Автореферат и диссертация по медицине (14.01.21) на тему:Особенности аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, у больных с ранним дебютом венозного тромбоза

На правах рукописи

ПОЛЯКОВА Анастасия Павловна

ОСОБЕННОСТИ АЛЛЕЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ ДИСФУНКЦИЕЙ, У БОЛЬНЫХ С РАННИМ ДЕБЮТОМ ВЕНОЗНОГО ТРОМБОЗА

14.01.21 — гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

0 3 АПР 2014

Санкт-Петербург - 2014

005546778

005546778

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Российский научно-исследовательский институт гематологии и трансфузиологии Федерального медико-биологического агентства" (ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России), директор - доктор медицинских наук, профессор A.B. Чечеткин

Научные руководители:

доктор биологических наук Капустин Сергей Игоревич доктор медицинских наук Шмелева Вероника Михайловна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Калинина Наталья Михайловна, главный научный сотрудник отдела лабораторной диагностики ФГБУ "Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины им. A.M. Никифорова" МЧС России

доктор медицинских наук, профессор Сорока Владимир Васильевич, руководитель отдела неотложной сердечно-сосудистой хирургии государственного бюджетного учреждения "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт скорой помощи им. И.И. Джанелидзе"

Ведущая организация: Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева Минздрава России

Защита состоится «28» апреля 2014 г. в_часов

на заседании диссертационного Совета Д 208.074.01 при ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России по адресу 191024, г. Санкт-Петербург, ул. 2-я Советская, д.16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России.

Автореферат разослан «_»_

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

2014г.

Татьяна Валентиновна Глазанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Тромбоэмболические заболевания являются ведущей причиной смертности и инвалидизации населения в России, странах Европы и США (Харченко В.И. и соавт., 2005; Heit J.A., 2005; Dowling N.F. et. al, 2003; Heit J.A., 2008). Частота возникновения венозного тромбоза (ВТ) и тромбоэмболических осложнений в общей популяции составляет 1-2 случая на тысячу населения ежегодно (Heit J.A. et. al, 2001; Naess I.A. et al, 2007). Важной чертой ВТ является многофакторный характер его этиопатогенеза (Lijfering W. M. et. al, 2010). В последние годы убедительно доказано, что наряду с классическими факторами риска (травмы, операции, беременность и пр.) (Knudson М.М. et. al, 2004; Paffrath T. et. al, 2010; Pottier P. et. al, 2009; Zoeller B. et. al, 2012; James A.H. et. al, 2009) значительную роль в увеличении вероятности возникновения данной патологии играет генетическая предрасположенность (Franco R.F., Reistma Р.Н., 2001; Капустин С.И. и соавт., 2003; Brouwer J.P. et. al, 2006).

В настоящее время все большее число авторов уделяют внимание функциональному состоянию эндотелия и его роли в патогенезе различных заболеваний, сопровождающихся поражением сосудистого русла (атеросклероз, артериальная гипертензия, сахарный диабет, артериальные тромбозы) (Davignon J., 2004; Contreras F. et. al, 2000; Corey Т.Е. et. al, 2010). Согласно классическим представлениям, поражение сосудистой стенки является обязательным звеном патогенеза тромбоза в артериальном русле, тогда как значение этого важнейшего компонента триады Вирхова для развития ВТ долгое время оставалось под вопросом. Однако результаты проведенных в последние годы ретро- и проспективных исследований свидетельствуют о наличии общих патогенетических механизмов при артериальном и венозном тромбозе, главным из которых признается "эндотелиальная дисфункция" (ЭД) (Jeijes-Sanchez С., 2005, Migliacci R. et. al, 2007). Термином "эндотелиальная дисфункция" сегодня обозначают нарушение целостности и/или функциональных свойств сосудистого эндотелия, сопровождающееся вазоконстрикцией и усиленной продукцией веществ, обладающих провоспалительными и протромботическими свойствами (Endermann D.H., 2004).

Молекулярные механизмы развития ЭД весьма разнообразны, что объясняется наличием значительного числа факторов, осуществляющих регуляцию физиологической активности эндотелия. К числу возможных причин развития ЭД относятся: снижение концентрации оксида азота (NO), гипергомоцистеинемия (ГГц), оксидативный стресс, нарушение регуляции процессов вазоконстрикции и вазодилатации вследствие дисбаланса ренин-ангиотензиновой системы (РАС), нарушения липидного обмена, активизация локального иммунного ответа, сопровождающаяся продукцией провоспалительных цитокинов и белков острой фазы воспаления. Многофакторный генез ЭД отражается наличием значительного числа биохимических маркеров, используемых для подтверждения данного

состояния, - снижение продукции N0 и активности его эндотелиальной синтазы (eNOS), повышение концентрации в плазме крови растворимого тромбомодулина (sTM), ангиотензина II (АТ II), фактора Виллебранда (vWF), ингибитора активатора плазминогена 1-го типа и многие другие (Петрищев

H.Н., 2007).

Степень разработанности темы. Несмотря на значительное число работ, посвященных изучению роли аллельных вариантов генов, кодирующих компоненты иммунной (Inge А.М., 2010), антиоксидантной (Levonen A.-L. et. al, 2008; Voetsch В. et. al, 2007), ренин-ангиотензиновой (Freitas A.I. et. al, 2008) и других систем организма в патогенезе артериального тромбоза, данные об их распространенности и ассоциации с маркерами ЭД при ВТ практически отсутствуют. В связи с этим, а также учитывая большое клиническое и социальное значение проблемы тромбоэмболических заболеваний, является актуальным установление особенностей аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, в группе больных с ранним дебютом ВТ.

Цель исследования

Установить роль аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, в патогенезе венозного тромбоза у лиц молодого возраста.

Задачи исследования

I. Провести сравнительный анализ частот встречаемости аллелей и генотипов ряда генов, ассоциированных с ЭД, в группе больных молодого возраста с ВТ и у здоровых лиц, проживающих в Северо-Западном регионе Российской Федерации.

2. Провести анализ "ген-генных взаимодействий" в группе больных с ранним дебютом ВТ и установить особенности аллельного полиморфизма изучаемых генов у пациентов с классическими формами наследственной тромбофилии.

3. Выявить особенности распределения аллелей и генотипов изучаемых генов, характерные для пациентов с различными клиническими проявлениями ВТ.

4. Изучить особенности аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, в группе больных с ВТ в зависимости от тяжести течения заболевания.

5. На основании анализа ряда биохимических маркеров ЭД оценить функциональное состояние сосудистой стенки у больных с ВТ, а также фенотипическое проявление полиморфизма изучаемых генов.

