Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Клиническое значение молекулярных маркеров при папилломавирусной инфекции

На правах рукописи

САБДУЛАЕВА Элина Хакимовна

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ ПРИ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

14.01.01 — Акушерство и гинекология

005049778

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 * ФЕ8 2013

Москва - 2013

005049778

Работа выполнена в ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им И.М. Сеченова Минздрава России

Научный руководитель:

доктор медицинских наук

Роговская Светлана Ивановна

Официальные оппоненты:

Зуев Владимир Михайлович - доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры акушерства и гинекологии № 1 лечебного факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова

Назаренко Татьяна Алексеевна - доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник отделения репродукции Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии

Ведущая организация: ФГБУ Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится « Р^ъ /7/^^^2013 г. в У**/час. на заседании диссертационного совета Д. 208.040.03 при Первом МГМУ имени И.М. Сеченова (119991, г. Москва, ул. Трубецкая дом 8, стр. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в ГНЦМБ Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский пр-т, д. 49)

Автореферат разослан «.2 Л » & / 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор

Шулутко Александр Михайлович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Папилломавирусная инфекция (ПВИ) — самая частая

сексуально-трансмиссивная инфекция, которая встречается у 70% сексуально активных женщин (Bosch F.X., 2003).

Персистирующая онкогенными типами ВПЧ-инфекция может привести к развитию цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН) и раку шейки матки (РШМ) (Peter J.F. Snijders, 2008).

Доказано, что рак шейки матки есть результат многоэтапного процесса опухолевой конверсии на фоне персистирующей инфекции, в течение которого цервикальные интраэпителиальные неоплазии (ЦИН I, II, III) и микроинвазивный рак последовательно сменяют друг друга на протяжении нескольких лет и даже десятилетий. Диагностика и тактика врача в случаях преинвазивного поражения сложны и неоднозначны ввиду высокой вероятности самоэлиминации вируса. Основной вопрос современной медицины — научиться выделять из огромной когорты ВПЧ-инфицированных женщин тех, кто действительно находится в зоне высокого риска прогрессирования процесса.

Общеизвестна прямая связь между ВПЧ-ВР и развитием предраковых состояний и РШМ, однако роль кофакторов опухолевой трансформации изучена недостаточно. Процесс канцерогенеза характеризуется нарастанием молекулярно-генетических повреждений эпителия шейки матки. Некоторые продукты этих повреждений могут стать прогностическими и диагностическими маркерами опухолевой прогрессии и в будущем послужить основой для создания тестовой скрининговой системы или стать объектом таргетной терапии.

Все вышеизложенное определяет актуальность исследований, направленных на поиск молекулярно-генетических маркеров неопластической трансформации, что позволит усовершенствовать алгоритмы обследования и ведения женщин с патологическими процессами шейки матки, ассоциированными с ПВИ, а также индивидуально прогнозировать риск развития цервикальных неоплазий.

Цель исследования: изучение клинической значимости молекулярных маркеров, генов, регулирующих пролиферацию и клеточный цикл, апоптоз,

рецепторный аппарат клеток, онкогенов Еб и Е7 у ВПЧ-инфицированных женщин на основании выявления корреляции между степенью тяжести CIN, ВПЧ-нагрузкой и уровнем указанных маркеров в динамике наблюдения.

Задачи исследования:

1. Изучить клинические особенности разных проявлений ВПЧ-инфекции у женщин с высокой вирусной нагрузкой и частоту прогрессии/регрессии на протяжении 6 - 18 мес. наблюдения.

2. Выявить закономерность изменения уровня экспрессии мРНК маркеров: Е6/Е7, Plö^43, Ki67, CCNB1, BIRC5, MYBL2, ESR1, PGR, BCL2, ВАХ у пациенток с LSIL, HSIL (внутриэпителиальных поражений плоского эпителия слабой и высокой степени) по сравнению с контрольной группой.

3. Сравнить диагностическую эффективность метода ПЦР в реальном времени с использованием отечественных праймеров определяющих вирусную нагрузку, по отношению к международно признанному тесту HCII (Digene).

4. Изучить корреляции между клинической картиной SIL, концентрацией ДНК ВПЧ и уровнем мРНК маркеров: Е6/Е7, P16rNK4\ KÍ67, CCNB1, BIRC5, MYBL2, ESR1, PGR, BCL2, ВАХ, на основании чего оценить возможность прогноза ВПЧ-инфекции до и после лечения.

5. Разработать тактику ведения женщин с различными проявлениями ВПЧ-инфекции с учетом измерения уровня молекулярных маркеров в динамике наблюдения.

Научная новизна

Впервые проведено комплексное обследование женщин с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями шейки матки с определением молекулярно-генетических маркеров Е6/Е7, PIÓ11®43, KÍ67, CCNB1, BIRC5, MYBL2, ESR1, PGR, BCL2, ВАХ. В динамике наблюдения выявлена их прогностическая значимость для оценки риска неопластической трансформации шейки матки. Дана оценка корреляционным связям между степенью тяжести SIL, ВПЧ-нагрузкой и уровнем молекулярных маркеров. Установлены различия в уровне экспрессии мРНК потенциальных биомаркеров в эпителии шейки матки у пациенток с

4

различными вариантами цервикальной интраэпителиальной неоплазии, РШМ и у здоровых женщин. Выявлены маркеры положительной динамики при SIL. На основании полученных данных разработаны рекомендации для использования их в практике.

Практическая значимость

Определены и систематизированы наиболее значимые прогностические молекулярно-биологические факторы клинического течения цервикальной неоплазии. Предложен способ определения групп женщин повышенного риска неопластической трансформации шейки матки. Обозначена целесообразность включения молекулярно-генетических методов исследования в комплекс прогностических маркеров, отражающих возможные пути развития предраковых заболеваний шейки матки. Применение разработанных рекомендаций расширяет возможность их ранней диагностики и предупреждает развитие злокачественных процессов шейки матки.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Большинство случаев HSIL и РШМ сопровождаются экспрессией мРНК Е6/Е7 в сочетании с ВПЧ высокого онкологического риска, выявление которых позволяет определить группу риска по прогрессии процесса.

2. При ЦИН увеличивается экспрессия генов, контролирующих пролиферацию, и уменьшается экспрессия генов, контролирующих апоптоз.

