Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Клиническое значение реактивного клеточного микроокружения при фолликулярных лимфомах

На правах рукописи

ТУПИЦЫНА Дарья Николаевна

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РЕАКТИВНОГО КЛЕТОЧНОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ ПРИ ФОЛЛИКУЛЯРНЫХ ЛИМФОМАХ

(14.01.12 - онкология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 3 ДЕК 2012

Москва - 2012

005057297

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук

Директор

академик РАН и РАМН, профессор Давыдов Михаил Иванович

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук

Османов Евгений Александрович Ковригина Алла Михайловна

Официальные оппоненты:

Поддубная Ирина Владимировна

член-корреспондент РАМН, профессор, ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России, заведующая кафедрой онкологии

Кадагидзе Заира Григорьевна

доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, заведующая централизованным клинико-лабораторным отделом

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства России

Защита диссертации состоится «/З»¿'/^<Р 2012 года в /О* часов на заседании диссертационного совета в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

Автореферат разослан « 2012 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

'(/ос

Шишкин Юрий Владимирович

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Фолликулярные лимфомы (ФЛ) составляют 22% среди всех неходжкинских лимфом взрослых. Это гетерогенная группа опухолей как по морфологическим характеристикам (выделяют 3 цитологических типа с нодулярным или диффузным характером роста), так и по клинической картине и прогнозу заболевания. Болезнь может протекать скоротечно и заканчиваться летальным исходом в течение первых 2 лет после диагностики или, напротив, -длиться более десятилетия. Причины крайних вариантов течения опухоли неясны. Прогностические индексы, разработанные специально для фолликулярной лимфомы (FLIPI), к сожалению, не охватывают всего многообразия болезни.

По этим причинам все большее число исследований направлено на изучение молекулярно-биологических особенностей фолликулярных лимфом. Опухоль характеризуется как высоко организованная структура, представленная всеми клеточными элементами зародышевого центра фолликула и паракортикальной зоны. К ним относятся в первую очередь опухолевые B-клетки, для обозначения которых используются термины «центроцит» и «центробласт», а также клетки так называемого реактивного неопухолевого микроокружения.

Взаимоотношения между опухолевыми клетками и элементами реактивного микроокружения - актуальная проблема клинической онкогематологии, и в последние годы она активно изучается.

В 2004 году серьезный прорыв в понимании биологии фолликулярных лимфом дала работа Dave S.S. и соавторов. Исследователи изучили профили генной экспрессии больных фолликулярными лимфомами до лечения, выделили гены, ассоциированные с различной выживаемостью, и сгруппировали их в соответствии с различным прогнозом заболевания. Особенно важным и интересным оказалось то, что данные профилей генной экспрессии характеризовали не биологические особенности опухоли, а уровни инфильтрации фолликулярных лимфом нормальными (неопухолевыми) иммунными клетками -Т-лимфоцитами и макрофагами. Профиль экспрессии «Иммунный ответ 1» (Immune response 1, IR-1) характеризовался благоприятным прогнозом (медиана выживаемости - 13,6 лет), а профиль экспрессии «Иммунный ответ 2» (IR-2), напротив - неблагоприятным (медиана выживаемости - 3,9 лет). Это была первая

публикация, в которой показана роль внутриопухолевой иммунной реакции при фолликулярных лимфомах и её влияния на прогноз заболевания. Прогностическое значение профилей генной экспрессии оказалось достоверно выше, чем любого из клинических или морфологических факторов, характеризующих фолликулярную лимфому.

В этой связи изучение прогностического значения иммуногистохимических особенностей клеток реактивного (неопухолевого) микроокружения при фолликулярных лимфомах является актуальной задачей клинической онкогематологии.

Дальнейшему решению данной актуальной задачи посвящена настоящая диссертационная работа.

Целью настоящей работы явилась оценка клинического значения реактивного клеточного микроокружения при фолликулярных лимфомах.

Задачи исследования.

1. Определить прогностическое значение клинических и морфологических параметров при фолликулярной лимфоме.

2. Оценить взаимосвязь иммунофенотипических характеристик опухолевой ткани (экспрессия CD10, CD23, CD21, Ki-67) с морфологическими особенностями и клинико-лабораторными факторами прогноза фолликулярной лимфомы (FLIPI).

3. Определить уровни дендритно-клеточной реакции в ткани фолликулярных лимфом (CD21, CD23) во взаимосвязи с морфологическими особенностями опухоли и клиническими признаками прогноза по FLIPI.

4. Определить уровни макрофагальной инфильтрации ткани фолликулярных лимфом (CD163) во взаимосвязи с морфологическими особенностями опухоли, клиническими признаками прогноза по FLIPI и результатами лечения.

5. Определить уровни Т-клеточной инфильтрации ткани фолликулярных лимфом (CD3, CD4, CD8, FOXP3, PD-1) и их связь с морфологическими особенностями опухоли и клиническими признаками прогноза по FLIPI.

Научная новизна. В результате проведенного исследования впервые изучены взаимоотношения реактивного микроокружения и опухолевых клеток фолликулярной лимфомы. По аналогии с профилями генной экспрессии Ж-1/1 Я-2 и на основании результатов изучения иммуногистохимических особенностей фолликулярной лимфомы установлены различные типы иммунологического ответа. Сохранность Т-клеточной субпопуляции лимфоцитов в интерфолликулярной области, а также нарастание инфильтрации этими клетками опухолевых зон характерны для больных с благоприятным прогнозом фолликулярной лимфомы, имеющих лучшие показатели общей выживаемости. Напротив, выраженная макрофагальная инфильтрация (СБ 163+) ассоциируется с неблагоприятным прогнозом. Установлена связь характера роста фолликулярной лимфомы с наличием фолликулярных дендритических клеток (СБ21+), а также уровнями Кл-67-позитивных клеточных элементов. Показано, что при выходе злокачественных клеток за пределы фолликулов, а также при нарастании диффузного роста утрачивается экспрессия антигена СБ 10 на злокачественных В-клетках. Установлено, что количественную оценку Т-регуляторных клеток (РОХРЗ+) целесообразно проводить только в зонах опухолевого роста (интрафолликулярно, парафолликулярно, в участках диффузного роста), так как уровни этих клеток в интерфолликулярных областях лимфатического узла не имеют прогностического значения. Сходные с БОХРЗ данные получены и для РБ1-позитивных лимфоцитов.

В условиях лечения ритуксимабом прогностическая роль выраженной макрофагальной инфильтрации нивелировалась. Прогностическая роль СИ4+ Т-лимфоцитов и регуляторных БОХРЗ+ Т- клеток сохранялась, а для маркера РБ-1 даже возрастала.

Научно-практнческая значимость.

Впервые профили генной экспрессии, ассоциированные с тем или иным клеточным типом реактивного микроокружения, привлекли внимание исследователей и клиницистов в связи с корреляцией с прогнозом заболевания.

В работе установлено клиническое значение различных субпопуляций клеток неопухолевого микроокружения (Т-клеток, фолликулярных дендритных

клеток, макрофагов), что позволяет рекомендовать их к практическому использованию.

Иммуногистохимическое исследование фолликулярных дендритных клеток (CD21+) целесообразно использовать во всех случаях фолликулярной лимфомы для более точной оценки характера роста опухоли, как одного из главных признаков, определяющих прогноз заболевания.

