Автореферат и диссертация по медицине (14.01.04) на тему:Клиническое значение полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы, оксидативного стресса и эндотелиальной дисфункции у больных хроническим гепатитом C

На правах рукописи

ТАРАТИНА ОЛЕСЯ ВАЛЕРИЕВНА

Клиническое значение полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы, оксндатнвного стресса и эндотелиальной дисфункции у больных хроническим гепатитом С

14.01.04 — Внутренние болезни

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

13 НОЯ 2014

Москва— 2014

005554921

005554921

Работа выполнена на кафедре внутренних болезней Факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова»

Научные руководители:

заведующий кафедрой внутренних болезней Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносовка доктор медицинских наук, профессор, академик РАН

Николай Алексеевич Мухин

ведущий научный сотрудник лаборатории генных и клеточных технологий Факультета фундаментальной медицины МГУ имени М.В. Ломоносова кандидат медицинских наук, доцент

Лариса Михайловна Самоходская

Официальные оппоненты:

заместитель директора по лечебной работе НОК центра «Инновационной терапии» ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, главный научный сотрудник,

доктор медицинских наук Чавдар Савов Павлов

заведующий научно-консультативным клинико-диагностическим центром ФБУН ЦНИИ

доктор медицинских наук Ведущая организация:

Государственное бюджетное учреждение здравоохранения «Московский клинический научно-практический центр» Департамента здравоохранения г. Москвы

Защита состоится «25» декабря 2014 года в 13.00 часов на заседании диссертационного совета Д212.203.18 при ФГАУ ВПО «Российский университет дружбы народов» (117292, г. Москва, ул. Вавилова, д. 61; Городская клиническая больница № 64). С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6). Автореферат разослан <(2£» октября 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор

медицинских наук, профессор 1 Гайрат Калуевич Киякбаев

Эпидемиологии Роспотребнадзора,

Владимир Петрович Чуланов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Естественное течение хронического гепатита С (ХГС) — особенности клинической картины заболевания, темпы прогрессировать фиброза печени и формирование цирроза печени (ЦП), а также развитие таких осложнений, как гепатоцеллюлярная карцинома и аутоиммунные синдромы — индивидуально и варьирует в широких пределах. Лечение больных ХГС представляет собой до конца нерешенную проблему. Современные трехкомпонентные схемы противовирусной терапии (ПВТ) улучшают результаты традиционной — двухкомпонентной — схемы только в 1,5 раза, но при этом число нежелательных эффектов возрастает, что в совокупности с высокой стоимостью лечения требует более четкого отбора больных с высоким риском быстрого прогрессирования заболевания для проведения ПВТ (Абдурахманов Д.Т., 2013, Моисеев C.B., 2010). В связи с этим продолжается поиск предикторов неблагоприятных исходов ХГС.

Известно, что употребление алкоголя, мужской пол, раса (не европейская), возраст старше 40 лет к моменту инфицирования, нарушение обмена железа, ожирение и инсулинорезистентность, иммуносупрессивная терапия, а также коинфекция вируса иммунодефицита человека или гепатита В ускоряют фиброгенез при ХГС и трансформацию его в ЦП (Рекомендации по диагностике и лечению взрослых больных гепатитом С, 2013, Ивашкин В.Т. и Павлов Ч.С., 2011, Asselah Т. et al., 2007, Poynard T. et al., 1997). Формирование ЦП определяется прогрессирующим фиброзом ткани печени, а также ремоделированием её сосудов, приводящим к повышению печёночного внутрисосудистого сопротивления и развитию портальной гипертензии (ПГ). Воспалительные реакции в ответ на повреждение вирусом играют главную роль в инициации процессов фиброзирования печени. Однако важную роль играют и медиаторы, активирующие локальные и системные механизмы фиброгенеза, такие как оксидативный стресс (ОС), активация ренин-ангиотензиновой системы (РАС), ангиогенез и нарушение функционального состояния эндотелия (эндотелиальная дисфункция — ЭД).

Наблюдающаяся при повреждении печени гиперпродукция реактивных форм кислорода ассоциируется со снижением образования и биодоступности NO в паренхиме печени — синусоидальной ЭД. Эта связь реализована через фермент

NADPH-оксидазу, состоящий из нескольких субъединиц. Субъединица p22-phox, кодируемая геном CYBA, необходима для ферментативной активности NADPH-оксидазы. При индуцированном фиброзе печени отмечено и снижение активности eNOS по сравнению с контрольной группой (Diesen D.L. and Kuo P.C., 2011). Носительство аллели 894Т гена NOS3, кодирующего эндотелиальную NO-синтазу (eNOS), ассоциировано с нарушением работы фермента и, как следствие, со снижением концентрации NO в плазме. Полиморфизм С677Т гена метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) — одного из ключевых ферментов метаболизма гомоцистеина, избыток которого вызывает оксидативное повреждение эндотелия и способствует развитию ЭД, — опосредует образование менее активного варианта фермента и недостаточную элиминацию гомоцистеина из кровотока. В развитии фиброза и ЦП большое значение имеют процессы активации локальной тканевой РАС, все ключевые компоненты которой при ХГС экспрессируются в повреждённой печени. Повышение концентрации ангиотензина II в печёночной ткани приводит к фиброгенезу (Bataller R. et. al., 2005). Генетическое же или фармакологическое блокирование РАС замедляет фиброгенез в печени.