3. Тактика ведения цервикальных интраэпителиальных неоплазий в группе пациенток репродуктивного возраста должна учитывать результаты молекулярно-биологических методов исследования с целью обеспечения дифференцированного подхода к сохранению репродуктивной функции.

Личный вклад соискателя состоит в непосредственном участии на всех этапах исследования, анализе и обобщении полученных результатов. Автором лично проведено общеклиническое обследование, вульвовагиноскопия, расширенная кольпоскопия, забор материала для исследований у всех обследованных женщин, статистическая обработка, научное обоснование полученных результатов.

Внедрение результатов в практику

Результаты исследования используются на курсах по тематическому усовершенствованию врачей на кафедре акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ФППОВ Первого МГМУ им. И.М. Сеченова, а также в практической деятельности врачей акушеров-гинекологов научно-поликлинического отделения ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России.

Работа частично поддержана Государственным контрактом Министерства образования и науки РФ №16.512.11.2093 от 22.02.2011.

Апробация диссертации состоялась на заседании кафедры акушерства, гинекологии, перинатологии и репродуктологии ФППО врачей ГОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова» Минздравсоцразвития России (28.03.2012, протокол №4).

Материалы диссертации доложены на Всемирном конгрессе по вопросам акушерства, гинекологии и бесплодия (BCGIP) (Барселона, Испания, 2012), работа отмечена как лучшая постерная презентация.

Публикации. Опубликовано 19 печатных работ, 2 из которых в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки России.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, содержащего 211 источников, из них 64 отечественных и 147 зарубежных авторов. Работа изложена на 157 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 17 таблицами и 11 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования

Обследовано 140 женщин в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст составил 32 ±8,1 года), обратившихся в научно-поликлиническое отделение НЦАГиП им. В.И. Кулакова с 2009 по 2011 г., у 117 из которых в анамнезе за последний год была обнаружена патология шейки матки SIL (сквамозная интраэпителиальная неоплазия — по терминологии Бетесда или CIN),

б

ассоциированная с ВПЧ, или методом ПЦР были выявлены различные серотипы ВПЧ-ВР. Для решения поставленных задач исследования выделено пять групп: 37 женщин с латентным течением ПВИ (без признаков SIL), 24 женщины с диагнозом «плоскоклеточное интраэпителиальное поражение низкой степени» (LSIL), 36 женщин с диагнозом «плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени» (HSIL), 20 женщин с раком шейки матки, контрольную группу составили 23 женщин без SIL и ПВИ.

Определение ДНК ВПЧ и генотипирование проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием набора реагентов «HPV КВАНТ 21».

Всем пациенткам проведено комплексное обследование, которое включало кольпоскопию, морфологическое исследование с проведением гистологической (по показаниям) или цитологической верификации SIL, определение ВПЧ высокого (16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82-й типы) и низкого (6,11,44-й типы) онкогенного риска.

Для всех видов исследования взятие материала осуществляли из цервикального канала и с поверхности экзоцервикса. Оценку результатов цитологического исследования производили согласно классификационной системе Папаниколау в соотношении с классификацией терминологической системы Бетесда. Гистологическое исследование и расширенную кольпоскопию проводили по общепринятой методике.

Экспрессию мРНК генов определяли методом количественной ОТ-ПЦР (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией) в режиме реального времени («ДНК-технология», Россия).

Уровень вирусного транскрипта Е6/Е7 определяли методом количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени («ДНК-технология», Россия).

Определение физического статуса ВПЧ определяли методом in situ гибридизации, с использованием набора ZytoFast PLUS (Германия).

В качестве меры центральной тенденции всех количественных показателей использовали медиану (Me), в качестве интервальной оценки — нижний (0,25) и

7

верхний (0,75) квартили. Результаты представлены Me (0,25 - 0,75). Достоверность межгрупповых различий количественных показателей определяли с помощью критерия Манна-Уитни, качественных показателей -%2 - критерия с поправкой Йетса для малых выборок. Коэффициент ранговой корреляции определяли по методу Спирмена. Для построения модели риска развития РШМ был выполнен дискриминантный анализ с использованием пакета программ Statistica 8.0 (StatSoft, США). Для оценки эффективности классификации и качества модели был проведен ROC-анализ.

Статистическая обработка полученных данных осуществлялась по общепринятым методикам с помощью пакетов прикладных программ SPSS V.15, Microsoft Excel 7.0 2010.

Результаты исследования и их обсуждение

Все обследованные женщины находились в возрасте от 18 до 55 лет (средний возраст 32,0 ± 8,1 года). Средний возраст обследованных женщин в группе с РШМ - 41,9 ± 6,5 года был значительно выше, чем в остальных группах (31,2 ± 7,3 года) (р < 0,05), что согласуется с данными литературы о высоком риске развития РШМ в возрасте 40 - 55 лет (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2008) (табл. 1).

Таблица 1. Клинические группы больных

№ группы Степень дисплазии Число наблюдений Средний возраст, лет

п %

1 ПВИ 37 22,5 29,5±6,2*

2 LSIL 24 14,6 30,7±9,0*

3 HSIL 36 21,9 31,8±7,3*

4 РШМ 20 12,1 41,9±6,5

5 Контроль 23 14 33,7±6,9*

Всего 140 100 32,0±8,1

* р < 0,05 — статистическая значимость различий с группой РШМ.

Почти все женщины относились к репродуктивному возрастному периоду,

что также подтверждает данные литературы о высоком инфицировании молодых

женщин (Башмакова М.А., Савичева A.M., 1999; Masumoto N. et al., 2004).

Анализ анамнеза обследованных пациенток позволил установить, что

количество половых партнеров более пяти было больше у женщин в группах,

8

ассоциированных с ПВИ по сравнению с неинфицированными, что согласуется с известным мнением о роли большого количества сексуальных партнеров как фактора повышенного риска инфицирования вирусом папилломы человека (Arbyn М„ 2008).

Барьерные методы контрацепции использовались в 86%, чаще в группе с отрицательным результатом на ВПЧ (47,8%), это согласуется с литературными данными, что презервативы не защищают от ВПЧ на 100%, но значительно снижают риск заражения (Winer RL. et al., 2006). Невынашивание беременности и аборты чаще всего встречались в группах с HSIL и РШМ — соответственно 20 (55,5%) и 13 случаев (65%) и значительно реже в контрольной группе 4 случая (17,3%) (р< 0,05).

Нами установлено, что SIL и РШМ наиболее часто наблюдаются у женщин, имеющих в анамнезе эктопию шейки матки, особенно пролеченные деструктивными методами лечения, что позволяет считать данные методы мало приемлемыми для лечения заболеваний шейки матки.

В целом не было найдено статистически значимых различий по гинекологическим заболеваниям. Отмечено, что заболевания шейки матки, гинекологическая патология, характеризующаяся гиперэстрогенией (миома матки, эндометриоз) и инфекциями передающимися половым путем (ИППП), несколько чаще встречаются в группах, ассоциированных с SIL и ПВИ.

Одним из основных методов диагностики патологии шейки матки является кольпоскопия, по мере усугубления тяжести SIL кольпоскопическая картина менялась в сторону более атипичных изменений, что подтверждается многочисленными исследованиями (Минкина Г.Н. и соавт., 2001; Franco E.L. et al., 2001).

Критерием отбора женщин в группы HSIL и LSIL был подтвержденный цитологический и (или) гистологический диагноз HSIL или ЦИН II - III и LSIL или ЦИН -1 и плоская кондилома (субклиническая форма ВПЧ-инфекции).

Результаты ВПЧ-тестирования. Исследование общей распространенности

типов ВПЧ выявило значительную долю женщин (46%), инфицированных 16-м

9

типом (р < 0,05). Остальные типы по частоте распространенности распределились следующим образом (в порядке убывающей частоты): 31, 58, 52, 45, 33, 39, 66, 18, 56,68,44,51,73,35,53,59,82.

Микст-инфекция несколькими типами ВПЧ характерна для населения европейской и центральной части России, где ее встречаемость составляет 54% (Евстигнеева Н.П., 2007, Золотоверхая Е.А. и соавт., 2007). В нашем исследовании в 49,5% случаев ВПЧ был представлен одним типом вируса. Множественная папилломавирусная инфекция была характерна почти одинаково для групп латентной ПВИ и ЬБ1Ь (по 46%) и отмечена несколько чаще в группе Н81Ь 58%. Наиболее распространенными были типы филогенетических групп а9 (16, 31, 58, 52, 33, 35-й типы) и а7 (45, 39, 18, 68, 59-й типы). При анализе распределений генотипов по группам отмечена прямая корреляционная зависимость между выявлением в цервикальном эпителии ВПЧ 16-го типа и степенью тяжести 81Ь. В группе НБШ 16-й тип ВПЧ резко преобладал над другими типами у 26 (72,2%) женщин, тогда как при Ь81Ь выявлен только у 6 (25%) женщин (Р < 0,01). Показано, что спонтанная элиминация вируса ниже, а риск прогрессии выше в случаях ВПЧ-инфекции с более высокой вирусной нагрузкой (МоЬе^ М. е! а1., 2005, гЬао Р.Н. е1 а!., 2009), другие авторы не находят такой ассоциации (ЬШо р.В. е1 а1., 2005). В нашем исследовании вирусная нагрузка в группе с ПВИ составила 0,4 (7,8 х 10'3 - 11) копии вируса на клетку, в группе с Ь81Ь — 0,7(0,1-29) копии вируса на клетку, в группе с НБ1Ь была достоверно выше, чем при ВПЧ - носительстве (р = 0,01) и составила 4 (2 - 10) копии вируса на клетку (рис. 1).

ИБП 1.511.

------- о

ВПИ В»»" 0,4

1 3 4

Рис. 1. Вирусная нагрузка в группах с ПВИ ЬБ1Ь и Н81Ь (п = 97)

Ю

Таким образом, вирусная нагрузка была ассоциирована со степенью ЦИН, что согласуется с литературными данными (Комарова Е.В., 2010; Moberg М. et al., 2005). Вместе с тем интервалы (0,25 - 0,75) величины вирусной нагрузки в мазках без и с цитологическими изменениями перекрывались в верхнем диапазоне, что свидетельствует о том, что вирусная нагрузка, как единственный маркер определения риска неопластической трансформации, малоинформативна.

Наиболее часто патологическая кольпоскопическая картина в виде АЗТ (атипическая зона трансформации) была ассоциирована со следующими типами ВПЧ-ВР: 52-й тип — 11 (91,6%), 58-й тип — 13 (81,2%), 33-й тип — 8 (80%), 35-й тип — 4 (80%), 18-й тип — 7 (77,7%), 16-й тип — 32 (71,1%), 44-й тип — 5 (71,4%), 66-й тип — 7 (70%) (р < 0,05).

Полученные данные подтверждают ведущую роль ВПЧ в индукции вирус-ассоциированных изменений в цервикапьном эпителии.

Сопоставление SIL с ВПЧ-статусом. Известно, что интеграция ВПЧ является необходимым, но не достаточным механизмом канцерогенеза.

Методом хромогенной гибридизации in situ (CISH) 35 женщинам был определен статус ВПЧ 16, 18, 31, 33 и 35-го типов.

Все 14 (100%) женщин из группы HSIL оказались с интегрированным вирусом. У 1 женщины было сочетание интегрированного вируса с эписомальной формой. У всех 6 (100%) женщин из группы LSIL ВПЧ был в эписомальной форме. В группе с ПВИ у 8 (88,8%) женщин вирус был в эписомальной форме и у 1 (11,1%) в интегрированной (табл. 2). При динамическом наблюдении данной пациентки через 12 мес. диагностирована персистенция ВПЧ. В контрольной группе у всех женщин вирус был в эписомальной форме.

Таблица 2. Статус ВПЧ в группах с ПВИ, LSIL, HSIL и контрольной

Статус ВПЧ ПВИ п = 9 LSIL /7 = 6 HSIL /7= 14 Контроль /7 = 6

Эписомальный 8 (88,8%) 6(100%) - -

Интегрированный 1 (11,1%) - 14 (100%) -

Смешанный - - 1 (7,1%) -

Полученные данные подтверждают, что интеграция ВПЧ в геном клетки человека является первым шагом к опухолевому перерождению вирус-инфицированной клетки и важным прогностическим показателем, однако требуются дальнейшие исследования с длительным наблюдением.

Определение экспрессии мРНК Е6. Е7 ВПЧ 16-го типа. Вирусные транскрипты Е6/Е7 — предшественники вирусных белков Е6 и Е7. Установлено, что два ранних гена, Е6 и Е7, являются онкогенами. При интеграции ДНК-вируса активируется синтез белков Еб и Е7. Из этого следует, что наличие онкобелков Е6 и Е7 в пробах из опухоли может рассматриваться как свидетельство высокого риска вирус-интегрирования.

Таким образом, измерение уровня онкобелков Е6 и Е7 позволяет уточнить характер вирусной инфекции, ее обратимость и потенциальную возможность злокачественной трансформации в случае интеграции ВПЧ в клеточный геном.

В нашем исследовании экспрессия вирусных мРНК Е6/Е7 зафиксирована: в группе с ПВИ в 6 (46%) из 13 случаев; в группе с Ь51Ь в 4 (50%) из 8 случаев; в группе с НБ1Ь в 21 (87,5%) из 24 случаев; в группе с РШМ в 9 (90%) из 10 случаев. В контрольной группе ни в одном случае не было выявлено наличие мРНК Е6/Е7. (табл. 3).

Таблица 3. Частота определения онкомаркера Е6/Е7 при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и инвазивном раке шейки матки_

Группа исследования N Е6/Е7 (+) Е6/Е7 (-)

абс/% абс/%

ПВИ 13 6/46,1 7/58,8

LSIL 8 4/50 4/50

HSIL 24 21/87,5* 3/12,5

РШМ 10 9/90* 1/10

Контрольная 23 - 23/100

Примечание: *р < 0,05.

Общий уровень экспрессии мРНК Е6/Е7 в группе с HSIL составил 350 (0 -1300) относительных единиц (o.e.) и был выше (р = 0,003), чем в группе с ПВИ — 0 (0 - 57) o.e. Данные по группам LSIL и РШМ не приведены из-за малочисленности выборок.

Экспрессия мРНК Е6/Е7 умеренно коррелировала с вирусной нагрузкой (rS = 0,61, р = 1,8 х 10 ~ 5). Выявлены сильные и умеренные положительные корреляции Е6/Е7 с уровнем экспрессии мРНК маркеров пролиферации и регуляции клеточного цикла Ki67 (rS = 0,73,р = 2,9 х 10 "9), CCNB1 (rS = 0,73,p = 4,1 х Ю-8), BIRC5 (rS = 0,61, р = 9,6 хЮ"7), MYBL2 (rS = 0,54, р = 5,6 х Ю"4), P16INR4a (rS = 0,40, р = 3,2 х 10"2), что соответствует современным представлениям о влиянии вирусных транскриптов Е6 и Е7 на клеточный цикл посредством взаимодействия с pRB и р53, приводящего к гиперпролиферации клеток.

Экспрессия белков Е6/Е7 коррелирует со степенью тяжести SIL и является важным диагностическим критерием неблагоприятного прогноза развития интраэпителиальных неоплазий шейки матки, требующим углубленной диагностики и мониторинга. Следовательно, обнаружение Е6/Е7 мРНК может иметь более высокую прогностическую ценность и значение по сравнению с ДНК ВПЧ- тестированием.

Определение экспрессионного профиля функционального комплекса генов человека. В качестве маркеров, описывающих функциональное состояние клеток, были выбраны гены, регулирующие пролиферацию и клеточный цикл (Ki67, CCNB1, BIRC5, AURKA, MYBL2, CDKN2A, NDRG1), инвазию (CTSL2), апоптоз (BCL2, ВАХ, BAG1), рецепторный аппарат клеток (ESR1, PGR, CD68), опухолевый супрессор PTEN, теломеразу, стабилизирующую хромосомы (TERT), ген детоксикации GSTM1, а также PTGS2 (синтез простагландинов), SCUBE (сигнальный пептид с неизвестной функцией). В соответствии с полученными результатами часть из этих генов не представляла клинического значения и практического интереса в рамках настоящей работы, в связи с чем мы остановились на более значимых и информативных генах.

Из пула изученного материала нами были выбраны гены, регулирующие пролиферацию и клеточный цикл [Ki67, CCNB1, BIRC5 (сурвирин), MYBL2, Р 16iNR4aj) апоптоз (BCL2, ВАХ), рецепторный аппарат клеток (ESR1, PGR).

По результатам нашего исследования:

> в группе латентной ПВИ выявлено достоверное повышение экспрессии мРНК Ki67 (р = 1,3 х 10 ~3) — в 2,6 раза по сравнению с контрольной группой;

> в группе LSIL отмечено достоверное повышение экспрессии мРНК р ] gINR4a — в 6 раз (5,1, Е-03), KÍ67 — в 2,2 раза (р = 2,3, Е-02) соответственно по сравнению с контрольной группой;

> в группе HSIL выявлено достоверное повышение не только KÍ67 — в 4,7 раза (р = 5,1 х 10 "6) и Pió™1142 — в 8,3 раза (р = 5,0 х 10 "5), но и других маркеров пролиферации и инвазии: MYBL2 — в 4 раза (р = 1,0 х 10 "4), CCNB1, BIRC — в 1,5-2 раза, а также достоверное снижение BCL2 — в 1,2 раза;

> при РШМ отмечено повышение маркеров пролиферации еще более значимо: KÍ67 — в 14 раз, Р16 Ша-в9 раз, MYBL2, CCNB1, BIRC5 — в 3 - 4 раза. При этом происходит значительное понижение экспрессии мРНК эстрогенового (ESR1) и прогестеронового (PGR) рецепторов в 34 и 45 раз соответственно, а также BCL2, В АХ соответственно в 5,4 и 2,5 раза по сравнению с контрольной

группой (табл. 4).

Таблица 4. Статистически значимое изменение уровня маркеров по сравнению с контрольной группой (р < 0,05)_____

Группа | ПВИ | LSIL | HSIL | РШМ

Маркеры регулирующие пролиферацию и клеточный цикл

KÍ67 ТВ 2,6 раза t В 2,2 раза Т В 4,7 раза . Т В 14 раз

Р16 ТВ 6раз Т В 8,3 раза Т В 9 раз

ЦиклинВ t В 1,5 раза Т В 3 раза

BIRC5 Т В 2 раза Т В 4 раза

MYBL2 Т В 4 раза Т В 3 раза

Маркеры, регулирующие апоптоз

BCL2 | В 1,2 раза | В 5,4 раза

ВАХ i В 2,5 раза

Рецепторный аппарат клеток

PGR J. В 45 раз

ESR1 1 В 34 раза

Следует отметить высокий уровень корреляции трех маркеров пролиферации Кл67, ССЫВ1 и ВЖС5 при попарных сравнениях (гБ = 0,77 - 0,82, р < 0,05), а также эстрогенового и прогестеронового рецепторов (гБ = 0,76,р=х10~5).

14

Полученные в ходе эксперимента данные согласуются с литературными данными и соответствуют ожидаемым и прогнозируемым в начале исследования результатам (Хунова JI.3., 2011; Gatta L.B., et al., 2011; Serbye S.W., et al., 2011; Kwasniewska A., 2011 и др.).

Таким образом, на фоне вирусной инфекции активность исследованных генов, регулирующих пролиферацию и клеточный цикл (Ki67, CCNB1, BIRC5, MYBL2, Pie"®4"), возрастает по мере роста степени тяжести SIL с максимальными показателями в РШМ. Анализ количества мРНК генов, контролирующих апоптоз (BCL2, ВАХ), показал, что в отличии от генов, активирующихся при процессах пролиферации, их активность снижается.

При проведении комплексных исследований генов неоднозначен вопрос об интерпретации полученных результатов. Эта проблема может быть решена с помощью методов многофакторного анализа с построением модели, позволяющей оценить функциональное состояние тканей.

На основании экспериментальных данных при сравнении женщин с РШМ и условно-здоровых женщин без изменений переходного эпителия шейки матки нами были получены соотношения уровня мРНК с повышенной и пониженной экспрессией генов и построена математическая модель, позволяющая вычислить значение канонической линейной дискриминантной функции (КЛДФ). Для каждого клинического образца с помощью ROC-анапиза было выбрано пороговое значение (точка cut-off). Значения показателей КЛДФ выше cut-off классифицировали как маркер повышенного риска неопластической трансформации.

В качестве примера выбрана модель, описывающая соотношение уровней экспрессии четырех генов: Ki67, Pie11^43, PGR и ВАХ.

Значение функции было определено по формуле:

у = 1,2 х lg (Р16т4а)/(ВАХ) - 1 х lg (PGR)/(Ki67) - 1, где (PGR)/(Ki67) -отношение уровней экспрессии мРНК прогестеронового рецептора и Ki67;

(pl6iNR4ay(BAX) _ отношение уровней экспрессии мРНК Р^1™43 и ВАХ.

При значении функции выше 0 риск неопластической трансформации был определен, как высокий. Результаты рассчитанных значений функции приведены на рисунке 2. Все пациентки контрольной группы и пациентки с РШМ по результатам классификации были определены в свои группы. Только 1 (4%) из 23 пациенток с ПВИ была определена в группу риска развития рака шейки матки. У данной пациентки определено сочетание семи типов вируса высокого онкогенного риска, включая ВПЧ 16-го типа. При общей невысокой суммарной вирусной нагрузке (две копии вируса на клетку) была определена повышенная экспрессия вирусной мРНК Е6/Е7 (свыше 10 ООО относительных единиц).

Из 24 пациенток с Ь81Ь 4 (16,6%) были определены в группу высокого риска неопластической трансформации. Во всех четырех случаях выявлен ВПЧ высокого онкогенного риска, в двух случаях сопровождавшийся экспрессией вирусной мРНК Е6/Е7, в двух других случаях исследование на наличие вирусной мРНК не проводилось.

КЖ Ж Ж Ж ~Ж.......................... Ш—......—

-6 -5 -4 -3 -2 -1 О 1 2 3 Л

Значение функции

©контроль «РШМ А ПВИ X LSIL Ж HSIL

Примечание: * Экспериментально полученные значения функции для мазков цервикапьного канала женщин с РШМ, HSIL, LSIL, ВПЧ-носительсгвом и здорового контроля. По оси X отложено значения функции, по оси У-группа исследования.

Рис. 2. Дискриминация между нормальным и патологическим эпителием по значению функции, описывающей активность четырех генов KI67, Р16 а, PGR и В АХ

В группу высокого риска неопластической трансформации были

определены 10 (27%) пациенток из 37 с HSIL. Во всех 10 случаях выявлен ВПЧ

высокого онкогенного риска, в 9 (90%) случаях сопровождавшийся высоким

16

уровнем экспрессии вирусной мРНК Е6/Е7 (Ме = 13 ООО o.e.), в одном случае исследование на наличие вирусной мРНК не проводилось (рис. 2). Всем пациенткам выполнена эксцизия или аблация шейки матки.

Данную модель мы можем использовать для оценки риска SIL и РШМ, однако требуются дополнительные наблюдения.

Сравнение Digene-TecTa и ПЦР-РТ. Digene-TecT, основанный на методе «гибридного захвата», часто называют «золотым стандартом» диагностики ПВИ. Digene-TecT позволяет выявить клинически значимое количество вируса папилломы, имеет высокую чувствительность, прогностическую ценность, однако не позволяет дифференцировать тип ВПЧ и достаточно дорогой (Бебнева Т.Н., 2007; Didelot M.N., Boulle N., 2011). Указанных недостатков лишен метод ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РТ), позволяющий определить количество ДНК клинически значимых типов ВПЧ в образце.

С помощью корреляционного анализа Пирсона мы провели сравнение методов, определяющих вирусную нагрузку: Digene и ПЦР-РТ.

Чувствительность диагностики ВПЧ методом ПЦР-РТ по отношению к Digene составила 92%, а специфичность — 100%.

Полученные результаты показали, что тест ПЦР-РТ почти не уступает Digene- тесту. Его преимуществом является возможность определения типов ВПЧ, что имеет немаловажное значение, так как опасность мапигнизации представляет именно хроническая персистентная форма инфекции с носительством одного типа ВПЧ.

Результаты контрольных исследований. Через 6-18 месяца после лечения (или без лечения) 55 женщинам проведено обследование, которое включало цитологическое исследование мазков из шейки матки, определение ВПЧ-ВР и мРНК генов Ki67, CCNB1, BIRC5, MYBL2, P16INR4a, BCL2, ВАХ, ESR1, PGR. В группе HSIL было 18, в LSIL — 21 и в группе с ПВИ — 16 женщин.

В первой группе всем женщинам было проведено хирургическое лечение: ампутация шейки матки была у 11 (61,1%) женщин, эксцизия — у 5 (27,7%) и конизация — у 3 (16,6%). После лечения диагноз HSIL, ассоциированный с ВПЧ,

17

сохранялся в 2 (11%) случаях (после эксцизии шейки матки). Таким образом, хирургическое лечение для элиминации ВПЧ оказалось эффективным в 89% случаев. У 2 (11%) пациенток цитологический диагноз изменился на более благоприятный ЬБ1Ь без ВПЧ. Цитология после лечения была в норме у 14 (77,7%).

Таблица 5. Исход заболевания через 6-18 мес (абс/%).

Группы ПВИ («=16) ЬБ1Ь (и = 21) Ш1Ь («=18)

Исход ВПЧ+ ВПЧ- ВПЧ+ впч- ЬБ1Ь ВПЧ+ ВПЧ- НЭП,

Всего 10/62,5 6/37,5 14/78 7/33 3/14 2/11 16/89 2/11 2/11

Хирургические методы лечения в случае Н81Ь оказались эффективными на 77,7% для полного исключения патологического процесса на шейки матки, на 11% — для улучшения состояния шейки матки, в 89% случаев способствовали элиминации ВПЧ, что было выявлено к периоду 6-18 мес. наблюдения.

Пациенты группы с ПВИ и ЬБ1Ь наблюдались без лечения. В группе с у 3 (14,2%) женщин через 6-12 мес. сохранился диагноз Ь81Ь, ассоциированный с ВПЧ. У остальных 18 (85,7%) женщин цитологические заключения были нормальными. В 14 (66,6%) случаях ВПЧ был сохранен. Во второй группе элиминация ВПЧ произошла в 7 (33,3%) случаях. Ухудшения не было ни в одном случае.

В группе с ПВИ ВПЧ сохранился у 10 (62,5%) женщин. Не было ни одного случая ухудшения, т.е. цитология во всех 16 (100%) случаях была нормальной. В 37,5% случаев произошла элиминация вируса (табл. 5).

В целом через 6-18 мес. почти в 50% случаев без лечения произошла элиминация ВПЧ в группе ЬБ1Ь и ПВИ. За этот срок значительно улучшились морфологические показатели в группе с ЬБ1Ь (на 85,7%).

Несмотря на большой процент персистенции ПВИ, вирусная нагрузка через 6-18 мес. значительно снизилась. В группе с и ПВИ в начале исследования

среднее значение вирусной нагрузки было 198 и 17,7 копии вируса на клетку, через 6-18 мес. — 9,75 и 0,93 копии вируса на клетку соответственно. Таким образом, вирусная нагрузка в группе с Ь81Ь и ПВИ снизилась почти в 20 раз, что позволило отметить тенденцию к элиминации вируса (рис. 3).

Известно, что в большинстве случаев ВПЧ элиминируется самостоятельно в среднем в течение 2-х лет (Роговская С.И., 2007; ЗсЫГйпап М. е1. а1., 2003). Сохранение ВПЧ у большого количества женщин в группах ЬБ1Ь и ПВИ возможно, объясняется не большим сроком их наблюдения во время нашего исследования.

лаа_

200 - ^ ,-----

150

100 -

50 - 9,75 17<7 о ЧЧ ............. .««шшшш ..................._

О К--»---1--Г --Г

1.511 в начале 1511. через б- ПВИ в ПВИ через 618 мес. начале 18 мес.

Рис. 3. Вирусная нагрузка в начале и через 6-18 мес.

Через 6-18 мес. наблюдения женщинам из групп НЭП, (и = 18) и ЬБ1Ь (п = 21) повторно определили экспрессию мРНК генов: Кл67, ССЫВ1, В111С5, МУВЬ2, Р16шк4а, Е8Ш, РвЯ, ВСЬ2, В АХ. Проведено сравнение экспрессии мРНК генов после полного или частичного выздоровления женщин. Обнаружено, что некоторые маркеры почти не изменили свои первоначальные значения. Мы полагаем, что им требуется более длительный срок для восстановления. Тем не менее экспрессия других генов существенно изменилась, что отражено в табл. 6.

При сравнении средних значений экспрессии мРНК генов до и после лечения получены следующие результаты. После лечения по поводу Н81Ь снижается экспрессия маркеров пролиферации и регуляторов клеточного цикла РвЯ, МУВЬ2, ЕБШ, Р16ГЫ1Ма в 18, 15, 10, 3 раза соответственно. При Ь81Ь уровень тех же маркеров снизился в 5, 8, 5, 2 раза соответственно. Маркер

апоптоза ВАХ в обоих группах SIL снизился в 2 раза. Остальные маркеры изменились незначительно.

Таблица 6. Уровень мРНК генов в динамике наблюдения в группах с SIL через 6 -18 мес. наблюдения_

мРНК генов HSIL LSIL

до лечения после лечения до лечения после лечения

ВАХ 3,61 1,43 (р < 0,05) 3,07 1,03 (р < 0,05)

MYBL2 7,72 0,08 (р < 0,05) 0,65 0,05 (р < 0,05)

р161М«а 1,25 0,11 (р < 0,05) 0,7 0,16 (р< 0,05)

При наблюдении женщин через 6-18 мес. после лечения или без него наиболее значимые показатели положительной динамики при HSIL и LSIL отмечены в отношении маркеров ESR1, MYBL2, PGR, P16INR4a, ВАХ. Учитывая, что уровень маркеров ESR1 и PGR может быть снижен и при РШМ, мы посчитали целесообразным исключить их из этой группы.

Клиническое наблюдение в динамике показало, что снижение экспрессии мРНК генов пролиферации, регуляторов клеточного цикла (MYBL2, Plö1^43), апоптоза (ВАХ) было ассоциировано с положительной динамикой при SIL, ассоциированным с ПВИ, основным показателем которой были положительные изменения в гистологической структуре слизистой оболочки шейки матки.

Таким образом, по результатам собственных исследований нами установлены различия в уровне экспрессии мРНК потенциальных онкомаркеров в эпителии шейки матки у пациенток с различными вариантами цервикальной интраэпителиальной неоплазии, РШМ и здоровых женщин.

Поиски высокоспецифических и прогностически значимых маркеров неопластической трансформации эпителия активно ведутся в различных направлениях. Однако говорить о наличии в арсенале клинициста метода, способного выступать в качестве абсолютного и достоверного лабораторного критерия дифференциации транзиторного носительства ВПЧ и прогрессирующего процесса опухолевой трансформации ВПЧ-инфицированных клеток, преждевременно. Тем не менее, применение современных молекулярно-

го

биологических методов исследования для диагностики эпителиальной дисплазии шейки матки, несомненно, имеет практическое значение и может служить основанием для более детального клинического исследования пациентов, а полученные нами данные являются предпосылкой для дальнейших исследований на большом клиническом материале.

ВЫВОДЫ

1.К факторам риска развития ВПЧ-ассоциированных интраэпителиальных поражений (SIL) относятся частая смена половых партнеров, деструктивные методы лечения шейки матки в анамнезе, невынашивание беременности, нерегулярное использование барьерной контрацепции, аборты.

2. Доминирующим типом ВПЧ-ВР у обследуемых женщин является ВПЧ 16-го типа. Частота идентификации доминирующего типа возрастает по мере увеличения степени тяжести SIL от 25% при LSIL до 72,2% при HSIL. В порядке убывающей частоты выявляются ВПЧ 16, 31, 58, 52, 45, 33, 39, 66, 18, 56, 68, 51, 73, 35, 59, 82-го типов, при этом в 49% случаев ВПЧ представлен одним типом вируса, в 5% отмечается сочетание от двух до шести типов.

3. Метод ПЦР в реальном времени (ПЦР-РТ) с отечественными праймерами можно считать достаточно валидированным по отношению к Digene-Tecry, признанному за рубежом, как стандарт ВПЧ-теста (г = 0,521, р = 0,002). Его преимуществом является возможность одновременного генотипирования ВПЧ и финансовая доступность.

4. Элиминация ВПЧ в группах ПВИ и LSIL произошла через 6-18 мес наблюдения у 35% женщин без лечения, при этом у 82,7% женщин с LSIL нормализовались цитологические показатели. Вирусная нагрузка по данным ПЦР-РТ в группе LSIL и ПВИ снизилась в среднем в 20 раз (р < 0,05), что подтверждает значимость оценки вирусной нагрузки в клинической практике.

5. В образцах HSIL выявлен повышенный уровень экспрессии комплекса маркеров Ki67, P16INR4a, MYBL2, BIRC5 соответственно, а также достоверное снижение BCL2 по сравнению с контрольной группой (р < 0,05). При РШМ

21

отмечено более выраженное повышение маркеров пролиферации Ki67, P16INR4a, MYBL2, CCNB1, BIRC5. При этом выявлено значительное понижение экспрессии мРНК эстрогенового и прогестеронового рецепторов, а также BCL2, ВАХ по сравнению с контрольной группой (р < 0,05).

У женщин с LSIL достоверно повышены показатели Ki67, и Р16INR4a По сравнению с женщинами контрольной группы (р < 0,05). При латентном течении ПВИ выявлено достоверное повышение экспрессии мРНК Ki67 (р < 0,05).

Снижение экспрессии мРНК MYBL2, Р16INR4a и ВАХ коррелировало с положительной клинической динамикой при SIL (р < 0,05), что позволяет считать указанные маркеры прогностическими для неблагоприятного течения неоплазии, однако требует дополнительных исследований на больших популяциях.

6. Вирусная нагрузка по данным ПЦР-РТ повышается с ростом степени тяжести SIL, при этом в группе с ПВИ она составила 0,4 (7,8 х 10 ~3 - 11) копии вируса на клетку, в группе с LSIL — 0,7 (0,1 - 29) копии вируса на клетку, в группе с HSIL — 4 (2 - 10) копии вируса на клетку, что достоверно выше, чем при ВПЧ-носительстве и LSIL (р = 0,01).

7. Отмечен более высокий уровень экспрессии мРНК Е6/Е7 в цервикапьном мазке у женщин с HSIL и РШМ (87,5 и 90% соответственно) по сравнению с LSIL (50%) (р < 0,05), что подтверждает диагностическую ценность данного маркера в ситуации неблагоприятного течения неоплазии шейки матки, которая требует адекватного мониторинга. Отсутствие экспрессии мРНК Е6/Е7 даже при наличии морфологических признаков дисплазии может быть критерием благоприятного прогноза и возможности использования консервативных методов ведения.

8. Многофакторный анализ позволяет предложить способ определения групп повышенного риска неопластической трансформации шейки матки по представленности мРНК генов Ki67, P16INR4a, PGR и ВАХ в клетках переходного эпителия цервикального канала, при этом значение функции может быть определено по формуле у = 1,2 х lg (P16INR4a)/(BAX) - 1 х lg (PGR)/(Ki67) - 1. При значении функции выше 0 риск неопластической трансформации повышен.

9. Использование физиохирургических методов лечения при HSIL в 77,7% способствовали нормализации морфологических (цитологических) показателей шейки матки и в 11% привели к регрессии HSIL до LSIL, а в 89% случаев способствовали элиминации ВПЧ, что свидетельствует о высокой эффективности.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В группу риска следует включить женщин с частой сменой половых партнеров, деструктивными методами лечения шейки матки в анамнезе, невынашиванием беременности, не регулярным использованием барьерной контрацепции и абортами.

2. Тест с определением экспрессии мРНК Е6/Е7 рекомендуется в качестве дополнительного обследования групп высокого риска развития РШМ, в случае мазков типа ASCUS/LSIL как метод триажа, а также для женщин старше 30 лет. При положительном тесте необходимо применение опережающих видов диагностики и терапии.

3. Для определения групп повышенного риска развития рака шейки матки при SIL и носительстве вируса папилломы человека (ВПЧ) в клинической практике целесообразно определять уровень экспрессии мРНК четырех генов: Ki67, P16INR4\ PGR и ВАХ. При уровнях указанных показателей выше порогового значения следует отказаться от пассивного наблюдения, отдавая предпочтение более активным методам лечения, сокращая интервалы динамического наблюдения.

4. Маркерами положительной динамики SIL при наблюдении женщин являются снижение экспрессии маркеров MYBL2, P16INR4a, ВАХ. Их рекомендуется использовать в сомнительных клинических ситуациях с мазками типа ASCUS/LSIL или при кольпоскопической картине типа НАЗТ (низкоатипическая зона трансформации).

5. При состояниях типа HSIL показаны хирургические методы лечения шейки матки с эксцизией участка измененного эпителия.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Роговская С.И., Бебнева Т.Н., Акопова Е.С., Прилепская В.Н., Сабдулаева Э.Х Сравнение ПЦР и Digene теста в диагностике цервикальной неоплазии // Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия: сб. материалов III междисц. научно-практ. конф. - М., 2010. - С. 10.

2. Роговская С.И., Бебнева Т.Н., Акопова Е.С., Прилепская В.Н., Сабдулаева Э.Х. ПЦР и Digene-TecT в диагностике цервикальной неоплазии // Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний: материалы XXIII междунар. конгр. с курсом эндоскопии. - М., 2010. - С. 243.

3. Сабдулаева Э.Х., Роговская С.И., Бурменская О.В., Непша О.С., Трофимов Д.Ю. Молекулярные маркеры в диагностике цервикальной неоплазии шейки матки // Мать и дитя: материалы XI Всерос. научного форума. - М., 2010. - С. 466.

4. Оламова А.О., Роговская С.И., Бебнева Т.Н., Межевитинова Е.А., Ледина A.B., Сабдуллаева Э.Х. Аргоноплазменная аблация при лечении патологии шейки матки // Мать и дитя: материалы XI Всерос. научного форума. - М., 2010. - С. 127.

5. Коган Е.А., Файзулина Н.М., Ежова Л.С., Демура Т.А., Сабдулаева Э.Х., Роговская С.И. Оптимизация цитологической диагностики патологии шейки матки // Мать и дитя: материалы XI Всерос. научного форума. - М., 2010. - С. 402 - 403.

6. Екимов А.Н., Квасцов A.B., Файзулин Л.З., Муллабаева С.М., Трофимов Д.Ю., Сабдулаева Э.Х., Роговская С.И. Сравнение эффективности количественной диагностики ВПЧ методами Digene и ПЦР в реальном времени // Мать и дитя: материалы XI Всерос. научного форума. - М., 2010. - С. 368.

7. Сабдулаева Э.Х., Роговская С.И., Назарова Н.М, Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Непша О.С., Екимов А.Н., Бадалова Л.А. Генотипирование ВПЧ у женщин с различными проявлениями ПВИ шейки матки // Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы: материалы Всерос. конгр. — М., 2011. — С. 318 — 319.

8. Оламова А.О., Коган Е.А., Ежова Л.С., Назарова Н.М„ Межевитинова Е.А., Роговская С.И., Сабдулаева Э.Х., Бадалова Л.А. Диагностическая информативность множественной биопсии шейки матки // Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы: материалы Всерос. конгр. - М., 2011. - С. 291 - 292.

9. Бадалова Л.А., Роговская С.И., Акопова Е.С., Сабдулаева Э.Х., Оламова А.О. Оценка эффективности стратегий диагностики цервикальных интраэпителиальных поражений // Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы: материалы Всерос. конгр. - М., 2011. - С. 117-118.

10. Коган Е.А., Файзулина Н.М., Ежова Л.С., Демура Т.А., Роговская С.И., Сабдулаева Э.Х. Регуляторная роль СОХ2 в прогрессировании ЦИН и микроинвазивного РШМ // Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы: материалы Всерос. конгр. - М., 2011. - С. 120 - 121.

11. Сабдулаева Э.Х., Роговская С.И., Назарова Н.М., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Непша О.С., Екимов А.Н., Оламова O.A. Выявляемость генотипов ВПЧ при

предраковой патологии шейки матки // Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия IV междисц. научно-практ. конф. - M., 2011. - С. 69 - 70.

12. Бадалова JI.A., Роговская С.И., Акопова Е.С., Сабдулаева Э.Х., Оламова А.О. Оценка клинико-экономической эффективности диагностики CIN // Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия IV междисц. научно-практ. конф. - М., 2011. - С. 11-12.

13. Оламова А.О., Роговская С.И., Коган Е.А., Ежова Л.С., Назарова Н.М., Сабдулаева Э.Х., Бадалова JI.A. Оценка эффективности множественной биопсии шейки матки // Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия IV междисц. научно-практ. конф. - M., 2011. - С. 61.

14. Шубина Е.С., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Непша О.С., Роговская С.И., Сабдулаева Э.Х., Сухих Г.Т. Маркеры предраковых состояний шейки матки // Проблемы фундаментальных и прикладных естественных и технических наук в современном информационном обществе. Молекулярная и биологическая физика: сб. трудов 54-й научной конф. МФТИ. — М., 2011. — С. 34 — 35.

15. Сабдулаева Э.Х., Трофимов Д.Ю., Коган Е.А., Бурменская О.В., Оламова А.О., Роговская С.И. Новые технологии в диагностике папилломавирусной инфекции // Мать и дитя в Кузбассе. - 2011. - № 1. Спецвыпуск. - С. 368 - 371.

16. Бадалова Л.А., Роговская С.И., Гончаревская 3.JL, Коган Е.А., Бебнева Т.Н., Шамаракова В.М., Акопова Е.С., Сабдулаева Э.Х. Клинико-экономическая эффективность методов диагностики при CIN // Мать и дитя в Кузбассе. - 2011. - № 1. Спецвыпуск. - С. 162 - 165.

17. Сабдулаева Э.Х., Оламова А.О., Бебнева Т.Н., Павлович C.B., Роговская С.И. Прегравидарная подготовка женщин с папилломавирусной инфекции гениталий // Вестник РУДН. (Сер. «Медицина. Акушерство и гинекология»), - 2011. - № 6. - С. 152-159.

18. Роговская С.И., Трофимов Д.Ю., Коган Е.А., Сабдулаева Э.Х. Клиническое значение молекулярных маркеров при папилломавирусной инфекции // Акушерство и гинекология. - 2011. - № 4. - С. 4 - 10.

19. Shubina J.S., Burmenskaya O.V., Trofimov D. Y., Nepsha O.S., Rogovskaya S.I., Sabdulaeva E.H., Sukhikh G.T. Molecular markers for premalignant lesions of cervix // The World Congress on Building Consensus in Gynecology, Infertility and Perinatology (BCGIP). Barcelona, Spain 2012.

Подписано в печать: 23.01.2012 Объем: 1,0 п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 47 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru