тонофибрилл. Содержание органелл в цитоплазме не выявлено. Сравнительно небольшое количество митохондрий, единичные цистерны гранулярной эт (доп лаз магической сети дислоцируется в узкой околоядерной зоне. В некоторых кератиноцитах росткового слоя обнаруживаются очаговые скопления меланосом, в основном в околоядерной зоне, а содержание тонофибрилл значительно уменьшено, они рассредоточены и и неупорядоченно рассеяны в цитоплазме. Количество десмосом в межклеточных сопряжениях кератиноцитов

уменьшено, на некоторых участках они деструктивно изменены и почти полностью отсутствуют.

В соединительной ткани дермы весьма часто обнаруживаются пикноморфные фибробласты. На отдельных участках сосочкового слоя и базальной пластинки имеют место явления фиброза и гиалиноза. Часто наблюдаются формы фибробластов с большим количеством фагосом в цитоплазме. Выражены проявления фиброклазии. Вместе с тем основная масса коллагеновых фибрилл имеют обычную ультраструктуру, нет лимфоцитарной инфильтрации.

Описанные особенности ультраструктуры кожи у больных АтД, которым проводилась АСИТ, по-видимому, являются оригинальными, поскольку нам не удалось найти сопоставимых литературных источников.

Таким образом, у пациентов, получавших АСИТ, в отличие от лиц, которым АСИТ не проводилась, в коже отсутствуют маркёры активации белоксинтетической функции, отмечается нормальная структура коллагеновых волокон, отсутствует лимфоцитарная инфильтрация, но на отдельных участках, как и в группе сравнения, имеются явления фиброза, гиалиноза, фиброклазии, деструкции десмосом. Следовательно, по данным электронной микроскопии кожи проведение одного курса АСИТ приводит лишь частично к шшелированию процессов ремоделирования кожи.

Выводы

1. У больных с атопическим дерматитом 100% выявление кожных реакций к аэроаллергенами (домашняя пыль, Вегтак)р1^о1(1е5Гаппае) свидетельствует об эпикутанном характере сенсибилиации.

2. В остром периоде атопического дерматита в кожных экссудатах наблюдается повышение содержания 1Ь-4 и 1Ь-10 в экссудатах кожного окна при средне-тяжёлой и тяжёлой формах и снижение ТРИ-у при тяжёлой формах болезни, что свидетельствует о дисбалансе ТЬ1 /ТИ2 в сторону поляризации ТЬ2 и важной роли 1Ь-4, 1Р]\'-у и 1Ь-10 в регуляции интенсивности атопического воспаления.

3. В периоде ремиссии атопического дерматита сохраняется повышение в кожных экссудатах содержания 1Ь-4 и снижение содержания №N-7. В очагах лихенификации по сравнению со здоровыми участками кожи отмечается повышение содержания 1Ь-10, что может свидетельствовать о важной роли данного цитокина в процессах ремоделирования кожи при данной патологии.

4. Проведение аллергенспецифической иммунотерапии приводит к стабилизации клинической ремиссии, уменьшению индекса 8СОТ1АП, в кожных экссудатах снижению содержания 1Ь-4 и 1Ь-10, повышению содержания №N-7, что свидетельствует о модификации иммунорегуляции на локальном уровне в коже после иммунотерапии.

5. По данным электронной микроскопии проведение аллергенспецифической иммунотерапии способствует частичному нивелированию процессов ремоделирования кожи, а именно восстановлению структуры коллагеновых волокон, исчезновению лимфоцитарной инфильтрации и маркёров активации белковосинтетической функции в клетках кожи.

Практические рекомендации

1. Целесообразно исследовать локальные уровни цитокинов в кожном окне при атопическом дерматите для определения резидуальной воспалительной активности в коже в периоде ремиссии.

2. Больным с атопическим дерматитом рекомендуется в качестве

дополнительного метода лечения проведение

аллергенспецифической иммунотерапии причинно-значимыми аллергенами. Наряду с традиционными методами терапии, необходимо включение данного метода в стандартизированный “Протокол ведения больных АтД”.

Список работ, опубликованных но теме диссертации

1. Денисов, А.А. Содержание ИЛ-4 и пнтерферона-у в крови и кожном экссудате в ходе проведения аллергенспецифической иммунотерапии при атопическом дерматите /А.А. Денисов, В.В. Климов, Е.К. Фнрсова и др. // Бюллетень Сибирского отделения Российский академии медицинских наук.-2010. - Том 30, №5. - С.11-13.

2. Саликова, Т.И. Ключевые цитокины Тх1 и Тх2 в крови и кожном экссудате при атопическом дерматите / Т.И. Саликова,

B.В. Климов, А.А. Денисов, Д.С. Загрешенко, Е.К. Фнрсова //Российский аллергологический журнал. - 2008. - Прнл. 1, №1. -

C.253-254.

3. Загрешенко, Д.С. Цитокины «кожного окна» при атопическом дерматите / Д.С. Загрешенко, В.В. Климов, А.А. Денисов, Т.И. Саликова, Е.К. Фнрсова // Бюллетень сибирской медицины. -2009. - №3. - С. 32-36.

4. Денисов, А.А. Содержание цнтокинов в кожных экссудатах при атоническом дерматите как психосоматическом заболевании /

A.А. Денисов, Д.С. Загрешенко, В.В. Климов, Т.И. Саликова, Е.К. Фнрсова//Сиб11рск11Й вестник психиатрии и наркологии. -2009. -№5 (56). - С. 67-69.

5. Саликова, Т.И. Расположение клеток Лангерганса в слоях эпидермиса при атопическом дерматите / Т.И. Саликова,

B.В. Климов, А.А. Денисов, Е.К. Фнрсова, Д.С. Загрешенко// Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2010. - № 2/1 (29).-С. 198-199.

6. Медицинская технология «Способ оценки минимальной воспалительной активности кожи при атопическом дерматите в стадии ремиссии»/ В.В. Климов, А.А. Денисов, Е.К. Фирсова, Т.И. Саликова, Д.С. Загрешенко//ФС№2010/217, опубл. 10.06.2010.- С.5.

7.Фирсова, Е.К. Цитокины «кожного окна» у больных атопическим дерматитом в зависимости от величины БСОНАО/Е.К. Фирсова, Д.С. Загрешенко// Сб. трудов X Международного конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке». - Томск, 2009. - С. 31-32.

8. Саликова, Т.И. Клеточно-цитокииовые ассоциации при атопическом дерматите / Т.И. Саликова, В.В. Климов, Т.В. Кошовкина, А.А. Денисов, Н.С. Кошкарова, Е.К. Фирсова // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Том 2(11), № 2-3. -

С. 217.

9. Саликова, Т.И. Делеция в гене филаггрина в популяции больных атопическим дерматитом в городе Томске / Т.И. Саликова,

В.В. Климов, А.А. Денисов, Е.К. Фирсова//Сибирский медицинский журнал. - 2008. - Том 23, №3. - С.111.

10. Денисов, А.А. ІЬ-4, ІГїХ-у, 1Ь-10 и 1Ь-17 кожных экссудатов как диагностические критерии ремоделирования кожи при атопическом дерматите /А.А. Денисов, В.В. Климов, Е.К. Фирсова //Цитокины и воспаление. - 2011. - Т.10. - №3. - С.23-25.

Перечень принятых сокращений

АтД — атопический дерматит

АСИТ - аллерген специфическая иммунотерапия

ПЗА - причинно-значимые аллергены

1Ь - интерлейкины

№N-7 - интерферон-гамма

БСОЯАО -шкала оценки степени тяжести атопического дерматита

ТЫ - Т-хелперы типа 1

ТЪ2 - Т-хелперы типа 2

ТЫ 7 - Т-хелперы 17

Тг1 - Т-регуляторы 1

Тге§ - регуляторные Т-клетки

Подписано к печати 23.01.2012 г. Формат 60х84|/16. Печать ризография. Бумага офсетная № 1.

Гарнитура «Times».

Тираж 100 экз. Заказ № 83.

Тираж отпечатан в типографии «Иван Фёдоров» 634026, г. Томск, ул. Розы Люксембург, 115/1 тел.: (3822) 40-71-24, тел./факс: (3822) 40-79-55 E-mail: mail@if.tomsk.ru