Взаимосвязь полиморфизма генов-кандидатов РАС, ОС и ЭД с прогрессированием фиброза, развитием ПГ и ответом на ПВТ изучена мало. Представляется актуальным определение влияния точечных мутаций в генах, кодирующих механизмы фиброза, на течение ХГС (Asselah Т. et al., 2007, Lee U.E. and Friedman S.L., 2011).

Цель исследования. Оценить клиническую и прогностическую значимость носительства аллельных вариантов генов, кодирующих компоненты РАС, а также белки, участвующие в регуляции функции эндотелия и развитии ОС, у больных ХГС.

Задачи исследования 1. У больных с хронической HCV-инфекцией и в группе сравнения изучить и сопоставить характер распределения генотипов и аллелей полиморфных локусов генов, вовлеченных в регуляцию функции эндотелия: G894T гена NOS3 и С677Т гена MTHFR, развитие ОС: С242Т гена CYBA, а также генов, кодирующих компоненты РАС: М235Т и G(-6)A гена AGT, AI 166С гена ATR1.

2. Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов отобранных генов и их комбинаций у больных ХГС и ЦП и выявить клинические и генетические факторы, наиболее значимые для трансформации ХГС в ЦП.

3. Провести сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов отобранных генов у больных с различной скоростью фибротических изменений в печени и оценить вклад генетических и клинико-демографических параметров в прогрессиро-вание фиброза.

4. Выявить генотипы и аллельные варианты генов N083, СУВА, МТИРЯ, АТШ, А ОТ, а также их комбинации, обладающие наибольшей прогностической ценностью в отношении развития синдрома ПГ у больных с хронической НСУ-инфекцией.

Научная новизна

Впервые проведён комплексный анализ распределения вариантных генотипов и аллелей шести полиморфных локусов генов РАС, ОС и ЭД у пациентов с хронической НСУ-инфекцией (162 человека) российской популяции.

Впервые выявлены генотипы исследованных полиморфных генов, ассоциированные с быстрым темпом прогрессирования фиброза печени, развитием и тяжестью синдрома ПГ и трансформацией ХГС в ЦП и установлена прогностическая значимость проведения генотипирования у больных ХГС по указанным полиморфным локусам.

Практическая значимость

Разработана прогностическая модель оценки вероятности быстрого прогрессирования фиброза у больных ХГС на основании комбинации генетических и клинико-демографических параметров.

Выявлены генетические и клинико-демографические факторы предрасположенности к развитию синдрома ПГ у больных ХГС и их относительная значимость.

Основные положения, выносимые на защиту

1. ТТ-генотип полиморфизма С242Т гена СУВА и АА-генотип полиморфизма й-бА гена АйТ более распространены у больных с ЦП в исходе ХГС, чем у больных ХГС без цирротической трансформации. При оценке комбинированного воздействия наследственных и клинико-демографических факторов

формирование ЦП в исходе ХГС в наибольшей степени ассоциируется с возрастом больных и наследованием 242ТТ-генотипа гена СУВА.

2. У больных с хронической НСУ-инфекцией и быстрым темпом прогрессирования фиброза печени чаще, чем у лиц с медленным темпом нарастания фиброза, встречаются 242ТТ генотип гена СУВА, (-б)А аллель и (-б)АА генотип гена АОТ, а также 235Т аллель и 235МТ генотип гена ЛОТ, что указывает на их «профиброгенный» эффект.

3. Наиболее прогностически ценными независимыми предикторами быстрого развития фиброза у больных ХГС при отсутствии сопутствующих факторов поражения печени служат: возраст на момент инфицирования, (-б)АА генотип гена А СТ. мужской пол, 242ТТ генотип гена СУВА и 235МТ генотип гена АСТ.

4. Развитие синдрома ПГ ассоциируется с носительством (-б)АА генотипа гена АОТ и 242ТТ генотипа гена СУВА и с отсутствием 235ТТ генотипа гена АОТ.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в практику гепатологического отделения Университетской клинической больницы №3 Первого МГМУ им. И.М. Сеченова и в практику преподавания курса внутренних болезней сотрудниками кафедры внутренних болезней ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры внутренних, профессиональных болезней и пульмонологии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на совместном заседании сотрудников кафедры внутренних болезней факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО МГУ имени М.В. Ломоносова и кафедры внутренних, профессиональных болезней и пульмонологии медико-профилактического факультета ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова (21 апреля 2014 г.).

Материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции «Аспирантские и докторантские чтения: Дерзания нового времени — поиск инноваций» (Москва, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, в том числе, 2 статьи в журналах, включённых в перечень ВАК РФ, 1 монография в соавторстве и 1 глава в монографии.

