Автореферат и диссертация по медицине (14.01.11) на тему:Связь полиморфизма генов иммунной системы с развитием и течением рассеянного склероза

На правах рукописи

9 15-14/774

ГРИДИНА Лини Олеговна

СВЯЗЬ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ С РАЗВИТИЕМ И ТЕЧЕНИЕМ РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА

14.01.11 - Нервные болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург - 2015

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научные руководители: Смагина Инна Ваднмовна

доктор медицинских наук, профессор

ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский

университет» Министерства здравоохранения Российской

Федерации

Ельчанинова Светлана Александровна

доктор биологических наук, профессор

ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский

университет» Министерства здравоохранения Российской

Федерации

Официальные оппоненты: Тотолян Наталья Агафоновна

доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.Г1. Наклона» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Бисага Геннадий Николаевич

доктор медицинских наук, профессор

ФГБВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени

С.М. Кирова» Министерства обороны Российской

Федерации

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « Ц» кйЛрк о 15 г. в _ часов на заседании диссертационного

Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.090.06 при ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6-8).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197022, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6-8) и на сайте spb-gmu.ru.

Автореферат разослан « 0:2 » ^¿уТ^ЬДС 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Сергей Владимирович Матвеев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Рассеянный склероз (PC) - хроническое заболевание центральной нервной системы (ЦНС), при котором воспалительная аутоиммунная демиелинизация волокон головного и спинного мозга сочетается с процессами нейродегенерации (Шмидт Т.Е., Яхно H.H., 2012; Шмидт Т.Е., Герасимова А.Е., 2011; Lassman H., 2014).

В последние годы зарегистрированы рост заболеваемости PC, расширение этнического коридора и возраста дебюта этого заболевания от 20-40 лет до 10-59 лет (Гусев Е.И., Завалишин И.А., Бойко А.Н., 2011; Шмидт Т.Е., Яхно H.H., 2012; Comi G., Martino G., 2006; Young C.A., 2011). Нарастание неврологического дефицита, ведущее к инвалидизации больных в трудоспособном возрасте, высокая стоимость лечения препаратами, изменяющими течение PC (ПИТРС), косвенные затраты, включающие уход за пациентами, обусловливают медико-социальную значимость PC (Kobell G., Pugliatti M., 2005; Fridman M.C., 2006; Scalfari A., Neuhaus A., Degenhardt A. et al., 2010).

Общепризнано, что PC - это мультифакторное заболевание, которое возникает при неблагоприятном сочетании комплекса генетических и внешних факторов (Трофимова Т.Н., Тотолян H.A., Пахомов A.B., 2010; Фаворова О.О., Кулакова О.Г., Бойко А.Н., 2010; Racke М.К., 2008; Baranzini S., Oksenberg J„ 2009). Наиболее интенсивно в последние годы изучается связь развития PC с генами иммунной системы, белковые продукты которых вовлечены в патогенез этого заболевания, - генами HLA-системы, лигандов и рецепторов фактора некроза опухоли (TNF) и других цитокинов - регуляторов иммунного ответа. Результаты этих исследований во многом противоречивы (Sawcer S., Hellenthal G., Pinnen M. et al., 2013; Yan J„ Liu J., Lin C.Y., 2012; Beecham A.H., Patsopoulos N.A., Xifara D.K. et al., 2013). Это связано с тем, что распространенность полиморфизма генов-кандидатов, спектр и сила влияния внешних факторов риска PC, а, следовательно, и фенотипические проявления особенностей генома существенно отличаются в различных популяциях (Favorova О.О. et al., 2006; Forte G.I. et al., 2006; Ristic S. et al., 2007).

Результаты ряда исследований позволяют полагать, что генетические факторы влияют не только на риск PC, но и на особенности клинического течения этого

заболевания (Burwick R.M., Ramsay P.P., Haines J.L. et al., 2006; Parmenter B.A., Denney D.R. et al., 2007; Cree B.A., Reich D.E. et. al., 2009), а также на эффективность наиболее широко используемых для лечения PC препаратов интерферонов и глатирамера ацетата (Царева Е.Ю., 2012; Grossman I. et al., 2007; Mahurkar S., Moldovan M. et al., 2013). Эти препараты на начальных этапах заболевания могут замедлить прогрессирование неврологического дефицита, повысить продолжительность и качество жизни больных (Гусев Е.И., Завалишин И.А., Бойко А.Н., 2004; Шмидт Т.Е., Яхно H.H., 2012). В связи с этим исследование генетического полиморфизма актуально не только для диагностики PC и формирования групп риска по этому заболеванию, но и для разработки персонализированных прогностических критериев течения PC и ответа на иммуномодулирующую терапию.

Степень разработанности темы исследования

К моменту начала исследования отсутствовали данные об ассоциации риска PC в Алтайском крае, особенностей клинического течения этого заболевания, ответа на ПИТРС с полиморфизмом генов иммунной системы, включая гены HLA-DRB1 (DR бета 1 главного комплекса гистосовместимости), TNF-а (фактора некроза опухоли альфа), TNFRSF1A и CD40 (рецепторов семейства фактора некроза опухоли 1А типа и 5 типа соответственно). Очевидно, что такого рода данные необходимы для разработки новых подходов к диагностике PC и повышению эффективности медицинской помощи больным, страдающим этим заболеванием.

Цель исследования

Оценить полиморфизмы генов иммунной системы

как факторы развития, особенностей течения рассеянного склероза и ответа больных рассеянным склерозом на терапию глатирамера ацетатом.

Задачи исследования:

1. Исследовать ассоциацию полиморфизма генов HLA-DRB1, TNF-а (rsl800629), TNFRSF1A (rs4149584), CD40 (rs6074022) и CD40 (rsl 1086998) с риском развития рассеянного склероза в Алтайском крае.

2. Исследовать связь особенностей дебюта, частоты обострений и скорости прогрессирования рассеянного склероза с полиморфизмом генов HLA-DRB1,

TNF- a(rs 1800629), TNFRSFIA (rs4¡49584, CD40 (rs6074022) и CD40 (rsl 1086998).

3. Изучить особенности ответа на лечение глатирамера ацетатом больных рассеянным склерозом в зависимости от полиморфизма генов HLA-DRBI, TNF-a (rsl800629), TNFRSFIA (Ы149584, CD40 (rs6074022) и CD40 (rsl 1086998) по данным трехлетнего наблюдения.

Научная новизна

Установлено, что риск рассеянного склероза у лиц европеоидной расы, родившихся и проживающих в Алтайском крае, повышается при носительстве аллелей 3 и/или 15 гена HL4-DRB1, генотипе С/С CD40 (rs6074022), а также при сочетании женского пола и аллеля А гена TNF-a (rsl 800629).

Впервые исследована связь особенностей течения ремитирующего рассеянного склероза с отдельными полиморфизмами генов иммунного ответа. Выявлены ассоциации частых обострений PC с HLA-DRB*3, высокой скорости прогрессирования заболевания - с генотипом G/A TNFRSFIA (rs4149584), а также с аллелем А TNFRSFIA (rs4149584) у женщин. Установлено протективное влияние на темпы прогрессирования заболевания генотипа G/G TNFRSF1А (rs4 ¡49584).

Впервые показано, что риск быстрого прогрессирования рассеянного склероза ассоциирован с мужским полом, коротким периодом первой ремиссии, поздним возрастом дебюта, двигательными расстройствами в период дебюта независимо от полиморфизма HLA-DRBI, TNF-a (rsl800629), TNFRSFIA (rs4149584), CD40 (rs6074022, rsl 1086998).

Впервые установлено, что на фоне лечения глатирамера ацетатом уменьшение частоты обострений рассеянного склероза ассоциировано с DRB1 *4, генотипом Г/С CD40 (rs6074022), снижение темпов инвалидизации - с женским полом и генотипом G/A TNF-a (rsl800629).

Теоретическая и практическая значимость

Установленные в исследовании генетические маркеры риска способствуют совершенствованию диагностики рассеянного склероза. Выявленные ассоциации полиморфизмов генов иммунной системы с особенностями течения рассеянного склероза, ответа на терапию глатирамера ацетатом создают основу для разработки индивидуализированной терапии этого заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У лиц европеоидной расы, родившихся и проживающих в Алтайском крае, риск развития рассеянного склероза повышен при носительстве аллелей 3 и/или 15 гена HLA-DRB1, генотипе С/С CD40 (rs6074022), а также при сочетании женского пола с аллелем А гена TNF- a (rs 1800629).

2. Особенности течения

ремитирующего рассеянного склероза ассоциированы с HLA-DRB*3, генотипами G/G, G/A гена TNFRSFIA (rs4149584), у женщин - с аллелем А гена TNFRSF1A (rs4149584).

3. Риск быстрого прогрессировать рассеянного склероза ассоциирован с мужским полом, коротким периодом первой ремиссии, поздним возрастом дебюта, нарушениями функций пирамидной и мозжечковой систем в период дебюта.

4. Эффективность трехлетнего лечения рассеянного склероза глатирамера ацетатом может модулироваться в зависимости от пола, полиморфизма HLA-DRB1, TNF-a(rs 1800629), CD40 (rs6074022).

Степень достоверности результатов

Исследование выполнено в соответствии с принципами доказательной медицины. Результаты получены на репрезентативных выборках с обоснованием критериев включения в исследование, стандартизованных группах больных и контроля с использованием стандартных методов клинического обследования, аналитически достаточно точных методов лабораторных и инструментальных исследований, адекватного задачам, типу переменных и характеру их распределения методов статистического анализа. Личный вклад автора

Лично автором проведены анализ отечественной и зарубежной литературы по теме исследования, клиническое обследование и наблюдение участников исследования, анализ медицинской документации, статистический анализ, интерпретация результатов исследования, подготовка публикаций по выполненной работе, написание диссертационной работы.

Молекулярно-генетические исследования выполнены совместно с сотрудниками группы фармакогеномики Института химической биологии и

фундаментальной медицины СО РАН (г. Новосибирск) - М.Л. Филиппенко и Е.А. Кудрявцевой (Соколовой). Исследования генетических факторов риска рассеянного склероза и клинических факторов риска быстрой инвалидизации выполнены совместно с преподавателями кафедры неврологии, нейрохирургии с курсом ФГТК и ППС ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации - Ю.Н. Игнатовой и И.В. Смагиной.

Апробация работы

Результаты работы доложены и апробированы на IV Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Рассеянный склероз: трудности диагностики и курации» (Новосибирск, 2009); XI городской научно-практической конференции «Молодежь - Барнаулу» (Барнаул, 2010); 2-ой региональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы лечения, реабилитации и профилактики у ветеранов войн», посвященной 65-летию ГУЗ «Краевой госпиталь для ветеранов войн» (Барнаул, 2011); краевой научно-практической конференции (Барнаул, 2012); XIV городской научно-практической конференции «Молодежь - Барнаулу» (Барнаул, 2012); VI Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Рассеянный склероз и другие аутоиммунные заболевания нервной системы» (Новосибирск, 2013); заседании проблемной комиссии по неврологии ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ (2015).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 5 статей - в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата и доктора медицинских наук.

Внедрение результатов работы

Результаты исследования внедрены в практику оказания помощи больным рассеянным склерозом в Алтайском крае: назначение иммуномодулирующих препаратов больным рассеянным склерозом проводится с учетом клинико-анамнестических и генетических факторов риска заболевания. Основные положения работы используются в образовательном процессе на кафедре неврологии,

нейрохирургии курсом ФГПС и ППС ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 101 странице и состоит из введения, обзора литературы, трех глав с результатами исследования и их обсуждением, заключения, выводов, практических рекомендаций. Рабата иллюстрирована 25 таблицами, одним рисунком. Указатель литературы содержит 57 работ отечественных и 186 работ зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Методология, материал и методы исследования

Все включенные в исследование пациенты с PC наблюдались в краевом центре демиелинизирующих заболеваний на базе поликлинического отделения КГБУЗ «Краевая клиническая больница» (г. Барнаул). Диагноз PC ставили по критериям McDonald (Polman С.Н. et al., 2005). Магнитно-резонансную томографию (MPT) головного и спинного мозга проводили на томографе Impact (Siemens-Magnetom, Япония) с напряженностью магнитного гтоля 1Т со стандартными TI- и Т2-изображениями и применением режима TIRM. Для контрастирования внутривенно вводили гадолинийсодержащий препарат гадовист (Bayer Schering Pharma, ФРГ) в дозе от 0,1 до 0,3 ммоль/кг массы тела.

Тяжесть клинического состояния и степень инвалидизации оценивали по шкале инвалидизашш (Expanded Disability Status Scale - EDSS) (Kurtzke J.F., 1983). Скорость прогрессирования (СП) PC рассчитывали делением EDSS на длительность болезни (Малкова H.A., 1988, 2006; Verians Е. et al., 1983).

Связь полиморфизма генов с риском PC оценивали по результатам рандомизированного контролируемого одномоментного исследования «случай-контроль». Группа больных PC (200 пациентов с ремитирующим типом течения) была сформирована как случайная выборка из популяции больных PC Алтайского края (на 01.01.2010 г. - 1001 пациент). Все больные родились и проживали в Алтайском крае, по этнической принадлежности - русские, по фенотипическим признакам - европеоиды. Группа контроля из 200 добровольцев, не страдающих PC и другими аутоиммунными заболеваниями, была стандартизована с группой

больных РС по половому составу, возрасту, этнической принадлежности, месту рождения и проживания. Характеристика групп участников исследования приведена в таблице 1.

Анализ ассоциации полиморфизма генов с особенностями течения РС и ответом на терапию глатирамера ацетатом (ГА) был выполнен по результатам рандомизированных ретроспективного и трехлетнего проспективного исследований соответственно.

Таблица 1 - Характеристика участников исследования генетического риска рассеянного склероза

Группа больных РС п=200 Группа контроля п=200 Уровень значимости различий, р

Возраст, годы (М + 50) 35,0+10,2 34,8+12,4 0,603

Соотношение мужчины : женщины, % 27,0:73,0 27,0:73,0 1,000

Возраст дебюта РС, годы (М + 5Э) 27,1+8,3

ЕОЗв, баллы (М + 80) 3,3+1,5

Длительность заболевания, годы (М + 80) 7,6+1,2

В исследование было включено 100 больных РС с инвалидизацией не более 6,5 балла по ЕОЗЭ и длительностью заболевания не менее 5 лет. Длительность заболевания в этой группе больных составила 7,8+1,6 года (от 6 до 10 лет, медиана -7 лет), СП РС - 0,50+0,22 балла/год (от 0 до 1,0). Для анализа связи СП РС с полиморфизмом генов больные были разделены на три подгруппы: с медленной СП (<0,25 баллов/год) - 13 пациентов (13%), средней (0,25<СП<0,75 баллов/год) - 64 пациент (64%) и высокой СП (>0,75 баллов/год) - 23 пациента (23%).

Включение в исследование больных с длительностью заболевания не менее 5 лет связано с тем, что в начальном периоде РС динамика развития неврологического дефицита, как правило, широко варьирует. Это, вероятно, обусловлено индивидуальными особенностями сочетания ослабевающего с течением болезни иммунного воспаления и усиливающегося процесса дегенерации в ЦНС. После развития тяжелых необратимых неврологических нарушений (ЕЭ88 более 6,5 баллов), которые нередко сохраняются на протяжении многих лет, низкая скорость инвалидизации не является показателем благоприятного течения РС.

Глатирамера ацетат (Копаксон-Тева, TEVA Pharmaceutical Industries Ltd., Израиль) назначался в стандартной дозе - 20 мг подкожно, ежедневно. При включении в исследование и через три года лечения ГА оценивали инвалидизацию по шкале EDSS, СП и частоту обострений (количество обострений в год). По ответу на терапию ГА все пациенты были разделены на две подгруппы: Responder (терапия эффективна) и Non-responder (терапия малоэффективна или неэффективна) (таблица 2).

Таблица 2 - Критерии эффективности лечения больных рассеянным склерозом глатирамера ацетатом

Группы больных в зависимости от ответа на терапию Частота обострений Скорость прогрессирования

Responder (терапия эффективна) Уменьшение Уменьшение

Non-responder (терапия малоэффективна или неэффективна) Нет изменений или увеличение Нет изменений или увеличение

Выбор для исследования однонуклеотидных полиморфизмов генов HLA-DR, TNF-а, TNFRSF1.4, CD40 проводили с учетом данных о связи локализованных там аллелей с риском развития и/или патогенезом аутоиммунных заболеваний, включая PC (Oksenberg J.R, Baranzini S.E., 2010). При исследовании полиморфных последовательностей генов из венозной крови получали ДНК с использованием стандартной процедуры, включающей выделение и лизис клеток крови, гидролиз белков протеиназой К, очистку ДНК фенол-хлороформом и осаждение ДНК этанолом. Генотипирование выполняли с применением TaqMan-зондов на амплификаторе iCycler iQ5 (Bio-Rad, США). При генотипировании HLA-DRBI секвенирование амплифицированных фрагментов ДНК проводили по методу Сэнгера на автоматическом секвенаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer с использованием набора BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, США). Реакцию Сэнгера проводили на амплификаторе Eppendorf Mastercycler gradient (Eppendorf, США).

