Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Клиническое значение определения субпопуляций Т-лимфоцитов в процессе формирования адаптивного иммунитета у недоношенных детей

На правах рукописи

ПАНКРАТЬЕВА Людмила Леонидовна

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБПОПУЛЯЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА У НЕДОНОШЕННЫХ ДЕТЕЙ

14.01.08 - Педиатрия

10 ОКТ 2013

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва-2013 005534676

005534676

Работа выполнена в ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Минздрава России

Научные руководители:

Академик РАМН,

доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор заведующая кафедрой педиатрии ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава Росс!

доктор медицинских наук, профессор старший научный сотрудник научно-консультационного отдела ФГБУ «ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева»

Минздрава России Финогенова Наталья Анатольевна

Ведущая организация:

Научный центр здоровья детей Российской академии медицинских наук (НЦЗД РАМН)

Защита диссертации состоится « »_ 20/_ г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д 208.050.01 в ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Минздрава России (117997, г. Москва, ул. Саморы Машела, дом 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачева» Минздрава России.

Автореферат разослан «_»_201_г.

Володин Николай Николаевич Румянцев Сергей Александрович

ни Захарова Ирина Николаевна

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Чернов Вениамин Михайлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы

Недоношенные новорожденные дети с осложненным течением неонатального периода составляют группу наибольшего риска перинатальных потерь и инвалидизации в раннем детском возрасте. Выживаемость детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, достигает 78-85% в ведущих перинатальных центрах (Martin J., 2008). Однако в последующие два года 5-8% из них умирают, а у 45-70% детей выявляются патологические состояния, связанные с проблемами перинатального периода (Tyson J., 2008).

В последние годы во всем мире пристальное внимание исследователей и практических врачей уделяется комплексу проблем, связанных с изучением онтогенеза иммунной системы в норме и функционированием её при патологических состояниях, особенно при тяжелых инфекциях в перинатальном периоде и в раннем детском возрасте. В пользу иммунопатогенетической теории развития тяжелых осложнений неонатального периода свидетельствует многократное и неконтролируемое увеличение уровня провоспалительных цитокинов в тканях и сыворотке крови, а также повышенная иммунореактивность тимоцитов и спленоцитов в отношении антигенов собственных тканей организма (Rosen D., 2006). Наряду с известными на сегодняшний день нарушениями в системе врожденного иммунитета у недоношенных детей (Adkins В., 2001; Gasparoni А., 2003; Lewis D., 2004), проблема нарушения формирования адаптивного иммунитета имеет не меньшее значение.

На процесс формирования фенотипа адаптивных реакций иммунной системы влияют многочисленные факторы, причем генетические факторы имеют важное, но не решающее значение. Ключевая роль в этом процессе отводится морфо- функциональному состоянию тимуса (Ladi Е., 2006).

Тимус (вилочковая железа) является центральным органом иммунной системы, в котором осуществляются процессы дифференцировки и клональной селекции Т-лимфоцитов (Harris D., 2005). Роль тимуса в формировании иммунной системы в постнатальном периоде до конца не ясна. В литературе практически отсутствуют данные о влиянии преждевременных родов на сложный и многоэтапный процесс созревания Т-лимфоцитов в тимусе и формирование иммунной системы в целом.

В настоящее время считается, что процесс инволюции тимуса начинается с конца первого года жизни ребенка и, наряду с изменениями структуры, утрачивается и его способность к генерации новых клонов Т-лимфоцитов (Lynch H., 2009). Однако в ряде исследований было показано, что объем вилочковой железы в раннем детском возрасте напрямую зависит от влияния огромного числа внешних факторов. Так, у детей, получавших грудное молоко в

качестве основного источника питания в течение первых шести месяцев жизни, объем тимуса по данным ультразвукового исследования значимо превышал таковой у детей, находившихся на искусственном вскармливании (Jeppesen D., 2004). В другом исследовании была выявлена взаимосвязь между развитием фунизита (гистологический маркер реакции системного воспалительного ответа плода) и инволюцией тимуса у плода (Toti Р., 2000).

Исходя из указанного выше, следует, что размеры тимуса в неонаталъном периоде и раннем детском возрасте вариабельны и зависят от целого ряда факторов как инфекционной, так и неинфекционной природы. Остается неясным, существует ли взаимосвязь между объемом вилочковой железы и пулом периферических Т-лимфоцитов, а также развитием отдельных патологических состояний и тяжестью их течения у недоношенных детей различного гестационного возраста, в том числе с экстремально низкой массой тела при рождении.

В настоящее время огромный научный интерес представляет изучение роли Т-регуляторного звена иммунной системы как фактора, обеспечивающего развитие адаптивных механизмов иммунной системы при различных формах патологии у недоношенных детей различного гестационного возраста, в том числе с экстремально низкой массой тела при рождении.

Так, в экспериментальных исследованиях на мышах было показано, что системный воспалительный ответ может нарушать дифференцировку Т-регуляторных (Трег) лимфоцитов. В то же время введение культивированных in vitro Foxp3+ Трег лимфоцитов способствует уменьшению воспаления и купированию колита и синдрома острого повреждения легких (D'Alessio F., 2009; Bilate А., 2012).

Известно, что Трег клетки играют фундаментальную роль в контроле аутоиммунных реакций, поддержании толерантности матери к плоду, в предотвращении патологического иммунного ответа на микробную инфекцию (Sakaguchi S., 2010). В то же время в литературе отсутствуют данные об особенностях постнатального онтогенеза Т-регуляторного звена иммунной системы у недоношенных детей, а также не изучен вопрос наличия взаимосвязи между развитием отдельных патологических состояний неонатального периода у недоношенных детей различного гестационного возраста и особенностями динамики относительного и абсолютного числа Т-регуляторных лимфоцитов и их клеточных соотношений на первом месяце жизни.

Цель исследования: изучить клинико-иммунологические характеристики новорожденных детей различного гестационного возраста с осложненным течением неонатального периода в процессе формирования адаптивного иммунитета.

Задачи исследования:

1. Изучить клеточный состав и определить абсолютные и относительные количества СОЗ+, С03"С045Я0, С03+С08*, С03+С04+, С04+С025+, С04+С025ь,81,РохрЗ+,

субпопуляций Т-лимфоцитов пуповинной крови доношенных и недоношенных новорожденных.

2. Установить анте- и интранатальные факторы, оказывающие влияние на клеточный состав и фенотипические характеристики Т-лимфоцитов пуповинной крови недоношенных новорожденных.

3. Охарактеризовать динамику изменения клеточного состава и абсолютных и относительных значений СОЗ\ С03+С08+, С03+С04+, С04"СП25*, С04Т025ч''ТохрЗ+,

субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови доношенных и недоношенных новорожденных на протяжении первого месяца жизни.

4. Изучить связь развития отдельных патологических состояний неонатального периода у недоношенных детей различного гестационного возраста, в том числе с низкой и экстремально низкой массой тела при рождении, с особенностями динамики относительного и абсолютного числа Т-регуляторных

С04+С025ь,Е|,РохрЗ+

лимфоцитов периферической крови на первом месяце жизни и значениями тимического индекса в возрасте 36 недель постконцептуального возраста.

Научная новизна. В результате изучения закономерностей становления фетального иммунитета выявлено, что лимфопоэз является доминирующим направлением кроветворения на этапе внутриутробного развития плода, тогда как активность гранулоцитарно-макрофагальных предшественников снижена.

Впервые показано, что отличительной особенностью субпопуляционного состава Т-лимфоцитов крови недоношенных детей на первом месяце жизни являются высокие абсолютные и относительные значения Т-регуляторных СП4+СВ25н'8ЬРохрЗ" лимфоцитов, характеризующихся высокой функциональной активностью.

Изучение взаимосвязи между объемной характеристикой вилочковой железы и динамикой пула Т-лимфоцитов, а также развитием отдельных патологических состояний и тяжестью их течения позволило выделить среди недоношенных детей группу повышенного риска по развитию срыва постнатальной адаптации. При этом установлено, что вариации клеточного состава и субпопуляций Т-лимфоцитов пуповинной крови не имеют прогностического значения в постнатальном периоде, а являются лишь отражением воздействия антенатальных факторов, среди которых гестационный возраст имеет наименьшее значение.