Личный вклад автора. Автор непосредственно участвовал в обследовании больных, проведении молекулярно-генетического анализа, составлении базы данных и их статистической обработке, написании научных публикаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на русском языке на 138 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырех глав — «Обзор литературы», «Объект, материалы и методы исследования», «Результаты собственных исследований» и «Обсуждение результатов», выводов и практических рекомендаций, иллюстрирована 23 таблицами и 29 рисунками. Список литературы содержит 267 источников, из них 66 работ отечественных авторов.

Базы проведения работы. Клиническое исследование проводилось на базе кафедры внутренних болезней ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова в клинике нефрологии, внутренних и профессиональных болезней им. Е.М. Тареева Университетской клинической больницы №3 Первого МГМУ им. И.М.Сеченова (заведующий кафедрой и директор клиники — академик РАН, д.м.н., профессор Н.А.Мухин). Молекулярно-генетический анализ проводился в научно-исследовательской лаборатории генных и клеточных технологий ФФМ МГУ имени М.В. Ломоносова (заведующий лабораторией — академик РАН, д.б.н., профессор В.А. Ткачук).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы исследования. В исследование были включены 162 больных (48 мужчин и 114 женщин) европеоидной расы с хронической НСУ-инфекцией в возрасте от 18 лет до 81 года (средний возраст 47,7±1,1 года), давших информированное согласие на исследование. Критерием исключения было наличие других этиологических факторов поражения печени, включая злоупотребление алкоголем. Группу сравнения составили 299 доноров крови без признаков поражения печени.

Обследование больных включало сбор жалоб, анамнеза, данных объективного обследования и стандартных лабораторных и инструментальных методов анализа. Всем больным проводился забор венозной крови для молекулярно-генетического исследования.

Для определения стадии фиброза использовались чрескожная биопсия печени с полуколичественной оценкой его по шкале МЕТАУ1Я или эластометрия печени. У больных с общепринятыми клинико-лабораторными и инструментальными признаками ЦП стадия фиброза была оценена как Р4.

Кпинико-морфологическая характеристика обследованных больных

Из 162 больных, включённых в исследование, у 93 (57,4%) был диагностирован ХГС, у 69 (42,6%) - ЦП. Стадия фиброза была определена у 139 больных, из которых у 41 (29,5%) была П степень фиброза, у 20 (14,4%) — ¥2, у 9 (6,5%) — РЗ, у 69 (49,6%) — Р4. Среди больных ЦП у 45 человек (65,2%) была декомпенсированная ПГ, и у 19 (27,5%) компенсированная ПГ. Ещё у 5 больных с ЦП (7,2%).

Расчёт длительности заболевания проводился от момента самого раннего из равнозначных факторов риска инфицирования или от желтушной формы острого гепатита С. При указании в анамнезе на наличие нескольких факторов риска началом заболевания считалось то из воздействий, которое предполагает максимальный объём инфицирующего материала. У 109 человек была установлена длительность заболевания и рассчитана скорость прогрессирования фиброза по формуле 1, предложенной Т. Роупагс! ег а1. (1997):

Р

Скорость прогрессирования фиброза[ед. фиброза/г/ = Г, (1)

где ^— стадия фиброза печени (ед.фиброза), Т— длительность заболевания (годы).

В 55 случаях (50,5%) темп развития фиброза составил >0,130 ед.фиброза/год (в среднем, 0,284±0,039 ед. фиброза/год) — группа с «быстрым» фиброзом. У 54 больных (49,5%) скорость прогрессирования не достигала 0,130 ед. фиброза/год (в среднем, 0,072±0,004 ед. фиброза/г) — группа с «медленным» фиброзом (табл. 1).

Таблица 1 — Клинико-демографнческие показатели в группах «медленного» и «быстрого» прогрессировання фиброза печени __

Показатели «Медленный» фиброз «Быстрый» фиброз Р

Число больных, п (%) 54 (49,5%) 55 (50,5%)

Средняя скорость прогрессирования фиброза, ед.фиброза/год (М±ш) 0,072±0,004 0,284±0,039 0,0000005

Мужчины, п (%) 12(22,2%) 18(32,7%) 0,2195

Женщины, п (%) 42 (77,8%) 37 (67,3%)

Возраст (М±т) 47,0±2,0 52,8±1,7 0,0318

Женщины моложе 50 лет 21 (38,9%) 8(14,5%) 0,004

Давность заболевания, (М±т) 24,0±1,5 17,1±1,1 0,0003

F1, п (%) 34 (63,0%) 3 (5,5%) 0,00000000002

F2, п (%) 7(13,0%) 8(14,5%)

F3, п (%) 3 (5,6%) 4 (7,3%)

F4, п (%) 10(18,5%) 40 (72,7%)

Возраст инфицирования, годы (М±т) 20,7±1,5 30,9±1,5 0,00009

Таким образом, скорость прогрессирования фиброза при «медленном» темпе была в 3 раза ниже, чем при «быстром». Группы с «медленным» и «быстрым» фиброзом были сопоставимы по числу больных и частоте обнаружения «неблагоприятных» генотипов вируса. «Медленный» темп значимо чаще выявлялся у женщин моложе 50 лет при раннем возрасте инфицирования.

