Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клиническое значение определения содержания ДНК в остеосаркомах

На прапах рукописи

ит> ОМ

ю ¿гс-2

ТРОФЛИЛА ИГОРЬ АЛЕКСЕЕВИЧ

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ДНК В ОСТЕОСАРКОМАХ.

( 14.00.14 - онкология )

АВ ТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учсион степени кандидата медицинских наук

МОСКВА - 2002 г.

Работа выполнена в хирургическом отделении общей онкологии и лаборато-

/

рии клинической цитологииРоссийского Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина РАМнЛ,

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор М.Д. Алиев доктор медицинских наук, профессор В.Н. Богатырёв

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор H.A. Шапиро кандидат медицинских наук, Н.М. Иванова

Ведущая организация — Московский научно-исследовательский онкологический институт имени П.А. Герцена. МЗ РФ

Защита диссертации состоится 2002 года

в_часов на заседании специализированного ученого совета К.001.017.01 при

РОНЦ РАМН (115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке РОНЦ им H.H. Блохина РАМН

Автореферат разослан '' ВД '' 2002

Учёный секретарь специализированного учёного совета, доктор медицинских наук Барсуков Ю.А.

Актуальность темы. Остеосаркома относится к наиболее агрессивно протекающим опухолевым заболеваниям человека. Это связано со склонностью данной опухоли к ранней гематогенной диссеминации с преимущественным поражением легких. При остеосаркоме у большинства больных уже в момент установления диагноза имеются отдаленные микрометастазы (H.H. Трапезников и соавт., 1986, 2001). Благодаря использованию комбинированного лечения прогноз при этом заболевании заметно улучшился (G. Bacci и соавт., 2000, S. Bielack и соавт., 1999, N. Delepine и соавт., 1994, R. Souhami и соавт., 1997). Однако, несмотря па применение химиотерапии, около 40% больных погибают в течение первых двух лет от прогрессировать заболевания. Отсутствие убедительных критериев стратификации больных с учетом степени риска до начала терапии вынуждает клиницистов использовать агрессивную, высокотоксичную и дорогостоящую химиотерапию во всех случаях (G. Bacci и соавт., 1995, 2001, J. Miser и соавт., 1994). В то же время, выраженного ответа на лечение и длительной ремиссии можно достигнуть путем применения менее токсичных, так называемых стандартных режимов предоперационной химиотерапии (H.H. Трапезников и соавт., 1993, N. Delepine и соавт., 1994, N. Jaffe и соавт., 1989). В этом контексте очевидно, что достижение удовлетворительных результатов лечения с одной стороны и снижение токсичности, сложности и стоимости терапии с другой стороны, тесно связано с разработкой индивидуализированных подходов, основанных на дотерапевтической оценке риска метастазирования у конкретного больного. Клинические и гистопатологиче-ские критерии не всегда позволяют адекватно оценить степень злокачественности и правильно выбрать режим лекарственного лечения (Л. Huvos, 1993). Одним из новых и активно изучаемых направлений п современной онкологии является анализ содержания ДНК в клетках различных опухолей человека с помощью проточной цитофлуоромстрии. Этот метод является дополнительным источником объективной информации о биологии опухолевой клетки, о се плоидности, популяци-онном составе опухоли и распределении клеток в фазах клеточного цикла. В связи с редкостью остеосарком, трудностью накопления репрезентативных групп однородно леченных больных, сведения, посвященные изучению клеточной кинетики при остеосаркоме, немногочисленны и касаются небольших серии больных

(H. Bauer и соавт., 1988, К. Kusuzaki и соавт., 1992, 1999, М. Neuburger и соагл 1999, Н. Takeshita и соавт., 2001). Этим обусловлена актуальность проведенног исследования ДНК-проточно-цитофлуорометрических параметров остеосаркомь а также изучение их прогностической роли.

Цель исследования.

Целью данного исследования является изучение плоидности и пролифератш ной активности опухолевых клеток у больных остеосаркомой, изучение и клинической и прогностической роли.