Практическая значимость. Выявленная повышенная экспрессия характерного для Т-клеток памяти маркера С045 КО в образцах пуповинной крови недоношенных детей, развивших

в течение первых 72 часов жизни неонатальный сепсис, позволяет выделить группу новорожденных с наличием факта внутриутробного инфицирования и проводить максимально раннюю профилактику тяжелых инфекционных осложнений неонатального периода.

Определены сроки исследования Т-регуляторного звена иммунной системы у недоношенного ребенка с целью прогнозирования течения адаптивных процессов в неонатальном периоде и оптимизации проводимой терапии.

Рекомендовано определение экспрессии CD127 (CD4+CD25hi6hCD127loW") в качестве надежного поверхностного клеточного маркера для идентификации Т-регуляторных лимфоцитов у недоношенных детей.

Внедрение в практику. Практические рекомендации внедрены в работу отделений реанимации и интенсивной терапии новорожденных детей (ОРИТН) Городской Больницы №8 Департамента здравоохранения г. Москвы.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на I Международном конгрессе по перинатальной медицине и VI ежегодном Всероссийском конгрессе специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии и качество» (16-18 июня 2011 г, Москва), на международной конференции «World immune regulation meeting - VI» (18-21 марта 2012 г, Давос), на международном конгрессе «XXIII European Congress of Perinatal Medicine» (13-16 июня 2012 г, Париж), на VII ежегодном конгрессе специалистов перинатальной медицины «Современная перинатология: организация, технологии и качество» (24-25 сентября 2012 г., Москва), на международном конгрессе «XI World Congress of Perinatal Medicine» (19-22 июня 2013 г, Москва). Апробация работы проведена 9 июля 2013 г. на совместной научно-практической конференции сотрудников ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России и кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России.

Публикация результатов. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3-х глав, посвященных результатам собственных наблюдений, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 34 таблицами, 19 рисунками. Библиография включает 15 источников отечественной, и 155 - зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнена в отделе молекулярной и экспериментальной медицины (заведующий - д.м.н., профессор Румянцев С.А.) ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачёва Минздрава России (директор - академик РАМН, д.м.н., профессор Румянцев А.Г.) совместно с отделом

клеточных технологий и регенеративной медицины (руководитель отдела - д.м.н., профессор Быковская С.Н.) ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава России за период с октября 2010 года по февраль 2013 года. Комплексное обследование новорождённых детей проводилось на базе родильного отделения (зав. отд.- Березина H.A.), ОРИТН №1 (зав. отд. -Милева О.И.) и №2 (зав. отд. - к.м.н. Бабак O.A.), отделений патологии новорожденных №1 (зав.отд. - к.м.н. Потапова О.В.) и №2 (зав.отд. - Миронюк О.В.) Городской Больницы №8 Департамента здравоохранения г. Москвы (главный врач - к.м.н. Дуленков А.Б.), отделения патологии новорожденных и недоношенных детей (зав. отд. - Кыштымов М.В.), отделения хирургии новорожденных (зав. отд. - к.м.н. Шумихин B.C.) Детской городской клинической больницы №13 им. Н.Ф. Филатова Департамента здравоохранения г. Москвы (главный врач -к.м.н. Константинов К.В.), в Московском Центре планирования семьи репродукции (главный врач - член-корреспондент РАМН, профессор Курцер М.А.) и родильном доме №10 г. Москвы (главный врач — к.м.н. Озимковская Е.П.).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В основу данной работы были положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 50 здоровых новорожденных детей с физиологическим течением неонатального периода и 80 новорожденных детей с гестационным возрастом от 25 до 36 недель с осложненным течением неонатального периода, потребовавших проведения интенсивной терапии по совокупности клинико-анамнестических, лабораторных и инструментальных данных (табл. 1 и 2).

Таблица 1. Характеристика новорожденных детей с физиологическим течением неонатального периода____

гв (недели) Масса тела (г) Ме [Ol; Q3] (minmax) Рост (см) Ме |Q1; Q3) (min-max) Оценка по шкале Апгар на 1 минуте жизнн Ме [Ql; Q3) (min-max) Оценка по шкале Апгар на 5 минуте жизни Ме [Ql; Q3[ (min-max)

37-40 (п=50) 3395 [3230; 3630] (3010-3910) 51 [51; 52] (50-54) 8 [8; 8] (7-8) 9 [9; 9] (8-9)

Таблица 2. Характеристика недоношенных детей с осложненным течением неонатального периода__

ГВ (недели) Масса тела (г) Ме ¡Ql; Q3| (minmax) Рост (см) Ме |Q1; Q3] (min-max) Оценка по шкале Апгар на 1 минуте жизни Ме |Q1; Q3] (min-max) Оценка по шкале Апгар на 5 минуте жизни Ме [Ql; Q3| (min-max)

25-28 (п=24) 1120 [780; 1190] (700- 1300) 33 [32; 38] (31-38) 6 [5; 6] (3-7) 7 [6; 7] (5-7)

29-31 (п=30) 1410 [1130; 1640] (690- 1830) 37 [36; 40] (30-42) 6 [5;6] (4- 7) 7 [7;7] (6-8)

32-36 (п=26) 1610 [ 1380; 1890] (1180-2270) 40[38; 45] (36-49) 6 [6;6] (5-7) 7 [7;7] (7-8)

Течение беременности у всех матерей недоношенных детей было патологическим. Угроза прерывания была отмечена у 79% женщин, акушерско-гинекологический анамнез (воспалительные заболевания репродуктивных органов, бесплодие, генитальные инфекции, медицинские аборты и самопроизвольные выкидыши в анамнезе, гормональные нарушения) был отягощенным в 91% случаев, соматический анамнез (хронический пиелонефрит или цистит, хронический тонзиллит, варикозная болезнь, бронхиальная астма, атопический дерматит, пролапс митрального клапана, холецистит, вегето-сосудистая дистония, гипертоническая болезнь, сахарный диабет и др.) - в 71% случаев. Пренатальная профилактика РДС дексаметазоном проводилась 15% женщин. Хорионамнионит был диагностирован у 15% женщин. Многоплодная беременность наблюдалась в 11% случаев. Роды были самостоятельными у 67% женщин, путем операции кесарева сечения - у 33% женщин. Беременность наступила в результате экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у 10% женщин. Длительный безводный промежуток отмечался (от 12 часов до 27 суток) в 28% случаев.

Все недоношенные дети, вошедшие в исследование, родились в тяжелом состоянии и нуждались в проведении интенсивной терапии и респираторной поддержки в условиях ОРИТН с рождения. Ведущими патологическими симптомами после рождения у всех детей являлись клинические признаки дыхательной недостаточности, нарушения кровообращения и неврологические нарушения в виде синдрома угнетения безусловно-рефлекторной деятельности.

Всем детям, включенным в исследование, проводился мониторинг жизненно важных функций, включавший измерение частоты дыхания и сердечных сокращений, артериального давления, контроль газового состава крови и показателей сатурации, оценку параметров вентиляции. Комплексное клинико-лабораторное обследование включало общеклинические анализы крови, мочи, биохимическое исследование крови, микробиологическое исследование трахеобронхиальных аспиратов, кала, мочи, люмбальные пункции по показаниям. В рамках инструментального обследования проводились ЭХО-КГ, НСГ, УЗИ органов грудной и брюшной полости, УЗИ тимуса, рентгенографическое исследование грудной клетки.

Для достижения поставленной цели забор крови для иммунофенотипирования Т-лимфоцитов у новорожденных детей проводили в динамике, начиная с пуповинной крови (ПК), и далее на 5-7, 14-16, 21-22 сутки и в возрасте 1 месяца жизни, а также в возрасте 36 недель постконцептуального возраста (ПКВ). ПК в объеме 5-7 мл получали при физиологических и оперативных родах после пережатия и пересечения пуповины посредством пункции сосудов пуповины с помощью вакуумных систем, содержащих антикоагулянт. Для исследования

фенотипических и количественных характеристик Т-лимфоцитов в динамике на первом месяце жизни в качестве биоматериала использовали периферическую кровь в объеме 400-500 мкл.

