Автореферат и диссертация по медицине (14.01.11) на тему:Клинико-фармакогенетический анализ результатов длительного лечения больных рассеянным склерозом с использованием глатирамера ацетата

На правах рукописи

Щур Сергей Геннадьевич

КЛИНИКО-ФАРМАКОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ДЛИТЕЛЬНОГО ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ РАССЕЯННЫМ СКЛЕРОЗОМ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ГЛАТИРАМЕРА АЦЕТАТА

14.01.11 - Нервные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

г дпр 2013

Москва - 2013

005057840

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Бойко Алексей Николаевич

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Фаворова Ольга Олеговна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой неврологии и нейрохирургии лечебного факультета

ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава России Ллифирова Валентина Михайловна

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой нервных болезней, медицинской генетики и нейрохирургии

ГБОУ ВПО ЯГМА Минздрава России Спирин Николай Николаевич

Ведущая организация:

ГБУЗ МО «Московский областной научно-исследовательский клинический институт им. М.Ф. Владимировского» по адресу: 129110, г. Москва ул. Щепкина, д.61/1

Защита состоится « »_2013 года в _часов

на заседании диссертационного совета Д 208.072.09 на базе ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1, зал ученого совета

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И. Пирогова Министерства здравоохранения РФ по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1

Автореферат разослан «_»_2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Л.В. Губский

. - ■ Общая характеристика работы - • Актуальность темы

Рассеянный склероз (PC) - широко распространенное заболевание ЦНС, которое преимущественно поражает лиц молодого возраста и приводит к их инвалидизации.

В России уже длительное время реализуются государственные и региональные программы по обеспечению больных с этим диагнозом эффективными иммуномодулирующими препаратами, изменяющими течение PC (ПИТРС). К одним из этих препаратов относится глатирамера ацетат (ГА), назначаемый при ремитирующем течение рассеянного склероза (РРС). В настоящее время накоплен 5 и 10-летний опыт позитивного использования этого препарата [Бойко А.Н. и соавт. 2007, 2012]. В то же время степень влияния ГА на течение PC может варьировать у разных больных. Имеется группа пациентов, резистентных к данному виду лечения.

Один из возможных путей раннего прогноза эффективности и безопасности терапии, оптимизации лечения - фармакогенетические исследования. Первые результаты таких исследований по результатам использования ГА при PC оказались противоречивы. Показано, что носительство аллеля DRB1* 1501 достоверно ассоциировано с улучшением течения PC и с уменьшением частоты обострений после лечения ГА [Fusco C.et. al., 2001; Gross R. et al., 2010]. В другом исследовании отмечено отсутствие значимой ассоциации носительства этого аллеля с ответом на лечение ГА [Grossman I. et al., 2007]. Все предшествующие исследования проводились на небольших группах больных, используя различные клинические критерии оптимального и неоптимального ответа, изучались разные генетические маркеры. В настоящее время в Москве имеется опыт длительного использования ГА при PC на большом числе больных, проведены генетические исследования, создан банк ДНК пациентов, что впервые позволило провести комплексное фармакогенетическое исследование. Учитывая высокую стоимость ГА и важность раннего начала иммуномодулирующего лечения с использованием ПИТРС, максимально эффективного в каждом конкретном случае, т.е. персонализированный подход к назначению препаратов, фармакогенетический анализ результатов использования ГА при PC представляются весьма актуальным.

Цель исследования

Поиск иммуногенетических маркеров позитивного и/или негативного эффекта ГА на основе сопоставления клинических эффектов и иммуногенетических характеристик больных PC, длительно получавших этот вид лечения.

Задачи исследования:

1. Анализ данных длительного клинического наблюдения за больными Московской популяции, получавших ГА (частота обострений, динамика шкалы EDSS) и выделение группы с оптимальным ответом на терапию;

2. Анализ результатов геномного типирования ДНК больных PC, получавших ГА, по 9 полиморфным локусам генов иммунного ответа: гена, кодирующего бета-цепи молекул ГКГ класса II (DRB1); гена, кодирующего антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4); 4 генов, кодирующих важные провоспалительные и антивоспалительные цитокины, а именно генов трансформирующего фактора роста бета 1 (TGFB1), интерферона-гамма (IFNG), фактора некроза опухолей (TNF) и интерферона-бета (1FNB1) и 3 генов рецепторов цитокинов и хемокинов, а именно генов первой субъединицы рецептора интерферонов типа I (IFNAR1), альфа-субъединицы рецептора интерлейкина 7 (1L7RA) и рецептора хемокинов-5 (CCR5);

3. Сопоставление результатов анализа клинических данных и результатов геномного типирования ДНК больных PC, длительно получавших ГА, направленное на выявление ассоциаций между оптимальным клиническим эффектом ГА и генотипом пациента;

4. Оценка возможности прогнозирования результатов лечения больных PC глатирамера ацетатом на основе генотипирования по 9 предложенным локусам.

Научная новизна

Впервые в России проведен клинико-фармакогенетический анализ одновременно по нескольким полиморфным локусам генов иммунного ответа результатов длительного применения ГА у большого числа пациентов с РРС русской этнической принадлежности. Выделены максимально приближенные к практической деятельности критерии эффективности терапии у пациентов с PC, длительно использовавших ГА. Показано, что в формирование ответа больных PC на лечение ГА существенный вклад вносят полиморфные локусы генов DRB1 и CCR5. Частоты аллелей этих генов ассоциированы с различной эффективностью ГА. Впервые в России выявлены как позитивные (для аллелей CCR5*\v, DRB1*4 и DRB1* 13), так и негативные (для аллеля CCR5* d) значимые ассоциации аллельных частот с оптимальным ответом больных PC на терапию ГА. Выявленные клинико-генетические ассоциации имеют большое значение для понимания патогенеза PC, особенностей реакций иммунной системы больных в ответ на регулярное введение ГА, на возможности прогнозирования клинического ответа.

Практическая значимость работы

Проведенное исследование показало наличие возможных генетических предикторов как оптимального, так и не оптимального клинического ответа на терапию ГА у больных PC русской этнической принадлежности. Оценена прогностическая значимость различных генетических маркеров для изучения фармакогенетики ответа на курс ГА. В частности, показана информативность исследования генов DRB1 и CCR5, определенные аллели которых имеют как позитивные, так и негативные ассоциации с оптимальным ответом на длительный курс лечения, так и малоинформативные маркеры - гены CTLA4, TGFB1, IFNG, TNF, IFNBI, IFNAR1 и IL7RA. Результаты работы могут быть включены в состав тестов для индивидуализации терапии ПИТРС и повышения ее эффективности, улучшат фармако-экономические показатели длительного лечения пациентов с PC за счет раннего прогнозирования ответа на терапию.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Выявлена связь полиморфных вариантов генов CCR5 и DRB1 в формировании

ответа на длительную терапию ГА пациентов с PC русской этнической принадлежности;

2. Не выявлена достоверная связь между полиморфными вариантами генов TNF,

TGFBJ, CTLA4, IFNG, IFNBI, IFNAR1, IL7RA с эффективностью длительной терапии ГА пациентов с PC русской этнической принадлежности;

3. Носительство аллелей DRB1*4 и/или DRB1* 13, CCR5*\v или CCRS*d можно

рассматривать как генетический предиктор при решении вопроса о выборе ГА как препарата из группы ПИТРС.

Внедрение в практику Результаты исследования внедрены в практическую деятельность Московского городского центра рассеянного склероза на базе ГБУЗ «ГКБ № 11 ДЗМ» и окружного неврологического отделения ГБУЗ «ГП №69 ДЗМ». Материалы диссертации включены в тематику лекций и практических занятий для студентов, клинических ординаторов и врачей-неврологов на кафедре неврологии и нейрохирургии лечебного факультета РНИМУ им. Н.И. Пирогова.

Апробация диссертации Материалы диссертации были предложены и рекомендованы к защите на совместной научно-практической конференции кафедры неврологии и нейрохирургии лечебного факультета ГБОУ ВПО РНИМУ им Н.И.Пирогова Минздрава России и сотрудников неврологических отделений №12 и №13 ГКБ №1

имени Н.И. Пирогова г. Москвы от 20.03.2012 года. Основные положения работы были изложены на научно-практической конференции с международным участием «Современные проблемы рассеянного склероза: теория и практика» (Казань, 2010), на X Всероссийском съезде неврологов (Нижний Новгород, 2012).

Публикации по теме диссертации: По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ в центральных медицинских изданиях, в том числе 5 - в ведущих рецензируемых научных журналах, определенных ВАК.

Структура и объем диссертации: работа изложена на 83 страницах машинописного текста, иллюстрирована 1 рисунком, содержит 14 таблиц. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения, а также выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего ссылки на 17 отечественных и 64 зарубежных источников.

Содержание работы Материалы и методы

В ретроспективное исследование включены 285 неродственных больных PC русской этнической принадлежности, проходивших лечение в Московском городском центре рассеянного склероза на базе ГКБ №11 ДЗ г. Москвы. Диагноз PC был поставлен согласно критериям МакДональда [McDonald W.I. et al., 2001]. Было получено разрешение локального Этического комитета на проведение фармакогенетического исследования. Все пациенты давали информированное согласие на использование их ДНК для исследования. Пациенты наблюдались в МГЦРС с осмотром одним врачом не реже 1 раза в 3 месяца, где оценивались их клиническое состояние (неврологический осмотр с определением балла EDSS, регистрация побочных явлений и обострений).

Все пациенты получали глатирамера ацетат (20 мг подкожно ежедневно) в качестве ПИТРС. Показанием для назначения ГА являлись РРС; возраст от 18 лет и старше; балл EDSS, не превышающий 5,5; не менее 2 обострений за последние 2 или меньше лет. На каждого из них была составлена унифицированная анкета, включавшая демографические и клинические данные (пол, возраст, национальность родителей, клинические симптомы дебюта PC, возраст дебюта, форму течения PC, длительность PC, тяжесть течения PC по шкале EDSS). Источники информации включали в себя данные регистра больных МГЦРС с учетом результатов анализа амбулаторных карт и анкет пациентов.

Демографические и клинические характеристики больных РРС на момент начала терапии ГА представлены в таблице 1. Средний возраст больных ± стандартное отклонение на момент начала терапии ГА равен 34,2±9,9 лет; соотношение по полу мужчины: женщины составило 1:2.4; средний возраст дебюта заболевания - 27.1±8.9 лет; средняя длительность PC на момент начала терапии ГА - 7,0±6.5 лет; средний балл EDSS 2,0+0,7; медиана (диапазон) показателей EDSS составил 1,5 (1.0-4.5); частота обострений за 1 год до начала терапии ГА - 1,6+0,6; за 2 года до начала терапии ГА - 2,5+0,7.

Таблица 1.

Демографические и клинические данные больных РРС на момент начала

терапии ГА (ретроспективно).

Демографические и клинические данные Больные РРС (п=285)

Соотношение по полу (мужчины: женщины) 1:2.4

Средний возраст+БО (годы) 34,2±9,9

Средний возраст дебюта+ЭО (годы) 27.1±8.9

Длительность РС±8Б (годы) 7.0±6,5

Средний балл ЕОБЗ+ЗЭ 2.0±0,7

Медиана Е085 (разброс) 1,5 (1,0-4,5)

Частота обострений за 1 год до начала терапии ГА±БО 1,6±0,6

Частота обострений за 2 года до начала терапии ГА±8Э 2,5±0,7

Полиморфные варианты генов-кандидатов, анализируемые в настоящем фармакогенетическом исследовании эффективности ГА при лечении больных РС.

Поиск генов, вовлеченных в эффективность лечения больных РС глатирамера ацетатом, проводили с использованием подхода «ген-кандидат». Он основан на предварительном выборе гена, который может быть вовлечен в формирование генетической предрасположенности к восприимчивости к действию лекарства, исходя из представлений о роли его белкового продукта в механизме действия лекарства и этиопатогенезе заболевания. При выборе полиморфных участков этих генов для последующего анализа исходили из данных об их связи с уровнем продукции и/или активности кодируемых белков (таблица 2).

Генотипирование

Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществляли с использованием экстракции смесью фенол-хлороформ с помощью модифицированного метода [БатЬгоок }. е1 а1., 2001].

Таблица 2.

Полиморфные участки генов иммунного ответа, включенные в анализ.

Ген, хромосомная локализация Полиморфизм (мутация), локализация в гене Значимость полиморфизма (мутации), [ссылка]

DRB1 6р21.3 Группы аллелей 01 -18, соответствующие специфичностям БИЛ - ОЯ18, кодирующая область Различная презентация репертуара антигенных пептидов конкретными аллелями гена DRB1 [Fridkis-Hareli М. et al.,1994]

CTLA4 2q33 ОНП 49А>в (ТЬг17А1а), экзон 1 Экспрессия CTLA-4 на клеточной поверхности значимо увеличена у носителей генотипа А/А [Ligers A. et al., 2001]

TGFB1 19ql3.1 ОНП -5090Т, промотор Носительство аллеля Т коррелирует с повышенным уровнем ТРФ61 в плазме [Grainger D.J. et al., 1999]

1FNG 12ql4 ОНП 874Т>А, интрон 1 Носительство аллеля Т коррелирует с повышенным уровнем экспрессии ИФНг [Pravica V. et al., 2000]

TNF 6p21.3 ОНП -3080>А, промотор Аллель А определяет повышенную продукцию ФНО [Не В. et al., 1995]

IFNB1 9p21 ОНП 153Т>С (Туг51Туг), экзон Продуктом гена является эндогенный ИФНб. Замена Т на С в кодирующей области гена, не приводящая к замене аминокислоты в белке (синонимическая замена) может оказывать влияние на структуру мРНК, ее стабильность и/или скорость трансляции, зависящую от использования альтернативных кодонов для тирозина TSauna Z.E. et al., 20071

1FNAR1 21q22.11 ОНП 16725С>С, интрон 3 Может влиять на свойства презентации антигенов дендритными клетками [Fujita М. et al., 2010]

IL7RA 5р13 ОНП ОТ (Thr244Ile), экзон 6 У носителей аллеля С, ассоциированного с развитием PC, увеличено количество растворимой формы IL7Ra [Gregory S.G. et al., 20071

CCR5 3р21.31 «Дикий тип»—»делеция 32 п.н. (w—>del32), экзон 3 Мутация со сдвигом рамки считывания. У носителей гомозиготного генотипа del32/del32 нарушается экспрессия рецептора на клеточной поверхности; у гетерозиготных носителей мутации экспрессия по сравнению с "диким типом" снижена ("Dean М. Еу al., 19961

Геномное типирование локуса \\LK-DRB1 проводили с использованием коммерческого набора для ПЦР с аллелеспецифическими праймерами ("ДНК-Технология", Москва, Россия). Проводили двухэтапную ПЦР, позволяющую амплифицировать все известные аллели гена ИЯВ! и разделить их на группы, соответствующие серологическим специфичностям от ОЯ1 до ОШ8. ПЦР-продукты гена DRB1 анализировали в стандартном 12% полиакриламидном геле в присутствии бромида этидия (1 мкг/мл) [Судомоина М. А. и соавт., 1998].