Задачи исследования

1. Оценка плоидности клеток опухоли и изучение числа клеток в Go/i, ! G2+M фазах клеточного цикла у больных остеосаркомой.

2. Оценка пролиферативной активности (индекс пролиферативиой активне сти) клеток опухоли.

3. Определение взаимосвязи между цитокинетическими характеристикам клеток опухоли и стадией заболевания.

4. Оценка корреляционных связей между плоидностыо и пролиферативно активностью опухолевых клеток с основными клиническими и морфологическим характеристиками остеосаркомы, а также с уровнем щелочной фосфатазы в сыве ротке крови.

5. Оценка прогностической роли плоидности и пролиферативной активност опухолевых клеток и связь этих количественных параметров со сроками метастг зирования остеосаркомы.

Научная новизна.

Впервые в отечественной медицине на большом клиническом материал! представленном 100 больными с остеосаркомой, для получения объективной иг формации использована высокоинформативная цитологическая методика лазер ной проточной цитофлуорометрии (FACScan, Becton Dickinson, США). Для аналя за плоидности, автоматизированного подсчета процента анеуплоидных клеток опухоли и распределения клеток в фазах клеточного цикла у больных с остеосар комой применена специальная компьютерная программа Multicycle (Phoenix Flo\ Systems, США). Впервые в отечественной онкологии проведен детальный анали

прогностического значения числа клеток в О0/ь 8 и С2+М фазах клеточного цикла, показателя индекса лролиферативной активности у больных с диплоидными остеосаркомамн. Полученные в работе результаты могут быть использованы для разработки индивидуальных схем лечения и прогнозирования у больных остео-саркомой.

Практическая значимость

Анализ плоидности и пролиферативпой активности клеток остеосаркомы расширяет знания о биологической сущности данной опухоли. На основании небольшого количества диагностического материала, полученного при открытой биопсии, за короткий интервал времени можно получить дополнительную объективную информацию о степени злокачественности остеосаркомы. Метод лазерной ДНК - проточной цитофлуоромстрии позволяет выделить группу больных с повышенным риском метастазирования на основании детального анализа распределения клеток в фазах клеточного цикла, создает предпосылки для разработки индивидуальных подходов при выборе тактики противоопухолевой терапии и прогноза у больных остеосаркомой.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, четырех глав, заключения и выводов, изложена на 114 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц и 22 рисунка. Библиографический указатель включает 12 отечественных и 175 зарубежных источников.

Публикация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано три научные работы.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на совместной научной конференции отделения обшей онкологии, лаборатории клинической цитологии, отдела патологической анатомии опухолей человека, лаборатории клипичс-жой биохимии, кафедры онкологии ММА им. И.М. Сеченова 19 декабря 1999 г.

Характеристика больных н методов исследования.

В данное исследование вошли 100 больных остеосаркомой, находившихся на 1ечешш в РОНЦ им. Н.Н. Блохнна РАМИ с 1989 по 1998 годы. Во всех случаях щагноз остеосаркомы был подтвержден цитологически и гистологически. 1'ас-феделенис больных по полу: мужчины-67, жспшипы-ЗЗ. Чаще остеосаркома на-

блюдалась у лиц молодого возраста 15-35 лет, преимущественно у юношей 16-Г лет. Излюбленными локализациями были метафизы костей, формирующих колен ный сустав. Отмечен ряд редких для остеосаркомы локализаций, таких как нижня) челюсть, грудина, кости таза, которые встречались преимущественно у лиц стар шсго возраста. Таким образом, по полу, возрасту и локализации анализируема) группа не отличается от описанных в литературе групп больных остеосаркомой До лечения устанавливали стадию заболевания. Для этого выполняли стандарт ную рентгенографию органов грудной клетки в двух проекциях. Компьютерна) томография органов грудной клетке выполнялась при подозрении на наличие от даленных метастазов после рентгенографии. Планарная сцинтиграфия скелет; выполнялась с целыо исключения метастатического поражения костей.

Для биологической характеристики остеосаркомы и проведения последую щего корреляционного анализа, количественные показатели опухолевых клето1 (плоидность, индекс ДНК (ИДНК), процент анеуплоидных клеток, распределенш клеток в Go/i, S, G2+M фазах клеточного цикла, индекс пролиферативной активно сти (ИП)) изучены с помощью компьютерных программ CellFit (Becton Dickinson США), WinList и Multicycle (Phoenix Flow Systems, США).

Также использовали следующие клинико-рентгенологические и лаборатор ные признаки:

длительность анамнеза, которая соответствовала интервалу времени межд} первыми проявлениями заболевания и моментом начала противоопухолевого ле чения.

степень местной распространенности опухолевого процесса по классифи кации Enneking. Для этого использовали стандартную рентгенографию первично! опухоли в двух проекциях и компьютерную томографию,

уровень щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови. объём первичной опухоли рассчитывали по формуле для эллипсоидных объ ектов: 0.52 х А х В х С, где А, В и С представляли собой максимальные размерь опухоли, определяемые на ангиограммах в капиллярной фазе, на компьютерны) томограммах или на стандартных рентгенограммах.

морфологический вариант опухоли выделяли на основании модифицированной классификации ВОЗ (F. Schajowicz и соавт., 1995):

Математическая обработка данных диссертации проводилась на основании базы данных, которая была создана и проанализирована на персональном компьютере с помощью комплекса программ медико-биологической статистики "ЛСТЛ", разработанной в группе медицинской кибернетики РОНЦ им H.H. Блохина РАМН, программы Statistica (версия 5.0, Statsoft Inc. США).

Лсченне

Начиная с 1986 года, лечение больных с локализованной остеосаркомой конечностей высокой степени злокачественности осуществлялось в соответствии с протоколом, основанном на принципах иеоадыовантной терапии. Суть данного похода заключается в проведении нескольких курсов предоперационной химиотерапии, локального лечения, чаще всего хирургического, и адыовантпой химиотерапии с учетом степени достигнутого лечебного патоморфоза (G.Rosen и соавт., 1982).

Предоперационная химиотерапия предусматривала проведение от двух до шести внутрнартериальных ипфузий цис-платины 120-150 мг/м2, или доксоруби-цина (адриамицина) 90 мг/м2 с интервалом между курсами 3-4 недели.

Время и характер локального лечения устанавливались с учетом возраста больного, степени местной распространенности опухоли, се локализации и гистологического заключения. У больных с местно-распространенными опухолями лечение начиналось с калечащей операции, а в дальнейшем проводилась адыовапт-ная химиотерапия. При опухолях таза, грудины или ребер проводилась лучевая терапия. При остеосаркоме нижней челюсти па первом этапе выполнялась резекция кости. При паростальной остеосаркоме единственным методом лечения был хирургический. Выбор объема операции зависел от локализации, степени местной распространенности опухоли и возраста больного. Основным условием операции являлось достижение адекватного уровня резекции кости, а также иссечения окружающих опухоль мягких тканей.

Послеоперационная (адыовантная) химиотерапия проводилась у радикально оперированных больных. Количество курсов колебалось от трех до шести. В зависимости от проведенной терапии больные распределились следующим образом:

- операция - 4 (4%),

- операция + химиотерапия - 13 (13%),

- химиотерапия - 19 (19%),

- химиотерапия + лучевая терапия ± химиотерапия - 12(12%),

- химиотерапия + операция - 9 (9%),

- химиотерапия + операция + химиотерапия - 40 (40%),

- без лечения - 3 (3%).

Сроки наблюдения за выжившими без метастазов больными составили от трех до 84 месяцев, в среднем 40.3 месяца. Выживаемость рассчитывали по методу Kaplan-Meier, а достоверность различий оценивали посредством log rank теста.

В качестве критерия оценки отдаленных результатов использовали безметастатическую выживаемость. Она определялась как временной интервал между началом лечения и клинико-рснтгснологическим выявлением отдаленных метастазов или датой последней консультации. Наблюдение за больным после лечения включало общеклиническое обследование, рентгенографию первичной опухоли или зоны операции, рентгенографию (компьютерную томографию по показаниям' органов грудной клетки, сканирование скелета, определение уровня щелочное фосфатазы в сыворотке крови.