Проведение исследований разрешено этическим комитетом ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Методы статистического анализа

В программе вшЦзйса V. 6.0 проводили межгрупповые сравнения по двухстороннему точному критерию Фишера, критерию Манна-Уитни, оценивали связи между переменными по коэффициенту корреляции Спирмена (г5), отношение шансов (ОШ) - методом логистического регрессионного анализа. Соответствие распределения генотипов равновесию Харди-Вайнберга оценивали по критерию хи-квадрат с помощью программы ОеРтеШ на сайте Института генетики человека (Мюнхен, ФРГ). Количественные показатели представлены в виде выборочного среднего (М) с указанием стандартного отклонения (±80), в ряде случаев - 95% доверительного интервала (ДИ). Для всех использованных статистических критериев принят критический уровень значимости р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ ассоциации полиморфизма генов НЬ.4-й11В1, ТХР-а («1800629), (п4149584), СВ40 («6074022, «11086998) с риском рассеянного склероза

По результатам генотипирования НЬА-ОКВ1 установлено, что распределение генотипов как в группе больных РС, так и в контрольной группе соответствовало распределению Харди-Вайнберга (р=0,87 и р=0,90, соответственно). Распределение частот аллелей гена ОКБ 1 у больных РС и в контрольной группе представлено на рисунке 1.

Рисунок 1 - Частоты носительства аллелей полиморфного локуса НЬА-ОИВ! в группе больных рассеянным склерозом и в контрольной группе

Как показал логистический регрессионный анализ с поправкой на пол,

с повышенным риском развития PC ассоциированы аллели DR3 и DR15 (таблица 3). Это согласуется с данными о связи PC с DR15 в популяциях народов европеоидной группы (Фаворова О.О., Бойко А.Н. и др., 2010; Mohme М., Hotz С. et al. 2013).

Установлено, что с развитием PC в Алтайском крае значимо ассоциированы четыре генотипа - DRB1*13+15, DRB1*15(2), DRBl*15+3, Ш*В1*3+другие (под «другими» понимаются все полученные в выборке аллели HLA-DRB1, отличные от аллелей 3 и 15 и встречающиеся с частотой менее 20%), (таблица 3).

Таблица 3 - Относительный риск рассеянного склероза в зависимости от носительства аллелей и генотипа полиморфного локуса HLA-DRB1

Отношение шансов, среднее значение (доверительный интервал) Уровень значимости, р

Аллель

1 0,56 (0,19-1,81) 0,256

3 3,21 (0,87-11,29) 0,035

4 0,87 (0,42-3,16) 0,831

7 0,57 (0,32-1,86) 0,391

11 0,68 (0,35-1,87) 0,644

13 1,80 (0,67-3,95) 0,213

15 2,45(1,02-5,71) 0,039

Генотип

13/15 15,98 (3,27-77,91) 0,001

15/15 16,57 (2,31-139,78) 0,011

15/3 7,41 (1,44-38,97) 0,029

3/3 0,61 (0,37-0,82) 0,974

15/Другие 2,31 (0,84-36,83) 0,073

З/Другие 4,02(1,13-12,71) 0,038

Распределение генотипов TNF-a (rsl800629), TNFRSF1A (rs4149584) соответствовало распределению Харди-Вайнберга в группе больных PC и в группе контроля (для TNF-a (rsl800629) р=0,54 и р=0,45, для TNFRSF1A (Ы149584) р=0,71 и р=0,19 соответственно). Не выявлено ассоциации аллелей или генотипов этих полиморфизмов с предрасположенностью к PC (таблица 4).Следует отметить, что данные о связи полиморфизма -308G>A гена TN Fa с предрасположенностью к PC, полученные в разных популяциях, противоречивы (Lucotte G. et al., 2000; Drulovic J. et al., 2003; Favorova O.O. et al., 2006; Forte G.I. et al., 2006; Ristic S. et al., 2007), что

может отражать генетическую гетерогенность РС в разных популяциях.

Обнаружена значимая связь РС с сочетанием женского пола и аллеля А гена ГЛ^-а (те 1800629) (ОШ 5,04; ДИ 1,17-21,13; р=0,029). Это согласуется с мнением о большей статистической мощности анализа сочетаний генов по сравнению с анализом отдельных геномных последовательностей при выявлении предрасположенности к РС (Фаворова О.О., Бойко А.Н. и др., 2010).

Таблица 4 - Относительный риск рассеянного склероза в зависимости от носительства аллелей и генотипа (ге 1800629), ГЛтаЯГ/Л (Ы149584), С040 («6074022, гя 11086998)

Численность аллелей,

Генотипы, аллели генотипов Отношение шансов, Уровень значимости, р

Группа больных PC n=200 Группа контроля п=200 среднее значение (ДИ)

TNFa (rs 1800629)

G/G 156 152 0,89(0,46-1,74) 0,737

G/A 42 42 1,01 (0,51-1,98) 1,00

A/A 2 6 3,06(0,31-30,37) 0,336

A 44 48 1,42(0,62-3,26) 0,402

G 198 194 0,70 (0,31-1,61) 0,401

TNFRSF1A (rs4149584)

G/G 182 190 0,53(0,23-1,19) 0,122

G/A 18 10 1,88(0,84-4,19) 0,122

A/A 0 0 NA NA

A 18 10 2,69 (0,59-12,26) 0,198

G 200 199 0,37 (0,08-1,69) 0,198

CD40 (rs6074022)

T/T 94 124 1,13 (0,76-1,67) 0,547

T/C 92 72 0,66 (0,44-0,99) 0,041

C/C 14 4 4,85(1,60-14,14) 0,005

T 186 196 0,80 (0,42-1,54) 0,512

С 106 76 1,25 (0,65-2,41) 0,511

CD40 (rs 11086998)

C/C 192 196 2,04 (0,36-11,51) 0,416

C/G 8 4 0,48 (0,09-2,77) 0,416

G/G 0 0 NA NA

С 200 200 2,04 (0,36-11,55) 0,417

G 8 4 0,48 (0,09-2,77) 0,416

Примечание. Здесь и далее NA (not available) - результат не представлен в связи с объемом выборки, недостаточным для корректного статистического анализа.

Распределение генотипов CD40 (rs6074022) и CD40(rsl 1086998)соответствовал о распределению Харди-Вайнберга в фуппе больных PC и в группе контроля (р=0,88 и р=0,73; р=0,86 и р=0,79; соответственно). Не найдено возрастания риска PC в зависимости от носительства редких аллелей: G - для специфичности rsl 1086998 и С у гетерозигот - для специфичности rs6074022, тогда как гомозиготное состояние по аллелю С специфичности CD40 (rs6074022) ассоциируется с повышенным риском PC (таблица 4). Генотип Т/С CD40 (rs6074022) может иметь протективное влияние в отношении риска PC.