Для выявления групп благоприятного прогноза целесообразно проводить изучение внутриопухолевых CD4+ лимфоцитов и Т-регуляторных клеток. Количественную оценку FOXP3+ клеток целесообразно осуществлять в различных микроанатомических областях лимфатического узла, имеющих непосредственное отношение к опухолевому росту. Оценка FOXP3+ Т-лимфоцитов в интерфолликулярных зонах не имеет клинического значения.

Обязательным при первичной иммуногистохимической диагностике фолликулярной лимфомы является изучение уровней макрофагальной инфильтрации (CD 163+) для выявления группы больных с неблагоприятным прогнозом. Применение в лечебных схемах ритуксимаба позволяет нивелировать неблагоприятное значение выраженной макрофагальной инфильтрации.

Апробация работы. Апробация диссертационной работы состоялась 2 октября 2012 г. на совместной научной конференции с участием отделения химиотерапии гемобластозов, лаборатории клинической иммунологии опухолей, лаборатории иммунологии гемопоэза, отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ Клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ имени Н.Н.Блохина» РАМН, отделения химиотерапии гемобластозов НИИ детской онкологии и гематологии, кафедры онкологии РМАПО, кафедры детской онкологии РМАПО.

Публикации. Автором опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации.

Диссертация написана на 161 странице. Состоит из введения, обзора литературы, главы по клинической характеристике пациентов и использованных методов исследования, трех глав собственных результатов, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 272 источника. Работа иллюстрирована 34 таблицами и 34 рисунками.

Содержание работы

Характеристика больных и методы исследования

Работа выполнена в отделении химиотерапии гемобластозов НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН (директор -академик РАН и РАМН М.И.Давыдов).

Для решения поставленных задач исследованы 73 больных фолликулярной лимфомой. Среди них было 26 мужчин и 47 женщин в возрасте от 25 до 91 года (медиана - 58 лет). Все пациенты находились под наблюдением в ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН с 1995 по 2009гг.

Больным было проведено стандартное общеклиническое обследование, включающее современные методы диагностики онкогематологических заболеваний.

Морфологическая диагностика фолликулярной лимфомы проводилась в отделе патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии ФГБУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (зав. - проф. А.И. Карселадзе).

В соответствии с классификацией ВОЗ 2008г проведено определение цитологических типов (grade) фолликулярной лимфомы.

Характер роста фолликулярной лимфомы определяли на основании соотношения фолликулярного и диффузного компонентов:

1. фолликулярный/нодулярный (более 75% фолликулярного роста),

2. фолликулярный и диффузный (25-75% фолликулярного роста),

3. фокально фолликулярный/преимущественно диффузный (менее 25% фолликулярного роста).

Диагноз во всех случаях был верифицирован иммуноморфологическими методами: иммуногистохимией по парафиновым блокам и иммунофенотипированием по криостатным срезам. В работе использована панель моноклональных антител, позволяющая охарактеризовать как клетки опухоли, то есть злокачественные В-клетки, так и клетки неопухолевого микроокружения.

Ткань фолликулярной лимфомы представляет собой сложную микроанатомическую структуру, включающую ряд отделов преимущественно опухолевого происхождения. Прогностическую роль играет не столько тот или иной клеточный тип микроокружения, сколько соотнесение лимфоцитарных

субпопуляций с различными микроанатомическими зонами лимфатического узла, пораженного фолликулярной лимфомой (схема 1).

Схема 1: Варианты расположения клеток микроокружения

Интрафолликулярное Парафолликулярное Диффузное

Иммуногистохимическое исследование материала парафиновых блоков у 66 больных проводилось с применением моноклональных антител к CD8, CD4, FOXP3, PD-1. Кроме того, было проведено специальное полу количественное исследование (процент позитивных клеток в каждом отделе лимфатического узла) среди Т-клеточных популяций (CD8, CD4, FOXP3, PD-1), таблица 1.

Таблица 1. Иммуногистохимическая оценка степени Т-лимфоцитарной инфильтрации при фолликулярных лимфомах

Степень инфильтрации Количество позитивных клеток (%)

FOXP3 PD-1 CD4 CD8

Интерфол-ликулярно Зоны опухолевого роста

незначительная <5% <3% <30% <10% <10%

умеренная 5-10% 3-10% >30% >10% >10%

выраженная >10% >10%

Иммунофенотипирование клеток материала биопсии проводилось методом иммунофлуоресцентного окрашивания свежезамороженных (криостатных) срезов в лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н. Н. Блохина» РАМН в.н.с. к.м.н. Е.Н.Шолоховой. Панель моноклональных антител включала антитела к В-линейным антигенам (CD 19, CD20, CD21, CD23, CD37), Т-линейным антигенам (CD3, CD5, CD7), антигенам гистиоцитов и макрофагов (CD 163), антигенам фолликулярных дендритических клеток (CD21,

CD23), антигенам плазматических клеток (CD3B), нелинейным антигенам (CD 10, CD38, HLA-DR), общелейкоцитарному антигену CD45, а также антитела к bcl-2.

Для установления степени распространенности опухолевого процесса использовалась классификация, принятая в Ann Arbor (1971г.) и дополненная в Costswald (1989). Факторы прогноза определялись в соответствии с международными прогностическими индексами - FLIPI и FL1PI2. Общее состояние пациентов оценивалось по шкале ECOG.

Анализ непосредственных и отдаленных результатов терапии проведен с учетом международных стандартизованных критериев ответа на лечение при неходжкинских лимфомах.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы SPSS на основе созданной базы данных. Оценка включала корреляционный анализ, сравнение средних, анализ по таблицам сопряженности признаков с применением критерия /2 , построение кривых выживаемости по методике Каплан и Майер.

Результаты исследования и обсуждение.

Иммуноморфологическая характеристика фолликулярной лимфомы

У 60 больных установлен 1-2-й тип фолликулярной лимфомы по клеточному составу, у 13 - ЗА. Нодулярный характер роста опухоли наблюдался у 29 больных, нодулярно-диффузный - у 28, диффузно-нодулярный - у 11, диффузный - у 4. При проведении дальнейшего анализа группы пациентов с диффузно-нодулярным и диффузным характерами роста были объединены.

При исследовании иммунологических показателей оценены как общие уровни реакции, так и субпопуляции лимфоцитов отдельных микроанатомических структур лимфатических узлов. Во всех изученных случаях отмечалась мономорфная экспрессия общелейкоцитарного антигена CD45 и В-клеточных антигенов - CD20, CD 19, CD37. Изучены Т-клетки, макрофаги (CD 163), фолликулярные дендритные клетки (CD21, CD23), плазмоциты (CD38++).

Результаты иммуногистохимического количественного подсчета процента позитивных Т-клеток (CD8, CD4, FOXP-3, PD-1) в пределах микроанатомических областей лимфатических узлов представлены в таблице 2.

Таблица 2. Характеристика уровней Т-регуляторных клеток, Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток в различных микроанатомических областях лимфатического узла при фолликулярной лимфоме

Субпопуляции Локализация Число больных Диапазон (%) М±ш (%)

FOX-P3 Интерфолликулярная 47 1-30 12,4±1,2

Интрафолликулярная 62 1-30 10,5+0,9

Парафолликулярная 10 1-20 15,4±2,4

Диффузная 35 1-30 10,4±1,1

PD-1 Интерфолликулярная 50 3-80 19,6+2,1

Интрафолликулярная 63 2-60 22,7+1,9

Парафолликулярная 10 1-80 32,0±7,3

Диффузная 34 2-40 17,5+1,7

CD4 Интерфолликулярная 48 1-70 39,0±2,1

Интрафолликулярная 63 7-50 21,5+1,3

Парафолликулярная 5 8-80 32,6±12,б

Диффузная 33 2-50 24,6±2,5

CD 8 Интерфолликулярная 49 2-30 18,8+1,0

Интрафолликулярная 62 3-30 9,4±0,6

Парафолликулярная 5 10-50 19,0±7,8

Диффузная 32 2-70 14,1±2,1

Как видно из таблицы, во всех зонах пораженного фолликулярной лимфомой лимфатического узла отмечалась наиболее выраженная инфильтрация CD4+ и PD-1+ Т-лимфоцитов.