Научная новизна

Впервые определены частоты встречаемости (ЧВ) аллельных вариантов ряда генов (TNF-a, IL-lp, IL-6, PONI, TM, EPCR), ассоциированных с ЭД, и их сочетаний у больных ВТ и в группе здоровых лиц Северо-Западного региона России. Выявлено статистически значимое увеличение доли лиц с вариантом

Ins/Ins гена ACE и снижение ЧВ аллеля TM 1418Т и генотипа 1418(Т/Т) гена ТМ в группе пациентов с ранним дебютом ВТ.

Проведен комплексный анализ и выявлена взаимосвязь между аллельным полиморфизмом генов, участвующих в регуляции функциональной активности эндотелия, и рядом биохимических маркеров ЭД (sTM, AT II, vWF, гомоцистеин - Гц, холестерин — Хс) в группе больных с ВТ.

Установлено, что ЭД является одним из важных патогенетических механизмов развития тромботического процесса в венозном русле и выявляется у 71,4% больных с ранним дебютом ВТ.

Показано, что основными предпосылками развития ЭД при ВТ являются аллельный полиморфизм генов, участвующих в регуляции функциональной активности эндотелия, и оксидативный стресс на фоне ГГц и/или дислипидемии. Носителями "неблагоприятных" генотипов, ассоциированных с ЭД, являются 99,5% пациентов с ВТ. При этом, в 62,8% случаев обнаруживается одновременное присутствие 3 и более таких генотипов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Получены новые данные, которые способствуют расширению знаний о патогенезе ЭД у больных с ВТ и определению информативного комплекса методов молекулярной диагностики дисфункции эндотелия у этих пациентов с целью выявления группы риска развития тромбоэмболических осложнений и посттромботической болезни (ПТБ), а также разработки индивидуализированного подхода к лечению.

Молекулярно-генетическое обследование пациентов с ранним дебютом ВТ имеет практическое значение для составления индивидуального профиля риска и определения прогноза течения заболевания. Для стратификации риска развития тромбоэмболических осложнений у больных с тромбозом глубоких вен нижних конечностей (ТГВНК) целесообразно исследование аллельного полиморфизма генов IL-Iß, IL-6 и TNF-a. Для определения риска развития ПТБ рекомендуется молекулярно-генетическое тестирование «инсерционно-делеционного» диморфизма гена АСЕ, а рецидива ВТ - анализ полиморфизма генов АСЕ (Ins/Del) и IL-lß (-31Т/С).

Методология и методы исследования

В работе были использованы общенаучные (анализ данных, синтез) и частные научные методы (клинические, лабораторные, статистические).

На первом этапе исследования были определены ЧВ вариантов генов, ассоциированных с ЭД, у больных с ВТ и в группе контроля (КГ) и проанализирована взаимосвязь между особенностями распределения генотипов отдельных генов и риском развития ВТ. Далее для выявления наиболее тромбоопасных сочетаний вариантов различных генов был проведен анализ "ген-генных взаимодействий" в группе пациентов с ВТ, результаты которого были сопоставлены с аналогичными данными в здоровой популяции.

Возможность использования молекулярно-генетических характеристик пациента для прогнозирования течения ВТ была оценена на основании

сравнительного анализа особенностей полиморфизма изученных генов в различных клинических подгруппах больных. Кроме того, в группе больных с ВТ была выполнена оценка функционального состояния эндотелия сосудистой стенки путем исследования ряда биохимических показателей, являющихся маркерами или/и факторами риска ЭД, и проведен анализ их взаимосвязи с полиморфизмом изучаемых генов. Анализ ассоциативных связей выполнялся по единому плану.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Аллельный полиморфизм генов, ассоциированных с ЭД, играет значимую роль в патогенезе ВТ у лиц молодого возраста, в том числе, являющихся носителями мутаций в гене фактора V (G1691A, FV Leiden) или/и в гене протромбина (G20210A).

2. Молекулярно-генетические механизмы развития ЭД у больных с ВТ носят гетерогенный характер и оказывают влияние, как на риск возникновения тромбоза, так и на особенности его клинического течения.

3. Генетически обусловленная склонность к повышенной продукции провоспалительных цитокинов ассоциирована с риском развития тромбоэмболических осложнений у больных с ТГВНК.

4. Для группы пациентов с рецидивирующим течением ВТ и/или развившейся ПТБ характерно значимое увеличение частоты встречаемости генотипа Ins/Ins гена АСЕ.

Степень достоверности и апробация результатов диссертации

Достоверность и обоснованность результатов работы обеспечена комплексным анализом аллельного полиморфизма изучаемых генов, функционального состояния венозного эндотелия и анамнестических данных 207 больных с ВТ с использованием современных методов молекулярно-генетического, биохимического и иммуноферментного анализа, медицинской документации (истории болезни, выписные эпикризы, заключения о проведенных функциональных исследованиях), адекватных методов статистической обработки полученных данных. Апробация результатов диссертационной работы была выполнена 19 декабря 2013 года на межлабораторном заседании в Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии ФМБА. Положения диссертационной работы были представлены на Всероссийских научно-практических конференциях: «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (Москва, 2011, 2013 гг.), «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2011, 2012 гг.), «Беломорский симпозиум» (Архангельск, 2011 г.), «Актуальные вопросы сосудистой хирургии» (Санкт-Петербург, 2012 г.), «Фундаментальная наука и клиническая медицина — человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2012г.), «Молекулярные основы клинической медицины — возможное и реальное»

(Санкт-Петербург, 2012 г.), «Патология гемостаза - общеклиническая проблема» (Санкт-Петербург, 2013 г.), «Противоречия современной кардиологии. Спорные и нерешенные вопросы» (Самара, 2013 г.), международной научно-практической конференции «Свободные радикалы и антиоксиданты в химии, биологии и медицине» (Новосибирск, 2013 г.), международных конгрессах по тромбозу и гемостазу: XXIII (Киото, 2011 г.) и XXIV (Амстердам, 2013 г.) конгрессы Международного общества по тромбозу и гемостазу, 18-ом конгрессе Европейской ассоциации гематологов (Стокгольм, 2013 г).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационной работы используются при обследовании больных с ВТ, находящихся на стационарном или амбулаторном лечении в клиническом отделении "Хирургическая гематология", а также получающих консультативную помощь в ФГБУ РосНИИГТ ФМБА России.

Результаты диссертационной работы войдут в качестве фрагмента в Методические рекомендации "Генетические факторы риска венозного тромбоэмболизма у лиц молодого возраста".

Публикации результатов исследований

По материалам диссертации опубликовано 21 научная работа, из них 3 -в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации результатов диссертационных исследований.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 35 рисунками. Библиография включает 199 источников, из них 19 - отечественных и 180 - зарубежных авторов.

Личный вклад автора

Автором лично выполнено исследование аллельного полиморфизма изучаемых генов у пациентов с ВТ и в КГ, которое включало в себя выделение ДНК, постановку полимеразной цепной реакции (ПЦР), учет результатов генетического анализа; выполнен иммуноферментный анализ уровней тромбомодулина и ангиотензина II в плазме крови у обследованных лиц; произведен сбор анамнестических данных, регистрация, статистическая обработка, анализ полученных данных, обобщение результатов исследований и подготовка материалов к публикациям.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В настоящее исследование вошли 207 пациентов (114 женщин и 93 мужчины) в возрасте от 18 до 53 лет (средний возраст группы - 35,0 ± 8,0 лет) с венозным тромбозом, проходивших в период с 2008 по 2013 год амбулаторное обследование или/и стационарное лечение в Российском научно-исследовательском институте гематологии и трансфузиологии ФМБА. Критериями включения в исследуемую группу было наличие в анамнезе ТГВНК и/или тромбоэмболии легочной артерии (ТЭЛА) с дебютом заболевания до 45 лет включительно. Лица моложе 18 лет, а также пациенты, имевшие в анамнезе эпизод(ы) артериального тромбоза, иные проявления артериальной патологии (ишемическая болезнь сердца, атеросклероз сосудов различной локализации, гипертоническая болезнь, цереброваскулярные заболевания), онкологические, онкогематологические и аутоиммунные заболевания, а также дефицит естественных антикоагулянтов были исключены из настоящего исследования. Данные объективного обследования пациентов были получены из историй болезни и выписных эпикризов. Анамнестические данные собирались на основании историй болезни, анкет и опросных листов пациентов. У 183 (88,4%) больных был диагностирован ТГВНК. Из них в 134 (64,7%) случаях клинико-инструментальное обследование не выявило признаков ТЭЛА (подгруппа "иТГВНК" - "изолированный ТГВНК"), а у 49 (23,7%) пациентов ТГВНК осложнился развитием ТЭЛА (подгруппа "ТГВНК+ТЭЛА"). У 24 (11,6%) индивидов, перенесших ТЭЛА, клинико-инструментальное обследование не выявило признаков ТГВНК (подгруппа "иТЭЛА" - "изолированная ТЭЛА"). В 21,9% случаев (40 человек) ТГВНК осложнился развитием ПТБ. У 58 (28,0%) человек наблюдались повторные эпизоды ВТ.

Контрольную группу составили 150 здоровых индивидов, соответствовавших по полу и возрасту обследованной группе пациентов и не имевших в анамнезе тромботических эпизодов.

В работе был исследован аллельный полиморфизм 11-ти генов, ассоциированных с ЭД:

1. Гены цитокинов (фактор некроза опухоли-а - TNF-a, интерлейкин-ip -IL-ip, интерлейкин-6 — IL-6);

2. Гены, участвующие в регуляции тонуса сосудов (ангиотензин-превращающий фермент - АСЕ, ангиотензиноген - AGT, рецептор ангиотензина II 1-го типа - AGTR1, эндотелиальная синтаза оксида азота -eNOS);

3. Гены, участвующие в регуляции липидного обмена и утилизации продуктов перекисного окисления липидов (апопротеин Е — ароЕ, параоксоназа - PONI);

4. Гены, ассоциированные с тромборезистентностью сосудистого эндотелия (тромбомодулин — ТМ, эндотелиальный рецептор протеина С — EPCR).

Амплификацию изученных в работе вариабельных участков геномной ДНК осуществляли методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Детекция результатов амплификации для инсерционно-делеционного (I/D) полиморфизма в гене АСЕ выполнялась методом электрофореза 10 мкл ПЦР продукта в 7% полиакриламидном геле. Идентификацию аллельных вариантов, обусловленных однонуклеотидными заменами, осуществляли с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ПЦР-продукта (метод ПЦР-ПДРФ).

Для выявления классических форм тромбофилии у пациентов был выполнен анализ активности антитромбина III, фактора VIII, компонентов системы протеина С, содержания антифосфолипидных антител (АФА) волчаночного типа. Оценка исследуемых показателей была выполнена на полуавтоматических коагулометрах COAG-A-MATE ХМ ("Organon Teknika", Голландия) и ACL-200 ("Instrumentation Laboratory", США). Истинного дефицита естественных антикоагулянтов среди обследованных пациентов выявлено не было. Лица с обнаруженными АФА (9 человек) были исключены из дальнейшего анализа в связи с высокой клинической значимостью указанных антител, как самостоятельного фактора риска развития тромбоза (Ginsberg J.S. et. al, 1995; Шостак H.A. и соавт., 2005; Денисова A.A. и соавт., 2009).

Оценка функционального состояния эндотелия путем определения содержания ряда маркеров ЭД (sTM, антиген vWF, Гц, Хс, AT II, малоновый диапьдегид — МДА) проводилась у 36 больных с различными клиническим проявлениями ВТ и 36 здоровых индивидов, соответствовавших по полу и возрасту группе исследования. Отбор образцов крови проводился спустя минимум 3 месяца после последнего тромботического эпизода. Перед сдачей крови на анализ все пациенты заполняли анкеты и подписывали информированное согласие на выполнение исследования.

Определение содержания антигена vWF (Ag vWF) в исследуемых образцах осуществлялось на полуавтоматическом анализаторе агрегации тромбоцитов SOLAR АР 2110 (SOLAR Technical Service, Украина). Исследование уровней AT II, TM и Гц проводилось методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческих наборов реагентов. Исследование показателей липидного обмена было выполнено на автоматическом биохимическом анализаторе Sapfir-400 (Niigata Mechatronics, Япония). Определение МДА проводилось колориметрическим методом по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (Андреева Л.И. и соавт., 1988).

Статистическая обработка результатов проводилась с помощью компьютерных программ GraphPad Prism, версия 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA) и SNPstats (http://bioinfo.iconcoloaia.net/snpstals/s1art.htm). Частоты встречаемости аллелей и генотипов определяли прямым подсчетом. Анализ «ген-генных взаимодействий» проводился на основании изучения ассоциативных связей между аллельными и генотипическими вариантами различных генов с помощью точного критерия Фишера с использованием

компьютерной программы для анализа генетических данных "GenePop", доступной в Интернете (http://genepop.cui1in.eclu.au.'"). Для оценки степени различий в частоте встречаемости аллелей, генотипов и их сочетаний между исследуемыми группами рассчитывали коэффициент "отношения шансов" (OR - odds ratio) с 95% доверительным интервалом (CI - confidence interval), а также /^-значение. Соответствие распределения генотипов в обследованных группах каноническому распределению Харди-Вайнберга оценивали с помощью программы GenAlEx, версия 6.501, доступной в Интернете (http:,''/biology.anu.edu.au/GenAlEx/Welcome.html). Оценка различий уровней биохимических маркеров эндотелиальной дисфункции между исследуемыми группами и их корреляции с наличием отдельных аллельных вариантов изучаемых генов выполнялась с помощью t-tests и one-way ANOVA в компьютерной программе GraphPad Prism, версия 5 (GraphPad Software Inc., San Diego, USA). Во всех случаях статистическая значимость различий принималась при значении р<0,05.