Статистическую обработку данных проводили с помощью пакетов «Statistica 10.0» и «Microsoft Office Excel 2007» с использованием двухвыборочного t-критерия Стьюдента (для анализа количественных признаков), двустороннего точного критерия Фишера и критерия х Пирсона (для качественных признаков). Также использовался критерий отношения шансов (ОШ) и 95% доверительного интервала для отношения шансов. Многофакторный анализ проводился методом бинарной логистической регрессии. Достоверными считались различия при р<0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Гены ОС и ЭД

При анализе частот аллелей и генотипов полиморфизма гена СУВА, кодирующего субъединицу р22р1юх, по локусу С242Т, у пациентов с НСУ-инфекцией достоверно реже, чем в группе сравнения, встречались гомозиготный мутантный генотип ТТ (8,1% и 14,7%, соответственно, р=0,0392) и минорная аллель Т (30,7% и 37,5%, соответственно, р=0,0419). При этом частоты СС-генотипа и Т-аплели гена СУВА в обеих выборках соответствуют данным, полученным для европейской популяции (СаЫНу С. й а!., 2000, Сьшк Т.! е1 а!., 2000).

Распределение генотипов и аллелей гена N083 по локусу С894Т у пациентов с хронической НСУ-инфекцией и в группе сравнения статистически значимо не различалось.

Частоты аллелей и генотипов гена МТНШ по локусу С677Т в группе больных с хронической НСУ-инфекцией были сопоставимы с группой сравнения.

Анализ связи полиморфизма генов ОС и ЭД с трансформацией ХГС в ЦП

У больных с ЦПС по сравнению с больными ХГС достоверно чаще выявлялся гомозиготный мутантный генотип ТТ гена СУВА (ОШ ТТ=3,70; р=0,0147). При объединении в одну подгруппу пациентов с СС и СТ генотипами и различия между группами были также статистически значимыми (р=0,0270, рис. 1).

р~0,0147 р-0,0270

СС СТ ГТ СС*СТ

Рнсунок 1 — Распределение генотипов полиморфизма С242Т гена СУВА у

больных ЦПС и ХГС

Распределение генотипов и аллелей полиморфизма в894Т гена N083 и

полиморфизма С677Т гена МТНП1 у больных с ЦПС и ХГС не имело статистически

достоверных различий.

Связь полиморфизма генов ОС и ЭД со скоростью прогрессировать фиброза У больных с «быстрым» фиброзом достоверно чаще встречался мутантный генотип ТТ гена СУВА (р=0,0256; рис. 2) по сравнению с группой с «медленным» фиброзом, при объединении в одну подгруппу пациентов с СС и СТ генотипами достоверность различий возрастала (ОШ ТТ=9,09; р=0,0161; рис. 2). Распределение генотипов гена СУВА у больных с медленным фиброзом значимо (р=0,0332) отличалось и от группы сравнения: в группе с «медленным» фиброзом реже встречался генотип ТТ; достоверность различий также повышалась при объединении носителей СС и СТ-генотипов в одну подгруппу (р=0,0091).

Рисунок 2 — Распределение генотипов по локусу С242Т гена СУВА у пациентов с различной скоростью развития фиброза

Не выявлены достоверные отличия в распределении аллелей и генотипов генов N083 и МТНРЯ между группами больных ХГС с «медленным» и с «быстрым» фиброзом. Различия вариантных маркеров по локусам С894Т N053 и С677Т МТНРЯ между каждой из групп больных и группой сравнения не были статистически значимыми.

Связь полиморфизма генов ОС и ЭД с развитием и тяжестью синдрома ПГ

В группе больных с признаками ПГ достоверно чаще встречалось носительство «мутантного» генотипа ТТ гена СУВА по сравнению с группой, в которой признаки ПГ отсутствовали (13,6% и 4,2%, соответственно; р=0,0308; ОШ ТТ=3,59; рис. 3), распределение всех трёх возможных генотипов гена СУВА в этих группах имело тенденцию к различию (р=0,0565).

Рисунок 3 — Распределение генотипов полиморфизма С242Т гена СУВА у больных с хронической НСУ-инфекцией с наличием и отсутствием ПГ

Распределение аллелей и генотипов по полиморфным локусам 0894Т гена N083 и С677Т гена МТНРЯ не имело статистически достоверных отличий ни между группами с наличием и отсутствием ПГ, ни между каждой из этих групп и группой сравнения. При подразделении группы больных с ПГ на подгруппы с компенсированной и декомпенсированной ПГ различия частот встречаемости вариантных маркеров генов СУВА, N053 и МТНРЯ не были статистически значимыми. Исключение составили больные с более редким носительством гетерозиготного варианта вТ гена N083 в подгруппе с декомпенсированной ПГ (35,6% и 61,9%, соответственно; ОШ СТ=0,34; р=0,044). По отношению к подгруппе больных без ПГ, в подгруппе с декомпенсированной ПГ из всех генов, кодирующих белки, влияющие на функцию эндотелия (СУВА, N083 и МТНРЯ), статистически достоверными были только различия в распределении генотипов гена СУВА (рис. 4): в группе с декомпенсированной ПГ чаще встречалось носительство ТТ генотипа и реже — генотипов СС и СТ (15,6% и 3,3%, соответственно; ОШ ТТ=5,46), при объединении носителей генотипов СС и СТ в одну подгруппу достоверность различий возрастала до р=0,0094.