Оцененные по трем показателям (CD3, CD5, CD7) Т-клетки были, в основном, представлены в умеренном количестве (42-43%). Уровни макрофагов (CD163) были незначительными в 38% случаев, умеренными - в 36% и выраженными - в 27%. Различные типы реакции плазмоцитов (CD38++)

распределились примерно с равной частотой: незначительное количество - 36%, умеренное - 33%, выраженное - 31%.

Иммунофенотипнческие характеристики опухоли и субпопуляций клеток реактивного микроокружения при фолликулярной лимфоме.

Уровни Т-клеточной реакции по трем маркерам CD3, CD5, CD7 были достоверно взаимосвязаны между собой. Установлена достоверная и близкая к достоверной взаимосвязь всех клеточных типов неопухолевого микроокружения (Т-клетки, макрофаги, плазмоциты, ФДК) с экспрессией клетками фолликулярной лимфомы нелинейного антигена CD 10. При усилении выраженности экспрессии CD 10 отмечается увеличение численности всех клеточных типов микроокружения ФЛ - Т-лимфоцитов (р=0,038), макрофагов (р=0,062), плазматических клеток (р=0,013), ФДКС023+ (р=0,022).

Морфологическая и иммунологическая характеристики фолликулярной лимфомы.

В работе проведена оценка взаимосвязи цитологического типа и характера роста ФЛ с экспрессией маркеров опухолевых клеток: HLA-DR, CD10, CD38, CD21, CD23. Цитологический тип ФЛ не был взаимосвязан ни с одним из перечисленных маркеров. Выявлена высоко достоверная взаимосвязь характера роста с экспрессией антигена CD 10 клетками ФЛ (хи-квадрат 16,94 р=0,02). Отмечено снижение выраженности экспрессии CD 10 при увеличении в ткани ФЛ диффузного компонента. При нодулярном характере роста экспрессия CD 10 (как мономорфная, так и на части клеток) отмечалась в 85% случаев, при нодулярно-диффузном - в 29%, а при диффузно-нодулярном и диффузном лишь в 25%.

При нодулярном и нодулярно-диффузном характерах роста выявлены достоверно более высокие уровни Т-клеток (CD3+, CD5+, CD7+) в ткани ФЛ, чем при диффузно-нодулярном и диффузном характерах роста (хи-квадрат 12,015; р=0,014). Не выявлено достоверной связи характера роста ФЛ с инфильтрацией опухолевой ткани плазмоцитами (CD38) и макрофагами (CD163+).

Выявлена высоко достоверная взаимосвязь числа CD21+ ФДК с цитологическим типом ФЛ (хи-квадрат 9,039, р=0,011 При 1-2 цитологических типах умеренное и выраженное количество ФДК наблюдалось в 86,6%, в то время как при ЗА цитологическом типе - только в 50%.

Установлена достоверная связь характера роста ФЛ с уровнями фолликулярных дендритических клеток CD21+ (хи-квадрат 18,6, р=0,001). При нодулярном характере роста выраженное количество CD21+ ФДК определялось в 90,5% случаев, при нодулярно-диффузном характере роста - в 60,0%, при диффузно-нодулярном и диффузном - в 18,2%. Аналогичные данные получены при оценке взаимосвязи характера роста ФЛ с количеством фолликулярно-дендритных клеток CD23+ (хи-квадрат 10,83; р=0,029).

Клинические факторы прогноза фолликулярной лнмфомы.

В настоящем исследовании связь с прогнозом фолликулярной лимфомы четко и достоверно прослеживается для стадий заболевания, уровня гемоглобина, ЛДГ н размеров лимфатических узлов (менее и более 6см).

Стадии заболевания достоверно влияли на показатели общей выживаемости пациентов (р=0,036): все 15 больных с ранними стадиями ФЛ оставались под наблюдением с максимальным сроком до 180 мес.

Показатели общей выживаемости были достоверно более низкими у пациентов со сниженным (менее 120г/л) уровнем гемоглобина (р=0,003). Аналогичные закономерности получены при изучении влияния уровней гемоглобина на безрецидивную (БРВ; р=0,000), бессобытийную выживаемость (БСВ; р=0,007), а также выживаемость без прогрессирования (ВБП, р=0,003) и DSS (р=0,001). Уровни гемоглобина были высоко взаимосвязаны со стадией заболевания (р=0,002). У больных с I и II стадиями снижение гемоглобина не наблюдалось (п=13), а при III и IV стадиях отмечено в 45,3% случаев. Отмечена достоверная взаимосвязь снижения уровня гемоглобина с поражением костного мозга (р=0,016). При отсутствии вовлечения костного мозга снижение гемоглобина отмечено только у 5 из 26 больных (19,2%). При вовлечении костного мозга снижение гемоглобина наблюдалось у 19 из 39 больных (48,7%).

Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой была достоверно более низкой у пациентов с повышенными уровнями ЛДГ (р=0,003).

Значительное ухудшение показателей общей выживаемости отмечено в группе пациентов с размерами очагов нодальных поражений более 6см в диаметре (р=0,035).

Выживаемость больных в различных группах риска по FLIPI достоверно различалась. Наихудшие показатели общей выживаемости наблюдались в группах высокого риска раннего прогрессирования (FLIPI = 3-5); р=0,026. Взаимосвязи прогностического значения параметров неопухолевого микроокружения и клинико-лабораторных признаков, обозначенных во FLIPI, в работе не установлено. В соответствии с критериями FLIPI2 установлено существенное ухудшение показателей общей выживаемости в группе высокого риска (п=16) в сравнении с группой (п=15) промежуточного риска, р=0,05.

Таким образом, в работе подтверждена прогностическая роль четырех факторов, включенных в прогностические индексы фолликулярной лимфомы -стадии по Анн-Арбор, уровней гемоглобина и ЛДГ, размеров пораженных лимфатических узлов (менее и более 6 см), а также групп риска прогрессирования, выделяемых в соответствии с критериями FLIPI и FLIPI2.

Морфологические параметры фолликулярной лимфомы и прогноз.

Морфологические факторы не включены в прогностический индекс FLIPI, однако, судя по данным литературы и классификации опухолей кроветворной и лимфоидной тканей ВОЗ 2008 г, некоторые морфологические признаки могут иметь прогностическое значение при ФЛ. В числе этих признаков обсуждаются цитологический тип ФЛ, характер роста опухоли (нодулярный - диффузный), а также пролиферативный индекс Ki-67.

Значение этих 3 параметров оценено у 63 больных ФЛ.

Цитологический тип не влиял на прогноз заболевания. Для оценки роли пролиферативного индекса использовался пороговый уровень 20%. Количество KÍ-67+ опухолевых клеток выше 20% достоверно ассоциировалось с ухудшением общей выживаемости (р=0,044), рисунок 1.