Таким образом, полученные данные позволяют рассматривать в качестве генетических факторов риска PC в популяции Алтайского края носительство аллелей 3 и 15 HLA-DRB1, сочетание женского пола и аллеля А гена TNFa (rsl800629), генотип С/С полиморфизма CD40 (rs6074022).

Анализ ассоциации полиморфизма генов HLA-DRB1,

TNFa (rsl800629), TNFRSF1A (rs4149584), CD40 (rs6074022, rsl 1086998) с особенностями течения рассеянного склероза

Ассоциации полиморфизма генов HLA-DRB1, TNFa (rsl800629), TNFRSF1A (rs4149584), CD40 (rs6074022, rsl 1086998) с особенностями течения PC оценивали ретроспективно по данным обследования 100 больных PC за весь период болезни до назначения ПИТРС.

Как показал анализ, риск быстрого прогрессирования PC связан только с одной из исследованных специфичностей генов - TNFRSF1A (rs4149584). При этом генотип G/A TNFRSF1A (rs4149584) ассоциирован с повышенным риском высокой СП PC, тогда как носительство генотипа G/G, напротив, с более низкими темпами инвалидизации (таблица 5). Ни для одного из генотипов HLA-DRB1, включая генотипы риска PC, не найдено ассоциации с высокой СП PC.

При исследовании половых особенностей динамики инвалидизации больных PC установлено, что СП у мужчин в 2 раза выше, чем у женщин (0,74+0,23 и 0,37+0,05 баллов в год, соответственно, р=0,009). Мужской пол положительно коррелировал со СП (rs=0,42, р=0,004) и ассоциировался с повышенным риском высокой СП PC (0111=2,21 ; ДИ 1,96-2,29; р=0,015). В связи с этим были проанализированы ассоциации сочетаний мужского или женского пола с генотипами или аллелями исследованных специфичностей. Выявлена связь сочетания женского пола и носительства аллеля A TNFRSF1A (rs4149584) с повышенным риском высокой СП PC (таблица 6).

Таблица 5 - Относительный риск высокой скорости прогрессирования рассеянного склероза в зависимости от генотипов ты ра (к!800629), тырибпа (ы149584), с040 (>$6074022, п11086998)

Генотип полиморфизма Частота генотипов, % Отношение шансов, среднее значение (ДИ) Уровень значимости, р

Низкая и умеренная СП Высокая СП

7№а (« 1800629)

ею 56 21 1,14(0,42-3,11) 0,791

в/а 15 7 1,04 (0,37-2,92) 0,942

А/А 0 1 КА КА

"ШИ^ЧА («4149584)

ею 59 26 0,05 (0,01-0,43) 0,005

а а 1 8 20,0 (2,3-172,5) 0,005

А/А 0 0 ЫА КА

св40 («6074022)

Т/Т 38 14 0,94(0,41-2,19) 0,892

Т/С 31 15 1,65 (0,71-3,17) 0,809

С/С 10 1 0,11 (0,01-1,85) 0,531

сэ40 (« 11086998)

С/С 59 31 0,64 (0,06-6,55) 0,700

ас 1 3 1,57 (0,15-16,15) 0,700

0 0 ЫА

Таблица 6 - Относительный риск высокой скорости прогрессирования рассеянного склероза в зависимости от сочетания пола и аллелей риска специфичностей НЬА-ОКВ1, ТЭТа («1800629), ТШТ^ПА («4149584), С040 («6074022, «11086998)

Полиморфизм гена, аллель риска, пол Отношение шансов, среднее значение (ДИ) Уровень значимости, р

ны-йквц3), мужской ЫА МА

Я1Л-£>ЛВ/(3), женский 0,49 (0,06-2,84) 0,365

ша-ояв1(15), мужской 0,38 (0,05-2,84) 0,318

ны-01{в1(15), женский 0,52(0,12-2,24) 0,367

ЮТа («1800629) (аллель А), мужской 3,61 (0,24-55,79) 0,315

ТОТа (к 1800629) (аллель А), женский 1,31 (0,16-10,87) 0,787

ЮТЮТМ («4149584) (аллель А), мужчины ^ ИА

ТКга5Р1А («4149584) (аллель А), женщины 2,78(1,12-6,89) 0,026

СБ40 («6074022) (аллель С), мужчины 0,38 (0,59-2,38) 0,276

СБ40 («6074022) (аллель С), женщины 0,27(0,05-1,61) 0,144

С040 («11086998) (аллель в), мужчины ИА ЫА

С040(ге 11086998) (аллель в), женщины 0,47 (0,03-8,21) 0,588

Таблица 7 - Относительный риск высокой скорости профессирования рассеянного склерозав зависимости от особенностей дебюта заболевания

Показатель Отношение шансов, среднее значение (ДИ) Уровень значимости, р

Возраст дебюта более 27 лет* 2,37 (1,24-4,32) 0,004

Длительность первой ремиссии менее 24 мес.* 3,54(1,58-7,37) 0,002

Пирамидные нарушения в дебюте 2,28 (1,16-4,66) 0,007

Мозжечковые нарушения в дебюте 2,04 (0,95-4,29) 0,015

Примечание: * - в качестве порогового значения использована медиана.

В популяции больных РС Алтайского края ранее было установлено, что риск высокой СП РС ассоциирован с определенными характеристиками дебюта заболевания: возрастом дебюта более 27 лет, двигательными нарушениями в дебюте, длительностью первой ремиссии менее двух лет (Смагина И.В., Ельчанинова С.А., 2012). Эти закономерности подтвердились в нашем исследовании (таблица 7). Вместе с тем не найдено связи ни одной из прогностически неблагоприятных особенностей дебюта РС с исследованными полиморфизмами генов.