По мере нарастания тяжести синдрома ПГ наблюдалось увеличение доли мутантных Т-аллели и ТТ генотипа гена СУВА (рис. 4), при этом различия были статистически значимыми при сравнении крайних групп (с декомпенсированной ПГ и её отсутствием). Для других полиморфных генов ЭД подобной тенденции не наблюдалось.

Рисунок 4 — Распределение генотипов гена CYBA в ряду изменения тяжести синдрома ПГ у больных с хронической HCV-инфекцией

Механизм, лежащий в основе выявленной ассоциации носительства ТТ-генотипа с «быстрым» фиброзом у больных с хронической HCV-инфекцией, трансформацией ХГС в ЦП и формированием у них ПГ, не ясен. Нами показано, что по сравнению со здоровыми донорами в группе больных хронической HCV-инфекцией ТТ-генотип гена CYBA встречался реже. Под влиянием этого полиморфизма снижается образование реактивных форм кислорода, что может влиять на апоптоз или экспрессию генов, в результате чего происходит ремоделирование внутрипечёночных сосудов и развитие фиброза печени. 242ТТ генотип гена CYBA ассоциируется с негативным эффектом на прогноз у больных ХГС, поскольку имеется корреляция носительства этого генотипа и с быстрой скоростью прогрессирования фиброза (ОШ ТТ=9,02), и с трансформацией ХГС в ЦПС (ОШ ТТ=3,70), и с формированием ПГ (ОШ ТТ=3,59), при этом в ряду нарастания тяжести симптомов ПГ (ОШ ТТ=5,46) доли мутантных Т-аллели и ТТ генотипа гена CYBA увеличиваются.

Наши данные свидетельствуют об отсутствии прямой связи полиморфизма G894T гена NOS3 и полиморфизма С677Т гена MTHFR со скоростью развития фиброза, формированием ЦП и развитием синдрома ПГ у больных ХГС российской популяции.

Гены РАС

У больных с HCV-инфекцией достоверно чаще, чем в группе сравнения,

встречался гомозиготный «дикий» генотип GG гена ангиотензиногена (AGT) по

локусу G-6A (35,8% и 22,7%, соответственно, р=0,0027) и аллель G (58,0% и 47,8%,

13

соответственно, р=0,0031) и реже - мутантная аллель А и генотипы АА и GA. Показатель ОШ> 1 может свидетельствовать в пользу неблагоприятного эффекта наследования (-б)О-аллели и (-б)ОО-генотипа гена AGT в отношении развития хронической HCV-инфекции.

Распределение генотипов и аллелей гена AGT по локусу М235Т, а также полиморфизма Al 166С гена ATR1, кодирующего рецептор 1 типа к ангиотензину II, у пациентов с хронической HCV-инфекцией и в группе сравнения статистически значимо не различались.

Анализ связи полиморфизма генов РАС с трансформацией ХГС в ЦП При анализе частот аллелей и генотипов полиморфизма гена AGT, по локусу G-6A (рис. 5) у больных с ЦПС по сравнению с больными ХГС достоверно чаще выявлялся генотип АА (ОШ АА=2,27) и реже два других генотипа (р=0,0377). Аллель А у больных с ЦПС по сравнению с группой ХГС встречалась чаще (47,7% и 38,1%, соответственно), различия носили характер тенденции (р=0,0878).

100,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% ■> 0,0%

■ ЦП

□ ХГС

р=0,0377 ^

GG GA АА GG+GA

Рисунок 5 — Распределение генотипов полиморфизма в-бА гена АвТ у

больных ЦПС и ХГС

Мы не выявили у больных с ЦПС и ХГС статистически достоверных различий распределения генотипов или аллелей полиморфизма М235Т гена АСТ и полиморфизма А1166С гена АТИЛ.

Связь полиморфизма генов РАС со скоростью прогрессирования фиброза

У больных с «быстрым» фиброзом по сравнению с группой с «медленным» фиброзом достоверно чаще встречались минорная А аллель гена АСТ по локусу О-6А (50,0% и 33,3%, соответственно, р=0,0126; рис. 6А) и гомозиготный мутантный генотип (-б)АА (27,3% и 11,1%, соответственно; р=0,0324; рис. 6Б).