50.00 100АО 1ЮЛ0 200 00

Продолжительность ЖИ1 ни (мое)

Рис. 1. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой с различным уровнем пролиферативного индекса (К>67). Верхняя кривая (сплошная линия) - - К1-67 определяется менее чем в 20% опухолевых клеток (п=37), нижняя кривая (пунктирная линия) - Кл-67 определяется в 20% и более опухолевых клеток (п=28); р=0,044.

Нарастание зон диффузного роста достоверно ухудшало показатели общей выживаемости, р=0,012, рисунок 2.

г.

0.2-

од-1-1-1-Г-1-1-1-

ОЛО 90,00 ЮОДО 150» 300.00 250ЛО Э00Л0

Продолжительность ЖИ1НН (мае)

Рис. 2. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой при различном характере роста опухоли. Верхняя кривая (сплошная линия) - нодулярный тип роста фолликулярной лимфомы (п=29), средняя кривая (пунктирная линия) - нодулярно-диффузный тип роста (п=28), нижняя кривая (точечная линия) - диффузно-нодулярный и диффузный типы роста ФЛ (п=15); р=0,012.

Таким образом, из числа иммуноморфологических признаков влияние на прогноз оказывало нарастание пролиферативного индекса (Ki-67) более 20% и наличие зон диффузного роста в опухолевой ткани.

Субпопуляционнын состав клеток реактнвиого микроокружения и прогноз фолликулярной лимфомы.

1. Общий уровень инфильтрации ткани фолликулярной лимфомы Т-клетками и показатели выживаемости.

Достоверной связи уровней инфильтрации CD3+, CD5+, CD7+ лимфоцитами с показателями общей выживаемости не установлено (р>0,18). Следует отметить, что наихудшие показатели общей выживаемости наблюдались у больных с единичными Т-лимфоцитами в срезах опухолевой ткани. Это относится ко всем трем маркерам, использованным в качестве пан-Т-клеточных - CD3, CD5, CD7.

2. Выраженность макрофагальной (CD163) реакции и показатели выживаемост и.

Для оценки прогностической роли макрофагальной реакции пациенты с низкой и умеренной макрофагальной инфильтрацией объединены в одну группу (п=47). Эта объединенная группа сопоставлена с больными с выраженной макрофагальной реакцией (п=17). Различия между группами оказались высоко достоверными, р=0,038. Кривые представлены на рисунке 3.

Продолжительность жиянм (мое)

Рис. 3. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой при различной выраженности макрофагальной реакции (СБ 163). Верхняя кривая (пунктирная линия) -низкая/умеренная степень макрофагальной инфильтрации (п=47), нижняя кривая (сплошная линия) - выраженная макрофагальная инфильтрация (п=17); р=0,038.

Таким образом, полученные данные полностью подтверждают неблагоприятное прогностическое значение выраженной макрофагальной реакции при ФЛ. Следует отметить, что для идентификации макрофагов использовался новый маркер СБ 163.

В условиях применения ритуксимаба (29 больных, из них 6 с выраженной макрофагальной реакцией) степень макрофагальной инфильтрации не имела прогностического значения. Таким образом, в эру ритуксимаба отмечается нивелирование неблагоприятного прогностического значения выраженной макрофагальной инфильтрации.

3. ФДК каркас (С021+) и показатели выживаемости.

Выраженность ФДК в опухолевых срезах коррелировала с благоприятным прогнозом фолликулярной лимфомы. Наблюдения с большим количеством ФДК характеризовались более благоприятным прогнозом (р=0,003), рисунок 4.

Продолжительность хоини (м«с)

Рис. 4. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой в группах с различным уровнем С021+ ФДК. Верхняя кривая (сплошная линия) - множество ФДК (п=35), нижняя кривая (пунктирная линия) - сниженное количество ФДК или их полное отсутствие (п=22); р=0,003.

Таким образом, выраженное количество СБ21+ ФДК в срезах ФЛ характерно для группы благоприятного прогноза и, напротив, снижение уровня ФДК (вне зависимости от уровня этого снижения) достоверно ухудшает прогноз (общую выживаемость).

Влияния уровня СБ23+ ФДК на показатели выживаемости не выявлено.

Сохранность ФДК каркаса (СБ21+) наиболее полно отражают характер роста фолликулярной лимфомы - стирание фолликулов (нодулярных структур) и появление диффузного компонента. Полученные результаты о важном прогностическом значении снижения уровней СБ21+ ФДК свидетельствуют о необходимости широкого использования этого маркера для установления характера роста фолликулярной лимфомы и определения группы больных с благоприятным прогнозом.

4. СБ4+ Т-лимфоциты и СП 8+ Т-.птфоциты различных микроанатомических областей лимфатических узлов и показатели выживаемости.

Высокие уровни (более 30%) интерфолликулярных СБ4+ клеток были характерны для прогностически благоприятной группы больных (р=0,047), рисунок

5.

-1-1-1-1-г-1-1-

о.оо 50.00 100.00 tso.c» 200,00 25о,оэ зоооо

Продолжительность жиани (м»е)

Рис. 5. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой в группах с различным уровнем интерфолликулярной инфильтрации CD4+ Т-лимфоцитами. Верхняя кривая (сплошная линия) - более 30% CD4+ Т-лимфоцитов (n=3l), нижняя кривая (пунктирная линия) - 30% и менее CD4+ Т-лимфоцитов (п=16); р=0,047.

Для анализа прогностической роли интрафолликулярных, парафолликулярных CD4+ Т клеток, а также CD4+ Т-клеток в зонах диффузного роста использовали пороговый уровень 10%. При количестве интрафолликулярных CD4+ Т-лимфоцитов более 10% показатели общей выживаемости были более высокими (р=0,005), рисунок 6.

5СМ 100.ГО 15С00 гос.со

Продолжительность ЖИ1НИ (мое)

Рис. 6. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой в группах с различным уровнем интрафолликулярной инфильтрации СЭ4+ Т-лимфоцитами. Верхняя кривая (сплошная линия) - более 10% интрафолликулярных СОА+ Т-лимфоцитов (п=50), нижняя кривая (пунктирная линия) - 10% и менее интрафолликулярных СЭ4+ Т-лимфоцитов (п=13); р=0,005.

При оценке прогностического значения парафолликулярных СБ4+ Т-клеток при фолликулярной лимфоме получены результаты аналогичные таковым для интрафолликулярной инфильтрации СБ4+ Т-клетками: показатели выживаемости лучше у больных с более выраженной инфильтрацией (р=0,046).

Уровни Т-цитотоксических лимфоцитов (СБ8+) различных отделов лимфатических узлов (интрафолликулярных, парафолликулярных, интерфолликулярных, а также в зонах диффузного роста) не влияли на прогноз фолликулярной лимфомы.

5. РОХРЗ+ Т-лимфоциты и показатели выживаемости.

Уровни интерфолликулярных БОХРЗ+ клеток не влияли на общую выживаемость больных ФЛ.

В то же время прослеживается отчетливая связь интрафолликулярных РОХРЗ+ клеток с прогнозом фолликулярной лимфомы. Высокое содержание интрафолликулярных РОХРЗ+ клеток характеризовало группу больных ФЛ с большей продолжительностью жизни, (р=0,013), рисунок 7.

о.оо Ео.оо 11/1 да 1?о,сю 20000 ;г-ооо эсю.оо

Продолжительность жиани (мое)

Рис. 7. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой в группах с различным уровнем интрафолликулярных РОХРЗ+ клеток. Верхняя кривая (сплошная) - более 10% интрафолликулярных РОХРЗ+ клеток (п=35), средняя кривая (пунктирная линия) - от 5 до 10% интрафолликулярных РОХРЗ+ клеток (п=16), нижняя кривая (точечная линия) — содержание интрафолликулярных БОХРЗ+ клеток менее 5% (п=11); р=0,013.