Частота обострений РС положительно коррелировала с аллелями риска РС -аллелем А ТЫРа (ге 1800629) и аллелем 3 HL.A-DR.Bl (таблица 8). Расчет отношения шансов выявил ассоциацию с повышенным риском обострений РС чаше одного раза в год только для Н1Л^В1*3 (ОШ=8,62; ДИ 1,25^-59,72; р=0,027).

Таблица 8 - Связь аллелей риска специфичностей ТЫ Б а (ге 1800629), ТЫРК8Е1А («4149584), С040 («6074022, « 11086998), НЬА-01*В 1 с частотой обострений

рассеянного склероза

Полиморфизм гена, аллель риска Коэффициент корреляции Спирмена Уровень значимости, р

ТЫИа (« 1800629) (аллель А) 0,205 0,040

"ШИШЧА («4149584) (аллель А) -0,177 0,076

Сй40 («6074022) (аллель С) 0,057 0,575

СР40 («11086998) (аллель О -0,115 0,258

Н1А^В1 (аллель 15) -0,115 0,256

НЫ-ОЯВ! (аллель 3) 0,194 0,042

Таким образом, с высокой СП РС ассоциирована полиморфная последовательность ТКП18Р1А («4149584), кодирующая структуру рецепторов цитокинов, вовлеченных в иммунное воспаление и апоптоз при РС. Эта ассоциация проявляется независимо от прогностически небаагоприятных особенностей дебюта

заболевания. Предрасположенность к частым обострениям PC значимо связана с аллелем HLA-DRB1*3, идентифицированным как фактор риска PC в этой же популяции.

Особенности ответа больных рассеянным склерозом на лечение глатирамера ацетатом в зависимости от полиморфизма HLA-DRB1, TNFa (rsl800629), TNFRSF1A (rs4149584), CD40 (rs6074022, rsl1086998)

В проспективном трехлетнем наблюдении у 100 больных PC (23 мужчины, 77 женщин) была оценена эффективность терапии ГА. Установлено, что более половины пациентов (56%) ответили на лечение как уменьшением частоты обострений, так и снижением СП (таблица 9). Это согласуется с результатами других исследований эффективности ГА при PC, включая результаты длительных проспективных постмаркетинговых отечественных наблюдений (Бойко А.Н., Давыдовская М.В. и др., 2012; Переседова A.B., Завалишин И.А., 2012; Johnson K.P., Ford С.С. et al., 2005).

Таблица 9 - Распределение больных рассеянным склерозом по ответу на терапию глатирамера ацетатом

Критерии эффективности Responder (%) Non Responder (%) Уровень значимости различий, р

Уменьшение частоты обострений 58,0 42,0 <0,001

Уменьшение скорости прогрессирования 93,0 7,0 0,012

Уменьшение и частоты обострений, и скорости прогрессирования 56,0 44,0 <0,001

По данным различных клинических испытаний, в зависимости от критериев оценки эффективности лечения от 30 до 50% больных невосприимчивы к терапии ПИТРС (Fisk J.D., Brown M.G., 2005; Brown M.G., Kirby S., 2007; Laing R. et al„ 2011).

Необходимо отметить, что эффективность терапии PC принято оценивать по изменению частоты обострений заболевания и динамики инвалидизации. Эти характеристики течения PC положены в основу различения оптимального или неоптимального ответа на терапию ГА и в нашем исследовании. Однако количественные критерии оптимального ответа на лечение по каждой из этих характеристик течения PC у разных исследователей различны и, по мнению ведущих специалистов, требуют стандартизации (Гусев Е.И., Завалишин И.А., 2011; Pozzilli С.,

Prosperini L., 2008; Healy B.C., Glanz B.I., 2010).

За период наблюдения уменьшение частоты обострений на фоне терапии ГА выявлено только у женщин, тогда как снижение СП заболевания было отмечено в группе в целом, у женщин и у мужчин (таблица 10).

Таблица 10 - Изменение скорости прогрессирования и частоты обострений рассеянного склероза через три года лечения глатирамера ацетатом

До лечения Через три года лечения Уровень значимости различий, р

Скорость прогрессирования, баллы по EDSS в год

Группа п=100 0,77+0,09 0,32+0,26 <0,001

Мужчины п=23 1,05+1,32 0,41 ±0,23 0,034

Женщины п=77 0,69+0,72 0,29+0,26 <0,001

Количество обострений в год

Группа п=100 1,07±0,65 0,65±0,73 <0,001

Мужчины п=23 1,12+0,54 0,88±0,83 0,252

Женщины п=77 1,05+0,68 0,58±0,62 <0,001

Влияние терапии ГА проявилось снижением доли больных с высокой СП (до лечения - 34%; через три года лечения - 10%, р<0,012).

Не выявлено ассоциации генотипов, а также аллелей НЬА-ЖВ1 со снижением СП заболевания на фоне лечения ГА. Обнаружена положительная связь ОЯВI *4 с уменьшением частоты обострений РС на фоне лечения ГА (таблица 11). Это согласуется с данными Царевой Е.Ю. и соавт. (2012), полученными при фармакогеномном анализе эффективности лечения ГА в группе больных РС, русских по этнической принадлежности.

Установлено, что со снижением СП на фоне лечения ассоциирован генотип й/А ТЫР-а (ге 1800629), со снижением частоты обострений - генотип Т/С С040 («6074022). Не найдено ассоциации аллелей и генотипов других исследованных специфичностей с ответом на лечение ГА (таблица 12).

Таблица 11 - Ассоциация аллелей НЫ-ОИВ] со снижением скорости прогрессирования и частоты обострений рассеянного склероза на фоне трех лет терапии глатирамера ацетатом

Уменьшение Уменьшение

скорости прогрессирования частоты обострений

Аллель Отношение Уровень Отношение шансов, Уровень

шансов,среднее значение (ДИ) значимости, Р среднее значение (ДИ) . значимости, Р

ОКВ1*1 2,73 (0,47-15.75) 0,250 0,69 (0,20-2,35) 0,552

БИВ 1*3 1,81 (0,09-34,91) 0,694 0,43 (0,07-2,66) 0,361

01*В1*4 ИА НА 4,53 (1,20-17,1) 0,023

01*В1*7 1,59 (0,18-14,14) 0,681 0,67 (0,24-1,90) 0,454

ЭКВ1*8 0 0,990 1,30 (0,35-4,85) 0,690

ОЯВ 1*11 2,16 (0,47-10,01) 0,323 0,74 (0,28-1,90) 0,523

ОКВ1*13 3,71 (0,29-46,76) 0,305 0,84 (0,17-4,06) 0,824

ОКВ1*15 0,60 (0,05-6,75) 0,682 1,17 (0,33-4,19) 0,802

ОКВ1*16 ИА КА 0,96 (0,20-4,64) 0,963

Таблица 12 - Ассоциация аллелей и генотипов 7№"-а (гя1800629) и СЭ40 (п6074022) со снижением скорости прогрессирования и частоты обострений рассеянного склероза на фоне трех лет терапии глатирамера ацетатом

Аллель (генотип) Уменьшение скорости прогрессирования Уменьшение частоты обострений

Отношение шансов, среднее значение (ДИ) Уровень значимости, р Отношение шансов, среднее значение (ДИ) Уровень значимости, р

ЮТ-а (ге 1800629)

С 0,10(0,01-1,48) 0,094 1,74(0,29-10,50) 0,544

А 9,69(0,68-138,47) 0,096 0,58 (0,10-3,47) 0,547

в/в 0,24 (0,05-1,09) 0,067 1,52 (0,58-3,97) 0,390

в/А 4,75(1,05-21,40) 0,044 0,52 (0,19-1,41) 0,192

А/А ИА ИА ЫА ЫА

СЭ40 («6074022)

Т 0,40 (0,03-5,74) 0,501 МА ИА

С 2,49(0,17-35,48) 0,491 НА ИА

Т/Т 0,53 (0,12-2,38) 0,401 ИА 0,970

Т/С 2,07 (0,46-9,39) 0,340 0,09 (0,35-0,24) <0,001

с/с НА МА 1ЧА ЫА

Результаты исследования подтверждают известные факты о гетерогенности ответа на лечение ГА - иммуномодулирующего препарата первой линии при длительном патогенетическом лечении больных PC (Бойко А.Н., Давыдовская М.В. и др., 2012, Царева Е.Ю., Кулакова О.Г. и др., 2011, Johnson K.P., Ford С.С. et al., 2005). Представляется перспективным анализ полиморфизма HLA-DRB1, TNF-a (rs!800629), CD40 (rs6074022) как возможных прогностически значимых генетических факторов, влияющих на реакции организма больных PC при длительности терапии ГА более трех лет.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на доказанность участия нарушений иммунного ответа в патогенезе PC остается малоизученным вопрос о том, какие именно генетические особенности иммунной системы являются значимыми факторами развития, прогрессирования этого заболевания и могут влиять на ответ больных PC на широко используемую в настоящее терапию современными дорогостоящими иммуномодулирующими препаратами. С учетом варьирования заболеваемости PC в разных популяциях представлялось обоснованным изучение связи полиморфизма генов иммунной системы с риском развития и особенностями течения этого мультифакторного заболевания в Алтайском крае.

Результаты исследований позволяют заключить, что отдельные из изученных полиморфизмов специфичностей генов иммунной системы - DR бета 1 главного комплекса гистосовместимости, гена фактора некроза опухоли альфа (rs!800629), генов рецепторов семейства фактора некроза опухоли 1А типа и 5 типа (rs4149584 гена TNFRSF1A и rs6074022 гена CD40 соответственно) - значимо ассоциированы с развитием и/или неблагоприятными особенностями течения PC, снижением темпов инвалидизации в ответ на иммуномодулирующую терапию копаксоном. Ассоциации PC с определенными специфичностями генов, кодирующих белки семейства фактора некроза опухоли, имеют половые особенности: только у женщин повышен риск развития PC при носительстве аллеля А TNF-a (rsl800629) и риск быстрого прогрессирования заболевания при носительстве аллеля А TNFRSF1A (rs4149584).

Выявленные клинико-генетические ассоциации указывают на перспективность использования результатов генотипирования HLA-DRB1, TNF-a (rsl800629), TNFRSF1A (rs4149584), CD40 (rs6074022) и CD40 (rslI086998) в прогнозировании течения PC и определении тактики терапии при оказании специализированной медицинской помощи больным, страдающим этим заболеванием.

ВЫВОДЫ

1. Генетическими факторами риска рассеянного склероза в популяции европеоидов, родившихся и проживающих на территории Алтайского края, являются аллели 3 и 15 HLA-DRB1, а также сочетание женского пола и аллеля A TNF-a(rs 1800629), генотип С/С CD40 (rs6074022).

2. Риск быстрого прогрессирования ремитирующего рассеянного склероза увеличивают мужской пол, короткий период первой ремиссии, поздний возраст дебюта, нарушения функций пирамидной и мозжечковой систем в период дебюта вне связи с полиморфизмами HLA-DRB1, TNF-а (rs1800629), TNFRSF1A (Ы149584), CD40 (rs6074022, rsl 1086998).

3. С частыми обострениями ремитирующего рассеянного склероза ассоциирован HLA-DRB1*3, тогда как с высокой скоростью прогрессирования заболевания - генотип G/A TNFRSF1A (rs4149584), сочетание женского пола и аллеля A TNFRSF1A (rs4149584); протективное влияние на прогрессирование заболевания имеет генотип G/G TNFRSF1A (rs4149584).

4. Эффективность терапии глатирамера ацетатом в течение трехлетнего периода у больных ремитирующим рассеянным склерозом в отношении снижения темпов инвалидизации ассоциирована с женским полом, генотипом G/A TNF-a (rsl800629), в отношении частоты обострений - с HLA-DRB1*4 и генотипом Т/С CD40 (rs6074022).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При дифференциальной диагностике рассеянного склероза и оценке предрасположенности к этому заболеванию у европеоидов, родившихся и проживающих в Алтайском крае, в качестве генетических маркеров риска рассеянного склероза рекомендуется рассматривать носительство аллелей 3 и 15 HLA-DRB1, сочетание женского пола и аллеля A 7Wa (rsl 800629), генотип С/С CD40 (rs6074022).

2. При выборе тактики лечения рассеянного склероза (эскалационной или индукционной терапии) рекомендуется учитывать, что факторами риска быстрого прогрессирования заболевания являются: мужской пол, возраст дебюта более 27 лет, длительность первой ремиссии менее 2 лет, нарушения функций пирамидной и мозжечковой систем в дебюте, генотип G/A TNFRSF1A (rs4149584), сочетание женского пола и аллеля A TNFRSF1A (rs4149584).

3. При персонифицированном выборе препаратов, изменяющих течение рассеянного склероза, рекомендуется учитывать, что со снижением темпов инвалидизации при применении глатирамера ацетата ассоциируются женский пол и носительство генотипа G/A TN F-a (is1800629).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК РФ

1. Игнатова, Ю.Н. Ретробульбарный неврит у больных рассеянным склерозом / Ю.Н. Игнатова, И.В. Смагина, А.О. Гридина и др. // Бюл. сибирской медицины. - 2009. - Т. 8, № 3 (2). - С. 115-117.

2. Смагина, И.В. Клинические и лабораторные предикторы высокой скорости прогрессирования рассеянного склероза / И.В. Смагина, С.А. Ельчанинова, A.B. Поповцева, А.О. Гридина и др. // Кремлевская медицина. Клинический вестник. -2010. - №4.-С. 16-18.

3. Ельчанинова, С.А. Конвекционные и генетические факторы риска рассеянного склероза в Алтайском крае / С.А. Ельчанинова, С.А. Федянин, И.В. Смагина, А.О. Гридина и др. // Вестн. Алтайской науки. - 2010. - № 1 (8). - С. 5-7.

4. Смагина, И.В. Факторы, ассоциированные с высокой скоростью прогрессирования рассеянного склероза / И.В. Смагина, С.А. Ельчанинова, А.Г. Золовкина, А.О. Гридина // Рассеянный склероз : прил. к «Журн. неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова». - 2011. - Т. 111, № 2 (вып. 2). - С. 25-29.

5. Смагина, И.В. Клинические проявления дебюта рассеянного склероза в Алтайском крае / И.В. Смагина, А.О. Гридина, Ю.Н. Игнатова и др. // Вестн. неврологии, психиатрии и нейрохирургии. - 2011. - № 10. - С. 66-70.

Прочие работы, опубликованные по теме диссертации

1. Ельчанинова, С.А. Клинические особенности рассеянного склероза в Алтайском крае / С.А. Ельчанинова, И.В. Смагина, А.О. Гридина и др. // Роль и место санаторно-курортных и реабилитационных учреждений в системе медицинских кластеров Алтайского края : тез. науч.-практ. конф., посвящ. 65-летию санатория «Барнаульский». - Барнаул, 2010. - С. 90-93.

2. Смагина, И.В. Случаи позднего дебюта рассеянного склероза в Алтайском крае / И.В. Смагина, C.B. Климанова, А.О. Гридина и др. // Актуальные вопросы лечения, реабилитации и профилактики у ветеранов войн : материалы 2-ой регионал. науч.-практ. конф., посвящ. 65-летию ГУЗ «Краевой госпиталь для ветеранов войн». - Барнаул, 2010. - С. 163-164.

3. Смагина, И.В. Ассоциация пола, полиморфных локусов генов HLA-DRBI, TNFa (rs 1800629), KIFIB (rs 10492972), CD40 (rs 6074022) с течением рассеянного склероза / И.В. Смагина, A.B. Поповцева, А.О. Гридина, С.А. Ельчанинова // Актуальные вопросы неврологии материалы 12-ой Межрегионал. науч.-практ. конф. с обсуждением смежных вопросов неврологии и медицинской генетики. - Новосибирск, Томск, 2012. - С. 132-133.

4. Юрченко, Ю.Н. Анализ семейных случаев рассеянного склероза / Ю.Н. Юрченко, А.О. Гридина, О.В. Переверзева и др. // Актуальные вопросы современной медицины : сб. науч. трудов по итогам 2-й международ, науч.-практ. конф. -Екатеринбург, 2015. - С. 45-48.

5. Смагина, И.В. Анализ ассоциации полиморфизма генов TNFRSFIA (rsI449584), TNFa (rs1800629) с прогрессированием рассеянного склероза / И.В. Смагина, С.А. Ельчанинова, А.О. Гридина и др. // Нейроиммунология. - 2015. - Т. 12, № 1-2. -

С. 86-87.

6. Ельчанинова, С.А. Особенности ответа больных рассеянным склерозом на лечение глатирамера ацетатом в зависимости от полиморфизма HL4-DRBI, TNF-a (rs 1800629), TNFRSFIA (rs4149584), CD40 (rs 6074022, rs 11086998) / C.A. Ельчанинова, И.В. Смагина, А.О. Гридина и др. // Факультет повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов -практическому здравоохранению : материалы ежегодной науч.-практ. конф. с международ, участием. - Барнаул, 2015. - С. 71-77.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГА - глатирамера ацетат

ДИ - 95% доверительный интервал

ОШ - отношение шансов

ПИТРС - препараты, изменяющие течение рассеянного склероза PC - рассеянный склероз

СП - скорость прогрессирования

CD40 - молекула CD40, рецептор семейства фактора некроза опухоли 5 типа

(CD40 molecule, TNF receptor superfamily member 5) EDSS - расширенная шкала инвалидизации (Expanded Disability Status Scale)

HLA-DRBI - DR бета 1 главного комплекса гистосовместимости (major histocompatibility complex, class II, DR beta 1) TNFRSFIA - рецептор семейства фактора некроза опухоли 1А типа (tumor necrosis factor receptor superfamily, member 1 A) TNF-a - фактор некроза опухоли альфа (tumor necrosis factor a)

Подписано в печать 09.09.2015 г. Формат 60x90/16. Бумага офсетная. Печать цифровая. Заказ № IЯ

2015809510

2015809510