Основные результаты исследования

На первом этапе исследования были определены ЧВ вариантов генов, ассоциированных с ЭД, у больных с ВТ и в КГ и проанализирована взаимосвязь между характером распределения генотипов отдельных генов и риском развития ВТ. Результаты сравнительного анализа представлены в таблице 1. Характер распределения генотипов для всех исследованных генов, как в группе больных, так и в контроле, соответствовал каноническому распределению Харди-Вайнберга.

Таблица 1 - Распределение аллелей и генотипов исследуемых генов у пациентов с ВТ и в КГ.

Полиморфизм Аллель ЧВ аллеля ВТ КГ N=207 N= 150 Генотип * ЧВ генотипа, % ВТ КГ N=207 N= 150

АроЕ ell еЗ/е4 е2 еЗ е4 0,085 0,824 0,092 0,090 0,814 0,096 Е2/Е2 е2/ЕЗ еЗ/ЕЗ Е2/Е4 ЕЗ/Е4 е4/Е4 0,5 15,0 67,6 1,0 14,5 1,4 0,0 16,7 65,3 1.3 15.3 1.4

PONI GInl92Arg 192Gln 192 Arg 0,742 0,258 0,678 0,322 192 (Gln/Gln) 192 (Gin/Arg) 192 (Arg/Arg) 54,1 40,1 5,8' 46,7 41,3 12,0

eNOS -786 Т/С -786 Т -786 С 0,623 0,377 0,620 0,380 -786 (Т/Т) -786 (Т/С) -786 (С/С) 41,5 41,5 17,0 39,3 46,0 14,7

AGT 704 Т/С 704 Т 704 С 0,507 0,493 0,518 0,482 704 (Т/Т) 704 (Т/С) 704 (С/С) 25.1 51.2 23,7 28,7 46,7 24,6

Продолжение таблицы 1

Полиморфизм Аллель ЧВ аллеля ВТ КГ N=207 N= 150 Генотип ЧВ генотипа, % ВТ КГ N=207 N= 150

АСЕ 287 п.н. Ins/Del Ins Del 0,531 0,469 0,483 0,517 Ins/Ins Ins/Del Del/Del 30,4' 45,4 24,2 20,7 54,7 24,7

AGTR1 1166 А/С 1166 А 1166 С 0,763 0,237 0,743 0,257 1166 (А/А) 1166 (А/С) 1166 (С/С) 58,9 34,8 6,3 56,7 36,0 7,3

TNF-a -308 G/A -308 G -308 А 0,884 0,116 0,889 0,111 -308 (G/G) -308 (G/A) -308 (А/А) 11,.3 22,2 0,5 78,7 20,7 0,7

IL-6 -176 G/C -176 G -176 С 0,560 0,440 0,570 0,430 -176 (G/G) -176(G/C) -176 (С/С) 29,5 53,1 17,4 31.3 51.4 17,3

IL-lp -31 Т/С -31 Т -31 С 0,703 0,297 0,697 0,303 -31 (Т/Т) -31 (Т/С) -31 (С/С) 48,8 43,0 8,2 48,7 41,3 10,0

EPCR 6936 A/G 6936 А 6936 G 0,862 0,138 0,902 0,098 6936 (А/А) 6936 (A/G) 6936 (G/G) 73,4 25,6 1,0 81,3 18,0 0,7

ТМ 1418 С/Т 1418 С 1418 Т 0,829 0.1722 0,722 0,278 1418 (С/С) 1418 (С/Т) 1418 (Т/Т) 68,12 29,5 2,42 54,0 36,0 10,0

Примечание: * Жирным шрифтом выделены генотипы, являющиеся потенциальными факторами риска тромбоза; N - здесь и далее количество индивидов в группе; 1 р <0,05; 2 р <0,01.

В результате проведенного исследования было установлено, что носители варианта Ins/Ins гена АСЕ, ассоциированного с низким уровнем АПФ в крови, встречались среди больных с ВТ значительно чаше, чем в контрольной группе (30,4% против 20,7% соответственно, р=0,04) (рисунок 1).

54,7%

30,4%

Ins/Ins

Ins/Del

Del/Del

0 ВТ □ КГ

Рисунок 1 - Распределение генотипов АСЕ у больных с ВТ и в КГ.

Кроме того, в группе пациентов с ВТ отмечалось увеличение доли лиц с генотипом 1418(С/С) ТМ (68,1% против 54,0% в КГ, соответственно, pSO.OI) и снижение ЧВ аллеля ТМ 1418Т и генотипа 1418(Т/Т) ТМ по сравнению с КГ (рЭ0,01 в обоих случаях) (рисунок 2), что указывает на протективную роль аллеля 1418Т гена тромбомодулина в развитии ВТ у лиц молодого возраста.

68,4%

Я ВТ □ кг

Рисунок 2 - Распределение генотипов ТМ у больных с ВТ и в КГ.

С целью поиска генотипических сочетаний, ассоциированных с риском развития ВТ у лиц моложе 45 лет, был выполнен анализ "межгенных взаимодействий" изучаемых генов в общей группе больных. В ходе этого анализа проводилось изучение ассоциативных связей между аллельными вариантами различных генов и выявление неслучайных генотипических сочетаний, ЧВ которых в исследуемой группе имели отклонения от произведения ЧВ входящих в их состав генотипов. С помощью компьютерной программы для анализа генетических данных "ОепеРор" в исследуемой группе были выявлены пары изученных генов с максимально значимым (р<0,2) коэффициентом неравновесного сцепления определенных аллельных вариантов. Затем, для каждой пары генов, с помощью точного критерия Фишера, были определены сочетания генотипов, для которых уровень статистической значимости ассоциативной связи между входящими в их состав генетическими вариантами соответствовал р<0,05. При отсутствии в составе "межгенной комбинации" генетического варианта с "основным эффектом", ЧВ которого в исследуемой группе пациентов имела статистически значимое отклонение от таковой в контроле, для оценки роли этого сочетания в развитии ВТ было использовано сравнение его ЧВ у больных и в КГ. При сравнении ЧВ выявленных в группе больных с ВТ неслучайных генотипических сочетаний с аналогичными значениями в КГ статистически значимых различий выявлено не было, что может быть связано с наличием в общей популяции аналогичных ассоциативных связей.

Для оценки возможного влияния полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, на риск возникновения ВТ в раннем возрасте у лиц, являющихся

носителями «классических» детерминант наследственной тромбофилии -мутаций в генах факторов II и V, был проведен анализ распределения генотипов "нейтрального ДНК-полиморфизма" в обследуемой группе пациентов в зависимости от наличия указанных генетических маркеров. Доли больных с ВТ, являющихся носителями мутации G1691A в гене фактора V (FV Gl691А Leiden) или G20210A в гене протромбина (FII G20210A), составили 19,3% и 9,7%, соответственно. У 4 (1,4%) пациентов Лейденская мутация была выявлена в гомозиготной форме, в 4 (1,9%) случаях обнаруживалось одновременное гетерозиготное носительство указанных генетических вариантов.

Как показали результаты проведенного анализа, для группы больных с ВТ, являющихся носителями мутации в гене фактора V, было характерным почти 2-кратное увеличение ЧВ гомозигот по аллелю eNOS -786С, по сравнению с группой пациентов, имеющих мутацию G20210A в гене протромбина (27,5% против 15,0%, р=0,3), и лицами без обозначенных генетических маркеров наследственной тромбофилии (27,5% против 14,6%, р=0,06). При этом носители генотипа -786(Т/С) гена eNOS встречались среди обладателей варианта FV Leiden почти в 2 раза реже, чем в группе больных без генетических маркеров НТ (25,0% против 45,7% соответственно, р=0,02) (рисунок 3). На значимость эффекта полиморфизма гена eNOS на риск возникновения ВТ в молодом возрасте у носителей Лейденской мутации может также указывать отклонение распределения генотипов eNOS в этой группе от канонического распределения Харди-Вайнберга (р=0,002).

-786 (Т/Т) -786 (Т/С) -786 (С/С) В FV(+) □ FII(-)/FV(-)

Рисунок 3 - Распределение генотипов eNOS у носителей мутации FV Leiden.

В группе больных с ВТ была выявлена положительная ассоциативная связь между наличием мутации FII G20210A и генотипом Ins/Ins гена АСЕ (р=0,02). Среди пациентов с ВТ, являющихся носителями мутации в гене протромбина, было отмечено существенное преобладание лиц с аллелем АСЕ Ins (90,0%) и гомозигот по этому аллелю (55,0%) по сравнению с больными, не имеющими генетических детерминант наследственной тромбофилии (р=0,02 в обоих случаях). В то же время, ЧВ гомозигот по «делеционному» аллелю гена АСЕ, характеризующихся повышенным уровнем продукции АПФ, в группе

пациентов с вариантом И1 С20210А была существенно ниже (10,0% против 23,8% в группе П1(-)/ГУ(-), р=0,3) (рисунок 4). 55,0%

■»«■ ■ ■ - i-n»^™' ' и—f—-

FII(+) FV(+) FII(-)/FV(->

Ш Ins/Ins H Ins/Del □ Del/Del

Подписи: FII - мутация в гене фактора II (FII 20210 G/A), FV - мутация в гене фактора V (FV 1691 G/A, FV Leiden).

Рисунок 4 — Распределение генотипов гена АСЕ у больных с ВТ в зависимости от наличия генетических детерминант наследственной тромбофилии.

Для установления возможного влияния аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, на особенности клинических проявлений ВТ был проведен сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов изучаемых генов в различных подгруппах больных, выделенных в зависимости от локализации и характера течения тромботического процесса. В результате проведенного исследования у пациентов с иТГВНК так же, как и в общей группе больных с ВТ, была отмечена протективная роль варианта 1418Т/Т гена ТМ в развитии тромботического процесса. Частота встречаемости аллеля ТМ 1418Т и гомозигот по этому аллелю в исследуемой группе составила 17,2% и 3,0% против 28,0% и 10,0% в КГ (р=0,01 и р=0,03, соответственно).

В группе "ТГВНК+ТЭЛА" наблюдалось статистически значимое увеличение ЧВ гомозигот по аллелю IL-lß -31Т (63,3% против 43,3%; OR=2,3; 95%С1: 1,2-4,4; р=0,02) и уменьшение доли гетерозиготных носителей указанного аллеля по сравнению с больными с "изолированным ТГВНК" (26,5% против 50,7%; OR=0,4; 95%С1: 0,2-0,7; р<0,01) (рисунок 5).

Кроме того, для пациентов с ТГВНК, осложненным развитием ТЭЛА, было характерно некоторое увеличение ЧВ "редких" аллелей генов IL-6 и TNF-а (51,0% против 42,5% и 15,3% против 10,8%, соответственно), хотя эти различия не были статистически значимы. Гомозиготные носители аллеля IL-6 -174С встречались в этой группе больных в 2 раза чаще, чем среди пациентов с изолированным поражением сосудов венозного русла нижних конечностей (26,5% против 14,2%; р=0,08). Стоит также отметить, что единственный больной, являющийся носителем генотипа —308(А/А) гена TNF-a, имел в анамнезе эпизод ТГВНК, осложненный развитием ТЭЛА.

63,3%

-31(Т/Т) -31 ('Г/С) -31(С/С) НТГВНК+ТЭЛА □иТГВНК

Рисунок 5 - Распределение генотипов IL-ip у больных с "изолированным ТГВНК" и с ТГВНК, осложненным ТЭЛА.

У пациентов с иТЭЛА отмечалось снижение ЧВ "делеционного" (Del) аллеля гена АСЕ по сравнению с больными, страдающими изолированным ТГВНК (35,4% против 50,0%, р=0,08), и представителями КГ (35,4% против 51,7%, р=0,04). Генотип АСЕ Del/Del также встречался среди лиц с иТЭЛА гораздо реже, чем в указанных группах сравнения, хотя эти различия и не были статистически значимыми (12,5% против 27,6% в группе "иТГВНК", р=0,1 и 12,5% против 24,7% в КГ, р=0,3). В то же время, ЧВ гомозигот по аллелю АСЕ Ins в этой подгруппе была в 1,5 раза выше, чем у больных с изолированным поражением глубоких вен нижних конечностей и в 2 раза выше, чем у здоровых лиц (41,7% против 27,6%, р=0,2 и 41,7% против 20,7%, р=0,04 соответственно). Кроме того, для пациентов с "изолированной ТЭЛА" было характерно снижение ЧВ аллеля ТМ 1418Т по сравнению с больными из группы "иТГВНК" и лицами КГ (10,4% против 17,2%, р=0,3 и 10,4% против 28,0%, рЕ0,01, соответственно). В исследуемой группе не было выявлено ни одного гомозиготного носителя данного варианта гена ТМ. Напротив, ЧВ генотипа 1418 С/С гена ТМ в группе "иТЭЛА" была несколько выше, чем у пациентов с изолированным поражением вен нижних конечностей (79,2% против 68,7%, р=0,3) и существенно превышала таковую у представителей КГ (79,2% против 54,0%, р=0,03).

Как для больных с рецидивирующим течением ВТ, так и для пациентов с развившейся после тромботического эпизода ПТБ было характерно статистически значимое снижение доли носителей аллеля АСЕ Del (36,2% против 51,0% у больных с единственным эпизодом ВТ в анамнезе, pS0,01 и 37,5% против 51,4% у больных без ПТБ, р=0,03) и гомозигот по этому аллелю (13,8% против 28,2%, р=0,03, и 10,0% против 30,0%, р=0,01, соответственно) (рисунок 6). Кроме того, в подгруппе пациентов с рецидивирующим течением ВТ частота встречаемости генотипа -31 (С/С) гена IL-ip была почти в 3 раза выше, чем у лиц с единственным тромботическим эпизодом в анамнезе (15,5% против 5,4%, р= 0,02).

Del/Del

■ ПТБ (+) ИПТБ(-) □ Рецидив ВТ (+) И Рецидив ВТ (-)

Рисунок 6 - Частота встречаемости генотипа Del/Del гена АСЕ у больных с осложненным течением ВТ.

Оценивая суммарный вклад генетического фактора - полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, в развитие ВТ у лиц молодого возраста, нами было установлено, что носителями "неблагоприятных" генотипов изучаемых генов являются 99,5% пациентов. Кроме того, у большинства больных с ВТ наблюдается сочетание нескольких "неблагоприятных" аллельных вариантов. В частности, в 62,8% случаев обнаруживается одновременное присутствие 3 и более таких генотипов (рисунок 7).

И 3 маркера □ более 3 маркеров

Рисунок 7 — Частота встречаемости "неблагоприятных" генотипов генов, ассоциированных с ЭД, и их сочетаний у больных с ВТ.

Значительным разделом нашего исследования была оценка функционального состояния эндотелия сосудистой стенки у больных с ВТ путем исследования ряда биохимических показателей, которые либо являются маркерами ЭД (бТМ, А§ у\\ПР), либо оказывают повреждающее воздействие на сосудистую стенку (Гц, Хс, МДА, АТ II) и характеризуют выраженность ЭД. Также был проведен анализ взаимосвязи некоторых из этих показателей с особенностями полиморфизма изучаемых генов. В результате проведенного исследования ЭД была выявлена у 71% обследованных пациентов. При этом в

45,1% случаев обнаруживалось увеличение уровней высокоспецифичных маркеров ЭД - антигенов фактора Виллебранда и тромбомодулина (Nadar S. et. al, 2004; Петрищев H.H.; 2007, Головина О.Г., 2004). Повышенные уровни ТМ наблюдались у 11,8% больных с ВТ, а у 33,3% пациентов было выявлено повышенное содержание Ag vWF.

Известно, что высокие уровни антигена vWF и его активности не только указывают на наличие повреждения эндотелия, но и повышают риск развития как артериальных, так и венозных тромбозов (Martinelli I., 2005; Головина О.Г., 2004). Функциональная роль растворимой формы ТМ до сих пор однозначно не определена. Ряд авторов рассматривает sTM в качестве одного из наиболее специфичных маркеров ЭД (Blann A. D., 1997; Nadar S. et. al, 2004; Петрищев H.H., 2007). В то же время, некоторые исследователи считают, что повышение уровня sTM свидетельствует об усилении антикоагулянтной активности плазмы и может, с одной стороны, играть защитную роль в развитии ВТ (Anastasious G. et. al, 2011, Navarro S. et. al, 2013), а с другой - быть предиктором кровотечений (Jansson J.-H. et. al, 1997). Для оценки влияния аллельного полиморфизма гена ТМ на его уровень в плазме крови был выполнен анализ содержания sTM у пациентов с различными генотипами гена ТМ, который показал, что носители аллеля ТМ 1418Т имеют более высокие показатели sTM, чем больные с генотипом 1418 (С/С) ТМ (рисунок 8). При этом средний уровень sTM в группе больных был несколько ниже, чем у здоровых лиц. Выявленное ранее статистически значимое снижение ЧВ аллеля ТМ 1418Т и генотипа 1418(Т/Т) у пациентов с ВТ по сравнению с КГ позволяет объяснить снижение sTM в обследованной группе пациентов.

Подписи: На оси абцисс отмечены генотипы и аллели гена ТМ. ТМ - эТМ. Рисунок 8 - Зависимость уровня вТМ от полиморфизма гена ТМ (1418С/Т).

Проведенный в данной работе анализ показал, что наибольшее значение в патогенезе ЭД у больных с ВТ имеют аллельный полиморфизм изученных

генов, а также оксидативный стресс, обусловленный, главным образом, дислипидемией или/и гипергомоцистеинемией (ГГц).

Гиперхолестеринемия (ГХс) была выявлена более чем у половины (55,6%) обследованных больных и обусловлена повышенным содержанием липопротеинов низкой плотности (ЛПНП), которые наиболее подвержены перекисному окислению (Steinberg D., 1997). Доля лиц с уровнем ЛПНП выше референтного значения 3,0 ммоль/л в обследуемой группе составила 65,4%. Индекс атерогенности в группе больных с ВТ варьировал от 0,9 до 7,9. Доля лиц с индексом атерогенности более 3,0 в обследуемой группе составила 38,5%. Известно, что механизм патологического воздействия холестерина ЛПНП на сосудистую стенку заключается в ее повреждении липидными радикалами -продуктами перекисного окисления липидов (D. Steinberg, 1997). Для оценки оксидантно-антиоксидантного статуса пациентов в нашей работе в качестве показателя оксидативного стресса использовался МДА - вторичный продукт перекисного окисления липидов. В результате, оксидативный стресс был выявлен у 44,4% больных с ВТ. При этом, повышенные уровни МДА наблюдались у 8 (53,3%) индивидов с ГХс. Биологические эффекты МДА до сих пор остаются до конца не изученными. Однако известно, что он вызывает повреждение ДНК, оказывая цитотоксичное и мутагенное воздействие на клетки (Marnett L.J., 1999), а также способствует активации лимфоцитов, усиливая воспалительный ответ (Raghavan S. et. al, 2012).

Гипергомоцистеинемия, которая выявлялась у 37,0% больных с ВТ, также вносит значимый вклад в развитие оксидативного стресса (Faraci F.M., 2004). Повышенные уровни МДА были выявлены у 50% больных с ГГц. Кроме того, у 6 человек (22,2%) было выявлено сочетание ГХс и ГГц. Содержание МДА у этих индивидов определялось на уровне 13,3 мкмоль/л. У лиц с «нормальными» уровнями Хс и Гц (8 человек, 29,6%) средняя концентрация МДА в плазме крови составила 12,6 мкмоль/л. Таким образом, сочетание ГХс и ГГц ассоциировано с усилением оксидативного стресса у больных с ВТ.

При изучении зависимости уровня Гц от генотипа MTHFR было установлено, что доля лиц с генотипом 677(Т/Т) MTHFR, ассоциированным с более высокими, по сравнению с носителями аллеля MTHFR 677С, уровнями исследуемого вещества, в группе больных с выявленной ГГц была почти в 2 раза выше, чем у пациентов с «нормальными» значениями Гц (30,0% против 17,6%).

Исследование уровня AT II в плазме крови, который также рассматривается в качестве одного из маркеров ЭД (Петрищев Н. Н., 2007), выявило некоторое его снижение в группе пациентов с ВТ по сравнению с КГ, хотя это различие и не было статистически значимым (0,17±0,03 нг/мл против 0,27±0,04 нг/мл, р=0,07). Таким образом, вопреки ранее высказанному предположению о том, что данный показатель может отражать степень выраженности ЭД, полученные результаты не позволяют сделать подобное заключение. Вероятно, наблюдаемое явление связано с особенностями распределения аллельных вариантов генов РАС у больных с ВТ, так как анализ

зависимости уровня AT II в плазме крови от полиморфизма указанных генов выявил тенденцию к повышению содержания исследуемого вещества у носителей «редких» аллелей. Так, при изучении распределения аллелей и генотипов генов РАС было установлено, что в общей группе пациентов с ВТ значительно чаше, чем в контроле выявлялись носители варианта Ins/Ins гена АСЕ (30,4% против 20,7%, р=0,04).

Учитывая тот факт, что фенотипическое проявление и протромботический потенциал рассмотренных в работе генетических вариантов может существенно модифицироваться экзогенными факторами, к числу которых относятся ГГц, ГХс и оксидативный стресс, представляется актуальным дальнейшее изучение влияния аллельного полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД, на риск развития ВТ, как в комплексе с другими известными факторами риска, так и в аспекте "ген-генных" взаимодействий.

Таким образом, результаты проведенного исследования доказывают, что ЭД является важным патогенетическим механизмом тромботического процесса в венозном русле. Значимую роль в ее развитии играет полиморфизм генов компонентов ренин-ангиотензиновой (АСЕ) и системы протеина С (ТМ). Отдельные аллельные варианты обозначенных генов, а также генов некоторых цитокинов ассоциированы не только с риском развития ВТ у лиц молодого возраста, но и с особенностями клинического проявления тромботического процесса, а также прогнозом его течения.

ВЫВОДЫ

1. Распределение аллельных вариантов генов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, имеет ряд характерных особенностей у больных с ранним дебютом венозного тромбоза: статистически значимое увеличение доли лиц с вариантом Ins/Ins гена АСЕ и снижение частоты встречаемости аллеля ТМ 1418Т и генотипа 1418(Т/Т) гена ТМ.

2. У носителей мутаций в генах факторов II и V с ранним дебютом ВТ выявлено снижение частоты встречаемости "неблагоприятных" вариантов генов, участвующих в регуляции тонуса сосудов (eNOS, AGT, АСЕ).

3. Генотип 1418(Т/Т) гена ТМ играет протективную роль в развитии ТГВНК у лиц молодого возраста.

4. Аллельный полиморфизм генов провоспалительных цитокинов (IL-lß и IL-6), обуславливающий их гиперпродукцию, ассоциирован с развитием тромбоэмболических осложнений у больных с ТГВНК.

5. Для пациентов с рецидивом ВТ и/или посттромботической болезнью характерна повышенная частота встречаемости генотипа Ins/Ins АСЕ. Наличие варианта -31 (С/С) гена IL-lß предрасполагает к развитию повторного эпизода тромбоза.

6. Эндотелиальная дисфункция является важным патогенетическим механизмом тромботического процесса в венозном русле и выявляется у 71,4% больных с ранним дебютом ВТ. Носителями "неблагоприятных" генотипов, ассоциированных с эндотелиальной дисфункцией, являются 99,5% пациентов с

ВТ. В 62,8% случаев обнаруживается одновременное присутствие 3 и более таких генотипов.

Практические рекомендации и перспективы дальнейших исследований

1. У лиц с ранним дебютом ВТ, наряду с обследованием на наличие классических форм наследственной тромбофилии, в спектр выполняемых молекулярно-генетических исследований целесообразно включать анализ полиморфизма генов, ассоциированных с ЭД.

2. Наличие у пациента с ВТ генотипов -31 (С/С) гена IL-Iß, Ins/Ins гена ACE или/и "редких" аллелей генов IL-6 и TNF-a указывает на повышенный риск развития тромбоэмболических осложнений, ПТБ и/или рецидива заболевания, что должно учитываться при проведении вторичной профилактики.

3. При наличии генетической предрасположенности к нарушениям липидного обмена у больных с ранним дебютом ВТ показан регулярный анализ показателей липидного спектра, с целью выявления дислипидемии и ее своевременной коррекции.

Дальнейшее изучение молекулярно-генетических механизмов развития ЭД у больных с ВТ позволит расширить представления о патогенезе данного заболевания, что будет способствовать разработке новых эффективных методов профилактики и лечения тромбоэмболических осложнений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах, рекомендованных ВАК

1. Полякова А. П. Молекулярные механизмы эндотелиальной дисфункции при венозном тромбоэмболизме: современные представления и перспективы дальнейшего изучения (Обзор литературы) / Полякова А. П., Блинов М. Н., Каргин В. Д., Капустин С. И. // Российский биомедицинский журнал Medline.ru. -2011.-Т. 12.-С. 1250-1268.

2. Полякова А. П. Особенности полиморфизма генов регуляции сосудистого тонуса у больных с ранним дебютом венозного тромбоэмболизма/ А.П. Полякова, В.М. Шмелева, В.Е. Солдатенков, М.Н. Блинов, В.Д. Каргин, Л.П. Папаян, С.И. Капустин// Тромбоз, гемостаз и реология. - 2013. - Т. 54, №2. - С. 71-78.

3. Полякова А. П. Роль полиморфизма генов провоспалительных цитокинов в развитии венозного тромбоэмболизма у лиц молодого возраста / Полякова А.П., Шмелева В.М., Блинов М.Н, Солдатенков В.Е., Каргин В.Д., Папаян Л.П., Капустин С.И.// Медицинская иммунология. - 2014. - Т. 16, №2. — С. (55- 16Ц.

Публикации в прочих журналах

4. Шмелева В. М. Роль гипергомоцистеинемии в развитии тромбоэмболических осложнений / Шмелева В. М., Капустин С. И., Блинов М.

Н., Полякова А. П., Салтыкова Н. Б., Папаян JI. П. // Медицина экстремальных ситуаций. - 2012. - Т. 39, №1. - С. 106-117.

Материалы конференций

5. Полякова А. П. Особенности аллельного полиморфизма генов иммунного ответа у больных с венозным тромбозом. / А. П. Полякова, Н. Б. Салтыкова, В. Д. Каргин, Н. А. Воробьева, В. М. Шмелева, С. И. Капустин // материалы V Всероссийской Конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием), г. Москва. -

2011.-С. 416-417.

6. Полякова А.П. Полиморфизм -308 G/A в гене фактора некроза опухоли -альфа и риск венозного тромбоэмболизма у женщин / А. П. Полякова, Н. Б. Салтыкова, Ю. С. Дрижун, В. Д. Каргин, В. М. Шмелева, JI. П Папаян, М. Н. Блинов, С. И. Капустин // Вестник гематологии. - 2011. - Т. VII, №2. - С.61-62.

7. Polyakova A. Proinflammatory cytokines gene polymorphism and susceptibility to venous thromboembolism in the population of the North-Western region of Russia / Polyakova A., Drizhun Y., Blinov M., Saltykova N., Shmeleva V., Kapustin S. // J.Thromb. Haemost. - 2011. - Vol. 9, suppl. 2. - abstr P-TU-243.

8. Капустин С. И. Полиморфизм Ser219Gly эндотелиального рецептора протеина С и предрасположенность к венозному тромбозу / Капустин С. И., Полякова А. П., Шмелева В. М., Дрижун Ю. С., Салтыкова Н. Б., Каргин В. Д., Блинов М. Н., Папаян Л. П.// Беломорский симпозиум IV. Сборник докладов и тезисов, г. Архангельск — 2011. — С. 20-21.

9. Полякова А. П. Полиморфизм гена АроЕ как возможный фактор риска рецидивирующего течения венозного тромбоза / Полякова А. П., Солдатенков

B. Е., Шмелева В. М., Каргин В. Д., Капустин С. И. // Ангиология и сосудистая хирургия, 2012. (23-я (XXVII) Международная конференция «Актуальные вопросы сосудистой хирургии», 29 июня - 1 июля 2012г, г. Санкт-Петербург). -

2012. - Т. 18, № 2 (приложение).

10. Полякова А. П. Особенности аллельного полиморфизма генов ренин-ангиотензиновой системы у больных с венозным тромбозом / Полякова А. П., Кустова Е. В. // Материалы XV Юбилейной всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием) "Фундаментальная наука и клиническая медицина — человек и его здоровье", Санкт-Петербург. -2012. - С.230-231.

11. Полякова А. П. Полиморфизм гена параоксоназы и риск венозного тромбоэмболизма / Полякова А. П., Дрижун Ю. С., Кустова Е. В., Шмелева В. М., Каргин В. Д., Блинов М. Н., Капустин С. И. // Сборник тезисов II Российского конгресса с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины — возможное и реальное», Санкт-Петербург. - 2012. —

C. 178-179.

12. Полякова А. П. Особенности аллельного полиморфизма С1418Т гена тромбомодулина у больных с венозным тромбозом / Полякова А. П., Дрижун

Ю. С., Салтыкова Н. Б., Кобилянская В. А., Капустин С. И. // Вестник гематологии. - 2012. - Т. VIII, № 4. - С. 63-63.

13. Полякова А. П. Полиморфизм -786Т/С гена эндотелиальной синтазы оксида азота как фактор риска рецидивирующего течения венозного тромбоза/ Полякова А. П., Салтыкова Н. Б., Дрижун Ю. С., Кустова Е. В., Шмелева В. М., Блинов М. Н., Каргин В. Д., Капустин С. И. // Гематология и трансфузиология. -2012.-Т. 57, №3,-С. 72.

14. Полякова А. П. Роль генов регуляции сосудистого тонуса в патогенезе венозного тромбоза у носителей мутаций в генах факторов II и V молодого возраста / Полякова А. П., Шмелева В. М., Блинов М. Н., Каргин В. Д., Папаян JI. П., Капустин С. И. // Материалы 6 Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии» (с международным участием), г. Москва. - 2013. — С. 330-332.

15. Polyakova A.Vascular tone regulating genes polymorphism can modulate the risk of early-onset venous thromboembolism in individuals with inherited thrombophilia / Polyakova A., Shmeleva V. M., Soldatenkov V. E., Blinov M. N., Kargin V. D., Kapustin S. I. // J.Thromb. Haemost. - 2013. - Vol. 11, suppl. 2. -abstr PB 2.69-5.

16. Polyakova A. P. Polymorphism of vascular tone regulating genes and the risk of venous thromboembolism in individuals with inherited thrombophilia / Polyakova A. P., Shmeleva V. M., Soldatenkov V. E., Blinov M. N., Kargin V. D., Kapustin S. I. // Hematologica. Abstract book. - 2013. - Vol. 98, suppl. 1. - abstr EHA18ABSSUB-3888.

17. Капустин С. И. Влияние полиморфизма генов регуляции сосудистого тонуса на риск венозного тромбоэмболизма у лиц молодого возраста / Капустин С. И., Полякова А. П., Дрижун Ю. С., Морозова Т. В., Каргин В. Д., Папаян JI. П. // Вестник гематологии. - 2013. - Т. IX, №4. - С. 20.

18. Кобилянская В. А. Частота встречаемости антифосфолипидных антител волчаночного типа у пациентов молодого возраста с тромбозом глубоких вен и тромбоэмболией легочной артерии / Кобилянская В. А., Полякова А. П., Морозова Т. В., Капустин С. И. // Вестник гематологии. - 2013. - Т. IX, №4. -С. 23-24.

19. Полякова А. П. Особенности аллельного полиморфизма генов провоспалительных цитокинов у лиц с ранним дебютом венозного тромбоэмболизма / Полякова А. П., Шмелева В. М., Сидорова Ж. Ю., Каргин В. Д., Капустин С. И. // Вестник гематологии. - 2013. - Т. IX, №4. - С. 26-27.

20. Капустин С. И. Полиморфизм гена каталазы и риск развития венозных тромбозов у жителей северо-западного региона России / Капустин С. И., Полякова А. П., Алексанян JI. Р., Кустова Е. В., Рыбакова JI. П., Блинов М. Н., Солдатенков В. Е., Салтыкова Н. Б., Каргин В. Д. // Материалы Международной научно-практической конференции «Свободные радикалы и антиоксиданты в химии, биологии и медицине», г. Новосибирск. - 2013. - С. 115-116.

21. Полякова А. П. Полиморфизм генов противовоспалительных цитокинов и риск развития тромбоэмболии легочной артерии у лиц молодого возраста//

Полякова А. П., Шмелева В. М., Морозова Т. В., Каргин В. Д., Папаян Л. П., Капустин С. И Тезисы Всероссийской конференции «Противоречия современной кардиологии. Спорные и нерешенные вопросы» г. Самара. - 2013. -С. 95

Подписано в печать 14.03.14 Формат 60х84'/16 Цифровая Печ. л. 1.25 Тираж 100_Заказ 08/03_печать_

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2)