Аналогичные данные получены при анализе парафолликулярного распределения РОХРЗ+ Т-клеток (р=0,001) и РОХРЗ+ Т-клеток в зонах диффузного роста (р=0,018) .

РОХРЗ+ Т-регуляторные клетки входят в подкласс СБ4+ Т-лимфоцитов. Следует отметить, что интрафолликулярные РОХРЗ+ Т-регуляторные клетки и в целом популяция С04+ Т-клеток имеют одинаковую направленность влияния на прогноз фолликулярной лимфомы. В работе оценено, насколько велика пропорция Т-регуляторных лимфоцитов среди СБ4+ Т-клеток в данной микроанатомической области лимфатического узла, и насколько эти субпопуляции (С04+ и РОХРЗ+) коррелируют между собой. Интрафолликулярные СБ4+ Т-клетки количественно преобладали над интрафолликулярными РОХРЗ+ клетками (п=62): 21,6±1,3% и 10,5±0,9% соответственно, р=0,001. Наблюдалась высоко достоверная корреляция между этими субпопуляциями (11=0,45, р=0,001). Возможно, именно высокой пропорцией РОХРЗ+ Т-лимфоцитов среди интрафолликулярных СБ4+ Т-клеток определяется однонаправленное влияние двух субпопуляций на прогноз.

6. РИ-1+ Т-лимфоциты и показатели выживаемости.

При анализе показателей общей выживаемости в зависимости от уровней РЭ1+ Т-клеток, расположенных в интерфолликулярной зоне, взаимосвязи не выявлено.

Отмечена существенная связь общей выживаемости больных ФЛ с уровнями РБ1+ Т-клеток, расположенных интрафолликулярно. Низкое и умеренное количество РБ1+ Т-клеток установлено у 24 больных, высокие уровни (более 10%) -у 37. Эти группы различались по прогнозу, р=0,05, рисунок 8.

5

—I-1-—I-р-1-1—-1—

0,00 50.00 100.00 1 £0.00 200.00 2М.ОО 300.00

Продолжительность жи>ни (мое)

Рис. 8. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой в группах с различным уровнем интрафолликулярных РО!+ Т-клеток. Верхняя кривая (сплошная линия) -уровень интрафолликулярных РБ1+ Т-клеток более 10% (п=37), нижняя кривая (пунктирная линия) - содержание интрафолликулярных РБ1+ Т-клеток от 0 до 10% (п=24); р=0,05.

Других взаимосвязей между уровнями РО-1+-Т-клеток, расположенных в различных микроанатомических областях лимфатического узла, пораженного ФЛ, и показателями выживаемости не установлено.

Маркер РБ-1 характеризует популяцию фолликулярных Т-хелперов (СБ4+). Интрафолликулярно количество СЭ4+ Т-клеток и число РЭ1+ Т-клеток было одинаковым (п=63): 21,5±1,3% и 22,7±1,9% соответственно, р=0,45. Отмечен высокий уровень корреляции между этими клеточными типами (11=0,52, р=0,001). Полученные данные свидетельствуют о том, что маркер РБ1 присутствует практически на всех интрафолликулярных СБ4+ Т-клетках при фолликулярной лимфоме.

Прогностическое значенне клеток реактивного мнкроокруження при использовании программ противоопухолевой терапии фолликулярных лимфом с включением ритукснмаба.

В работе оценено влияние добавления ритуксимаба в схемы лечения на прогностическую роль маркеров клеток неопухолевого микроокружения. - СБ4,

20

РОХРЗ, РБ1. В условиях лечения ритуксимабом прогностическая роль интрафолликулярных СВ4+ Т- лимфоцитов сохранялась (р=0,002), рисунок 9.

50.00 75.00 100.00

Продолжительность ЖИ1ИИ (мьс)

Рис. 9. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой с различным уровнем интрафолликулярных СБ4+ Т-лимфоцитов в условиях лечения с ритуксимабом. Верхняя кривая (сплошная линия) - количество СБ4+ Т-лимфоцитов более 10% (п=21), нижняя кривая (пунктирная линия) - количество СБ4+ Т-лимфоцитов менее 10% (п=7); р=0,002.

При добавлении в программы лечения ритуксимаба различия в

выживаемости пациентов в зависимости от уровня интрафолликулярных БОХРЗ+

Т-клеток сохранялись и были достоверными, рисунок 10. Все пациенты с наличием

БОХРЗ+ Т-клеток (более 10%) ко времени окончания настоящего исследования

оставались под наблюдением с максимальной длительностью наблюдения 10 лет.

!„«-I

| о,«-

I

0.00 25.00 50.00 75.00 ЮО.ОО 125.00

Продолжительность ЖИ1НИ (мес)

Рис. 10. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой с различным уровнем интрафолликулярных РОХРЗ+ Т-лимфоцитов в условиях лечения с ритуксимабом. Верхняя кривая - количество РОХРЗ+ Т-лимфоцитов более 10% (п=16), нижняя кривая -количество РОХРЗ+ Т-лимфоцитов от 0 до 10% (п=11); р=0,022.

Прогностическое значение РБ1+ Т- клеток в условиях современного лечения с добавлением ритуксимаба возрастало и было высоко достоверной (р=0,018), рисунок 11.

0.00 3500 ».00 75.00 1С0.ТО 125.00

ПрОДОПЖИТОЛЬМОСП* ЖМ1НИ (мое)

Рис. 11. Общая выживаемость больных фолликулярной лимфомой с различным уровнем интрафолликулярных РБ1+ Т-лимфоцитов в условиях лечения с ритуксимабом. Верхняя кривая (сплошная линия) - количество РБ1+ Т-лимфоцитов более 10% (п=18), нижняя кривая (пунктирная линия) - количество РБ1+ Т-лимфоцитов от 0 до10% (п=10).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на все достижения онкогематологии морфологические признаки играют главную роль в диагностике фолликулярной лимфомы. В исследовании преобладали 1 и 2 цитологические типы опухоли, тип ЗА составил 18%. Абсолютное большинство наблюдений было с преобладанием нодулярного характера роста - 78%. Эти два основных морфологических параметра -цитологический тип и характер роста опухоли были взаимосвязаны. Так, 3-й цитологический тип при нодулярном характере роста составил 4%, при нодулярно-диффузном — 22% , а при диффузно-нодулярном 36%. Пролиферативный индекс (Кл-67) был достоверно более высоким при ЗА цитологическом типе в сравнении с 1-2 - 55 и 22% соответственно.

Морфологические характеристики были взаимосвязаны не только с иммунологическим фенотипом опухоли, но и с клетками неопухолевого микроокружения. Для 1-2 цитологических типов были характерны более выраженная Т-клеточная инфильтрация или сохранность Т-клеточных зон, а также

22

наличие крупных областей фолликулярных дендритических клеток. Связи с уровнем макрофагальной инфильтрации не отмечено.

Анализ прогностического значения двух важных морфологических параметров с учетом иммунологических особенностей опухолевой ткани проведен в связи с тем, что характер роста фолликулярной лимфомы определяется выраженностью клеток, образующих его остов — фолликулярных дендритических клеток, которые относятся к элементам неопухолевого микроокружения. Иными словами фолликулярные дендритические клетки невозможно рассматривать в отрыве от характера роста фолликулярной лимфомы и ее цитологического типа. Даже при диффузном характере роста сохраняющиеся фолликулярные дендритические клетки указывают на неполную утрату фолликулярности. По результатам настоящего исследования утрата фолликулярности, то есть нодулярности при сохраняющемся СБ21/23+ фолликулярно-дендритическом каркасе далеко не всегда указывает на неблагоприятный прогноз. При нарастании зон диффузного роста показатели общей выживаемости, как правило, ухудшаются, а при сохранении крупных зон фолликулярных дендритических клеток, несмотря на диффузный характер роста опухоли, то есть утрату фолликулоподобных структур, показатели общей выживаемости пациентов были лучше.

В настоящем исследовании выделение субпопуляций Т-лимфоцитов проведено на основании изучения четырех ключевых иммунологических маркеров - СБ4, СБ8, БОХРЗ и РБ1.

Показатели общей выживаемости пациентов были достоверно более высокими при наличии большого количества РОХРЗ+ Т-клеток в зонах опухолевого роста - интрафолликулярно, парафолликулярно, а также в участках диффузного роста. Иными словами прогностическую роль играли только РОХРЗ+ Т-клетки, расположенные в участках опухолевого роста, но не в межфолликулярных зонах лимфатического узла, пораженного ФЛ. Различие показателей общей выживаемости наблюдалось в группах больных с разным уровнем реактивных Т-клеток микроокружения, экспрессирующих маркер РО-1. Высокое количество РБ1+ реактивных Т-клеток микроокружения (более 10%) характеризовало больных фолликулярной лимфомой с благоприятным прогнозом.

Молекула БОХРЗ характерна для Т-регуляторных клеток и в срезах лимфатических узлов экспрессируется только на этой популяции клеток и используется для их идентификации. В нормальном лимфатическом узле и лимфатическом узле, пораженном фолликулярной лимфомой, экспрессия РБ1 в отличие от РОХРЗ характерна для так называемых фолликулярных Т-хелперов, то есть СВ4+ Т-лимфоцитов, расположенных в зародышевых центрах фолликулов, а при фолликулярной лимфоме - интрафолликулярно. По результатам работы количество интрафолликулярных СБ4+ Т-клеток примерно вдвое превышает содержание интрафолликулярных Т-регуляторных клеток РОХРЗ+. Напротив, уровни интрафолликулярных РБ1+ Т-лимфоцитов практически точно совпадают с количеством фолликулярных С04+ Т-клеток. Отмечена выраженная корреляция между этими клеточными типами. Клетки фолликулярной лимфомы - это лимфоидные иммунные клетки, на которые распространяется супрессивное действие Т-регуляторных лимфоцитов, также как и на нормальные клетки фолликулов лимфатических узлов. В норме интрафолликулярные Т-регуляторные клетки подавляют пролиферацию клеток светлых центров фолликулов. По-видимому, именно этим объясняется благоприятная прогностическая роль БОХРЗ+ Т-регуляторных клеток при фолликулярной лимфоме, установленная в данной работе. Снижение степени инфильтрации интрафолликулярными СБ4+ Т-клетками достоверно ухудшало показатели общей выживаемости больных фолликулярной лимфомой.

Внедрение инновационных методов лечения, в том числе лекарственных, может нивелировать прогностическое значение тех или иных маркеров. В связи с этим в работе была поставлена задача понять, сохраняют ли свое прогностическое значение параметры микроокружения в эру ритуксимаба, то есть когда во все программы лечения включались анти-С020 моноклональные антитела.

Полученные данные свидетельствуют о важной роли клеток неопухолевого микроокружения в прогнозе фолликулярной лимфомы. В условиях лечения ритуксимабом прогностическая роль выраженной макрофагальной инфильтрации нивелировалась. Вместе с тем, прогностическая роль СБ4+ Т-лимфоцитов и регуляторных БОХРЗ+ Т- клеток сохраняла свое значение, а для маркера РБ1 даже возрастала, о чем убедительно свидетельствуют отдаленные результаты лечения.

Таким образом, не только клинические признаки и иммуноморфологические особенности фолликулярной лимфомы определяют прогноз заболевания. Важную роль играют клетки реактивного неопухолевого микроокружения - Т-лимфоциты, макрофаги, фолликулярные дендритические клетки.

ВЫВОДЫ

1. В условиях современной противоопухолевой терапии наиболее важными факторами прогноза фолликулярной лимфомы являются стадия заболевания, уровни гемоглобина и ЛДГ, размеры нодальных очагов поражения (менее и более 6см), а также характер роста опухоли (степень выраженности диффузного компонента).

2. Пролиферативный индекс (Кл67) был достоверно более высоким при ЗА цитологическом типе опухоли в сравнении с 1-2 — 55% и 22% соответственно (р=0,001). Увеличение индекса пролиферативной активности (Ю67) опухолевых клеток выше 20% ведет к ухудшению прогноза фолликулярной лимфомы. Общая 5-летняя выживаемость при Кл-67 <20% составила 80%, а при Кл-67>20% - 55% (р=0,044).

3. Важным компонентом реактивного клеточного микроокружения при фолликулярных лимфомах являются фолликулярные дендритические клетки (СВ21+, СБ23+). Характер роста опухоли определяется выраженностью клеток, образующих ее остов, то есть ФДК. Утрата фолликулярности (нодулярности) при сохраняющемся СБ21/23+ ФДК-каркасе не всегда указывает на неблагоприятный прогноз.

4. При нарастании зон диффузного роста показатели общей выживаемости ухудшаются. Однако сохранение крупных зон фолликулярных дендритических клеток даже при диффузном характере роста фолликулярной лимфомы является благоприятным прогностическим признаком, не ухудшающим отдаленные результаты лечения.

5. Характер роста фолликулярной лимфомы и выраженность экспрессии СБЮ достоверно взаимосвязаны. Выход опухолевых клеток за пределы фолликулов и нарастание зон диффузного роста сопровождаются утратой экспрессии антигена СБ 10.

6. Из числа лимфоидных клеток реактивного неопухолевого микроокружения СТ>4-позитивные Т-лимфоциты любого из микроанатомических отделов пораженного фолликулярной лимфомой лимфатического узла являются важным фактором благоприятного прогноза заболевания.

7. Нарастание уровней FOXP3+ Т-регуляторных клеток в опухоли (интрафолликулярно, парафолликулярно, а также в зонах диффузного роста) является фактором благоприятного прогноза фолликулярной лимфомы.

8. Популяция интрафолликулярных PD1-позитивных Т-лимфоцитов соответствует популяции фолликулярных CD4+ Т-лимфоцитов. Высокий уровень реактивных PD1+ Т-клеток неопухолевого микроокружения является благоприятным прогностическим признаком фолликулярной лимфомы.

9. Выраженность макрофагальной инфильтрации ткани фолликулярной лимфомы в эру до ритуксимаба имела прогностическое значение. Увеличение степени макрофагальной инфильтрации ухудшало показатели общей выживаемости больных.

10. В условиях лечения по программам, включающим ритуксимаб с последующей поддерживающей терапией этим препаратом, ,прогностическое значение выраженной макрофагальной инфильтрации нивелировалось, CD4+ Т-лимфоцитов и FOXP3+ Т-регуляторных клеток сохранялось, а маркера PD1 даже возрастало.