Многофакторный анализ проводили с помощью компьютерного алгоритм; статистически взвешенных синдромов (СВС), (V. Kuznetsov и соавт., 1996).

Определение содержания ДНК

Содержание ДНК в клетках остеосаркомы определялось с помощью метод; проточной цитофлуорометрии. Данный метод позволяет получать ламинарньп поток клеток опухоли. Это обеспечивает высокую точность измерений и даст воз можность анализировать десятки тысяч клеток за считанные секунды. В даннол исследовании образцы опухолевой ткани получали из материала открытой диаг ностической биопсии. Для достижения большей информативности исследований снижения влияния на результаты такого фактора как гетерогенность клеточной

состава, образцы опухолевой ткани брались из различных участков ее внутрико-стной части и внекостного компонента. Аналогичный методологический подход был использован и в исследовании S. LaRue и соавт., 1994. Получали не менее 0.5 см3 ткани опухоли, которые содержали более 104 клеток. В течение одного часа материал доставлялся в лабораторию клинической цитологии POI1Ц им. H.H. Бло-хина РАМН, где из него готовились клеточные суспензии. Для морфологического контроля изучаемого образца, проводилось параллельное цитологическое исследование мазков-отпечатков (окраска по Лейшману) и препаратов, полученных по методике Cytospin (Shandon, Великобритания).

После окрашивания клеточную суспензию исследовали на проточном анализаторе FACScan (Becton Dickinson, США). В качестве флуоресцентного красителя нами использован пропидиум йодид (Sigma, США).

Для характеристики степени анеуплоидин клеток опухолн с помощью специальной компьютерной программы Multicycle (Phoenix Flow Systems, США) выделяли индекс ДНК, который характеризовал отношения интенсивности флуоресценции пика анеуплоидпых клеток (его номер капала) к диплоидному. Диплоидными мы считали опухоли, у которых Go/i пик находился в пределах контрольного пика диплоидных стандартов (лимфоциты), и соответственно, их ИДНК всегда был равен 1.0. В анеуилоидных новообразованиях он был больше или меньше 1.0.

Таким образом, с помощью типа гистограмм при строгом морфологическом контроле были выделены группы больных с диплоидными и анеуплоидными новообразованиями и по ИДНК оценена степень анеуплоидин, определено число анеуплоидпых клеток в опухоли и их число в Gn/r, S и G2+M -фазах клеточного цикла.

ДНК - проточпо-цнтофлуоримстричсскап характеристика клеток остеосаркомы.

Нами проведен анализ содержания ДНК в опухолевых клетках у 93 больных с локализованной остеосаркомой. Трос больных с паростальной остсосаркомой и четверо с явными отдаленными метастазами в момент установления диагноза анализируются отдельно. Как следует из данных представленных в таблице 1, у преобладающего большинства пациентов (87%) клетки опухоли содержали анеупло-

идный набор хромосом. В то же время у 12 больных (13%) наблюдались диплоидные остеосаркомы, рис.1. Соотношение между частотой анеугоюидных и диплоидных опухолей в нашей серии больных, в целом, соответствует среднемировым данным.

Таблица 1.

Диплоидные Анеуплоидные Ссылка

28 (29%) 68 (71%) N. Baldini и соавт., 1993

1 (3%) 38 (97%) A. Kreicbergs и соавт., 1994

9(21%) 34 (79%) J. Mankin и соавт., 1985

0 (0%) 19(100%) J. Xiang и соавт., 1987

2(10%) 18(90%) W. Hiddemann и соавт., 1987

2 (4%) 43 (96%) М. Werner и соавт., 1996

8 (29%) 20 (71%) М. Hirata и соавт., 1996

2(13%) 13 (87%) Н. Helio и соавт., 1985

12(40%) 18(60%) К. Kusuzaki и соавт., 1999

12(13%) 81 (87%) И. Трофаила, 2002

Наиболее распространенным видом нарушения содержания ДНК была анеуп-лоидия с индексом ДНК в пределах митотического цикла, рис.2. Такой тип гистограмм отмечен у 45 пациентов (56% от всех анеуплоидных остеосарком).

Рисунок 1. Днплонднаи остсосар-кома. ИДИК=1.0

Рисунок 2. Анеуплоидная остсосар-кома. ИДНК в пределах митотического цикла (1.1-1.8)

Следующей по частоте была многоклоновость опухоли, рис.5. Данный тип распределения ДНК выявлен у 19 больных (23%). Гиперанеуплоидное содержание ДНК в опухолевых клетках встречалось у 16 больных (20%), рис.4. Самым редким видом ансуплондии была тетраплоидия, один больной (1%), рис. 3.

Рисунок 3. Тстраплоиднап остсо- Рисунок 4. Гппсрапсуплоидпаи ос-саркома. ИДИ К (1.9-2.05). тсоспркоия. ИДШ02.1

Рисунок 5. Многоклонопая остсосаркома. ИДПК=1.2, ИДНК=1.7

Клеточный состав в исследованном материале отличался вариабельностью и гетерогенностью. Чаще в опухоли преобладали клоны анеупло-идных клеток, рис. 6. У 20% больных опухоли состояли более чем па 99% из анеуплоидных клеток.

25%

О Диплоидные остеосаркомы □ 10-30% анеуплоидных клеток 53 31-60% анеуплоидных клеток И 61 -98% анеуплоидных клеток ЕЯ 99-100% анеуплоидных клеток

Рисунок 6. Распределение больных в зависимости от процента анеуплоидных клеток в опухоли.

Далее проведен анализ пролиферативной активности опухолевых клеток с учетом их плоидности, таблица 2.

Таблица 2.

Пролифератнвная активность клеток остеосаркомы в зависимости от плоидности. ______

Плоидность п Со/1 Б 02+М ИП

1. Диплоидные 12 82.7±3.1 8.9±1.7 9.3±2 18.2±3.3

2. Апеуплоидные 80 73.5±2 11.9±0.7 15.6±1.2 27.4±1.6

Всего 92 р=0.042 р=0.047 р=0.029 р=0.033

2.1 ИДНК 1.1-1.8 45 73.6±1.9 12.4±0.8 15.4±1.4 27.7±1.9

2.2.Гиперанеуплоидные 16 78.3±2.1 10.8±1.5 10.9±20 21.7±2.8

2.3. Много клоповые 19 69.6±3 12± 1.4 19.6±3.2 31.6±4

п- число больных.

Опухолевые клетки анеуплоидных остеосарком по сравнению с диплоидными характеризовались, в среднем, более высоким индексом пролиферации. Большинство опухолевых клеток в диплоидных остеосаркомах находились в фазе вол. Среди анеуплоидных опухолей, наибольшие значения ИП встречались в группе больных, у которых клетки опухоли имели индекс ДНК в пределах митотического цикла и в группе с многоклоновыми остеосаркомами.

Анализ зависимости ДНК проточно-цитофлуорометрических параметров от наиболее часто используемых клинических и лабораторных характеристик остеосаркомы показал, что наиболее выраженная корреляционная связь существует с объёмом опухоли и темпом её роста, таблица 3. По мере увеличения объёма первичной опухоли достоверно возрастает чистота случаев с выраженными нарушениями плоидности (гиперанеуплоидные остеосаркомы), а также частота много-клоновых опухолей. Наиболее показательными в этом отношении были остеосаркомы, объём которых превышал 1000 см3. Аналогичные закономерности были выявлены при изучении взаимосвязи между индексом ДНК и темпом роста опухоли.

Таблица 3.

Показатели ИДИ К опухолевых клеток с учетом объема н темпов роста первичной опухоли у больных с остеосаркомой._

Признак Индекс ДНК

п 1.0 1.1-1.8 1.9-2.05 >2.1 МК*

Объем опухоли до 500 см3 от 501 до 1000 см3 свыше 1000 см3 48 26 19 6(13%) 4(15%) 2(11%) 26 (54%) 16(62%) 4(21%) 1 (4%) 1 (5%) 8(17%) 1 (4%) 5 (26%) 8(17%) 4(15%) 7 (37%)

Всего 93 12 46 2 14 19

Темп роста до 100 см3/мес. 101-200 см3/мес. > 200 см3/мес. 37 26 30 6(16%) 4(15%) 2 (7%) 21 (57%) 13 (50%) 12(40%) 2 (7%) 6(16%) 4 (15%) 4 (13%) 4(11%) 5 (19%) 10(33%)

Всего 93 12 46 2 14 19

п - число больных, * - многоклоновые опухоли

Прогностическое значение ДНК - проточно-цнтофлуорометрнческнх параметров клеток остсосаркомы.

Прогностическое значение содержания ДНК в клетках опухоли анализировалось в группе, состоящей из больных с локализованной формой заболевания. У 4 больных при поступлении имелись явные метастазы в легкие, поэтому они не были включены в анализ. Помимо этого, для достижения максимальной однородности по типу лечения, ряд больных был исключен в связи со значительными нарушениями терапевтического протокола. Критериями для исключения были отказ от лечения, проведение только предоперационной химиотерапии, только хирургическое или лучевое лечение, а также диагноз паросталыгой остсосаркомы. Таким образом, исследуемая группа состояла из 72 пациентов, получавших комбинированное лечение.

Было изучено прогностическое значение плоидности опухолевых клеток, проведен однофакторный анализ взаимосвязи между характеристиками клеток ос-теосаркомы и отдаленными результатами.

Пятилетняя безметастатическая выживаемость в группе из 12 больных с диплоидными остеосаркомами высокой степени злокачественности составила 19%, по

сравнению с 15%, в группе, состоящей из 61 больного с анеуплоидными опу> лями. Эти различия статистически недостоверны (р>0.05), рис.7.

Ш 10

Диплоидные п=12

Лиеупломдмые п=60

Годы

Рисунок 7. Пптнлетнпп бсзметастатнческап выживаемость больных с тсосаркошой в зависимости от плондностн опухолевых клеток, (п - количес во больных)

Наши данные не позволяют отнести плоидность клеток остеосаркомы к и формативным прогностическим факторам, что, в целом, соответствует даннь мировой литературы. Также не удалось выявить статистически достоверные р; линия в безметастатической выживаемости больных остеосаркомой с учетом и декса ДНК клеток опухоли, рис.8.

Рисунок 8. Пятилетняя бсзмстастатическая выживаемость больных о теосаркомой в зависимости от индекса ДНК. (и - количество больных)

Большей информативностью для прогноза обладали параметры, характеризующие пролиферативнуго активность опухолевых клеток. При изучении прогностической роли этих показателей использовали статистически установленные в клинической онкологии градации (В.II. Богатырёв 1991, 1999). Для количества клеток в Б фазе использована следующая градация: до 7%, от 7 до 14% и свыше 14%. Для фракции клеток в премитотической и митотической фазах (вг+М), использовали градацию: до 10%, от 10 до 20% и свыше 20%. Индекс пролиферации (клетки, находящиеся в Б и Сг+М фазах) разделяли на следующие интервалы: до 17%, от 17 до 34% и свыше 34% клеток опухоли.

Анализ показал, что в группе больных с анеуплоидными остеосаркомами, содержащими менее 7% клеток в Б-фазе, пятилетняя безметастатичсская выживаемости достигает 40%. В то же время при наличии более 14% клеток в этой фазе этот показатель не превышает 10%, рис. 9. Различия между анализируемыми кривыми статистически достоверны (р<0.006).

50 -т

о 40 -£

О 30

0

45

1 20 2

® 10 о

--•I) до 7% п=11

П -2) от7 до 14 % п=33

-3) свыше 14% п=17

Годы

Рисунок 9. Пятилетняя безметастатичсская выживаемость больных с ансуплоиднон остсосаркомои п зависимости от процента клеток в 8 фазе, (п -количество больных)

о

3

4

5

Количество анеуплоидных клеток в премитотической и митотической фазе также достоверно коррелировало с прогнозом заболевания. Наиболее высокие показатели безмстастатической выживаемости можно ожидать среди пациентов, у которых количество клеток в фазе С2+М не превышает 10%, рис. 10.

С? 40

& 30

о

а

| 20 ш Ю о

| и \

'V \ '. \ •

ч \

. • N..... О — — —

••■■о-

►-•1) до 10% п=23

-•□■■•2) от 10 до 20% п=23

—Лг- Э) свыше 20% п=15 Годы

Рисунок 10. Пятилетняя бсзметастатическап выживаемость больных с ансуплопдпон остсосаркомой в зависимости от процента клеток в Сг+М фазе, (п - количество больных)

С другой стороны, обращает на себя внимание вероятность чрезвычайно агрессивного течения заболевания у больных с более чем 20% клеток в премитоти-ческой и митотической фазах. У всех пациентов этой группы генерализации процесса можно ожидать в течение первых двух лет наблюдения. Отмеченные различия в исследуемых группах отличаются высокой статистической достоверностью (р<0.002).

Индекс пролиферации при анеуплоидных остеосаркомах также характеризовался высокой прогностической информативностью. Используя вышеуказанные градации, удалось установить, что при содержании в опухоли менее 17% делящихся клеток, пятилетняя безметастатичсская выживаемость достигала 45%, в то время как при значительном увеличении фракции таких клеток (свыше 34%) прогноз крайне неблагоприятный, и у всех пациентов наступала генерализация в течении первых двух лет наблюдения, рис.11.

50 _ 40 -I 5 зо

о

и а

2 20 К

я

10 -о

1) до 17% п= 13

•□■■•2) от 17 до 34 % п=32

-3) спышс 34% п= 16

0 1 2 3 4 5 Годы

Рисунок 11. Пятилетняя безметастатнчсская выживаемость больных с ансуплонднон остсосаркомон в зависимости от индекса пролиферации опухолевых клеток, (п - количество больных)

Несмотря на небольшое количество больных с диплоидными остеосаркома-ми, проведен анализ прогностического значения показателей пролиферативной активности опухолевых клеток среди больных, у которых опухоль состояла более чем на 90% из диплоидных клеток. Обращает на себя внимание присутствие противоположных тенденций, чем при анеуплоидных остеосаркомах, рис.12.

-1) до 17% п=6

•■■□••■2) спышс 17% 11=6

0 12 3 4 5 Годы

Рисунок 12. Пятилетняя бсзмстастатнчсская выживаемость больных с диплоидной остсосаркомой в зависимости от индекса пролиферации опухолевых клеток, (п - количество больных)

В диплоидных остеосаркомах низкая пролиферативная активность опухолевых клеток ассоциируется с крайне агрессивным течением заболевания. У всех

больных с индексом пролиферации <17% генерализацию процесса можно ожидать в течение первого года наблюдения. Хотя отмеченные различия статистически достоверны (р<0.0001), небольшое количество наблюдений не позволяет считать данную группу достаточно репрезентативной, а выявленные тенденции как истинно отражающие биологию преимущественно диплоидных остеосарком.

Мпогофакторный анализ также показал, что признаки, характеризующие пролиферативную активность клеток остсосаркомы, обладают прогностическим значением. Значения р для каждого из анализируемых признаков представлены ниже:

\) процент клеток в Б-фазе - 0.049

2) процент клеток в фазе вг+М - 0.0061

3) индекс пролиферации - 0.019

Следовательно, наибольшей информативностью в многофакторном анализе обладает процент клеток в прсмитотической и митотической фазах. Суммарные данные проведенного анализа дали р<0.01.

Таким образом, исследование опухолевых клеток с помощью ДНК-проточной цитофлуорометрип позволяет в течении 20-30 мин. получить дополнительную объективную информацию о биологических характеристиках остеосаркомы, важную для клинициста с точки зрения прогноза течения остеосаркомы. Проведенный однофакторный и многофакторный анализы выявил наиболее информативные прогностические признаки. Речь идет о параметрах, характеризующих пролиферативную активность клеток опухоли: количество клеток в Б и С2+М фазах и индекс пролиферации. Наиболее агрессивное течение наблюдалось в группе больных с апеуплоидиыми опухолями с высоким (>17%) содержанием клеток в Б и 02+М фазах. Мы полагаем, что полученные результаты могут быть использованы для улучшения стадирования данного заболевания. Наряду с другими факторами, ДНК - проточно-цитофлуорометрические признаки клеток могут быть включены в различные прогностические модели, направленные на идентификацию уже в момент установления диагноза больных с повышенным риском метастазирования, которым показано изначально более агрессивное лекарственное лечение.

Выводы

1. Использование лазерной ДНК - проточной цитофлуоромстрии объективно подтверждает высокий злокачественный потенциал остеосаркомы. Более 85% опухолей содержат анеуплоидные клетки.

2. Наиболее частым видом нарушения содержания ДНК в остеосаркомах являлась анеуплоидия с индексом ДНК в пределах митотического цикла (56%). Частота ги-перанеуплоидных, тетраплоидпых и многоклоновых опухолей составила 20%, 1% и 23%, соответственно.

3. Анеуплоидные опухолевые клетки остеосаркомы отличаются более высокими показателями пролиферативной активности по сравнению с диплоидными. Индекс пролиферации в анеуплоидных опухолях составлял 27.4±1.6, по сравнению 18.2±3.3% - в диплоидных.

4. Плоидность опухолевых клеток в наибольшей степени коррелирует с объемом опухоли и темпом ее роста. В остеосаркомах с объемом более 1 ООО см3 отмечены наибольшая частота опухолевых клеток с И ДНК более 1.8 (31%) и многоклоновых опухолей (37%). В опухолях с темпом роста, превышающим 200 см3/мес., наблюдалась наибольшая частота многоклоновых остеосарком (33%), по сравнению с 13% - в медленнорастущих опухолях. ИДНК не был достоверно взаимосвязан с полом, возрастом, локализацией, морфологическим вариантом, и с уровнем щелочной фосфатазы в сыворотке крови.

5. У больных остеосаркомой с метастазами первичные опухоли чаще анеуплоидные, а индекс пролиферации их клеток превышает 25%.

6. Индекс ДНК опухолевых клеток не коррелирует с безметастатичсской выживаемостью у больных остеосаркомой.

7. По данным статистического исследования, включая многофакторный анализ, показатели пролиферативной активности остеосаркомы являются высокоипфор-мативными прогностическими критериями. Наибольшую пятилетнюю безметастатическую выживаемость можно ожидать при содержании в опухоли менее 7% клеток в Б-фазе, менее 10% клеток в вг+М фазе и индексе пролиферации не превышающем 17%.

Список работ опубликованных по теме диссертации.

1. Ploidy and proliferative activity of tumor cells for predicting response of preoperative chemotherapy in osteosarcoma (preliminary results). 7lh International Congress on AntiCancer Treatment, 1997, Paris-France, стр.109 (соавт. V. Bogatyrev, V. Sokolova, B. Tailakov, S. Scherbakov, F. Abbasov)

2. The possibilities of Cytologic Diagnosis and DNA Flow Cytometry (DNA-FCM) in Osteosarcoma. Acta cytologica, vol.41, №4, July-August 1997, стр.1218, (соавт. V. Sokolova, V. Bogatyrev, A. Petrova)

3. DNA-flow Cytometry (DNA-FCM) parameters for predicting response of preoperative chemotherapy (PCT) in osteosarcoma (OS). 5lh international conference on the computerized cytology and histology laboratory, Chicago, U.S.A., 1998, стр.21, (соавт. V. Bogatyrev, V. Sokolova, Y. Solovyev).