Для определения фенотипа лимфоцитов в работе использовали метод проточной цитометрии. Оценка экспрессии маркеров проводилась в соответствии с протоколом, разработанным производителем набора антител (Miltenyi Biotec, GmbH, Германия). В состав набора входили следующие антитела: aHTH-CD45-VioBlue (клон 5В1), aHTH-CD3-FITC (клон BW264/56), aHTH-CD45RO-PerCP (UCHL1), анти-С08- РЕ (клон BW135/80), aHTO-CD4-FITC (клон М-Т466), анти-С04-АРС (клон М-Т466), анти- CD25-APC (клон 4ЕЗ), анти-С0127-РЕ (клон МВ15-18С9), анти- Foxp3-PE (клон 3G3) и соответствующие им изотопические контроли (IgGl или IgG2 с флуоресцентным коньюгатом).

При фенотипировании Трег клеток мы ориентировались не только на рецепторные молекулы CD25+ (альфа-цепь рецептора ИЛ-2), но и на продукт гена Foxp3 (forkhead box рЗ), являющийся фактором транскрипции, отвечающим за дифференцировку Трег клеток, а также определяли Трег по низкой экспрессии рецептора к ИЛ-7 (CD 127) (рис. 1А и 1Б).

Ьшшт- ■

Рисунок 1. (А) Гейтинг CD4+CD25'"ghFoxp3+ субпопуляции лимфоцитов; (Б) Гейтинг CD4+CD25hi8hCD127low' субпопуляции лимфоцитов

Для CD4+CD25highFoxp3+ лимфоцитов определялся показатель средней интенсивности флуоресценции MFI Foxp3-PE (median fluorescence intensity Foxp3-PE). Измерения проводили на проточном цитофлуориметре MACSQuant (Miltenyi Biotec, GmbH, Германия). Процентное содержание позитивных по специфическим маркерам клеток подсчитывали при помощи программного обеспечения MACSQuantify (Miltenyi Biotec, GmbH,Германия).

В качестве основного метода исследования 76 детям было выполнено ультразвуковое исследование тимуса в возрасте 36 недель ПКВ. Исследование проводилось на ультразвуковом аппарате Logiq 500 (General Electric Medical Systems, США) с использованием линейных датчиков с частотой 5-10 МГц. Проводили измерение линейных параметров тимуса: ширины (Штм), длины (Дтм), передне-заднего размера (толщины) долей тимуса (ПЗРтм) (рис. 2). В качестве интегрального показателя рассчитывался тимический индекс (ТИ) по следующей

формуле: ТИ (см3) = максимальная Штм (см) х максимальная площадь саггитального среза (см2).

Рисунок 2. Линейные размеры тимуса в продольной и поперечной плоскостях сканирования (Штм - максимальный показатель ширины тимуса, ПЗРтм - передне-задний размер правой и левой долей тимуса (толщина), Дтм - длина тимуса — максимальный кранио-каудальный размер)

Статистическая обработка данных выполнялась с использованием пакета прикладных программ «Statistica 9.1» (StatSoft Inc., США). Количественные признаки описывались медианами и квартилями (Me [LQ; UQ]). Качественные признаки описывались абсолютными и относительными частотами их значений. Для количественных признаков сравнение несвязанных групп проводилось с использованием непараметрических тестов Манна-Уитни (litest) и Крускала-Уоллиса (K-W ANOVA), сравнение связанных групп проводилось с использованием непараметрического теста Вилкоксона (W-test). Для сравнения частот значений признаков в группах применялся двухсторонний точный критерий Фишера (ТКФ). Анализ зависимостей между изучаемыми признаками проводили с использованием метода регрессионного анализа. Различия считались статистически значимыми при достигнутом уровне значимости р<0,05 (Флетчер Р., 1998; Гланц С., 1999; Реброва О.Ю., 2006).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При изучении клеточного состава ПК детей различного гестационного возраста было выявлено, что в ПК недоношенных новорожденных статистически значимо снижено общее количество лейкоцитов, а также изменен состав лейкоцитарной формулы по сравнению с образцами ПК, исследованными у доношенных новорожденных. Доля юных форм нейтрофилов статистически значимо ниже в ПК недоношенных детей по сравнению с доношенными новорожденными. При исследовании соотношения лимфоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов выявлено, что в ПК недоношенных новорожденных определяется относительный и абсолютный лимфоцитоз, в то время как количество полиморфноядерных лейкоцитов статистически значимо снижено по сравнению с образцами ПК доношенных новорожденных

(табл. 3). При проведении корреляционного анализа отмечена прямая корреляционная связь средней силы между гестационным возрастом недоношенного ребенка и общим количеством лейкоцитов в ПК (г5=0,61; р=0,001), а также обратная корреляционная связь средней силы между гестационным возрастом новорожденного и относительным количеством лимфоцитов в ПК (г5=-0,65; р<0,001).

Таблица 3. Характеристика клеточного состава пуповинной крови доношенных и недоношенных новорожденных различных сроков гестацнн__

Показатель Недоношенные новорожденные (п=80) Ме [01; 031 Доношенные новорожденные (п=50) Ме 101; 031 р, Шея!

Лейкоциты (*Ю'/л) 9,1 [7,3; 12,71 16,7 [14,3; 17,8] <0,001

Палочкоядерные нейтрофнлы (%) 4 [3; 5] 8 [7; 10] <0,001

Сегментоядерные нейтрофнлы (%) 30 [27; 38] 67 [64; 70] <0,001

Лимфоциты (%) 62 [57; 651 21 [19; 261 <0,001

Лимфоциты (*10'/л) 5,7 [5,3; 61 3,2 [3; 4,3] <0,001

Моноциты (%) 4 [4; 51 5 [4; 61 >0,05

При сравнении показателей иммуногралшы ПК выявлено, что относительные и абсолютные значения СЭЗ+ и СБ4+ лимфоцитов значимо не различаются у доношенных и недоношенных новорожденных различного срока гестации.

Таблица 4. Относительные (% от общего числа лимфоцитов) и абсолютные (*10'/л) значения основных субпопуляций Т-лимфоцитов в пуповинной крови доношенных и недоношенных новорожденных различного гестационного возраста__

Показатель Недоношенные новорожденные (п=80) Ме [01; 031 Доношенные новорожденные (п=50) Ме [01; 031 р, и^еэ!

СОЗ+ (%) 65 [63; 70] 61 [58;69] >0,05

С1)3+ (абс) 2,9 [1,9; 3,2] 2,1 [1,2;4,9] >0,05

СШ+С0451Ю (%) 12,4 [9,2; 14,6] 4,5 [3,1; 5,8] <0,001

С1)3+С04+(%) 37 [21; 53] 35 [26; 53] >0,05

С03+С04+(абс) 1,75 [1,4; 2,2] 1,2 [0,9; 2,8] >0,05

С03+С08+(%) 18 [14; 21] 23 [19; 26] 0,013

С03+С08+(абс) 0,42 [0,29 0,75] 0,71 [0,62; 0,91] 0,034

СП25Ы1!,ТохрЗ+(%) 3,2 [2,05 3,7] 1,5 [1,2; 3,1] <0,001

С025ы^РохрЗ+(абс) 0,16 [0,07 0,17] 0,06 [0,04; 0,09] 0,005

В ПК недоношенных детей относительное количество СОЗ+СЭ45КО лимфоцитов статистически значимо выше по сравнению с ПК доношенных новорожденных, что

свидетельствует о состоявшемся внутриутробно контакте плода с антигеном и согласуется с фактом повышенного риска внутриутробного инфицирования у детей, родившихся раньше срока. Еще одной отличительной особенностью ПК недоношенных детей являются высокие абсолютные и относительные значения Трег CD4"CD25h,ehFoxp3+ клеток (табл.4). При оценке взаимосвязи гестационного возраста и количества CD4+CD25highFoxp3+ лимфоцитов в ПК недоношенных детей с осложненным течением неонатального периода значимой корреляции выявлено не было (Rs=-0,002; р=0,976).

Показатель медианного значения интенсивности флуоресценции MFI (median fluorescence intensity) Foxp3-PE Трег CD4+CD25h,ghFoxp3+ лимфоцитов ПК также оказался значимо ниже в группе здоровых новорожденных по сравнению с недоношенными детьми (2 [1,5; 2,4] против 3,4 [2,6; 4,7] соответственно, р<0,001).

При проведении корреляционного анализа была выявлена обратная корреляция средней силы между гестационным возрастом и интенсивностью флуоресценции MFI Foxp3-PE Трег CD4+CD25highFoxp3+ лимфоцитов ПК новорожденных детей (Rs= -0,66; р< 0,001), что говорит о возрастании функциональной активности Трег клеток с уменьшением срока гестации.