Список опубликованных работ

1. Тупицына, Д.Н. Клиническое значение интратуморальных FOXP3+ Т-регуляторных клеток при солидных опухолях и фолликулярных лимфомах / Тупицына, Д.Н., Ковригина A.M., Османов Д.Ш. // Клиническая онкогематология.- 2012,- №3.- С. 193-203.

2. Шуйкова, К.В. Метастатическое поражение сердца у пациента с анапластической крупноклеточной лимфомой / Шуйкова К.В., Емелина Е.И., Гендлин Г.Е., Сторожаков Г.И. Лепков C.B., Тупицына Д.Н., Тумян Г.С., Демина Е.А., Абрамова H.H., Османов Д.Ш., Ковригина A.M. // Клиническая онкогематология,- 2010,- т.З,- №3,- С. 252-259.

3. Быков, Д.А. Иммунологические особенности неходжкинских лимфом с поражением мягких тканей / Быков Д.А., Поляков Б.И., Тупицына Д.Н. и

соавт. // Тез. докл. VI съезда онкологов и радиологов стран СНГ. Душанбе.-1-4 октября 2010,- С.65.

4. Тупицына, Д.Н. Критерии минимальной остаточной болезни В-клеточного хронического лимфолейкоза в диагностике индолентных лимфом / Тупнцына Д.Н., Купрышина Н.А., Гривцова Л.Ю. // Вестник гематологии.-

2011,- т.VII,- №1,- 52-53.

5. Tupitsyna, D.N. CD4+ T-cell populations in different microanatomical lymph node compartments of follicular lymphoma / Tupitsyna D.N., Kovrigina A.M., Zeinalova et al. // 17th Congress EHA, Amsterdam, the Netherlands, June 1417 2012,- Abstract book P. 644 - 645

6. Рамазанова, P.M. Сравнение экспрессии CD23 на клетках опухоли и лейкемического компонента / Рамазанова P.M., Шолохова Е.Н., Андреева Л.Ю., Пробатова Н.А., Тупицына Д.Н., Фалалеева Н.А., Османов Д.Ш. // Онкология и радиология,- №3 (12).- 2005,- Алматы, С. 28-32.

7. Рамазанова, P.M. Алгоритм иммунодиагностики мелкоклеточных В-клеточных лимфом по лейкемическому компонент}' / Рамазанова P.M., Андреева Л.Ю., Пробатова Н.А., Тупнцына Д.Н., Фалалеева Н.А. // Онкология и радиология.- №3 (12).- 2005.- Алматы, С. 38-4

Подписано в печать 7.11.12 . Формат бОх84/1 б. Бумага офисная «ЗуеКзСору». Тираж 100 экз. Заказ № 1040

Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фолликулярные лимфомы составляют 22% среди неходжкинских лимфом человека и являются одной из самых частых нозологических форм (Armitage J.O. et at., 1998; ВОЗ, 2008). Это гетерогенная группа опухолей как по морфологической характеристике (выделяют 3 цитологических типа, диффузный и нодулярный характер роста), так и по клинической картине и прогнозу заболевания. Болезнь может протекать скоротечно и заканчиваться летальным исходом в течение 1-2 лет или, напротив, - длиться более десятилетия. Причины этого неясны. Международный прогностический индекс (IPI) и, разработанный специально для фолликулярных лимфом FLIPI, далеко не в полной мере характеризуют клиническое течение и прогноз фолликулярных лимфом.

По этим причинам все большее внимание исследователей обращается к молекулярно-биологическим особенностям фолликулярных лимфом. Это особая группа опухолей, возникающих из клеток зародышевых центров фолликулов лимфатических узлов. В патогенезе фолликулярных лимфом важную роль играет активация антиапоптотического гена BCL2, возникающая, как правило, в результате транслокации 14; 18. Иммунофенотипически опухоль характеризуется зрелым (периферическим) фенотипом, в большинстве случаев - экспрессией антигена CD 10.

Серьезный прорыв в понимании биологии фолликулярных лимфом дала работа Dave S.S. et al. (2004). Авторы изучили профили генной экспрессии у 191 больного фолликулярными лимфомами до лечения, выделили гены, ассоциированные с различной выживаемостью, и сгруппировали их в соответствии с различным прогнозом заболевания. Особенно важным и интересным оказалось то, что данные профили генной экспрессии характеризовали не биологические особенности опухоли, а уровни инфильтрации фолликулярных лимфом нормальными неопухолевыми) иммунными клетками - Т-лимфоцитами и макрофагами. 5

Профиль экспрессии «Иммунный ответ 1 (Immune response 1, IR 1)» позволял устанавливать благоприятный прогноз (медиана выживаемости 13,6 лет), а профиль «иммунный ответ 2 (IR 2)», напротив, - неблагоприятный прогноз (медиана выживаемости 3,9 лет). Это была первая публикация, доказавшая роль интратуморальной иммунной реакции при фолликулярных лимфомах в прогнозе заболевания. Прогностическая значимость профилей генной экспрессии была достоверно выше, чем любого из клинических или морфологических факторов.

Разумеется, статья породила целый ряд вопросов. Как соотносится прогностическая значимость IR1 и IR2 с цитологическим типом фолликулярных лимфом и наличием зон диффузного роста (Kobayashi К. at al., 2005). Играет ли роль инфильтрация иммунными клетками собственно опухолевых фолликулов (Naresh K.N., 2005). Возможно и то, что рост фолликулярной лимфомы подавляет иммунную систему, а не противоположное - иммунная инфильтрация опухоли сдерживает опухолевый рост (Gajewski T.F., 2005). Ответы на многие из этих вопросов можно получить с использованием иммуногистохимического метода.

По этим причинам дальнейшее развитие концепции неопухолевого микроокружения получено при использовании иммуногистохимического метода. Farinha P. et al. (2005) показали неблагоприятную роль выраженной макрофагальной реакции (CD68) при фолликулярных лимфомах. Однако впоследствии выяснилось, что прогностическую роль туморассоциированных макрофагов необходимо рассматривать с учетом схемы лечения - при включении в программы лечения ритуксимаба CD68+ макрофаги играли благоприятную прогностическую роль (Taskinen М. et al.,

2007; Canioni D. et al., 2008). Возможно, одной из причин этого является усиление клеточно-опосредованной цитотоксичности ритуксимаба за счет макрофагов, экспрессирующих Fcy-рецепторы (Minard-Colin V. Et al., 2008).

Эти данные позволили уточнить и конкретизировать некоторые клеточные компоненты, ассоциированные с IR2. Несколько неожиданной оказалась роль 6

Т-клеток (IR1) - J.Carreras et al. (2006) установили благоприятную роль FOXP3-позитивных тумор-инфильтрирующих Т-регуляторных лимфоцитов в прогнозе фолликулярных лимфом. Помимо Т-регуляторных клеток важное значение придается CD7-, CD3-, CD8- и СВ4-позитивным лимфоцитам (Burger G.A. et al., 2009). Важно отметить, что профили генной экспрессии неопухолевого микроокружения, присутствующие в опухолевой ткани фолликулярных лимфом, рассматриваются в контексте прогноза не только с точки зрения влияния иммунных клеток в опухолевой ткани в рамках цитологических вариантов фолликулярных лимфом, но и с точки зрения возможного влияния этих клеток на опухолевую прогрессию -трансформацию мелкоклеточных вариантов в крупноклеточные (Glas A.M. et al., 2007).

Представленные данные свидетельствуют о том, что исследования нормального клеточного микроокружения при фолликулярных лимфомах в настоящее время широко ведутся во всем мире. Это обусловлено их значением в определении групп риска при фолликулярных лимфомах в условиях проведения лечения с включением моноклональных антител (ритуксимаб) и без таковых. Дальнейшему решению данной актуальной задачи посвящена настоящая диссертационная работа.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценить клиническое значение реактивного клеточного микроокружения при фолликулярных лимфомах.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Определить прогностическое значение клинических и морфологических параметров при фолликулярной лимфоме.

2. Оценить взаимосвязь иммунофенотипических характеристик опухолевой ткани (экспрессия CD 10, CD23, CD21, Ki-67) с морфологическими особенностями и клинико-лабораторными факторами прогноза фолликулярной лимфомы (FLIPI).

3. Определить уровни дендритно-клеточной реакции в ткани фолликулярных лимфом (CD21, CD23) во взаимосвязи с морфологическими особенностями опухоли и клиническими признаками прогноза по FLIPI.

4. Определить уровни макрофагальной инфильтрации ткани фолликулярных лимфом (CD 163) во взаимосвязи с морфологическими особенностями опухоли, клиническими признаками прогноза по FLIPI и результатами лечения.

5. Определить уровни Т-клеточной инфильтрации ткани фолликулярных лимфом (CD3, CD4, CD8, FOXP3, PD-1) и их связь с морфологическими особенностями опухоли и клиническими признаками прогноза по FLIPI. НАУЧНАЯ НОВИЗНА

В результате проведенного исследования впервые изучены взаимоотношения реактивного микроокружения и опухолевых клеток фолликулярной лимфомы. По аналогии с профилями генной экспрессии IR

1/IR-2 и на основании результатов изучения иммуногистохимических особенностей фолликулярной лимфомы установлены различные типы иммунологического ответа. Сохранность Т-клеточной субпопуляции лимфоцитов в интерфолликулярной области, а также нарастание инфильтрации этими клетками опухолевых зон характерны для больных с благоприятным прогнозом фолликулярной лимфомы, имеющих лучшие показатели общей выживаемости. Напротив, выраженная макрофагальная инфильтрация (CD 163+) ассоциируется с неблагоприятным прогнозом.

Установлена связь характера роста фолликулярной лимфомы с наличием фолликулярных дендритических клеток (CD21+), а также уровнями Ki-67позитивных клеточных элементов. Показано, что при выходе злокачественных клеток за пределы фолликулов, а также при нарастании диффузного роста утрачивается экспрессия антигена CD 10 на злокачественных В-клетках. Установлено, что количественную оценку Трегуляторных клеток (FOXP3+) целесообразно проводить только в зонах опухолевого роста (интрафолликулярно, парафолликулярно, в участках 8 диффузного роста), так как уровни этих клеток в интерфолликулярных областях лимфатического узла не имеют прогностического значения. Сходные с РОХРЗ данные получены и для РБ1-позитивных лимфоцитов.

В условиях лечения ритуксимабом прогностическая роль выраженной макрофагальной инфильтрации нивелировалась. Прогностическая роль СЭ4+ Т-лимфоцитов и регуляторных РОХРЗ+ Т- клеток сохранялась, а для маркера РБ-1 даже возрастала.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Впервые профили генной экспрессии, ассоциированные с тем или иным клеточным типом реактивного микроокружения, привлекли внимание исследователей и клиницистов в связи с корреляцией с прогнозом заболевания.

В нашей работе клиническое значение различных субпопуляций клеток неопухолевого микроокружения (Т-клеток, ФДК, макрофагов) подтверждено, что позволило рекомендовать их к практическому использованию.

Иммуногистохимическое исследование фолликулярных дендритных клеток (СБ21+) целесообразно использовать во всех случаях фолликулярной лимфомы для более точной оценки характера роста опухоли, как одного из главных признаков, определяющих прогноз заболевания.

Для выявления групп благоприятного прогноза целесообразно проводить изучение внутриопухолевых С04+ лимфоцитов и Т-регуляторных клеток. Количественную оценку РОХРЗ+ клеток целесообразно осуществлять в различных микроанатомических областях лимфатического узла, имеющих непосредственное отношение к опухолевому росту. Оценка РОХРЗ + Т-лимфоцитов в интерфолликулярных зонах не имеет клинического значения.

Обязательным при первичной иммуногистохимической диагностике фолликулярной лимфомы является изучение уровней макрофагальной инфильтрации (СБ 163+) для выявления группы больных с неблагоприятным прогнозом. Применение в лечебных схемах ритуксимаба позволяет нивелировать неблагоприятное значение выраженной макрофагальной инфильтрации.

выводы

1. В условиях современной противоопухолевой терапии наиболее важными факторами прогноза фолликулярной лимфомы являются стадия заболевания, уровни гемоглобина и ЛДГ, размеры нодальных очагов поражения (менее и более 6см), а также характер роста опухоли (степень выраженности диффузного компонента).

2. Пролиферативный индекс (Ki67) был достоверно более высоким при ЗА цитологическом типе опухоли в сравнении с 1-2 - 55% и 22% соответственно (р=0,001). Увеличение индекса пролиферативной активности (Ki67) опухолевых клеток выше 20% ведет к ухудшению прогноза фолликулярной лимфомы. Общая 5-летняя выживаемость при Ki-67 <20% составила 80%, а при Ki-67>20% - 55% (р=0,044).

3. Важным компонентом реактивного клеточного микроокружения при фолликулярных лимфомах являются фолликулярные дендритические клетки (CD21+, CD23+). Характер роста опухоли определяется выраженностью клеток, образующих ее остов, то есть ФДК. Утрата фолликулярности (нодулярности) при сохраняющемся CD21/23+ ФДК-каркасе не всегда указывает на неблагоприятный прогноз.

4. При нарастании зон диффузного роста показатели общей выживаемости ухудшаются. Однако сохранение крупных зон фолликулярных дендритических клеток даже при диффузном характере роста фолликулярной лимфомы является благоприятным прогностическим признаком, не ухудшающим отдаленные результаты лечения.

5. Характер роста фолликулярной лимфомы и выраженность экспрессии CD 10 достоверно взаимосвязаны. Выход опухолевых клеток за пределы фолликулов и нарастание зон диффузного роста сопровождаются утратой экспрессии антигена CD 10.

6. Из числа лимфоидиых клеток реактивного неопухолевого микроокружения С04-позитивные Т-лимфоциты любого из микроанатомических отделов пораженного фолликулярной лимфомой лимфатического узла являются важным фактором благоприятного прогноза заболевания.

7. Нарастание уровней РОХРЗ+ Т-регуляторных клеток в опухоли (интрафолликулярно, парафолликулярно, а также в зонах диффузного роста) является фактором благоприятного прогноза фолликулярной лимфомы.

8. Популяция интрафолликулярных РБ1-позитивных Т-лимфоцитов соответствует популяции фолликулярных СБ4+ Т-лимфоцитов. Высокий уровень реактивных РЭ1+ Т-клеток неопухолевого микроокружения является благоприятным прогностическим признаком фолликулярной лимфомы.

9. Выраженность макрофагальной инфильтрации ткани фолликулярной лимфомы в эру до ритуксимаба имела прогностическое значение. Увеличение степени макрофагальной инфильтрации ухудшало показатели общей выживаемости больных.

10. В условиях лечения по программам, включающим ритуксимаб с последующей поддерживающей терапией этим препаратом, прогностическое значение выраженной макрофагальной инфильтрации нивелировалось, СБ4+ Т-лимфоцитов и РОХРЗ+ Т-регуляторных клеток сохранялось, а маркера РБ1 даже возрастало.