При сравнении частот аллелей и генотипов полиморфизма М235Т гена АвТ у больных ХГС с быстрым прогрессированием фиброза достоверно чаше встречалась аллель Т и реже — аллель М, чем в группе с медленно прогрессирующим фиброзом (р=0,0407; ОШ Т=1,76; рис. 7А).

80,0% 60,0% 40,0% 20,0% 0,0%

Быстрый фиброз □ Медленный фиброз р=0,0126

Y 66.7%

1Х50,0УГ1

£ и

50.0%

■ Быстрый фиброз □ Медленный фиброз 100,0%

50,0%

0,0%

72,7%Г**^

88,9% р=0,0324 0Щ

GGtGA

Рисунок 6 — Распределение аллелей (А) и генотипов (Б) полиморфизма G-6A гена AGT у больных ХГС с различной скоростью развития фиброза

При этом у больных с «быстрым» темпом фиброза по сравнению с группой «медленного» фиброза реже выявлялся «дикий» генотип ММ (20,8% и 44,4%, соответственно) и чаще — гетерозиготный генотип МТ (50,9% и 31,5%, соответственно, р=0,0268). При объединении генотипов ММ и МТ в одну подгруппу достоверность различий в распределении частот генотипов между группами ещё возрастала (р=0,0090; рис. 7Б).

Рисунок 7 - Распределение аллелей (А) и генотипов (Б) полиморфизма М235Т гена АСТ у больных ХГС с различной скоростью развития фиброза

Достоверных отличий в распределении вариантных аллелей и генотипов гена АТЮ между группами больных ХГС с «медленным» и с «быстрым» фиброзом выявлено не было.

Связь полиморфизма генов РАС с развитием и тяжестью синдрома ПГ

У больных хронической НСУ-инфекцией с наличием и отсутствием признаков ПГ распределение аллелей и генотипов гена ЛОТ (локусы С-6А и М235Т), а также полиморфизма А1166С гена АТШ статистически значимо не различалось. В подгруппе больных с декомпенсированной ПГ по сравнению с подгруппой компенсированной ПГ наблюдалась тенденция к более частому выявлению минорной аллели (-б)А (р=0,0604) и меньшей распространённости генотипа (-б)ОО (р=0,0823) гена АСГ. Различия в распределении полиморфных маркеров гена АОТ по локусу М235Т гена АйТ и гена АТЯ1 по локусу А1166С в группах с компенсированной и декомпенсированной ПГ не были статистически значимы. Недостоверными были и различия в распределении аллелей и генотипов генов РАС при попарном сравнении групп как с компенсированной, так и с декомпенсированной ПГ с группой больных с хронической НСУ-инфекцией без признаков ПГ.

Таким образом, наследование минорной 235Т-аллели гена АвТ, как и наследование (-б)О-аллели, является неблагоприятным маркером в отношении скорости прогрессирования фиброза при ХГС (ОШ Т=1,76), при этом у гетерозигот МТ риск высокого темпа нарастания фибротических изменений в печени был больше в 2,26 раза. Наследование «дикого» 235ММ генотипа гена АСГ, напротив, снижало этот риск в 3 раза (ОШ ММ=0,33) и его можно считать благоприятным прогностическим фактором и маркером медленного прогрессирования фиброза у больных ХГС.

Мы выделили «благоприятные» и «неблагоприятные» комбинации полиморфизма генов СУВА и АОТ. К «благоприятным» комбинациям были отнесены сочетания генотипов с отсутствием либо гетерозиготным носительством минорных (-б)А и 242Т-аллели. «Неблагоприятная» включала в себя носительство гомозиготных (-б)АА и 242ТТ генотипов. Носительство «благоприятных» комбинаций среди пациентов с ЦПС отмечалось реже, чем на стадии хронического гепатита (25,9% и 48,1%, соответственно; р=0,0339), а «неблагоприятная» встречалась исключительно в группе больных ЦП (2,5%, рис. 8).

Рисунок 8 — Носительство «благоприятных» (ТТ-/АА-) и «неблагоприятного» (TT+/GG+) генотипов у больных с ЦП и с ХГС

Многофакторная модель связи полиморфизма генов ОС, ЭД и РАС с развитием ЦП, скоростью развития фиброза печени и формированием ПГ

Однофакторный анализ выявил ассоциацию формирования ЦП у больных с хронической HCV-инфекцией как с полиморфизмом С242Т гена СУВА, так и с полиморфизмом G-6A гена AGT. При многофакторном анализе на фоне эффекта носительства гомозиготного мутантного генотипа 242ТТ гена СУВА (р=0,0169; ОШ ТТ=31,53) негативный эффект наследования АА-генотипа полиморфизма G-6A гена AGT не был статистически значимым, как и вклад носительства мутантных аллелей других полиморфных генов. При включении в логистическую модель клинико-демографических параметров: возраста пациента на момент обследования, пола, возраста, в котором произошло инфицирование, индекса массы тела, длительности заболевания, а также максимальной активности трансаминаз за весь период наблюдения (в виде отношения к верхней границе нормы наиболее изменённого показателя) значимая прямая и сильная ассоциация с формированием ЦП наблюдалась только для возраста больного на момент последнего обследования: чем старше — тем выше вероятность ЦП. Относительное прогностическое значение этого показателя было выше, чем вклад полиморфизма гена CYBA (статистика Вальда 7,261 и 5,710; соответственно). Другие клинические факторы при комплексной оценке не имели статистически достоверных ассоциаций с риском развития ЦП и имели меньшую прогностическую значимость, чем носительство генотипа 242ТТ гена СУВА. Эти результаты согласуются с данными Н. Huang et al. (2007), которые свидетельствуют о том, что из всех клинических параметров только

возраст больных и их пол имели значимую ассоциацию с риском развития ЦП. Т. Роупагс! е1 а1. (1997) показали, что фибротические изменения в печени при ХГС нарастают нелинейно, скорость этих изменений тем выше, чем старше пациент на момент инфицирования и чем больше стаж заболевания.

Многофакторный анализ подтвердил, что наиболее весомыми наследственными факторами прогноза «быстрого» прогрессирования фиброза печени являются носительство генотипов (-б)АА и 235МТ гена АОТ [ОШ (-6)АА=4,64; ОШ 235МТ=3,79] и 242ТТ генотипа гена СУВА [ОШ 242ТТ=13,49] (табл. 2).

Таблица 2 - Многофакторный анализ влияния полиморфизма генов CYBA и AGT на скорость прогрессирования фиброза печени у больных ХГС_

Генотипы Статистика Вальда р для статистики Вальда ОШ (95% ДИ) р для модели логистической регрессии

AGT(-6)AA+ 6,793799 0,009 4,64 (1,444-14,034) р=0,00019

AGT 235МТ+ 8,590034 0,003 3,79 (1,538-9,323)

CYBA 242ТТ+ 5,385376 0,020 13,49 (1,460-124,525)

При построении прогностической модели оценки риска быстрого прогрессирования фиброза, в которую были включены клинические и демографических показатели, а также выявленные генетические маркеры, оказалось, что значимое негативное влияние на скорость прогрессирования фиброза оказывали возраст больных на момент инфицирования (чем старше — тем быстрее) и мужской пол, носительство мутантного 242ТТ-генотипа гена СУВА, мутантного АА генотипа (полиморфизм 0-6А) и гетерозиготного МТ генотипа (полиморфизм М235Т) гена АОТ (табл. 3).

Таблица 3 - Уровень значимости клинических и генетических предикторов

Прогностические факторы Негативные

Возраст на момент инфицирования G-6A гена AGT Мужской пол С242Т гена CYBA М235Т гена AGT

Статистика Вальда 11,30 6,10 5,64 5,05 4,97

Р 0,00077 0,01348 0,01761 0,02460 0,02581

Уровень значимости —, 'Т 1 1 □

-----—1

Прогноз вероятности (Р) быстрого прогрессирования фиброза у больного ХГС в полученной модели рассчитывается по формулам 2-3:

р=--

1 + *?"', (2)

г = -0,93 + 2,52*(С242тт СУВЛ)+1,76*(С._6ллЛ(;Т) + 1,06*(С235МТЛ(;Т) + 0,01*(Возраст инфицирования) - 1,55*(Пол1_2), (3) где (7 - носительетво или отсутствие соответствующего генотипа (может принимать значения 0 или 1), Пол может принимать значения 1 (мужской) или 2 (женский).

В нашей работе изучался полиморфизм генов, кодирующих вещества, влияющие на сосудистый компонент фиброгенеза в печени. Поэтому особый интерес представляла оценка связи исследованных полиморфных маркеров с формированием синдрома ПГ и нарастанием тяжести его проявлений. При построении прогностической модели развития ПГ, в которую были включены клинические и демографических показатели, а также выявленные генетические маркеры, оказалось, что статистически достоверным было негативное влияние показателей индекса массы тела и возраста больных на момент последнего обследования (табл. 4).

Таблица 4 - Уровень значимости клинических и генетических предикторов

формирования ПГ у больных ХГС при комбинированном воздействии

Прогностические факторы Негативные Протективный

Возраст имт С-6Л АОТ С242Т СУВА М235Т АОТ

Статистика Вальда 14.99 4.35 3,73 3,08 0,84

Р 0.000002 0,000108 0,053545 0,079205 0,358826

Уровень значимости —=„... ..... 1 1 "1 1 1 0П1 _

При исключении из модели логистической регрессии общепопуляционных факторов риска развития ПГ (возраста и индекса массы тела) проявился эффект полиморфизма исследованных генов. Наиболее весомым генетическим маркером формирования ПГ служил (-б)АА генотип гена А ОТ (статистика Вальда 6,07). Однонаправленный с ним, но менее выраженный эффект оказывало носительство мутантного 242ТТ-генотипа гена СУВА (статистика Вальда 4,73). Наследование ТТ-генотипа полиморфизма М235Т гена АОТ снижало вероятность формирования синдрома ПГ. Такое же влияние приведенная комбинация генотипов оказывала на декомпенсацию ПГ.

При ранжировании эффекта наследования изученных генотипов на формирование синдрома ПГ наиболее значимым был вклад полиморфизма G-6A гена AGT, далее следовали полиморфизм М235Т гена AGT и С242Т гена CYBA.

ВЫВОДЫ

1. У больных с хронической HCV-инфекцией Т-аллель и ТТ-генотип гена CYBA (локус С242Т) встречались реже, а G-аллель и GG-генотип гена AGT (локус G-6А) — чаще, чем в группе сравнения; распределение полиморфных вариантов генов NOS3 (локус G894T), MTHFR (локус С677Т), AGT (локус М235Т) и ATR1 (локус A1166А) было сопоставимо с группой сравнения.

2. У больных циррозом печени чаще, чем у больных ХГС, определялись генотипы 242ТТ гена CYBA и (-б)АА гена AGT. При многофакторном анализе прогностически неблагоприятными был генотип 242ТТ гена CYBA и возраст больных на момент обследования.

3. У больных с «быстрым» развитием фиброза печени чаще выявлялись 242ТТ генотип гена CYBA, (-б)А аллель и (-б)АА генотип гена AGT, а также 235Т аллель и 235МТ генотип гена AGT, при этом наиболее прогностически ценными независимыми предикторами «быстрого» развития фиброза были возраст на момент инфицирования, (-б)АА генотип гена AGT, мужской пол, 242ТТ генотип гена CYBA и 235МТ генотип гена AGT.

4. По мере нарастания тяжести синдрома ПГ увеличивалась частота выявления му-тантных Т аллели и ТТ генотипа гена CYBA. Развитие синдрома ПГ прямо коррелировало с носительством (-б)АА генотипа гена AGT и 242ТТ генотипа гена CYBA и с отсутствием 235ТТ генотипа гена AGT.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Для выявления больных с риском «быстрого» развития фиброза печени целесообразно проведение анализа полиморфизма гена AGT (локусы М235Т и G-6A) и гена CYBA (локус С242Т). Неблагоприятными в этом случае являются генотипы 242ТТ гена CYBA, (-б)АА и 235МТ гена AGT.

Для уточнения прогноза необходимо учитывать демографические показатели (пол и возраст на момент инфицирования) — мужской пол и более старший возраст инфицирования увеличивают вероятность быстропрогрессирующего течения ХГС.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Таратнна О.В., Краснова Т.Н., Самоходская Л.М., Лопаткина Т.Н., Ткачук В.А., Мухин H.A. Значение полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы в прогрессировании фиброза печени у больных хроническим гепатитом С / Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2014. - №2. - С. 69 - 77.

2. Таратнна О.В., Краснова Т.Н., Самоходская J1.M., Лопаткина Т.Н., Ткачук В.А., Мухин H.A. Полиморфизм генов эндотелиальной дисфункции и скорость прогрессирования фиброза печени при хроническом гепатите С / Терапевтический архив. —2014. —№4. -С. 45 — 51.

3. Таратнна О.В., Краснова Т.Н., Самоходская Л.М., Сагинова Е.А., Мухин H.A., Ткачук В.А. Роль структурного полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы и эндотелиальной дисфункции в прогрессировании фиброза печени при хроническом гепатите С / В кн.: Постгеномные исследования и технологии. Коллективная монография / Под ред. С.Д. Варфоломеева. - М.: Издательство Московского университета, 2011. - С. 347 - 375.

4. Самоходская Л.М., Бапацкий A.B., Садекова О.Н., Таратнна О.В. и др. Молекулярно-генетический анализ предрасположенности человека к мультифакторным заболеваниям: Монография /Научный ред. акад. РАН В.А. Ткачук. — М.: Издательство Московского университета, 2011. — 388 с.

5. Таратина О.В. Оценка роли полиморфизма генов ранин-ангиотензиновой системы и эндотелиальной дисфункции в прогрессировании хронического гепатита С и ответа на противовирусную терапию. Сборник материалов конференции «Аспирантские докторантские чтения: дерзания нового времени — поиск инноваций», Москва, 8 февраля 2012 г. М.: Издательство Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, 2012.-С. 179- 180.

Список сокращений

AGT ген ангиотензиногена

CRS шкала оценки риска развития цирроза (Cirrhosis Risk Score)

HCV вирус гепатита С

MTHFR метиленттетрагидрофолатредуктаза

NADP(H) никотинамидадениндинуклеотидфосфат (гидрированный)

NO оксид азота

eNOS (NOS3) эндотелиальная синтаза оксида азота

ATR1 ген рецептора 1 типа ангиотензина II

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ПГ портальная гипертензия

ОС оксидативный стресс

ОШ отношение шансов

РАС ренин-ангиотензиновая система

ХГС хронический гепатит С

ЦП цирроз печени

эд эндотелиальная дисфункция

Подписано в печать: 23.10.2014 Объем: 1,3 п.л Тираж: 100 экз. Заказ № 420 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru