Автореферат и диссертация по медицине (14.01.08) на тему:Клиническое значение определения субпопуляций Т-лимфацитов в процессе формирования адаптивного иммунитета у недоношенных детей

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ФЕДЕРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-КЛИНИЧЕСКИЙ ЦЕНТР ДЕТСКОЙ ГЕМАТОЛОГИИ, ОНКОЛОГИИ И ИММУНОЛОГИИ ИМЕНИ ДМИТРИЯ РОГАЧЁВА» ФГБУ ФНКЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева Минздрава России

УДК 616-053.31, 612.649, 612.017.1; 612.112.94

04201362866

ПАНКРАТЬЕВА

Людмила Леонидовна

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУБПОПУЛЯЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ В ПРОЦЕССЕ ФОРМИРОВАНИЯ АДАПТИВНОГО ИММУНИТЕТА

У НЕДОНОШЕННЫХ ДЕТЕЙ

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.01.08 - Педиатрия

Научные руководители:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Володин Николай Николаевич

Доктор медицинских наук, профессор

Румянцев Сергей Александрович

МОСКВА 2013

Введение............................................................................................4

Глава 1. Обзор литературы.....................................................................13

1.1 Современные представления о строении, развитии и функциях тимуса

в онтогенезе. Исследование тимуса у новорожденных...............................13

1.2 Фенотипические характеристики Т-лимфоцитов на разных стадиях дифференцировки........................................................................................22

1.3 Особенности клеточного состава и основных субпопуляций Т-лимфоцитов плода и новорожденного. Понятие о регуляции

иммунного ответа................................................................................28

Глава 2. Объект и методы исследования................................................39

2.1 Характеристика обследованных детей...............................................40

2.1.1 Характеристика новорожденных детей с физиологическим течением неонатального периода......................................................................40

2.1.2 Характеристика новорожденных детей с осложненным течением неонатального периода......................................................................42

2.2 Методы исследования и подходы к трактовке полученных данных..........48

2.3 Общий объем выполненных исследований.........................................53

2.4 Статистическая обработка результатов................................................54

Глава 3. Результаты собственных исследований......................................55

3.1 Особенности клеточного состава и основных субпопуляций Т-лимфоцитов в пуповинной крови детей различного гестационного возраста....................55

3.2 Особенности динамических изменений клеточного состава и основных субпопуляций Т-лимфоцитов в периферической крови детей различного

гестационного возраста на протяжении первого месяца жизни.....................65

3.3. Изучение взаимосвязи между вариабельностью размеров вил очковой железы и клинико-анамнестическими и лабораторными данными.................76

3.3.1 Значение анте- и интранатальных факторов.......................................79

3.3.2 Значение факторов, действующих в неонатальном периоде..................83

3.3.3 Лабораторные корреляции............................................................91

Глава 4. Обсуждение полученных результатов.......................................106

Выводы...........................................................................................115

Практические рекомендации..............................................................116

Список литературы.............................................................................117

Список сокращений

БЛД - бронхолегочная дисплазия.

ВЖК - внутрижелудочковые кровоизлияния

ГБ- городская больница

ГВ - гестационный возраст

ДГКБ - детская городская клиническая больница

ЗВУР - задержка внутриутробного развития

ИВЛ - искусственная вентиляция легких

ИЛ - интерлейкин (IL)

НСГ - нейросонография

НЭК - некротизирующий энтероколит

ОРИТН - отделение реанимации и интенсивной терапии новорожденных

ПК - пуповинная кровь

ПКВ - постконцептуальный возраст

РДС - респираторный дистресс-синдром

РН - ретинопатия новорожденных

ТКФ - точный критерий Фишера

Трег - Т-регуляторные клетки (лимфоциты)

УЗИ - ультразвуковое исследование

ХА -хорионамнионит

ЭХО-КГ - эхокардиография

CI - confidential interval (доверительный интервал, ДИ) Fi02 - фракция кислорода во вдыхаемой смеси K-W test - непараметрический тест Крускала-Уоллиса МНС - major histocompatibility complex (главный комплекс гистосовместимости)

PEEP - положительное давление на выдохе PIP - максимальное давление на вдохе RR - relative risk (относительный риск) TCR - T-cell receptor (Т-клеточный рецептор) U-test - непараметрический тест Манна-Уитни W-test - непараметрический тест Вилкоксона

ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы

Недоношенные новорожденные дети с осложненным течением неонатального периода составляют группу наибольшего риска перинатальных потерь и инвалидизации в раннем детском возрасте. Выживаемость детей, родившихся с низкой и экстремально низкой массой тела, достигает 78-85% [103]. Однако в последующие два года 5-8% из них умирают, а у 45-70% детей выявляются патологические состояния, связанные с проблемами перинатального периода [162].

Приведенные неблагоприятные статистические данные о состоянии здоровья детей, родившихся раньше срока, обусловлены анатомо-физиологическими особенностями недоношенного ребенка, в первую очередь, незрелостью дыхательной и нервной систем, несостоятельностью основных механизмов антибактериальной и противовирусной защиты, становлением биоценоза кишечника в условиях проведения интенсивной терапии, избыточной активностью провоспалительного ответа.

В последние годы во всем мире пристальное внимание исследователей и

практических врачей уделяется комплексу проблем, связанных с изучением

онтогенеза иммунной системы в норме и функционированием её при

патологических состояниях, особенно при тяжелых инфекциях в перинатальном

периоде и в раннем детском возрасте. Иммунные механизмы участвуют в

патогенезе основных заболеваний перинатального периода и во многом

обуславливают исход и возможность полноценной реабилитации заболевшего

ребенка. В пользу иммунопатогенетической теории развития тяжелых

осложнений неонатального периода свидетельствует многократное и

неконтролируемое увеличение уровня провоспалительных цитокинов в тканях и

сыворотке крови, а также повышенная иммунореактивность тимоцитов и

спленоцитов в отношении антигенов собственных тканей организма [140]. Наряду

4

с известными на сегодняшний день нарушениями в системе врожденного иммунитета у недоношенных детей [16, 52, 92, 174], проблема нарушения формирования адаптивного иммунитета имеет не меньшее значение [62]. Однако в литературе практически отсутствуют данные о характере изменений абсолютных и относительных количеств основных субпопуляций Т-лимфоцитов в процессе формирования адаптивного иммунитета у недоношенных новорожденных на протяжении первого месяца жизни, являющегося определяющим для всей последующей жизни ребенка. Не изучены факторы анте-, интра- и перинатального периодов, потенциально приводящие к нарушению адаптивных реакций иммунной системы на первом месяце жизни.

На процесс формирования фенотипа адаптивных реакций иммунной системы влияют многочисленные факторы, причем генетические факторы имеют важное, но не решающее значение. Ключевая роль в этом процессе отводится морфо-функциональному состоянию тимуса [88].

Тимус (вилочковая железа) является центральным органом иммунной системы, в котором осуществляются процессы дифференцировки и клональной селекции Т-лимфоцитов [59, 63]. Роль тимуса в формировании иммунной системы в постнатальном периоде до конца не ясна. В литературе практически отсутствуют данные о влиянии преждевременных родов на сложный и многоэтапный процесс созревания Т-лимфоцитов в тимусе и формирование иммунной системы в целом.

В настоящее время считается, что процесс инволюции тимуса начинается с конца первого года жизни ребенка и, наряду с изменениями структуры, утрачивается и его способность к генерации новых клонов Т-лимфоцитов [98]. Однако в ряде исследований было показано, что объем вилочковой железы в раннем детском возрасте напрямую зависит от влияния огромного числа внешних факторов. Так, у детей, получавших грудное молоко в качестве основного источника питания в течение первых шести месяцев жизни, объем тимуса по данным ультразвукового исследования значимо превышал таковой у детей,

5

находившихся на искусственном вскармливании [77]. В другом исследовании была выявлена взаимосвязь между развитием фунизита (гистологический маркер реакции системного воспалительного ответа плода) и инволюцией тимуса у плода [56, 68, 90, 161]. В результате анализа факторов риска у новорожденных с бронхолегочной дисплазией, было показано, что размеры тимуса (по данным стандартного рентгенографического исследования) могут зависеть от состояния ферментной системы коры надпочечников у недоношенных детей и иметь прогностическое значение [41].

Исходя из указанного выше, следует, что размеры тимуса в неонатальном периоде и раннем детском возрасте вариабельны и зависят от целого ряда факторов как инфекционной, так и неинфекционной природы [57]. Остается неясным, существует ли взаимосвязь между объемом вилочковой железы и пулом периферических Т-лимфоцитов, а также развитием отдельных патологических состояний и тяжестью их течения у недоношенных детей различного гестационного возраста, в том числе с экстремально низкой массой тела при рождении.

В настоящее время огромный научный интерес представляет изучение роли Т-регуляторного звена иммунной системы как фактора, обеспечивающего развитие адаптивных механизмов иммунной системы при различных формах патологии у недоношенных детей различного гестационного возраста, в том числе с экстремально низкой массой тела при рождении.

Так, в экспериментальных исследованиях на мышах было показано, что системный воспалительный ответ может нарушать дифференцировку Т-регуляторных лимфоцитов (Трег). В то же время введение культивированных in vitro Foxp3+ Трег способствует уменьшению воспаления и купированию колита и синдрома острого повреждения легких [24, 40].

Основными маркёрными характеристиками Трег служат рецепторные

молекулы CD25+ (альфа цепь рецептора ИЛ-2), продукт гена Foxp3 (forkhead box

рЗ), являющийся фактором транскрипции, отвечающим за дифференцировку

6

Трег, а также низкая экспрессия рецептора к интерлейкину 7 (1Ь7Я (С0127)). Известно, что Трег играют фундаментальную роль в контроле аутоиммунных реакций, поддержании периферической толерантности при трансплантационном иммунитете, толерантности матери к плоду, а также в предотвращении патологического иммунного ответа на кишечную микрофлору и микробную инфекцию [143, 170]. В то же время в литературе отсутствуют данные об особенностях постнатального онтогенеза Т-регуляторного звена иммунной системы у недоношенных детей, а также не изучен вопрос наличия взаимосвязи между развитием отдельных патологических состояний неонатального периода у недоношенных детей различного гестационного возраста и особенностями динамики относительного и абсолютного числа Трег и их клеточных соотношений на первом месяце жизни.

Для решения вышеуказанных проблем и было предпринято настоящее исследование.

Цель исследования: изучить клинико-иммунологические характеристики новорожденных детей различного гестационного возраста с осложненным течением неонатального периода в процессе формирования адаптивного иммунитета.

Задачи исследования:

1) Изучить клеточный состав и определить абсолютные и относительные количества СБЗ+, СБЗ+СБ45КО, СОЗ+СБ8+, СОЗ+СБ4+, СБ4+СБ25+, С04+СБ25Ыё,1РохрЗ+, СВ4+СО25ы^СО12710Ш/" субпопуляций Т-лимфоцитов пуповинной крови доношенных и недоношенных новорожденных.

2) Установить анте- и интранатальные факторы, оказывающие влияние на клеточный состав и фенотипические характеристики Т-лимфоцитов пуповинной крови недоношенных новорожденных.

3) Охарактеризовать динамику изменения клеточного состава и абсолютных

и относительных значений СБЗ+, СБЗ+СБ8+, СОЗ+СБ4+, СБ4+СБ25+,

С1)А+СТ>2 5 ы§11РохрЗСБ4+СВ25Ыё'1СВ1271™/" субпопуляций Т-лимфоцитов

7

периферической крови доношенных и недоношенных новорожденных на протяжении первого месяца жизни.

4) Изучить связь развития отдельных патологических состояний неонатального периода у недоношенных детей различного гестационного возраста, в том числе с низкой и экстремально низкой массой тела при рождении, с особенностями динамики относительного и абсолютного числа Т-регуляторных CD4+CD25highFoxp3+ лимфоцитов периферической крови на первом месяце жизни и значениями тимического индекса в возрасте 36 недель постконцептуального возраста.

Материалы и методы исследования

Работа проводилась в лаборатории молекулярной и экспериментальной медицины (заведующий лабораторией - д.м.н., профессор Румянцев С.А.) Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии имени Дмитрия Рогачёва» Минздрава России (директор - академик РАМН, д.м.н., профессор Румянцев А.Г.) совместно с отделом клеточных технологий и регенеративной медицины (руководитель отдела - д.м.н., профессор Быковская С.Н.) Государственного Бюджетного Образовательного Учреждения Высшего Профессионального Образования «Российский национальный

исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации за период с октября 2010 года по февраль 2013 года.

Обследование новорождённых детей проводилось на базе родильного

отделения (зав. отд.- Березина H.A.), отделений реанимации и интенсивной

терапии новорожденных детей (ОРИТН) №1 (зав. отд. - Милева О.И.) и №2 (зав.

отд. - к.м.н. Бабак O.A.), отделений патологии новорожденных №1 (зав.отд. -

к.м.н. Потапова О.В.) и №2 (зав.отд. - Миронюк О.В.) Городской Больницы №8

Департамента здравоохранения г. Москвы (главный врач - к.м.н. Дуленков А.Б.),

отделения патологии новорожденных и недоношенных детей (зав. отд. -

8

Кыштымов М.В.), отделения хирургии новорожденных (зав. отд. - к.м.н. Шумихин В.С.), Центра восстановительного лечения детей до 3-х лет с кабинетом катамнестического наблюдения консультативно-диагностического центра (зав. отд. - к.м.н. Лукина Л.И.) Детской городской клинической больницы №13 им. Н.Ф. Филатова Департамента здравоохранения г. Москвы (главный врач - к.м.н. Константинов К.В.), в Московском Центре планирования семьи репродукции (главный врач - член-корреспондент РАМН, профессор Курцер М.А.) и родильном доме №10 г. Москвы (главный врач - к.м.н. Озимковская Е.П.).

В основу данной работы были положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 50 здоровых новорожденных детей с физиологическим течением неонатального периода и 80 новорожденных детей с гестационным возрастом от 25 до 36 недель с осложненным течением неонатального периода, потребовавших проведения интенсивной терапии по совокупности клинико-анамнестических, лабораторных и инструментальных данных.

Научная новизна. В результате изучения закономерностей становления фетального иммунитета выявлено, что лимфопоэз является доминирующим направлением кроветворения на этапе внутриутробного развития плода, тогда как активность гранулоцитарно-макрофагальных предшественников снижена.

Впервые показано, что отличительной особенностью субпопуляционного состава Т-лимфоцитов крови недоношенных детей на первом месяце жизни являются высокие абсолютные и относительные значения Т-регуляторных СВ4+СВ25ь,ёНРохрЗ+ лимфоцитов, характеризующихся высокой функциональной активностью.

Изучение взаимосвязи между объемной характеристикой вилочковой железы

и динамикой пула Т-лимфоцитов, а также развитием отдельных патологических

состояний и тяжестью их течения позволило выделить среди недоношенных детей

группу повышенного риска по развитию срыва постнатальной адаптации. При

этом установлено, что вариации клеточного состава и субпопуляций Т-

9

лимфоцитов пуповинной крови не имеют прогностического значения в постнатальном периоде, а являются лишь отражением воздействия антенатальных факторов, среди которых гестационный возраст имеет наименьшее значение.

Практическая значимость. Выявленная повышенная экспрессия характерного для Т-клеток памяти маркера CD45RO в образцах пуповинной крови недоношенных детей, развивших в течение первых 72 часов жизни неонатальный сепсис, позволяет выделить группу новорожденных с наличием факта внутриутробного инфицирования и проводить максимально раннюю профилактику тяжелых инфекционных осложнений неонатального периода.

Определены сроки исследования Т-регуляторного звена иммунной системы у недоношенного ребенка с целью прогнозирования течения адаптивных процессов в неонатальном периоде и оптимизации проводимой терапии.

Рекомендовано определение экспрессии CD 127 (CD4+CD25highCD127low/") в качестве надежного поверхностного клеточного маркера для идентификации Т-регуляторных лимфоцитов у недоношенных детей.

Внедрение в практику

Практические рекомендации внедрены в работу отделений реанимации и интенсивной терапии новорожденных и патологии новорожденных Городской Больницы №8 Депа