Геномное типирование полиморфного участка -308С>А гена 77УГ (гэ 1800629) проводили методом ПЦР с аллелеспецифическими праймерами (ПЦР-ЗБР) [Не В. е1 а!., 1995]. Фрагмент ДНК длиной 230 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5'-ААТАОСТТТТОАСОООСАТОА-З' (прямой А) 5'-АТАООТТТТСАООСССАТСО-3' (прямой в), 5'-САТСАССТСАТСТСОАООАА-3' (обратный). Для амплификации фрагмента длиной 577 п.н., служащего внутренним положительным контролем амплификации, использовали общий прямой праймер 5'-

АСТСТССОООТСАОААТОАА-З'. Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Трис-НС1 рН 9.0, 20 мМ (МН4)2504, 1.0 мМ 1У^С12, 0.025% Т\уееп 20, 0.025% КР-40, по 5 пкмоль каждого праймера, 0.2 мМ сМТР, 0.256 мкмоль 20% РМБО, 0.5 ед. Тая-полимеразы (Б^ккэ, Россия) и 100-200 нг ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло. Программа амплификации: 30 циклов: 92°С - 50 сек.; 65°С - 1 мин. 30 сек.; 72°С - 1 мин. Наличие продуктов амплификации проверяли методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия (1 мкг/мл) и визуализировали в проходящем УФ-излучении. В качестве буфера для электрофореза здесь и в других случаях использовали 1хТВЕ: 0.89 М Трис-

борат; 0.89 М борная кислота; 0.002 М ЭДТА, рН 8.0; состав 5х буфера для нанесения проб: 30% глицерин, по 0.025% бромфенолового синего и ксиленцианола. В качестве маркера молекулярной массы использовали плазмиду pUC19, обработанную рестрикционной эндонуклеазой Mspl.

Геномное типирование полиморфного участка -5090Т гена TGFB1 (rs 1800469) проводили методом ПЦР-SSP [Судомоина М.А. и соавт., 2010]. Фрагмент ДНК длиной 265 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5'-GGGCAACAGGACACCTGAA-3' (SSP А), 5'-GGGCAACAGGACACCTGAG-3' (SSP G) и общего праймера 5'-AAGGCATGGCACCGCTTCTG-3', сконструированных с помощью программы Primo (http://www.changbioscience.com/primo/'). Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Трис-HCI рН 9.0, 20 мМ (NH^SO.», 1.0 мМ MgCl2, 0.025% Tween 20, 0.025% NP-40, по 5 пкмоль каждого праймера, 0.2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq-полимеразы (Sileks, Россия) и 100-200 нг ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло. Программа амплификации: 1) 95°С - 5 мин; 2) 10 циклов: 95°С - 1 мин; 64°С - 1 мин; 72°С - 1 мин; 3) 20 циклов: 95°С - 30 сек; 58°С - 50 сек; 72°С - 50 сек. Наличие продуктов амплификации проверяли методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия (1 мкг/мл) и визуализировали в проходящем УФ-излучении. В качестве маркера молекулярной массы использовали плазмиду pUC19, обработанную рестрикционной эндонуклеазой Mspl.

Геномное типирование полиморфного участка 874Т>А гена 1FNG (rs2430561) проводили методом ПЦР-SSP [Pravica V. et al., 2000]. Фрагмент ДНК длиной 262 п.н., содержащий этот полиморфный участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5'-TCAACAAAGCTGATACTCCA-3' (обратный), 5'-ТТСТТАСААСАСААААТСАААТСТ -3' (прямой Т), 5'-

ТТСТТАСААСАСААААТСАААТСА -3' (прямой А). Для амплификации фрагмента длиной 400 п.н., служащего внутренним положительным контролем амплификации, использовали общий прямой контрольный праймер 5'-

GTTGCTCACTGGGATTTTTGG-3'. Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Tris-HCI рН 9.5, 20 мМ (NH4)2S04, 1 мМ MgCl2, 0. 025% Tween 20, 0.025% NP-40, по 5 пкмоль каждого праймера, 0.2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq полимеразы (Sileks, Россия) и 100-200 нг геномной ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло. Программа амплификации: 1) 95 °С - 5 мин; 2) 10 циклов: 95 °С - 1мин; 62 °С - 1мин; 72 "С - 1мин; 3) 20 циклов: 95 °С - 30 с; 56 °С - 50

8

с; 72 °С - 50 с. Наличие продуктов амплификации проверяли методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия (1 мкг/мл) и визуализировали в проходящем УФ-излучении. В качестве маркера молекулярной массы использовали плазмиду риС 19, обработанную рестрикционной эндонуклеазой МврГ

Геномное типирование полиморфного участка 49А>й гена СТЬА4 (^231775) проводили методом анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов продуктов ПЦР с использованием рестрикционной эндонуклеазы &;£// [Маггоп М.Р. е1 а1., 1997]. Фрагмент ДНК длиной 152 п.н., содержащий указанный полиморфный участок, амплифицировали с использованием праймеров: 5'-ААОССТСАССТСААССТССТ-З' и 5'-CTGCTGAAACAAATGAAACCC-3,. Амплификационная смесь в объеме 10 мкл содержала 0.05 М КС1, 0.01 М ТрисНО (рН 9.0), 5% формамид, 1.5 мМ М§С1г, 0,2 мМ сШТР, по 5 пкмоль каждого праймера, 0.5 е.а. Taq-пoлимepaзы (ЭЛекБ, Россия) и 100-200 нг ДНК. На реакционную смесь наслаивали минеральное масло. Программа амплификации: 1) 94°С - 5 мин; 2) 30 циклов: 94°С - 1 мин; 58°С - 1 мин; и 72°С - 1 мин; 3) 72°С - 7 мин. Наличие продуктов амплификации проверяли методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия (1 мкг/мл) и визуализировали в проходящем УФ-излучении. В качестве маркера молекулярной массы использовали плазмиду р11С19, обработанную рестрикционной эндонуклеазой Мэр!.

Геномное типирование участка "дикий тип —* делеция 32-х п.н. гена ССЯ5 (\у—>с1, геЗЗЗ) проводили методом ПЦР с праймерами, фланкирующими область делеции [Запёйэп! АЛ. е1 а1., 1997]. Для выявления делеции 32 п.н. в гене ССЯ5 фрагмент длиной 169 п.н. (в случае гена дикого типа) или фрагмент длиной 137 п.н. нуклеотидов (в случае аллеля, несущего делецию), амплифицировали с использованием праймеров: 5'-АОСТСТТСАТТАСАССТССАОС-3' и 5'-СТТСТСАТТТССАСАССОААОС-3'. Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70мМ Трис НС1; 20мМ (КН4)2504; 0.025% Тритон-ХЮО; 0,2 мМ <ШТР; 1.5мМ Г^С12; по 10 пмоль каждого праймера, 0.5ед. Taq ДНК полимеразы (ЗПекэ, Россия) и 100-200 нг геномной ДНК, на реакционную смесь наслаивали минеральное масло. Программа амплификации: 40 циклов: 94°С - 30 с; 59°С - 30 с; 72°С - 45с. Наличие продуктов амплификации проверяли методом электрофореза в 3% агарозном геле, содержащем бромид этидия (1 мкг/мл) и визуализировали в проходящем УФ-излучении. В качестве маркера молекулярной массы использовали плазмиду риС19, обработанную рестрикционной эндонуклеазой Мэр1.

Геномное типирование полиморфного участка 153Т>С в гене IFNB1 (rsl051922) проводили методом ПЦР-SSP. Фрагмент ДНК длиной 238 п.н., содержащий этот участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5'-ТСATCCTGTCCTTGAGGCAG-3' (SSP С), 5'-ТСATCCTGTCCTTGAGGCАА-3' (SSP Т) и праймера 5'-CTGCAACCTTTCGAAGCCTTT-3', сконструированных с помощью программы Primo (http://www.changbioscience.com/primo/). Для амплификации фрагмента длиной 450 п.н., служащего внутренним положительным контролем амплификации, использовали контрольный праймер 5'-

CTCCAGTTTTTCTTCCAGGAC-3'. Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Tris-HCI рН 9.5, 20 мМ (NH4)2S04, 1 мМ MgCl2, 0. 025% Tween 20, 0.025% NP-40, по 5 пкмоль каждого праймера, 0,2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq полимеразы (Sileks, Россия) и 100-200 нг геномной ДНК. Программа амплификации: 1) 95°С - 5 мин; 2) 10 циклов: 95°С - 1мин; 64°С - 1мин; 72°С - Imhh; 3) 20 циклов: 95°С - 30 с; 60°С - 50 с; 72°С - 50 с. Наличие продуктов амплификации проверяли методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия, и визуализировали в проходящем УФ-излучении. В качестве маркера молекулярной массы использовали плазмиду pUC19, обработанную рестрикционной эндонуклеазой Mspl.

Геномное типирование полиморфного участка 16725G>C гена IFNAR1 (rsl012335) проводили методом ПЦР-SSP. Фрагмент ДНК длиной 237 п.н., содержащий этот участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5'-GCAACAAGAAC AAAACTCTGTG-3' (SSP С), 5'-GC AACAAGAAC AAAACTCTGTC-3' (SSP G) и праймера 5'-GGAGGCTGTTTGATGTGTGATG-3', сконструированных с помощью программы Primo. Для амплификации фрагмента длиной 443 п.н., служащего внутренним положительным контролем амплификации, использовали контрольный праймер 5'-TGGGCAGATCACCTGAGGTTG-3'. Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Tris-HCI рН 9.5, 20 мМ (NH4)2S04, 1 мМ MgCl2, 0. 025% Tween 20, 0.025% NP-40, по 5 пкмоль каждого праймера, 0,2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq полимеразы (Sileks, Россия), 0,2 мкг моноклональных антител к активному центру Taq полимеразы и 100-200 нг геномной ДНК. Программа амплификации: 1) 95°С - 5 мин; 2) 10 циклов: 95°С - 1мин; 60°С - 1мин; 72°С - 1мин.; 3) 20 циклов: 95°С - 30 с; 56°С - 50 с; 72°С - 50 с. Наличие продуктов амплификации проверяли методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия, и визуализировали в проходящем УФ-

излучении. В качестве маркера молекулярной массы использовали плазмиду pUC19, обработанную рестрикционной эндонуклеазой Mspl.

Геномное типирование полиморфного участка С—>Т (Thr244IIe) в экзоне 6 гена IL7RA (rs6897932) проводили методом ПЦР-SSP. Фрагмент ДНК длиной 278 п.н., содержащий этот участок, амплифицировали с использованием аллелеспецифических праймеров: 5'- AGATGGATCCTATCTTACTAAC-3' (SSP С), 5'-GAG ATGGATCCTATCTTACTAAT-3' (SSP Т) и праймера 5'-TTCGTGAAATGCCTTAATCCCC-3', сконструированных с помощью программы Primo. Для амплификации фрагмента длиной 426 п.н., служащего внутренним положительным контролем амплификации, использовали контрольный праймер 5'-ACATTTCAAGTGGCAGATGCTC-3'. Амплификацию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 70 мМ Tris-HCI рН 9.5, 20 мМ (NH^SO.), 1 мМ MgCl2, 0. 025% Tween 20, 0.025% NP-40, по 5 пкмоль каждого праймера, 0,2 мМ dNTP, 0.5 ед. Taq полимеразы (Sileks, Россия), 0,2 мкг моноклональных антител к активному центру Taq полимеразы и 100-200 нг геномной ДНК. Программа амплификации: 1) 95°С - 5 мин; 2) 10 циклов: 95°С - 1мин; 62°С - 1мин; 72°С - 1мин.; 3) 20 циклов: 95°С - 30 с; 56°С — 50 с; 72°С — 50 с. Наличие продуктов амплификации проверяли методом электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия, и визуализировали в проходящем УФ-излучении. В качестве маркера молекулярной массы использовали плазмиду pUC19, обработанную рестрикционной эндонуклеазой Mspl.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с помощью программного пакета «Statistica for Windows 6.0». Различия признавались статистически значимыми при значении р<0,05.

У исследуемых больных PC определяли частоты аллелей и частоты носительства аллелей и генотипов исследуемых генов. Отклонение наблюдаемых частот генотипов от равновесия Харди-Вайнберга проверяли по критерию у! с использованием свободно распространяемой программы Haploview 3.32 http://www.broad.mit.edu/mpg/haploview/).

Сравнение частот аллелей и частот носительства аллелей и генотипов в сравниваемых группах проводили с помощью точного двустороннего критерия Фишера с использованием онлайн-версии программы GraphPad Instat (http://www.graphpad.com/quickcalcs/index.cfm). Значимым считали различие сравниваемых величин при значении р<0.05. Силу выявленных ассоциаций оценивали в значениях отношения шансов (ОШ) и его 95%-го доверительного интервала (ДИ)

также с использованием программы вгарИРас! ЬиШ. Значимым считали различие сравниваемых частот при р < 0.05. Исключали из числа статистически значимых ассоциаций те, для которых ДИ пересекал 1. ОШ больше 1 характеризует позитивную ассоциацию сочетания аллелей/генотипов с эффективностью терапии больных РС глатирамера ацетатом.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ " Клинико-демографическая характеристика больных с РРС

В результате проведенного ретроспективного анализа динамики клинического состояния пациентов с PC, получавшими ГА не менее 2 лет, выработаны критерии оценки эффективности ГА. Учитывались клинические показатели: наличие обострений и нарастание степени инвалидизации. Отсутствие неблагоприятных событий -обострения и/или нарастания неврологического дефицита по шкале инвалидизации EDSS - в течение всего времени лечения (не менее двух лет) до момента оценки эффективности лечения ГА, явилось основанием для выделения из всех пациентов группы пациентов с оптимальным ответом на лечение глатирамера ацетатом (группа респондеров, А группа, 130 человек). Остальные больные PC, у которых оптимальный ответ на лечение ГА не наблюдался, а эффективность лечения варьировала, составили группу сравнения (пациенты без оптимального ответа на лечение ГА, В группа, 155 человек) (Таблица 3). Разделение всех пациентов на 2 крайние группы - респондеров и пациентов без оптимального ответа - проведено сознательно с целью оптимизации и достоверности статистического анализа.

Таблица 3.

Демографические и клинические данные для групп больных PC в зависимости от

эффективности 2-х летнего использования ГА (ретроспективно).

Демографические и клинические данные Все п=285 Больные с оптимальным ответом (группа А) ' ' п=130 Больные без оптимального ответа (группа В) п=155

Соотношение по полу (мужчины:женщины) 1:2.4 1:2.0 1:3.0

Средний возраст дебюта РС±8Б (годы) 27.1+8.9 26.9±8.8 27,2±8,8

Средний возраст на момент начала лечения+ББ (годы) 34.2±9.9 зз.шо.о' 35.5±10.2

Средняя длительность приема+SD на момент оценки эффективности лечения(годы) 4,3±1,9 4,5±2,1 4,2±1,8

Форма PC (РРС/ВПРС) На момент начала лечения 285/0 130/0 155/0

На момент оценки эффективности лечения 268/17 130/0 138/17

Среднее значение EDSS±SD [разброс] На момент начала лечения 2.0±0.7 [1.0-4.51 1.8±0.6 Г1.0-4.51 2,1±0,7 Г1.0-4.51

На момент оценки эффективности лечения 2.3±1.0 [1.0-6.5] 1,8±0.6 [1.0-4.5] 2,7+1.0 [1.5-6.5]

Первоначально эти группы не отличались по клинико-демографическим характеристикам.

Для всех больных PC, получавших ГА не менее 2-х лет, проведено геномное типирование групп аллелей гена DRBI ГКГ класса II, соответствующих специфичностям DR1-DR18, и следующих биаллельных полиморфизмов: -308G>A в промоторной области гена TNF, -5090Т в промоторной области гена TGFB1, 49A>G в первом экзоне гена CTLA4, 874Т>А в первом интроне гена IFNG, 153Т>С в кодирующей области гена IFNB1 (синонимическая замена Tyr51Tyr), 16725G>C в третьем интроне гена IFNAR1, С—>Т в экзоне 6 гена IL7RA (Thr244Ile), и инсерционно-делеционного полиморфизма (w—>d) гена CCR5.

Анализ распределения частот аллелей и генотипов всех рассматриваемых полиморфных участков с помощью критерия х2 показал, что для больных PC соблюдается равновесие Харди-Вайнберга.

Сравнение частот аллелей и частот встречаемости аллелей гена HLA-DRB1 в группах больных PC с различной эффективностью лечения ГА

Проведено сравнение частот аллелей и носительства (частот встречаемости)

аллелей гена DRB1 ГКГ класса II у больных PC с оптимальным ответом на терапию ГА

(группа А) и в группе без оптимального ответа на терапию ГА (группа В) (таблица 4).

Из представленных результатов видно, что частоты аллеля DRB1*4 (р = 0.029,

0111=1.9) и аллеля DRB1* 13 (р=0.034, ОШ=1.7) были значимо выше в группе А. При

сравнении у групп А и В частот этих аллелей, объединенных в общую группу (DRB1*4

+ DRB1* 13), уровень значимости различий существенно возрастал (р=0.0009, ОШ=2.0).

При сравнении частот встречаемости аллелей было показано, что частота носительства

аллеля DRB1* 4 (в эту группу входят все больные, несущие данный аллель в

гомозиготной или гетерозиготной форме) также значимо выше в группе больных PC с

13

оптимальным ответом на терапию глатирамера ацетатом (р = 0.044, ОШ=1.9), тогда как для аллеля ИЯВ]* 13 значимых отличий не наблюдалось. Проведено сравнение групп А и В по количеству пациентов, являющихся носителями (в гомозиготной или гетерозиготной форме) или аллеля ОЯВ1*4 или аллеля ОЯВ1*\Ъ, а также обоих аллелей вместе. Уровень значимости различий частоты носительства аллелей ОШ31*4 и/или £)Я5/*13 между группой А и группой В (р=0.011, ОШ=1.9) был выше, чем в случае носительства одного аллеля ¿)Я5/*4. Число пациентов, которые несли оба этих аллеля вместе, как и следовало ожидать, было невелико (4 человека в группе А и один - в группе В), и различия между группами не достигали уровня значимости. Для остальных аллелей гена НЬА-£>/?В/ не было выявлено значимых различий в частоте аллелей или частоте встречаемости аллелей.

Таблица 4.

Распределение частот аллелей и частот встречаемости аллелей гена ОЯВ1

ГКГ класса II у больных РС в зависимости от эффективности лечения ГА.

Аллели# Группы больных РС Величина р при попарном сравнении, ОШ [95% ДИ] для значимых отличий

Больные с оптимальным ответом (группа А) п=130 Больные без оптимального ответа (группа В) п=155

Частота аллелей, число (%)

Ш1В1* 1 19(7.3) 24(7.7) Н.з.

ИЯВІ* 4 32(12.3) 21(6.8) 0.029 1.9 [1.1-3.41

ИЯВІ*! 23(8.8) 37(11.9) Н.з.

£>ЯЯ/*8 12(4.6) 19(6.1) Н.з.

ИЯВІ* 11 23(8.8) 28(9.0) Н.з.

оявтз 43(16.5) 32(10.3) 0.034 1.7 fl.l-2.81

£>ЯЯ/* 15 58(22.3) 88(28.4) Н.з.

£>ДЯ/* 16 8(3.1) 10(3.2) Н.з.

ОИВІ* 17 34(13.1) 37(11.9) Н.з.

75(28.8) 53(17.1) 0.0009 2.0 [1.3-2.91

Частота встречаемости аллелей, число (%) носителей

йШІ* 1 18(13.8) 24(15.5) Н.з.

DRB1* 4 30(23.1) 21(13.5) 0.044 1.9 [1.0-3.51

DRB1*1 21(16.2) 32(20.6) Н.з.

DRB1*& 12(9.2) 19(12.3) Н.з.

DRBl* 11 21(16.2) 27(17.4) Н.з.

DRB1* 13 37(28.5) 32(20.6) Н.з.

DRBl* 15 54(41.5) 79(51.0) Н.з.

DRBl* 16 8(6.2) 10(6.5) Н.з.

DRB1*\1 31(23.8) 34(21.9) Н.з.

DRBl*4 и/или DRBl* 13 63(48.5) 52(33.5) 0.011 1.9 [1.1-З.Ц

Н.з. - не значимо

Здесь и далее - жирным шрифтом выделены значимые различия

# - Данные для аллелей DRB1* 09, *10, *12 и *14, число носителей которых в любой подгруппе больных PC было менее или равно 6 чел. (4%), не представлены в таблице. Различия их частот в сравниваемых группах были незначимыми.

Сравнение частот аллелей, частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма участка 49A>G в гене CTLA4 в группах больных PC с различной эффективностью лечения ГА.

При сравнении частот аллелей и частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфизма -308G>A в первом экзоне гена CTLA4 в группе больных PC с различной эффективностью лечения глатирамера ацетатом значимых различий не выявлено (таблица 5). Однако, обращает внимание несколько большие частоты аллеля G, носительства этого аллеля и генотипа G/G у больных с оптимальным ответом на глатирамера ацетат и несколько меньшие частоты альтернативного аллеля А - у остальных больных.

Таблица 5.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного участка 49A>G в гене CTLA4 у

больных PC с различной эффективностью терапии ГА.

Аллели и генотипы Больные с оптимальным ответом (группа А) п=130 Больные без оптимального ответа (группа В) п=155 Величина р при попарном сравнении, ОШ [95% ДИ] для значимых отличий

Частота аллелей, число (%)

А 145 (55.8) 183 (59.0) Н.з.

G 115 (44.2) 127 (41.0) Н.з.

Частота встречаемости аллелей, число (%) носителей

А (A/A+A/G) 102 (78.5) 127 (81.9) Н.з.

G (G/G+A/G) 87 (66.9) 99 (63.9) Н.з.

Частота генотипов, число (%) носителей

А/А 43 (33.1) 56 (36.1) Н.з.

A/G 59 (45.4) 71 (45.8) Н.з.

G/G 28 (21.5) 28 (18.1) Н.з.

Н.з. - не значимо

Сравнение частот аллелей, частот встречаемости аллелей и генотипов однонуклеотидных полиморфизмов генов цитокинов TGFB1, IFNG, TNF и IFNB1.

Проведено сравнение в группах больных PC с различной эффективностью лечения ГА частот аллелей и частот встречаемости аллелей и генотипов следующих однонуклеотидных полиморфизмов в генах цитокинов: -509С>Т в промоторной области гена TGFB1 (таблица 6), 874Т>А в первом интроне гена IFNG (таблица 7), -308G>A в промоторной области гена TNF (таблица8) и 153Т>С в кодирующей области гена IFNB1 (таблица 9). Ни в одном случае значимых различий между группами больных PC с различной эффективностью лечения ГА не выявлено.

Таблица 6.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного участка -509С>Т в гене TGFB1

у больных PC с различной эффективностью терапии ГА.

Аллели и генотипы Больные с оптимальным ответом (группа А) п=130 Больные без оптимального ответа (группа В) п=155 Величина р при попарном сравнении, ОШ [95% ДИ] для значимых отличий

Частота аллелей, число (%)

С 180(69.2) 208 (67.1) Н.з.

Т 80 (30.8) 102 (32.9) Н.з.

Частота встречаемости аллелей, число (%) носителей

С (С/С+СЯ) 120 (92.3) 142 (91.6) Н.з.

Т (Т/Т+С/Т) 70 (53.8) 89 (57.4) Н.з.

Частота генотипов, число (%) носителей

С/С 60 (46.2) 66 (42.6) Н.з.

С/Т 60 (46.2) 76 (49.0) Н.з.

Т/Т 10 (7.6) 13(8.4) Н.з.

Таблица 7.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного участка 874Т>А в гене /УЖ» у

больных PC с различной эффективностью терапии ГА.

Аллели и генотипы Больные с оптимальным ответом (группа А) п=130 Больные без оптимального ответа (группа В) п=155 Величина р при попарном сравнении, ОШ [95% ДИ] для значимых отличий

Частота аллелей, число (%)

А 150 (58.1) 186 (60.0) Н.з.

Т 108 (41.9) 124 (40.0) Н.з.

Частота встречаемости аллелей, число (%) носителей

А (А/А+АЯ) 108 (83.7) 131 (84.5) Н.з.

Т (Т/Т+А/Т) 87 (67.4) 100 (64.5) Н.з.

Частота генотипов, число (%) носителей

А/А 42 (32.5) 55 (35.5) Н.з.

Л/Т 66 (51.2) 76 (49.0) Н.з.

ТЯ 21 (16.3) 24 (15.5) Н.з.

Н.з. - не значимо

Таблица 8.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного участка -308G>A в гене TNF у

больных PC с различной эффективностью терапии ГА.

Аллели и генотипы Больные с оптимальным ответом (группа А) п=130 Больные без оптимального ответа (группа В) п=155 Величина р при попарном сравнении, ОШ [95% ДИ] для значимых отличий

Частота аллелей, число (%)

А 36(14.0) 35(11.3) Н.з.

G 222 (86.0) 275 (88.7) Н.з.

Частота встречаемости аллелей, число (%) носителей

А (A/A+A/G) 34(26.4) 34 (21.9) Н.з.

G (G/G+A/G) 127 (98.4) 154 (99.4) Н.з.

Частота генотипов, число (%) носителей

А/А 2(1.6) 1 (0.6) Н.з.

AJG 32 (24.8) 33 (21.3) Н.з.

G/G 95 (73.6) 121 (78.1) Н.з.

Таблица 9.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного участка 153Т>С гена /КАТИ у

больных РС с различной эффективностью терапии ГА.

Аллели и генотипы Больные с оптимальным ответом (группа А) п=130 Больные без оптимального ответа (группа В) п=155 Величина р при попарном сравнении, ОШ [95% ДИ] для значимых отличий

Частота аллелей, число (%)

С 143 (55.0) 178 (57.4) Н.з.

Т 117(45.0) 132 (42.6) Н.з.

Частота встречаемости аллелей, число (%) носителей

С (С/С+С/Т) 106 (81.5) 126 (81.3) Н.з.

Т (Т/Т+СЯ) 93 (71.5) 103 (66.5) Н.з.

Частота генотипов, число (%) носителей

С/С 37 (28.5) 52 (33.6) Н.з.

СЯ 69 (53.1) 74 (47.7) Н.з.

Т/Т 24 (18.4) 29 (18.7) Н.з.

Н.з. - не значимо

Сравнение частоты аллелей, частот встречаемости аллелей и генотипов генов рецепторов цитокинов и хемокинов IFNAR1,1Ь7ЯА и ССЯ5 в группах больных РС с различной эффективностью лечения ГА

В группах больных РС с различной эффективностью терапии ГА проведено сравнение частот аллелей и генотипов полиморфного участка 16725в>С в третьем интроне гена первой субъединицы рецептора интерферонов типа I (1РИАН1) (таблица 10), полиморфного участка С—>Т в экзоне 6 гена альфа-субъединицы рецептора интерлейкина 7 (1Ь7ЯЛ), приводящего к замене 244-го аминокислотного остатка в кодируемом белке (ТЬг244Ие) (таблица 11) и инсерционно-делеционного полиморфизма (\у—>(132) в гене рецептора хемокинов-5 (ССЯ5) (таблица 12).

При сравнении частот аллелей и частот встречаемости аллелей и генотипов полиморфных участков генов рецепторов цитокинов ШИАШ и 1Ь7КА в группах больных РС с различной эффективностью лечения ГА значимых различий не найдено. В то же время, выявлено, что в группе А частота аллеля хемокинового рецетора ССЯ5*™ значимо выше (р=0.025, ОШ=1.9), тогда как частота аллеля ССЯ5*Л значимо выше в группе В (р=0.025, 0111=0.53) (таблица 12). При сравнении частот встречаемости аллелей и генотипов этого полиморфизма носительство аллеля дикого типа \у и генотипа \у/\у было выше у больных с оптимальным ответом на терапию ГА, однако уровень значимости не был достигнут.

Таблица 10.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного участка 16725С>С гена

^FAГ/^Я^ у больных РС с различной эффективностью терапии ГА.

Аллели и генотипы Больные с оптимальным ответом (группа А) п=130 Больные без оптимального ответа (группа В) п=155 Величина р при попарном сравнении, ОШ [95% ДИ] для значимых отличий

Частота аллелей, число (%)

С 95 (36.5) 111 (35.8) Н.з.

Є 165 (63.5) 199 (64.2) Н.з.

Частота встречаемости аллелей, число (%) носителей

С (С/С+С/С) 75 (57.7) 87 (56.1) Н.з.

в (С/(3+С/С) 110(84.6) 131 (84.5) Н.з.

Частота генотипов, число (%) носителей

С/С 20(15.4) 24 (15.5) Н.з.

СЮ 55 (42.3) 63 (40.6) Н.з.

в/в 55 (42.3) 68 (43.9) Н.з.

Н.з. - не значимо

Таблица 11.

Распределение аллелей и генотипов полиморфного участка С—>Т гена /1,7&4

(ТЬг244ІІе) у больных РС с различной эффективностью терапии ГА.

Аллели и генотипы Больные с оптимальным ответом (группа А) п=130 Больные без оптимального ответа (группа В) п=155 Величина р при попарном сравнении, ОШ [95% ДИ] для значимых отличий

Частота аллелей, число (%)

С 200 (77.5) 240 (77.4) Н.з.

Т 58 (22.5) 70 (22.6) Н.з.

Частота встречаемости аллелей, число (%) носителей

С (С/С+С/Т) 126 (97.7) 148 (95.5) Н.з.

Т (Т/Т+С/Т) 55 (42.3) 63 (40.6) Н.з.

Частота генотипов, число (%) носителей

С/С 74 (57.4) 92 (59.4) Н.з.

С/Т 52 (40.3) 56 (36.1) Н.з.

Т/Т 3(2.3) 7 (4.5) Н.з.

Таблица 12.

Распределение аллелей и генотипов инсерционно-делеционного полиморфизма (и1—»(132) гена ССЛ5 у больных РС с различной эффективностью терапии ГА.

Аллели и генотипы Больные с оптимальным ответом (группа А) п=130 Больные без оптимального ответа (группа В) п=155 Величинар при попарном сравнении, ОШ [95% ДИ] для значимых отличий

Частота аллелей, число (%)

w 239 (91.9) 266 (85.8) 0.025 1.9 fl.l-3.31

d 21 (8.5) 44 (14.2) 0.025 0.53 J0.3-0.921

Частота встречаемости аллелей, число (%) носителей

w (w/w+w/d) 130 (100.0) 150 (96.8) Н.з.

d (d/d+w/d) 21 (16.2) 39 (25.2) Н.з.

Частота генотипов, число (%) носителей

w/w 109 (83.8) 116(74.8) Н.з.

w/d 21 (16.2) 34 (21.9) Н.з.

d/d 0(0) 5 (3.3) Н.з.

Н.з. - не значимо

В целом, проведенный анализ позволил выявить и позитивные (для аллелей CCR5*w, DRB1*4 и DRB1* 13), и негативные (для аллеля CCR5*d) значимые ассоциации аллельных частот с оптимальным ответом больных PC на терапию ГА. По результатам анализа можно сделать вывод о вкладе полиморфных вариантов генов CCR5 и DRB1 в формирование ответа на лечение глатирамера ацетатом у русских больных PC.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В этом исследовании проведен анализ ассоциации аллелей/генотипов 9 генов иммунного ответа с эффективностью лечения больных PC глатирамера ацетатом. ГА оказался максимально (оптимально) эффективным (нет обострений и прогрессирования инвалидности минимум 2 года терапии ГА) и хорошо переносимым для половины пациентов.

Ранее проведенные фармакогенетические исследования эффективности

применения ГА в лечении PC в первую очередь касались гена HLA-DRB1 [Фаворова

О.О. и соавт., 2010], другие локусы анализировались мало и на небольшом числе

больных. При анализе роли HLA-DRB1 в формировании эффективности лечения ГА в

представленном исследовании наблюдается вовлечение различных групп аллелей гена

DRB1 (*04, *13). Полученные данные дают основание предположить, что ответ на

20

лечение ГА определяется различными функциональными свойствами тримолекулярных комплексов, формируемых с участием различных молекул DR на антиген-презентирующих клетках. В результате образуется пул разных ГА-специфичных клеток, что может приводить к изменению баланса ТЬ1/ТЬ2-цитокинов и/или к нейропротективному эффекту в ЦНС за счет синтеза нейротрофических факторов.

В работе впервые показана ассоциация оптимального ответа на длительный курс ГА с геном CCR5. Частоты определенных аллелей этого гена, как и в случае гена DRB1, ассоциированы с различной эффективностью терапии ГА. Ген CCR5 кодирует рецептор для СС-хемокинов МІР-la, МІР-ір и RANTES. Этот рецептор принимает участие в одном из важнейших этапов патогенеза PC — в проникновении активированных Т-клеток через гематоэнцефалический барьер [Simpson J. et аі., 2000]. Деления 32-х п.н. в кодирующей части его гена приводит к продукции нефункциональной формы рецептора. По представленным данным, носительство аллеля с делецией гена CCR5 является негативным фактором при лечении больных PC глатирамера ацетатом. Исходя из общепринятого механизма действия ГА, можно утверждать, что продукция нефункциональной формы рецептора приводит к уменьшению проникновения в ЦНС не только аутореактивных Т-клеток, но и ГА-специфичных ТЬ2-лимфоцитов, что и обуславливает отсутствие оптимального ответа на терапию глатирамера ацетатом.

Показано отсутствие значимой ассоциации полиморфных вариантов генов, кодирующих некоторые цитокины (IFNG, TGFBI, TNF), цитокиновые рецепторы (IFNARI, IL7RA) и CTLA4 с эффективностью лечения больных PC глатирамера ацетатом.

Ранее были проведены только два исследования по анализу ассоциации полиморфизма генов, кодирующих белки, участвующие в развитии аутоиммунного ответа, с эффективностью лечения ГА больных PC. Оба выполнены на очень небольшой (менее 80) выборке пациентов. Одно из них касалось только гена IL12B [Алифирова В.М. и соавт., 2006], в другом анализировали панель из 27 генов, включающую гены Т-клеточного рецептора, некоторых цитокинов и хемокинов, их рецепторов, костимулирующих молекул, аутоантигенов, протеаз и белков, участвующих в апоптозе [Grossman I et al., 2007]. В последней работе не было выявлено ассоциаций между эффективностью действия ГА и полиморфизмами в генах IFNG, CTLA4 и TGFB1, что согласуется с результатами, полученными в данной работе.

Отсутствие ассоциации полиморфных вариантов генов, кодирующих некоторые цитокины и цитокиновые рецепторы с эффективностью 'лечения больных PC препаратом ГА, может быть связано с большим значением синтеза нейротрофических факторов, нежели цитокинов, ГА-специфическими Т- лимфоцитами в формировании оптимального ответа на ГА.

В целом проведенное исследование может помочь созданию прогностического теста выбора ПИТРС для конкретного пациента. Носительство пациентом аллеля DRB1*4 или аллеля DRB1* 13 можно использовать в качестве маркера, определяющего ГА как препарат первого выбора среди ПИТРС при лечении больных РРС. Пациентам, которые являются носителями этих двух аллелей гена DRB1 (без детализации, какой из них присутствует в ДНК пациента), а их число достигает 40% больных PC, безусловно показано назначение лечения ГА. Напротив, носительство делетированного аллеля CCR5 (присутствует примерно у 20% больных PC) можно считать основанием для выбора другого ПИТРС при начале курса длительного лечения, что позволит оптимизировать терапию и расходы на лечение.

Выводы

1. Для 285 больных рассеянным склерозом русской этнической принадлежности проведен анализ ассоциации эффективности их лечения препаратом глатирамера ацетатом с аллельным полиморфизмом ряда генов иммунного ответа, кодирующих бета-цепь молекул ГКГ класса II (DRB1), антиген 4 цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLA4), трансформирующий фактор роста бета 1 (TGFB1); интерферон-гамма ([IFNG); фактор некроза опухолей (TNF), интерферон бета (IFNB1); первую субъединицу рецептора интерферонов типа I (IFNAR1), альфа-субъединицу рецептора интерлейкина 7 (IL7RA) и рецептор хемокинов-5 (CCR5).

2. Сравнение частот аллелей и генотипов полиморфных участков гена HLA-DRB1, кодирующего бета-цепь молекул ГКГ класса II, показало, что частоты аллеля и частоты носительства аллеля DRB1* 4, а также частоты аллеля DRB1* 13 значимо выше в группе больных PC с оптимальным ответом на терапию глатирамера ацетатом. Уровень значимости существенно повышается, если сравнение больных PC с оптимальным ответом на терапию глатирамера ацетатом с остальными больными проводить для объединенной группы носителей аллелей DRB1*4 и/или DRB1* 13.

3. Сравнение частот аллелей и генотипов полиморфных участков гена CCR5, кодирующего рецептор СС-хемокинов 5, показало, что в группе больных с оптимальным ответом на лечение глатирамера ацетатом частота аллеля CCR5*w значимо выше, тогда как частота аллеля CCR5*d значимо выше в группе больных без оптимального ответа на терапию глатирамера ацетатом.

4. Для генов TNF, TGFB1, CTLA4, IFNG, IFNB1, IFNARi, IL7RA не выявлено значимой ассоциации полиморфных вариантов этих генов с эффективностью терапии глатирамера ацетатом.

5. Носительство аллелей DRB1*4 и/или DRB1* 13, CCR5*w или CCR5*d можно рассматривать как генетический предиктор при решении вопроса о выборе глатирамера ацетата как ПИТРС.

Практические рекомендации

При разработке прогностических генетических тестов для решения вопроса о выборе ПИТРС рекомендовано включение в исследование у пациентов аллелей DRB1*4, DRB1* 13, CCR5*w, CCR5*d, как генетических маркеров эффективности использования ГА среди больных PC русской этнической принадлежности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Щур, С.Г. Результаты длительного использования копаксона и бетаферона в Московском городском центре рассеянного склероза: оценка эффективности и приверженности к терапии / А.Н. Бойко, М.В. Давыдовская, С.Г. Щур и др. // Журнал неврологии и психиатрии им.С.С. Корсакова. - 2006. - № 3 - С. 101-110.

2. Щур, С.Г. Фармакогенетические исследования эффективности терапии больных рассеянным склерозом иммуномодулирующими препаратами / О.Г. Кулакова, А.Н. Бойко, С.Г. Щур и др. // Журнал неврологии и психиатрии им.С.С. Корсакова. — 2007. - №4 -С. 117-121.

3. Щур, С.Г. Опыт длительного использования бетаферона и копаксона в повседневной практике неврологов — результаты 5-летнего лечения больных рассеянным склерозом в Московском городском центре рассеянного склероза / А.Н. Бойко, Т.П. Демина, С.Г. Щур и др. // Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2007. - № 4 - С. 84-94.

4. Щур, С.Г. Генетические маркеры в прогнозе развития и лечения рассеянного склероза / А.Н. Бойко, М.В. Давыдовская, С.Г. Щур и др. // Материалы научно-

23

практической конференции с международным участием «Современные проблемы рассеянного склероза: теория и практика». Казань. - 2010. - Неврологический вестник -2010- T.XLII(I)-С. 151-152.

5. Щур, С.Г. Эффективность и переносимость глатирамера ацетата (копаксона) при длительном использовании: 10-летний опыт Московского городского центра рассеянного склероза / А.Н. Бойко, М.В. Давыдовская, С.Г. Щур и др. // Журнал неврологии и психиатрии им.С.С. Корсакова. — 2012. - № 2(2) - С. 86-92.

6. Щур, С.Г. Фармакогеномика рассеянного склероза: ассоциация полиморфизма генов иммунного ответа с эффективностью лечения копаксоном / Е.Ю. Царева, О.Г. Кулакова, С.Г. Щур и др. // Молекулярная биология. — 2011. - №6 (45) — С. 963-972.

7. Щур, С.Г. Эффективность и переносимость глатирамера ацетата при 10-летнем использовании / А.Н. Бойко, О.В. Бойко, С.Г. Щур и др. // Материалы X Всероссийского съезда неврологов с международным участием. Нижний Новгород. — 2012. - С. 204-205.

8. Щур, С.Г. Клинико-генетические особенности формирования ответа на терапию больных рассеянным склерозом препаратом глатирамера ацетат / С.Г. Щур, А.Н. Бойко, Е.Ю. Царева и др. // Материалы X Всероссийского съезда неврологов с международным участием. Нижний Новгород — 2012. - 260 с.

9. Shchur, S.G. Allelie combination of immune-response genes associated glatiramer acetate treatment response in Russian multiple sclerosis patients / E.Y. Tsareva, A.N. Boyko, S.G. Shchur et al. // Pharmacogenomics. - 2012. - Vol 13. - № 13. - P. 43-53.

Подписано в печать 14.02.2013 г.

Формат 60x90/16. Заказ 1642. Тираж 100 экз.

Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов.

Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96