В связи с полиморфизмом факторов, оказывающих патологическое действие в антенатальном периоде развития недоношенного ребенка, мы предприняли попытку изучить вклад наиболее значимых из них в формирование особенностей клеточного состава и фенотипических характеристик Т-лимфоцитов пуповинной крови (табл. 5).

Таблица 5. Влияние независимых факторов на клеточный состав пуповинной крови и относительные и абсолютные значения субпопуляций Т-лимфоцитов недоношенных новорожденных__

Параметр ГВ (+/-%, p) СЗРП (+/-%, p) XA (+/-%, P) Гестоз (+/-%, P) Дексон (+/-%, P)

Лейкоциты (*10*/л) 3,5 (0,001) -3,7 (0,003) >0,05 >0,05 +7,5 (0,016)

Лимфоциты (%) -5,9 (0,001) >0,05 -6,7 (0,021) >0,05 >0,05

Лимфоциты (*10"/л) >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 -4,5 (0,013)

CD3+ (%) >0,05 >0,05 +12 (<0,001) >0,05 >0,05

CD3+ (абс) >0,05 >0,05 >0,05 >0,05 -4,7 (0,01)

CD3+CD45RO (%) >0,05 >0,05 +18 (<0,001) >0,05 >0,05

CD3+CD4+(%) >0,05 >0,05 >0,05 -17 (<0,001) >0,05

CD3+CD4+(a6c) >0,05 >0,05 >0,05 -11 (<0,001) -2,5 (0,003)

CD4+CD25+(%) >0,05 >0,05 +8,4 (0,001) >0,05 >0,05

CD25hlghFoxp3T (%) >0,05 -1,3 (0,005) >0,05 -21 (<0,001) >0,05

При проведении множественного регрессионного анализа было выявлено, что гестационный возраст как независимый фактор оказывает наименьшее влияние на клеточный состав и значения абсолютных и относительных количеств субпопуляций Т-лимфоцитов ПК по сравнению с другими инфекционными и неинфекционными факторами риска, действующими в антенатальном периоде, а именно, гистологически верифицированным хорионамнионитом и тяжелым гестозом у матери. При этом выявленная разнонаправленность влияний вышеуказанных факторов риска на клеточный и субпопуляционный состав ПК представляет интерес для дальнейших исследований.

При проведении лонгитудинального исследования клеточного состава периферической крови на первом месяце жизни было выявлено, что у недоношенных новорожденных происходит значимое увеличение общего числа лейкоцитов к концу первых 24 часов жизни по сравнению с исследованными образцами ПК (9,1 [7.3; 12,7] (*109/л) против 15,8 [10,9; 22,8] (*109/л) соответственно, р<0,001, \V-test). У доношенных новорожденных общее число лейкоцитов периферической крови к концу первых суток жизни не отличалось от такового в ПК. Начиная с 14-16 суток жизни, количество лейкоцитов в периферической крови

недоношенных новорожденных

значимо превышало данный параметр у доношенных детей. Так, к концу 3-й недели жизни количество лейкоцитов периферической крови составило в среднем 14,9 (* 109/л) и 11 (* 109/л), а к концу 1-го месяца жизни 14,8 (*109/л) и 9,2 (* 10ч/л) у недоношенных и доношенных новорожденных

соответственно (рис. 3).

Рисунок 3. Динамика общего числа лейкоцитов (*109/л) в периферической крови доношенных и недоношенных новорожденных на протяжении первого месяца жизни

—♦—доношенные недоношенные

У / ^ /

? .$> -О-

Мы проанализировали динамику соотношения нейтрофильных лейкоцитов и лимфоцитов у доношенных и недоношенных новорожденных на протяжении первого месяца жизни. Показано, что в ПК доношенных новорожденных нейтрофильные лейкоциты преобладают над лимфоцитами. К 5-7 суткам жизни доля нейтрофильных лейкоцитов снижается, а доля лимфоцитов увеличивается и формируется «перекрест». К возрасту 14-16 суток жизни в лейкоцитарной формуле доношенных новорожденны преобладают лимфоциты и составляют в среднем 51 % (рис. 4А). В ПК недоношенных новорожденных напротив выявляется относительный лимфоцитоз. Однако уже в течение первых суток жизни происходит

взаимное изменение доли лимфоцитов и нейтрофилов с формированием первого «перекреста». К 21-22 суткам жизни формируется второй «перекрест» и к концу первого месяца жизни доля лимфоцитов в лейкоцитарной формуле недоношенных новорожденных не отличается от таковой у доношенных детей (рис. 4Б). При анализе зависимости гестационного возраста и сроков формирования «перекреста» у недоношенных новорожденных была отмечена тенденция к более раннему формированию последнего с увеличением гестационного возраста, однако различия не достигали уровня статистической значимости.

► нейтрофигы I- лимфоциты

V«- ,-г лг

л^ У

нейтрофияы — лимфоциты

У

У У

у

Рисунок 4. Динамика соотношения лимфоцитов (%) и нейтрофилов (%) у доношенных (А) и недоношенных (Б) новорожденных на первом месяце жизни

Как у доношенных, так и у недоношенных новорожденных к 5-7 суткам жизни отмечается статистически значимое увеличение доли СОЗ+ лимфоцитов по сравнению с исследованными образцами ПК. Однако динамика увеличения относительного значения СОЗ+ клеток статистически значимо выше у доношенных новорожденных по сравнению с недоношенными детьми. Так, в среднем доля СШ+ лимфоцитов у доношенных новорожденных в возрасте 5-7 суток жизни составила 83 [81,3;88,7] %, а у недоношенных 78 [71,2;83,4] % (р<0,001). К 14-16 суткам жизни данный показатель не различается в исследуемых группах детей. Статистически значимое увеличение абсолютного числа СЭЗ лимфоцитов к 5-7 суткам жизни было зарегистрировано только в образцах периферической крови доношенных новорожденных, в то время как у недоношенных детей значимое увеличение абсолютного значения СБЗ+ клеток происходит только к концу первого месяца жизни (р<0,001).

Доля С04+ лимфоцитов от общего числа лимфоцитов периферической крови статистически значимо возрастает к 5-7 суткам жизни как у доношенных, так и недоношенных новорожденных. При этом статистически значимых различий по данному показателю на протяжении первого месяца жизни в исследуемых группах выявлено не было. Напротив, абсолютные значения С04+ клеток статистически значимо отличались у доношенных и недоношенных детей в возрасте 5-7 суток жизни и составили в среднем 3,5 [3;4] и 1,8 [1,04;2,9] (* 109/л) соответственно.

Статистически значимое увеличение доли CD8+ лимфоцитов от общего числа лимфоцитов периферической крови к 5-7 суткам жизни было характерно только для недоношенных детей ввиду их более низких относительных значений CD8 лимфоцитов в образцах пуповинной крови. В то же время, абсолютные значения CD8" клеток статистически значимо увеличивались в динамике к 5-7 суткам жизни как у недоношенных, так и доношенных новорожденных и составили 0,75 [0,4; 1,09] (* 10%) и 1,6 [1,19:1,99] (*109/л) соответственно (р<0,001).

При анализе динамики количества Трег лимфоцитов в периферической крови у недоношенных детей выявлено статистически значимое увеличение доли CD4+CD25h'ghFoxp3+ лимфоцитов к 5-7 суткам жизни (3,2 [2%; 3,7%] при рождении и 7,4 [5.8%; 8.7%] в возрасте 5-7 суток жизни соответственно, р<0,001) с последующей стабилизацией относительного количества клеток к концу 2 недели жизни и постепенным снижением к 1 месяцу жизни (7 [5,2%; 7,9%] в возрасте 14-16 суток жизни и 4,3 [3,3%;5,3%] в возрасте 1 месяца жизни). В группе доношенных детей с физиологическим течением неонатального периода количество регуляторных Т-клеток на 1 -ом месяце жизни также статистически значимо увеличивается к 5-7 суткам жизни (1,5 [1,2%; 3,1%] при рождении и 2,5 [1,9%; 3%], р=0,009) (Рис. 5). Однако при сравнении доли Трег лимфоцитов доношенных и недоношенных новорожденных, начиная с 57 суток жизни было показано, что доля CD4tCD25h'8hFoxp3*

лимфоцитов у последних статистически значимо выше по сравнению со здоровыми доношенными детьми (2,5 [1,9%; 3%] против 7,4 [5,8%; 8,7%], р< 0,001).

Рисунок 5. Динамика относительного числа CD4+CD25high Foxp3 Трег лимфоцитов (Ме,%) периферической крови недоношенных детей различного гестационного возраста с осложненным течением неонатального периода (р<0,05)

Таблица 6. Динамика абсолютного числа CD4+CD25hl8hFoxp3+ Т-регуляторных

лимфоцитов (*109/л) периферической кровн доношенных и недоношенных новорожденных на первом месяце жизни_

Показатель Me [Q1;Q3| ПК Сутки жизни

5-7 14-16 21-22 30

CD4+CD25hish Foxp3*(абс) H 0,16 [0,07;0,171 0,57 [0,4!; 0,781 0,44 [0,3; 0,561 0,41 [0,3,0,511 0,34 [0,21,0,39]

Д 0,06 [0,04; 0,091 0,12 [0,09;0,251 0,19 [0,13;0,251 0,19 [0,15;0,281 0,24 [0,18;0,351

р, U-test 0,005 <0,001 <0,001 <0,001 >0,05

Аналогичная закономерность была выявлена и для абсолютных значений CD4+CD25h,EhFoxp3+лимфоцитов (табл. 6).

Динамика Трег лимфоцитов на первом месяце жизни может отражать напряженность механизмов адаптации у недоношенных детей и оказывать протективное воздействие в условиях относительной, а нередко абсолютной лимфопении. Так, в исследовании, проведенном Winstead С. и соавт, было показано, что Т-регуляторные клетки могут играть ключевую роль в контроле спонтанной пролиферации «наивных» CD4+ и CD8+ лимфоцитов, индуцированной лимфопенией.

В нашей работе при изучении абсолютных и относительных значений Трег клеток мы ориентировались на данные, полученные при использовании анти- Foxp3 антител, меченных РЕ, и соответствующие им изотипические контроли. Однако Foxp3 является внутриклеточным (ядерным) белком, что, с практической точки зрения, обусловливает целый ряд технических трудностей при его определении. Мы провели корреляционный анализ двух субпопуляций лимфоцитов, который показал, что значения доли CD4+CD25hlghFoxp3+ Трег клеток статистически значимо коррелируют со значениями доли Трег лимфоцитов, фенотипируемых с помощью маркера CD 127 (CD4+CD25h,ghCD127low) у новорожденных детей различного гестационного возраста (rs=0,89, р<0,001). Таким образом, определение экспрессии маркера CD 127 может быть использовано для выделения и последующего культивирования Трег клеток и дает преимущество с точки зрения практического применения методики.

В нашем исследовании было продемонстрировано, что у недоношенных детей различного гестационного возраста объемная характеристика тимуса, выраженная в виде наиболее объективного на сегодняшний день показателя - тимического индекса (ТИ), в возрасте 36 недель ПКВ может быть крайне вариабельна и не зависит от гестационного возраста, пола и массы тела при рождении (ТИ-гестационный возраст: rs=-0,07, р=0,633; ТИ-масса тела: rs=-0,22, р=0,151; ТИ-рост: rs=-0,13, р=0,369), а является отражением тяжести патологических процессов, развивающихся на первом месяце жизни.

Ретроспективный анализ данных ультразвукового исследования тимуса выявил сильную вариацию показателя ТИ (коэффициент вариации составил 51%), что позволило вычислить интерквартильный интервал значений ТИ (интервал средних значений) и определить интервалы минимальных и максимальных значений данного показателя. С учетом полученных результатов были выделены 3 группы детей:

группа 1 (п=38)- дети со значениями ТИ в интервале Q1-Q3 (Me 9,8 [7,4 см3; 12,8 см3]); S группа 2 (ч=19)- дети со значениями ТИ в диапазоне Q3-Max (12,9 см3 -25,2 см3); ^ группа 3 (п=19)- дети со значениями ТИ в диапазоне Min-Ql (2,3 см3-7,3 см3).

Средние значения линейных параметров вилочковой железы (максимальный показатель ширины тимуса, передне-задний размер правой и левой долей тимуса (толщина), длина тимуса — максимальный кранио-каудальный размер) для каждой из групп представлены в таблице 7. Следует отметить, что максимальные значения ТИ в возрасте 36 недель ПКВ не превышали нормативные значения ТИ доношенных детей при рождении (Varga I., 2011).

Таблица 7. Средние значения линейных параметров вилочковой железы у новорожденных в исследуемых группах (Штм - максимальный показатель ширины тимуса, ПЗРтм - передне-задний размер правой и левой долей тимуса (толщина), Дтм —

Группа ТИ интервал значений,см3 Штм, Me [LQ;UQ], см ПЗРПтм, Me [LQ;UQ], см ПЗРЛ, Me [LQ;UQ], см Дтм, Me [LQ;UQ], см

1 (п=38) 7,4-12,8 2,81[2,5;3,31] 1,56[1,1;1,7] 1,58[1,2;1,7] 3,15[2,7;3,4]

2 (п=19) 12,9-25,2 3,31[2,9;3,7] 1,76[1,4;1,9] 1,84[1,4;2] 3,72[3,3;3,9]

3(п=19) 2,3 - 7,3 2,51[2,3;2,9] 1,26[1; 1,4] 1,28[1,1;1,5] 2,93[2,5;3,1]

Распределение детей в группах сравнения по гестационному возрасту, полу, массе тела при рождении и оценке по шкале Апгар представлено в таблице 8.

Таблица 8. Распределение детей в группах сравнения по гестационному возрасту, полу, массе тела при рождении н оценке по шкале Апгар __

Характеристики групп 1 группа (п=38) 2 группа (п=19) 3 группа (п=19) р, ANOVA

ГВ (недели) 31 [29;32] 31 [28;32] 29 [28;31] 0,172

Пол Абс % Абс % Абс % р, ТКФ

М 20 51,2 10 55,4 11 56,8 >0,05

Ж 18 48,8 9 44,6 8 43,2

Масса (г) 1400 [1120; 1640] (690-2070) 1380 [1180; 1610] (700-1800) 1240 [ 1130;1640] (750-1830) 0,409

Оценка по шкале Апгар (1 мин) 6 [5;6] 6 [5;6] 6 [5,6] 0,924

Оценка по шкале Апгар (5 мин) 7 [7;7] 7 [7;7] 7 [6,7] 0,121

По анамнестическим данным у большинства матерей обследуемых детей отмечалось неблагоприятное течение беременности. Гистологически верифицированный хорионамнионит значимо чаще встречался в группе 2 и 3 по сравнению с 1 группой (р1.2=0,033; ЯЯ=5 95% С1 [1,07;23,16]; р,.3=0,043; ЯЯ= 4 95%С1 [1,81;19,62]). Частота развития позднего гестоза у матерей 3 группы статистически значимо превышала таковую у матерей 1 и 2 групп (р,.3=0,044; ЯЯ=5 95% С1 [1,69;17,5]; р2-з=0,017; ЯК= 8 95% С1 [1,11;57,2]).

В 1, 2 и 3 группах сравнения не выявлено различий по частоте встречаемости такой патологии течения беременности, как ОРВИ, наложение швов на шейку матки, антенатальная гибель одного из плодов, маловодие, многоводие, проведение профилактики РДС дексаметазоном перед родами, угроза прерывания беременности или задержка внутриутробного развития (ЗВУР) любой степени тяжести.

При анализе факторов интранатального риска мы учитывали способ родоразрешения и длительность безводного промежутка. При безводном промежутке более 12 часов увеличивается риск интранатального инфицирования плода. Согласно полученным нами данным, частота встречаемости основных интранатальных осложнений была сопоставимой в группах сравнения.

Все обследованные дети сразу после рождения поступали в отделение реанимации и интенсивной терапии новорожденных в тяжелом состоянии и имели осложненное течение раннего периода постнатальной адаптации. Новорожденные 1, 2 и 3 групп статистически значимо различались по инфекционным факторам риска в неонатальном периоде. Так, среди детей 2 и 3 групп значимо чаще развивался некротизирующий энтероколит (р|-2~0,023; ЯЯ=2,68 95% С1 [1,13;6,34]; р,.3 =0,005; 1111=2,98 95% С1 [1,28;6,93]), а также отмечалась более выокая частота верификации диагноза «сепсис» (р!.2=0,013; ЯК.=5,36 95% С1 [1,19; 24,27]; р,.3 =0,004; ЯЯ=6,26 95% С1 [1,44; 27,18]) по сравнению с детьми 1 группы. При анализе количества инфекционно-воспалительных очагов из расчета на одного недоношенного ребенка на протяжении первого месяца жизни статистически значимых различий в исследуемых группах выявлено не было. Такое специфическое заболевание для недоношенных новорожденных, как ретинопатия недоношенных (РН), одинаково часто регистрировалось среди детей 1, 2 и 3 групп. Однако прогрессирующие формы (РН 3 степени) статистически значимо чаще регистрировались среди детей 3 группы по сравнению с детьми 1 и 2 групп (р,_з=0,001; №=7,2 95% С1 [1,69; 30,34]; р2.3=0,031; ЯЯ=4 95% С1 [0,97; 16,44]). При этом зависимость от высоких концентраций дополнительного кислорода во вдыхаемой смеси не может служить фактором, обуславливающим различия в частоте формирования тяжелых форм РН у детей 2 и 3 групп ввиду отсутствия статистически значимой разницы значений фракционной концентрации кислорода во вдыхаемой газовой смеси и длительности зависимости от дополнительного кислорода в этих группах. Бронхолегочная дисплазия (БДД) статистически значимо чаще формировалась у детей 2 и 3 групп по сравнению с детьми 1 группы (р,.2<0,001; КК=7,3 95% С1 [2,32; 23,2]; Р|.3<0,001; ЯЯ=9,3 95% С1 [3,05; 28,57]).

Учитывая отсутствие значимых различий в общем количестве очагов инфекции в группах недоношенных детей, мы проанализировали частоту развития отдельных патологических состояний неонатального периода, для которых характерно развитие осложнений, в том числе

приводящих к инвалидизации. При анализе частоты развития клинической симптоматики некротизирующего энтероколита (НЭК) у недоношенных новорожденных в исследуемых группах на первом месяце жизни было выявлено, что по совокупности клинико-инструментальных данных НЭК развивался статистически значимо чаще как у детей с низкими (3 группа), так и высокими (2 группа) значениями ТИ по сравнению с детьми 1 группы. При оценке стадии течения НЭК было показано, что клиническая симптоматика НЭК у детей 1 группы соответствовала I стадии. При оценке стадии течения НЭК как у детей 2, так и 3 групп отмечалось прогрессирование клиники НЭК до стадии II. В то же время у детей с низкими значениями ТИ (3 группа) статистически значимо чаще диагностировалась III стадия НЭК с последующим развитием перфорации кишечника по сравнению с детьми во 2 группе (табл.9). Результаты микробиологического исследования не позволили нам выявить взаимосвязь между тяжестью или частотой развития НЭК и обнаружением инфекционных агентов. Следует отметить, что обследование было проведено с использованием стандартных микробиологических методов. В то время как применение современных мультипраймерных тест-систем, работающих в режиме ПЦР в реальном времени, позволило бы расширить диагностические возможности и провести количественную оценку бактериальной обсемененности исследуемого материала.

Таблица 9. Частота развития НЭК у детей 1,2 и 3 групп

Группы Частота развития НЭК, % р, ТКФ

1 15,7% (6/38) 1-3 <0,005 1-2 <0,023

2 47,3% (9/19)

3 52,6% (10/19)

Группы Прогрессированне клиники НЭК (Стадия II) р, ТКФ

1 0% (0/6) 1-2=0,044

2 56% (5/9) 1-3=0,007

3 80% (8/10) 2-3 >0,05

Группы Прогрессирование клиники НЭК (Стадия III) р,ТКФ

2 20% (1/5) 2-3=0,032

3 87% (7/8) RR=4,375 95% CI [0,74; 25,7]

В настоящее время известно, что бактериальная инфекция усугубляет тяжесть течения респираторного дистресс-синдрома за счет инактивации не только эндогенного, но и экзогенно вводимого сурфактанта под действием бактериальных токсинов и провоспалительных цитокинов. Активный воспалительный процесс в легких приводит к вынужденной необходимости применять более жесткие режимы искусственной вентиляции легких (ИВЛ), что в большинстве случаев приводит к дополнительному повреждению альвеолярного эпителия и

запуску мощного провоспалительного каскада с последующим тяжелым поражением легких и формированием бронхолегочной дисплазии.

Нами была проанализирована частота развития тяжелой степени бронхолегочной дисплазии у недоношенных детей, находящихся на ИВЛ, в исследуемых группах. В таблице 10 представлены основные клинические характеристики детей, нуждавшихся в проведении механической вентиляции легких, а также средние параметры ИВЛ на 1 неделе жизни.

Таблица 10. Характеристика детей в исследуемых группах, потребовавших проведения ИВЛ__

Параметры 1 (п=9) 2 (п=9) 3 (п=8) р, ANOVA (post-hoc) /ТКФ

ГВ (недели) 29 [28;30] 30 [29;32] 31 [31;32] >0,05

Препарат сурфактанта в родильном зале (%) 8/9 (88%) 6/9 (66%) 7/8 (87%) >0,05

Среднее ПОг за весь период госпитализации 0,3 [0,3;0,4] 0,5 [0,4;0,7] 0,45 [0,3;0,6] >0,05

Длительность зависимости от повышенных концентраций 02 (сутки) 11 [8; 17] 36 [18;55] 42 [23;65] <0,05 (рьз<0,001 р,.2<0,001)

Максимальный PIP (см Н20) 20 [19;25] 23 [20;25] 22 [19;27] >0,05

PEEP (см Н20) 4[4;4] 5 Г4;51 4 [4;41 >0,05

Длительность ИВЛ (сутки) 7 [4; 12] 27 [16,52] 31 [21;57] <0,05 (р,.3<0,001 Pi.2<0,001)

Несмотря на отсутствие значимых различий при сравнении частоты применения заместительной сурфактантной терапии в первые сутки жизни, длительности респираторной терапии и параметров ИВЛ у детей 2 и 3 групп, частота развития тяжелой степени БЛД оказалась статистически значимо выше у детей 3 группы по сравнению со 2 группой и составила 75%. Среди детей 1 группы, потребовавших проведения ИВЛ, случаев тяжелой степени БЛД выявлено не было (1/9 (11%) во 2 группе против 6/8 (75%) в 3 группе, р=0,015; ЯЯ=6,75; 95% С1 [1,019; 44,713]).

Таблица 11. Частота формирования тяжелой степени БЛД в исследуемых группах

Параметр 1 группа (п=9) 2 группа (п=9) 3 группа (п=8) р, ТКФ

БЛД (тяжелая степень) 0 (0%) 1 (11%) 6 (75%) Р2.з=0,015

U. Urealyticum 4 (44%) 3 (33%) 5 (6,25%) >0,05

Частота выявления и. игеа1уйсит в трахеальных аспиратах была одинаковой в исследуемых группах (табл. 11).

С целью оценки взаимосвязи между объемной характеристикой тимуса в 36 недель ПКВ и данными лабораторного обследования был исследован клеточный состав и определены относительные и абсолютные значения основных субпопуляций Т-лимфоцитов пуповинной и периферической крови недоношенных новорожденных на протяжении первого месяца жизни. При анализе результатов иммунофенотипирования Т-лимфоцитов ПК недоношенных детей установлено, что доля С03+С0451Ш+ Т-лимфоцитов была статистически значимо выше в образцах ПК у детей 2 и 3 групп по сравнению с детьми в 1 группе, что может объясняться наличием в указанных группах такого антенатального фактора риска инфекции, как гистологически верифицированный хорионамнионит (табл. 12).

Таблица 12. Доля (%) CD3 CD45RO Т-лимфоцитов в образцах пуповинной крови детей 1,2 и 3 групп____

CD3+CD45RO+(%) 1 группа (п=38) 2 группа (п=19) 3 группа (п=19) р, ANOVA (post-hoc test)

6,4 [3,2; 9,6] 14,5 [7,9; 16,5] 16,3 [8,1; 19] <0,05 Pi-3.i-2=0,001

С целью оценки роли воспаления нами произведен анализ показателей гемограммы в первые 72 часа жизни ребенка (табл. 13). Воспалительные изменения в клиническом анализе крови отмечались статистически значимо среди детей 2 и 3 групп, чем у детей 1 группы. При анализе характера воспаления обнаружено, что для детей 2 и 3 групп был более характерен лейкоцитоз в первые 72 часа жизни, чем для детей 1 группы. Признаки воспалительного сдвига лейкоцитарной формулы крови встречались среди детей 2 и 3 группы в 45% и 51% случаев соответственно, тогда как у детей 1 группы они отмечались лишь в 10% случаев.

Таблица 13. Особенности показателен общего клинического анализа крови (OAK) в первые трое суток у детей в исследуемых группах___

Показатели 1 группа (п=38) 2 группа (п=19) 3 группа (п=19) р, ТКФ

Воспалительные изменения в ОАК 14 (39%) 13 (71%) 15 (76%) р,.2=0,024 pi.3=0,005 р2-з>0,05

Лейкопения 10 (28%) 6 (35%) 7 (39%) >0,05

Лейкоцитоз 4(11%) 7 (36,8%) 8 (42%) Pi-2=0,03 р 1-з=0,013 р2-З>0,05

Воспалительный сдвиг лейкоцитарной формулы крови 3 (10%) 9 (45%) 10(51%) Pi-2=0,001 р1_з<0,001 рз-З>0,05

Считается, что уменьшение размеров тимуса сопровождается снижением периферического пула Т-лимфоцитов (^от Р., 2011), что нашло подтверждение в нашей работе. Эпизоды стойкой абсолютной лимфопении в течение первых 14 дней жизни преобладали у детей с

низкой объемной характеристикой тимуса (р!_з=0,001; ЯЯ= 3,42 95% С1 [1,616; 7,274]; р2-з=0.02: ЯЯ=3 95%С1 [1,17;7.56]; р,.2>0,05).

При анализе относительных и абсолютных количеств основных субпопуляций Т-лимфоцитов периферической крови в динамике на первом месяце жизни у обследуемых детей наиболее значимые результаты были получены при исследовании минорных субпопуляций лимфоцитов.

Показано, что низкие значения ТИ ассоциированы с критически низкими показателями как относительного, так и абсолютного числа Трег СВ4+С025+РохрЗ+ лимфоцитов периферической крови новорожденных, начиная с 5-7 суток жизни, в то время как максимальные значения данного показателя наблюдались в группе детей с высокими значениями ТИ. При этом как доля, так и абсолютные показатели С03+С04+ на 5-7 сутки жизни статистически значимо не отличались в исследуемых группах. Выявленные закономерности могут отражать три варианта развития адаптивных механизмов иммунной системы у недоношенных детей с осложненным течением неонатального периода (рис. 6).

-1 группа 2 группа -3 группа

]сутки 5-7сутки 14-16сутни 21-22сутки

Рисунок 6. Динамика рЗ Трег лимфоцитов (% и *10%) у

недоношенных детей в исследуемых группах на протяжении первого месяца жизни

Нами были изучены соотношения Трег С04+С025Ы8ЬРохрЗ+ к С03+С04+ и СЭЗ+С08* субпопуляций Т-лимфоцитов в исследуемых группах. Установлено, что у недоношенных новорожденных в группе 3 указанные отношения оставались статистически значимо более низкими на протяжении всего периода наблюдения (рис. 7).

14-26Cv=hm 21-22cymi

i 0.3 - ■ с

I 0.2 f"

3 0.15 >

8 01 f

0.05 \

0,269 "0228" S"

SB"?"" nHl Hi

ill III

ё i группа

2 tpymtii

■ ;группа

1 сутки 5-7Сутки 14-1Gcvikh 21-22сучки

Рисунок 7. Отношение CD4+CD25highFoxp3+ /CD4+ и CD4+CD25highFoxp3+/CD8+ у детей 1, 2 и 3 групп в течение 1 месяца жизни (*pANOVA <0,001; pl-2, 1-3, 2-3 <0,001; ** pANOVA <0,001; pl-3, 2-3 <0,001)

При сравнении соответствий абсолютных значений Т-регуляторных клеток абсолютным значениям CD4+ и CD8+ субпопуляций Т-лимфоцитов в единице объема у детей 2 и 3 групп, изменения количества Трег клеток происходят в области статистически значимо более низких значений признака у детей с низкими значениями ТИ (группа 3) при сравнимых показателях CD4+ и CD8* лимфоцитов (р<0,001) (рис. 8).

900 950 1000 1050 1100 1150 '

CD8* (абс)

1500 1600 1700 1800 1900

CD4*(a6c)

^ 2

2200 2300 2400 " - л

Рисунок 8. Динамика абсолютных значений (*10б/л) С04+С025Ы8"РохрЗ+ Т-регуляторных лимфоцитов относительно линейно изменяемых показателей С03+С04+ (*106/л) и С03+С08+(*Ю6/л) лимфоцитов у детей 2 и 3 групп (21 сутки жизни)

Учитывая значительную вариабельность значений лимфоцитов на 5-7

сутки жизни у детей в исследуемых группах, мы косвенно оценили функциональную активность Т-регуляторных клеток, проанализировав величину показателя медианного значения интенсивности флуоресценции Трег лимфоцитов из расчета на одну клетку. Полученные данные свидетельствуют не только о снижении абсолютного числа Трег

хрЗ* лимфоцитов у детей с низкими значениями ТИ в возрасте 36 недель ПКВ, но и косвенно говорят о низкой функциональной активности этих клеток (табл. 14).

Таблица 14. Показатель медианного значения интенсивности флуоресценции ЕохрЗ-РЕ Трег СР4*СР25''181Тох рЗ лимфоцитов на 5-7 сутки жнзнн у детей 1, 2 и 3 групп

Показатель 1 группа (n=38) Me [Q1; 031 2 группа (п=19) Me [QI; Q3| 3 группа (п=19) Me [01; 031 р, K-W ANOVA (post-hoc test)

5-7 сутки жизни

MFI Foxp3-PE (Ед) 4,17 [3,36; 5,15] 4,32 [3,67;5,25] 2,62 [2,34; 3,18] <0,05 Pl-2=1 Рю<0,001 Рг-з<0,001

Мы полагаем, что критически низкие значения Т-регуляторных клеток у недоношенных новорожденных со стойкой абсолютной лимфопенией не позволяют осуществлять контроль над спонтанной пролиферацией «наивных» Т-лимфоцитов, что приводит к формированию клонов активированных Т-клеток, способных играть не последнюю роль в патогенезе осложнений неонатального периода.

Известно, что двойные позитивные клетки, прошедшие положительную селекцию, мигрируют в кортикомедуллярную зону, где подвергаются негативной селекции, суть которой заключается в элиминации аутоагрессивных клонов Т-лимфоцитов (Раге1 У., 2004). Взаимодействие тимоцитов с интердигитальными дендритными клетками, макрофагами, медуллярными эпителиальными клетками, экспрессирующими НЬА-молекулы со встроенным аутологичным антигеном, вызывает элиминацию аутоагрессивных Т-лимфоцитов. Продемонстрированное в нашем исследовании прогрессивное увеличение доли двойных позитивных клеток в периферической крови недоношенных новорожденных с низкими значениями ТИ может являться косвенным признаком нарушения структурности кортикомедуллярной зоны вилочковой железы у недоношенных детей (табл. 15).

Таблица 15. Динамика доли двойных позитивных С1)4+СЭ8+ лимфоцитов (%) в периферической крови детей в исследуемых группах на 5-7 н 21-22 сутки жизнн_

1 группа (n=38) Me 101; 031 2 группа (n=19) Me [01; 031 3 группа (n=19) Me [01; 031 p, K-W ANOVA (post-hoc test)

CD4+CD8+ (%) 5-7 сутки 1,2 [0,8; 1,7] 1,5 [1,1;1,9] 1,8 [1,3; 2,7] p>0,05

CD4+CD8+ (%) 21-22 сутки 1,6 [0,9; 2,1] 1,9 [1,1; 2,4] 4 [2,8; 6,5] p<0,05 Pi-з. 2-3 <0,001

p, YVilcoxon (matched pair test) p>0,05 p>0,05 p=0,013

Таким образом, состояние иммунной системы новорожденного ребенка вне зависимости от его гестационного возраста нельзя назвать иммунодефицитным. Напротив, новорожденный ребенок, а в большей степени недоношенный ребенок, имеет особое, не повторяющееся в онтогенезе, но с биологической точки зрения целесообразное состояние иммунной системы, которое препятствует развитию избыточных реакций системного воспалительного ответа, аутоиммунных процессов, деструкции собственных органов и тканей. Специфические особенности иммунной системы недоношенного ребенка помогают ему выжить в условиях интенсивной колонизации кожи и слизистых оболочек микрофлорой. В связи с этим раннее выявление нарушений регуляции адаптивных процессов иммунной системы представляет собой актуальную задачу, реализация которой позволит прогнозировать течение неонатального периода. Дальнейшее изучение становление адаптивного иммунитета у детей различных сроков гестации послужит базой для более глубокого понимания патогенетических основ заболеваний перинатального периода и позволит разработать дифференцированный подход к профилактике тяжелых осложнений перинатального периода, что улучшит прогноз жизни и здоровья и снизит частоту инвалидизации детей, родившихся с очень низкой и экстремально низкой массой тела.

ВЫВОДЫ

1. Пуповинная кровь недоношенных новорожденных характеризуется статистически значимо более низким числом лейкоцитов по сравнению с пуповинной кровью детей, рожденных в срок, а также относительным и абсолютным лимфоцитозом (р<0,001). При этом гестационный возраст прямо пропорционален общему числу лейкоцитов (г5=0,61; р=0,001) и обратно пропорционален доле лимфоцитов в пуповинной крови (г5=-0,65; р<0,001).

2. Отличительной особенностью субпопуляционного состава пуповинной крови недоношенных новорожденных являются высокие относительные и абсолютные значения Т-регуляторных С1М+С025+РохрЗ+ лимфоцитов (р<0,01). При этом показатель интенсивности флуоресценции МР1 РохрЗ-РЕ, косвенно свидетельствующий о функциональной активности клеток, обратно пропорционален гестационному возрасту (г5=-0,66; р<0,001).

3. Гестационный возраст как независимый фактор оказывает наименьшее влияние на клеточный состав и фенотипические характеристики Т-лимфоцитов по сравнению с другими инфекционными и неинфекционными факторами, действующими в антенатальном периоде, а именно, гистологически верифицированным хорионамнионитом и тяжелым гестозом у матери.

4. На 1-м месяце жизни происходит значимое увеличение доли и абсолютных значений Т-регуляторных С04+С025Ь|8ЬРохрЗ+лимфоцитов в периферической крови недоношенных детей с пиковым уровнем на 5-7 сутки и постепенным снижением к 1 месяцу жизни на фоне статистически значимо более низких значений СОЗ+, С03+С04+, СОЗ+СЭ8+ субпопуляций Т-

лимфоцитов по сравнению с доношенными новорожденными.

5. Вариабельность значений ТИ у недоношенных детей в возрасте 36 недель скоррегированного постконцептуального возраста является свидетельством напряженных механизмов постнатальной адаптации, причем низкие значения ТИ ассоциированы со срывом адаптационных процессов, проявляющимся в виде прогрессирующих стадий НЭК с развитием перфорации кишечника (RR=4,375; 95% CI [0,74; 25,7]), БЛД тяжелой степени тяжести (RR=6,75; 95% CI [1,019; 44,71]), формирования злокачественных форм PH (RR=4; 95% CI [0,97; 16,44]) и сопровождающимся критически низкими значениями Т-регуляторных CD4+CD25h,8l,Foxp34 лимфоцитов на 5-7 сутки жизни.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. С целью верификации факта внутриутробного инфицирования предлагается определять относительное число Т-клеток памяти с маркером CD45RO в образцах пуповинной крови недоношенных детей.

2. Для прогнозирования течения адаптивных процессов в неонатальном периоде и дифференцированного подхода к проводимой терапии рекомендуется проводить оценку Т-регуляторного звена иммунной системы с определением абсолютных и относительных значений Т-регуляторных CD4+CD25h,8hFoxp3+ лимфоцитов на 5-7 сутки жизни недоношенного ребенка.

3. В ходе иммунофенотипического исследования Т-регуляторных клеток у недоношенных новорожденных определение экспрессии маркера CD 127 (CD4+CD25highCD 127loW' ) является более простым и экономически выгодным методом для использования в клинической практике.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Панкратьева Л.Л., Мухин В.Е., Воронцова Ю.Н., Бабак O.A., Милева О.И., Быковская С.Н., Солдатова И.Г., Володин H.H., Дегтярева М.В. Роль Т-регуляторных CD4+CD25+Foxp3+ лимфоцитов в поддержании иммунного гомеостаза у новорожденных детей различного гестационного возраста с осложненным течением неонатального периода. // Материалы I Международного Конгресса по перинатальной медицине и VI ежегодного Конгресса специалистов перинатальной медицины, 16-18 июня 2011. - С.127.

2. Панкратьева Л.Л., Мухин В.Е., Обидина A.A., Кураксина O.A., Быковская С.Н., Дуленков А.Б., Солдатова И.Г., Володин H.H., Дегтярева М.В. Динамика Т-регуляторных CD4+CD25+Foxp3+ лимфоцитов у новорожденных детей различного гестационного возраста на первом месяце жизни. // Материалы I Международного Конгресса по перинатальной медицине и VI ежегодного Конгресса специалистов перинатальной медицины, 16-18 июня 2011. - С. 128.

3. Pankratyeva L.L., Mukhin V.E., Degtyareva M.V., Bykovskaia S.N. «Low levels of CD4+CD25+Foxp3+CD127low T-regulatory cells are associated with rapid progression of necrotizing enterocolitis and severe bronchopulmonary dysplasia in critically ill premature neonates». // Материалы международной конференции «World immune regulation meeting - VI», 18-21 марта 2012, г. Давос.-С. 223.

4. Pankratyeva L.L., Mukhin V.E., Soldatova I.G., Bykovskaia S.N., Degtyareva M.V., Volodin N.N. «Low circulating CD4+CD25highFoxp3+CD127low T-regulatory cell levels in association with lymphopenia predict poor outcome in critically ill neonates». // The Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. - 2012. - Vol.25, supplement 2, p. 106.

5. Панкратьева JT.Jl., Мухин B.E., Чернова M.A., Милева О.И., Солдатова И.Г., Быковская С.Н., Володин Н.Н. Т-регуляторные CD4+CD25+Foxp3+ лимфоциты периферической крови и их значение в патологии неонатального периода. // «Вопросы практической педиатрии». - 2013. -Т.8, №1.-С. 8-13.

6. Pankratyeva L.L., Soldatova I.G., Roumiantsev S.A., Roumiantsev A.G., Volodin N.N. «Wide variability in thymic size in critically ill neonates: ultrasound imaging, clinical and immunological parallels». //The Journal of Maternal-Fetal and Neonatal Medicine. - 2013. - Vol. 41, p. 285.

Список сокращений:

БДД - бронхолегочная дисплазия.

ВЖК - внутрижелудочковые кровоизлияния

ГБ- городская больница

ГВ - гестационный возраст

ДГКБ - детская городская клиническая больница

ЗВУР - задержка внутриутробного развития

ИВЛ — искусственная вентиляция легких

ИЛ - интерлейкин

НСГ — нейросонография

НЭК - некротизирующий энтероколит

ОРИТН - отделение реанимации и интенсивной терапии новорожденных

ПК - пуповинная кровь

ПКВ - постконцептуальный возраст

РДС — респираторный дистресс-синдром

РН - ретинопатия новорожденных

ТКФ - точный критерий Фишера

Трег — Т-регуляторные клетки

УЗИ - ультразвуковое исследование

ХА - хорионамнионит

ЭХО-КГ - эхокардиография

CI - confidential interval (доверительный интервал, ДИ) FiC>2 — фракция кислорода во вдыхаемой смеси K-W test - непараметрический тест Крускала-Уоллиса PEEP - положительное давление на выдохе PIP - максимальное давление на вдохе RR - relative risk (относительный риск) U-test - непараметрический тест Манна-Уитни W-test - непараметрический тест Вилкоксона

Формат 60x90/16. Заказ 1707. Тираж 100 экз. Печать офсетная. Бумага для множительных аппаратов. Отпечатано в ООО "ФЭД+", Москва, Ленинский пр. 42, тел. (495)774-26-96