Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммунологические и молекулярно-биологические факторы персистирующего течения папилломавирусной инфекции

На правах рукописи

485098/

ЗОТОВА Мария Александровна

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ПЕРСИСТИРУЮЩЕГО ТЕЧЕНИЯ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

14.03,09- клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 ИЮН 2011

Челябинск —20)1

4850987

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, Телешева Лариса Федоровна

профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Рябинин Вячеслав Евгеньевич

профессор

доктор биологических наук, Пряхин Евгений Александрович

профессор

Ведущая организация: НИИ экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, г. Пермь

Защита состоится «30» июня 2011 года в_часов на заседании диссертационного совета Д 208. 117. 03 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Автореферат разослан йяО _2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Латюшина Л.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

На сегодняшний день папилломавирусная инфекция (ПВИ) является актуальной социально-значимой проблемой. По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) число инфицированных за последние десять лет увеличилось более чем в 10 раз, достигнув 23,5% [Белокриницкая Т.Е. и др., 2005; Козаченко В.П. и др., 2009]. Чрезвычайно важной представляется проблема ПВИ в связи с онкогенным потенциалом вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого риска, который признан этиологическим агентом рака шейки матки (РШМ) [WHO, 2006]. Несмотря на высокую распространенность и онкогенный потенциал ВПЧ, высокий процент самопроизвольного регресса ПВИ свидетельствуют о том, что инфицирование является необходимым, но недостаточным условием для возникновения РШМ. По данным литературы, главным фактором риска развития неопластической патологии является персистенция онкогенных типов ВПЧ [Кузнецова Ю.Н. и др., 2009; Manavi M. et al., 2008; Castle P.E., 2009; Carcopino X. et al., 2011]. Считается, что канцерогенез является следствием "персистентных инфекций ВПЧ высокого риска" продолжительностью более 6 месяцев [Современные подходы..., 2009; Вакцины для профилактики..., 2011; Woodman C.B. et al., 2007; Koshiol J. et al., 2008; Bhat P. et al., 2011]. Тем не менее, понятие "персистирующая инфекция" — это только условное определение и не включает никакого функционального критерия, который бы опирался на молекулярные события, необходимые для развития канцерогенеза, вызванного ВПЧ. И хотя в настоящее время данный термин широко используется, крайне необходимо дифференцировать клинически значимые фазы течения инфекций ВПЧ высокого риска на основе молекулярных показателей [Doeberitz M. К, 2009].

Большую важность приобретают исследования, направленные на поиск вирусологических маркеров, ответственных за развитие персистирующего течения. В настоящее время, в качестве таких вирусологических факторов рассматриваются инфекция, вызванная онкогенными типами ВПЧ, а также несколькими типами вируса одновременно, высокая вирусная нагрузка, повышенная экспрессия онкобелков Е6 и Е7 ВПЧ, сверхэкспрессия циклин-зависимых киназ pl6INK4a и другие [Мынбаев O.A. и др., 2009; Вакцины для профилактики..., 2011].

Клинические наблюдения, а также данные экспериментальных исследований свидетельствуют о ведущей роли иммунной системы в контроле возникновения, течения и исхода ПВИ [Баткаев Э.А., Рюмин Д.В., 2003; Роговская С.И., 2005; Stanley M., 2006]. Поскольку ВПЧ эпителиотропен, особо важное значение имеет состояние факторов местной защиты органов репродуктивного тракта. Несмотря на многочисленные исследования роли местного иммунитета, в защите от ВПЧ, недостаточно изучены механизмы действия клеточных и гуморальных компонентов мукозального иммунитета на формирование перси-стенции данного вируса. Учитывая тот факт, что персистенция ВПЧ высокого

риска является ключевым событием в малигаизации клеток, изучение факторов, инициирующих этот процесс, и, следовательно, способствующих реализации оикогснного потенциала ВПЧ определяет актуальность настоящего исследования.

Цель исследования

Установление иммунологических, молекулярно-биологических особенностей транзиторного и персистирующего течения папилломавирусной инфекции и выявление маркеров персистенции вируса папилломы человека высокого риска.

Задачи исследования

1. Установить типы вируса папилломы человека высокого риска, ассоциированные с транзиторным и персистирующим течением папилломавирусной инфекции в репродуктивном трасте женщины.

2. Определить показатели вирусной нагрузки вируса папилломы человека высокого риска при транзиторном и персистиругощем течении папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

3. Изучить иммунологические показатели цервикальной слизи при транзиторном и персистирующем течении папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

4. Определить взаимосвязь между молекулярно-биологическими и иммунологическими показателями цервикальной слизи при транзиторном и персистирующем течении папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

5. Установить маркеры персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

Научная новизна

Впервые установлен широкий спектр генотипов ВПЧ высокого риска при транзиторном и персистирующем течении ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев. Показано преобладание ВПЧ 16 типа независимо от течения и длительности ПВИ. Впервые установлено, что транзиторное течение ассоциировано с ВПЧ 52 типа и инфицированием 1 типом вируса. Персистирующее течение ПВИ характеризуется высокой частотой встречаемости микстинфекции ВПЧ высокого риска и моноинфекции ВПЧ 16 типа. Установлено, что при персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев в разном проценте случаев определяются 16, 18,31,33,35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы ВПЧ высокого риска, в то время как при транзиторном течении ПВИ не установлено случаев инфицирования 35 типом ВПЧ, при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев - 39 и 58 типами ВПЧ.

Впервые проведена комплексная оценка иммунологических факторов цервикальной слизи в зависимости от длительности персистенции ВПЧ высокого риска. Выявлены общие закономерности изменений факторов местного им-

мунитета, сопровождающие наличие ВПЧ высокого риска в цервикальном канале обследованных женщин: снижение активности, интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа нейтрофилов, увеличение активности лизосомальных ферментов нейтрофильных гранулоцитов и уровня ИЛ-2. Установлено, что пер-систирующее течение ПВИ длительностью б месяцев характеризуется снижением лизосомальной активности нейтрофилов и повышением концентрации ^ в на фоне высоких уровней ИФН-а и ИФН-у в цервикапьной слизи относительно транзиторного течения ПВИ. Персистирующее течение ПВИ длительностью 12 месяцев сопровождается снижением интенсивности фагоцитарных реакций нейтрофилов, дефицитом ИНФ-а и повышенными концентрациями А, А и ^ М в цервикальной слизи.

Впервые получены данные по показателям вирусной нагрузки в зависимости от длительности персистенции ВПЧ высокого риска. Установлено влияние вирусной нагрузки ВПЧ высокого риска на факторы локального иммунитета репродуктивного тракта женщины, определяющее развитие и длительность персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

Впервые с помощью бинарной логистической регрессии определены маркеры риска развития и длительности персистирующего течения ПВИ.

Теоретическая и практическая и значимость

Полученные данные расширяют представление о роли генотипа, концентрации вируса папилломы человека высокого риска и факторов местного иммунитета цервикальной слизи в развитии и длительности персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

На основании комплексного молекулярно-биологического и иммунологического исследования определены основные маркеры, определяющие риск развития и длительность персистенции вируса папилломы человека высокого риска в репродуктивном тракте женщины.

Положения, выносимые на защиту

1. Транзиторное течение папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины ассоциировано с вирусом папилломы человека 52 типа и инфицированием 1 генотипом вируса, персистирующее течение папилломавирусной инфекции характеризуется высокой частотой встречаемости микстин-фекции вируса папилломы человека высокого риска и моноинфекции вируса папиллома человека 16 типа. Персистирующее течение папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины сопровождается высокими концентрациями вируса папилломы человека высокого риска и преобладанием случаев вирусной нагрузки выше 5 ^ на 105 клеток человека.

2. Наличие вируса папилломы человека высокого риска в цервикальном эпителии характеризуется угнетением нейтрофилыюго звена местного иммунитета, в то время как развитие и длительность персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины определяется со-

стоянием гуморального иммунитета и уровнем интерферонов в цервикальной слизи.

3. Развитие персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины сопровождается изменением не только показателей вирусной нагрузки и местного иммунитета, но и взаимосвязей между ними.

4. Выявленные особенности молекулярно-биологических факторов и иммунологических показателей цервикальной слизи позволяют определить маркеры риска развития и длительности персистирующего течения папиллома-вирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

Внедрение результатов в практику

Результаты исследований внедрены в клиническую практику женской консультации МУЗ ГКБ № 2 г.Челябинска, в лабораторную диагностику НИИ иммунологии ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава, в педагогическую практику кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, кафедры акушерства и гинекологии № 2 ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы на: VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2007); VII итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2009); VII Российской конференции иммунологов Урала (Архангельск, 2009); Российской научной конференции «Перси-стенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009); VIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге - 2009» (Санкт-Петербург, 2009); И-ом Ежегодном конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010); VIII Российской конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010); межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии - междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва, 2010); 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 24 научные работы, в том числе 9 из перечня изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего работы 155 отечественных и 77 иностранных авторов. Диссертация изложена на 145 страницах компьютер-

ного текста и включает 12 таблиц, 4 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы к методы исследования

Для решения поставленных задач в период с 2008 по 2010 гг. на базе Центральной научно-исследовательской лаборатории и Научно-исследовательского института иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» было проведено обследование 152 женщин с наличием ВПЧ высокого риска в цервикальном канале, являющихся пациентками амбулатор-но-поликлинмческого приема женской консультации МУЗ ГКБ № 2 г.Челябинска. Критериями включения пациенток в данное исследование являлись: папилломавирусная инфекция, подтвержденная методом ПЦР; возраст — от 18 до 45 лет; первая фаза менструального цикла. Критерии исключения: беременность; экстрагенитальные заболевания в стадии декомпенсации; инфекционные заболевания в стадии обострения; хламидийная, цитомегаловирусная и гсрпстичсская инфекции урогенительного тракта; опухолевая патология.

Для установления факта персистенции ВПЧ высокого риска всем женщинам проводили повторное ВПЧ-тестирование (выявление, дифференциация и количественное определение ВПЧ высокого риска) методом ПЦР через 6 и 12 месяцев после первичного обнаружения вируса. На основании полученных данных ретроспективно все пациентки были разделены на 3 группы: 1 группу составили 68 пациенток с отрицательными результатами ВПЧ-тестирования через 6 и 12 месяцев после первичного выявления ВПЧ высокого риска (транзи-торное течение ПВИ), 2 группу - 32 женщины с персистирующим течением ПВИ, у которых вирус выявлялся через б месяцев и не выявлялся через 12 месяцев после первичного обследования (персистирующее течение ПВИ длительностью б месяцев), в 3 группу вошли 52 женщины с положительным ВПЧ-тестом через 6 и 12 месяцев после первичного обследования (персистирующее течение ПВИ длительностью 12 месяцев).

Контрольную группу составили 32 женщины без ВПЧ высокого риска, клинико-морфологических изменений на шейке матки и иной гинекологической патологии.

В группы с транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев вошли женщины с эктопией шейки матки, хроническим цервицитом и их сочетанием, цервикальной интраэпитслиальной неоплазией (ЦИН) I степени и без клинико-морфологических изменений на шейке матки и иной пшекологической патологии. Диагноз выставлен акушерами-гинекологами женской консультаций МУЗ ГКБ № 2 на основании анамнестических, клинических и по показаниям кольпоскопического и морфологического методов исследования. Все пациентки с ПВИ находились под наблюдением лечащего врача-гинеколога и по показаниям получали лечение в соответствии с установленной патологией. Средний возраст обследованных женщин составил

26,07±0,46 лет. Исследуемые группы были сопоставимы по возрасту и клиническим характеристикам.

Материалом для молекулярно-биологического исследования послужили соскобы эпителиальных клеток цервикального канала. Выявление и дифференциация ВПЧ высокого риска 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типов проводили с помощью тест-системы «АмплиСенс® ВПЧ ВКР генотип-FL» производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора, г.Москва. Количественное определение ДНК ВПЧ высокого риска проводили с помощью тест-системы «АмплиСенс® ВПЧ ВКР скрин-титр-FL» производства ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора (г.Москва). Результаты концентрации ДНК ВПЧ выражались в lg (ВПЧ на 100 тыс. клеток человека) и оценивались следующим образом: вирусная нагрузка менее 3 - малозначимая, от 3 до 5 - значимая и более 5 - повышенная. Исследования проводили методом ПЦР в режиме реального времени на приборе «Rotor-Gene» 6000 («Corbett Research», Австралия).

Для оценки иммунологических показателей у женщин исследовалась цер-викальная слизь, в которой определяли:

- общее количество лейкоцитов, абсолютное и относительное содержание жизнеспособных нсйтрофилов, показатели функциональной активности ней-трофилов с оценкой фагоцитарных реакций и содержания лизосом (Фрейдлин И.С., 1986), кислородозависимый метаболизм в НСТ тесте (Маянский А.Н., Виксман М.К., 1979).

- концентрации иммуноглобулинов А, М, G (íg A, Ig М, Ig G) определяли с помощью тест-систем ООО «Хема» (г.Москва), секреторного Ig A (slgA) -тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) методом ИФА.

- определение уровней ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-10, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-8, ИЛ-10, РАИЛ-1, ФНО-а проводили методом ИФА с использованием тест-систем ООО «Цитокин» (г. Санкт-Петербург).

Результаты оценивали с помощью пакетов «Statistica 6.0» и MedCalc 10.2.0.0 с вычислением средней арифметической и ее стандартной ошибки (М±т). Анализ количественных признаков производился с использованием непараметрического критерия Манна-Уитни. Оценка качественных показателей осуществлялась с помощью критерия у2 и точного критерия Фишера. Связь между исследуемыми показателями оценивали с помощью ранговой корреляции Спирмена. Для оценки диагностической эффективности молекулярно-биологических параметров и иммунологических показателей цервикальной слизи и построения математических моделей использовали бинарную логистическую регрессию. Во всех случаях различия, связи и зависимости считали статистически значимьми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ частоты встречаемости генотипов ВПЧ высокого риска показал преобладание ВПЧ 16 типа как в группе с транзиторным течением ПВИ, так и в группах с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев

Таблица 1

Распределение генотипов ВПЧ высокого риска у женщин с транзиторным и

псрсистирующим течением папилломавирусиой инфекции_

Тип Стат. показатели Группа 1 Группа 2 Группа 3

Транзиторное течение ПВИ, п=96 Персисгирующее течение ПВИ, 6 месяцев, п=54 Персистирующсс течение ПВИ, 12 месяцев, п=112

16 п 22 10 28

% 23,4 18,5 25,0

18 п 4 6 6

% 4,3 11,2 5,4

31 п 8 8 14

% 8,5 14,8 12,5

33 п 8 4 6

% 8,5 7,4 5,4

35 п 0 2 6

% 0 3,7 5,4

39 п 8 0 12

% 8,5 0 10,7

45 п 4 2 10

% 2,1 3,7 8,9

51 п 8 8 8

% 8,5 14,8 7,1

52 п 16 10 8 р1-3=0,03 р2-3=0,03

% 17,0 18,5 7,1

56 п 8 2 6

% 8,5 3,7 5,4

58 п 8 0 4

% 8,5 0 3,6

59 п 2 2 4

% 2,1 3,7 3,6

Примечание: п - количество типоспецифических сигналов; р1-3 - достоверные отличия показателей группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев от показателей группы с традзиторным течением ПВИ; р2-3 _ достоверные отличия показателей группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев от показателей группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев.

(табл.1). Полученные нами результаты согласуются с данными мировых исследований о высокой распространенности ВПЧ 16 типа в популяции [Евстигнеева Н.П., 2007; Видяева И.Г. и др., 2003; Современные подходы..., 2009; Munoz N. et al., 2004; Bosh F.X. et a!., 2008]. При персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев наравне с ВПЧ 16 типа выявлялся ВПЧ 52 типа.

Характерной особенностью персистирующего течения ПВИ длительностью 12 месяцев было снижение частоты встречаемости ВПЧ 52 типа относительно как группы с транзиторным течением ПВИ, так и группы с персисти-рующим течением ПВИ длительностью б месяцев. Аналогичные результаты получены Е.А. Золотоверхой и соавт. (2007), в работе которой не было обнаружено ВПЧ 52 типа при персистирующем течении ПВИ. Вероятно, инфицирование 52 типом ВПЧ ассоциировано с элиминацией, либо с краткосрочной перси-стенцией ВПЧ высокого риска.

У женщин с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев в разном проценте случаев встречались все 12 определяемых типов ВПЧ высокого риска, тогда как при транзиторном течении ПВИ не выявлялся ВПЧ 35 типа, при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев — ВПЧ 39 и 58 типов.

Характеризуя частоту встречаемости количества типов ВПЧ высокого риска в исследуемых группах необходимо отметить, что при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев достоверно чаще выявлялась микстинфекция ВПЧ высокого риска (инфицирование 2 и более генотипами вируса) по сравнению с транзиторным течением ПВИ (р=0,04 и р<0,001, соответственно). Наши данные согласуются с результатами других исследователей, которые в своих работах пришли к выводу, что инфицирование несколькими типами ВПЧ снижает скорость элиминации и обеспечивает менее благоприятный прогноз течения ПВИ [Евстигнеева Н.П., 2009; Современные подходы..., 2009].

Анализ частоты встречаемости типов ВПЧ высокого риска при моноинфекции (инфицирование 1 генотипом вируса) показал, что персистирующее течение ПВИ длительностью 6 месяцев характеризовалось высокой частотой встречаемости ВПЧ 51 типа по сравнению с транзиторным течением ПВИ (р=0,03). При персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев отмечена наиболее высокая частота инфицированности моноинфекцией ВПЧ 16 типа относительно групп с транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев (р<0,001 и р=0,004, соответственно).

По данным литературы, моноинфекция ВПЧ, в особенности высокоагрессивного 16 типа, является неблагоприятным прогностическим фактором течения инфекционного процесса [Евстигнеева Л.А., 2008; Yamada Т. et al., 1997; Nielsen А. et al., 2010]. Отраженное в некоторых работах предположение о повышенном риске развития персистенции в случае инфицирования ВПЧ 16 типа нашло подтверждение в нашей работе.

Интересно отметить, что при персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев в виде моноинфекции выявлялось только 4 генотипа ВПЧ - 16, 31, 33 и 58 типы. Учитывая, что большая часть определяемых нами типов ВПЧ персистировали в кооперации, можно предположить, что способность к перси-стенции одного типа должна определяться его наиболее мощными функциональными особенностями, позволяющими выработать высокую степень адаптации к иммунной системе организма-хозяина.

Характеризуя типовой состав микстинфекции ВПЧ высокого риска, установлено, что особенностью персистирующего течения ПВИ длительностью 12 месяцев была низкая частота встречаемости ВПЧ 52 типа по сравнению транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев (р=0,02 и р=0,02, соответственно). ВПЧ 18 типа во всех исследуемых группах обнаруживался только в кооперации с другими генотипами ВПЧ высокого риска.

Изучение биологических особенностей транзиторного и персистирующего течения ПВИ в нашем исследовании показало, что лидирующую позицию независимо от исхода ПВИ занимал ВПЧ 16 типа. При этом транзиторное течение было ассоциировано с ВПЧ 52 типа и инфицированием 1 генотипом вируса, в то время как персистирующее течение ПВИ характеризовалось высокой частотой встречаемости микстинфекции ВПЧ высокого риска и моноинфекции ВПЧ 16 типа. В то же время, в большинстве случаев, как при транзиторном, так и при персистирующем течении ПВИ, определялись одни и те же генотипы вируса. Вероятно, для понимания этого факта необходимо более детальное изучение каждого генотипа вируса, так как в некоторых исследованиях показано, что разные внутритиповые варианты ВПЧ, определяемые на основании генетического полиморфизма, различаются по своей способности вызывать персистирующую инфекцию [Xi L.F. et al., 1995; Villa L.L. et al., 2000; Gagnon S. ct al., 2004].

Таким образом, молекулярное генотипирование ВПЧ высокого риска является эффективным методом установления факта персистенции вируса, что имеет большое практическое значение для своевременного предотвращения прогрессирования патологических изменений цервикального эпителия и развития необратимой неопластической трансформации.

Тем не менее, только тип вируса не является определяющим в развитии персистенции, и существуют другие факторы, влияющие на исход ПВИ. В качестве одного из них рассматривается вирусная нагрузка ВПЧ высокого риска [Stanley М., 2003; Song S.H. et al., 2006]. Исследование показателей вирусной нагрузки ВПЧ высокого риска в изучаемых группах женщин показало, что средняя концентрация вируса при транзиторном течении ПВИ была 3,26±0,32 Ig ВПЧ на 10s клеток, что сочеталось с преобладанием в этой группе случаев малозначимой нагрузки (41,2%). У женщин с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев средний показатель вирусной нагрузки был достоверно выше (5,64±0,22 lg ВПЧ на 10s клеток, р<0,001), а повышенная вирусная нагрузка встречалась чаще, чем в группе с транзиториьгм

течением ПВИ (р<0,001). При этом малозначимая вирусная нагрузка в данной группе не обнаружена. При персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев средняя концентрация вирусной ДНК определялась на уровне 4,28±0,33 lg ВПЧ на 105 клеток, что выше по сравнению с группой транзитор-ного течения ПВИ (р=0,04), но ниже относительно персистирующего течения ПВИ длительностью 6 месяцев (р=0,001). При этом преобладала вирусная нагрузка от 3 до 5 lg ВПЧ на 10s клеток, а частота встречаемости повышенной снижалась по сравнению с персистирующим течением ПВИ длительностью б месяцев (р<0,001). Полученные результаты свидетельствуют о том, что высокая вирусная нагрузка может способствовать персистенции вируса, но не всегда является признаком неблагоприятного исхода ПВИ. В нашем исследовании в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев, несмотря на повышенную вирусную нагрузку ВПЧ высокого риска у пациенток в итоге произошла элиминация вируса, но для этого потребовалось больше времени по сравнению с группой транзиторного течения ПВИ.

Особенности жизненного цикла ВПЧ определяют ведущую роль факторов локального иммунитета в процессах инфицирования и, самое главное, вероятности последующего развития заболевания (элиминация или персистенция ВПЧ) [Современные подходы..., 2009; Stanley М., 2009; Bhat P. et al., 2011]. При изучении иммунологических показателей цервикальной слизи установлены однонаправленные изменения функциональной активности нейтрофилов как в группе с транзиторным, так и в группах с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев, характеризующиеся достоверным снижением активности, интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа нейтрофилов, увеличением их лизосомальной активности (табл. 2). Выявленные нами изменения фагоцитарной реакции нейтрофилов отражают нарушение их поглотительной и переваривающей способностей, а также неэффективность внутриклеточной киллерной функции при ПВИ. В то же время, высокое содержание ли-зосомальных энзимов свидетельствует об активности и способности нейтрофилов к реализации кислороднезависимой биоцидности, направленной на уничтожение вируса [Цыганкова О.В., 2009].

В группах с транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев установлено повышение общего количества лейкоцитов и абсолютного содержания жизнеспособных нейтрофилов относительно группы контроля. В то время как в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев эти изменения были на уровне тенденции. Вероятно, полученные данные отражают активацию воспалительного процесса при ПВИ, так как ключевым этапом в защите организма от внедрения антигена является выход нейтрофилов из кровяного русла к месту инвазии микроорганизма для решения своих эффекторных задач [Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000; Долгушин И.И и др., 2009].

Отличительной особенностью группы с персистирующим течением ПВИ длительностью б месяцев по сравнению с транзиторным течением ПВИ стало снижение лизосомальной активности нейтрофилов. По нашему мнению, это

Таблица 2

Количество и функциональная активность нейтрофилов цервикальной слизи у __обследованных женщин, М±т_____

Показатели Группа контроля, п~32 Группа 1 Группа 2 Группа 3

Транзиторное течение ПВИ, п=68 Персистирую-щее течение ПВИ, 6 месяцев, п=32 Персистирую-щее течение ПВИ, 12 месяцев, п=52

Общее количество лейкоцитов, 109/л 7,41±0,89 18,27±2,54 р=0,001 11,4б±1,93 16,88±2,52 р=0,002

Количество жизнеспособных нейтрофилов, % 39,81±2,89 40,65±2,82 38,27±2,27 35,89±3,38

Количество жизнеспособных нейтрофилов, 109/л 2,66±0,34 7,79±1,11 р<0,001 3,56±0,59 р 1-2=0,002 4,84±0,65 р=0,008 р1-3=0,03

Лизосомальная активность нейтрофилов, у.е. 29,13±3,37 218,63±18,92 р<0,001 139,33±24,77 р<0,001 р 1-2=0,02 179,47±31,05 р=0,006

НСТ-тест спонтанный, % 23,75±2,08 26,85±2,55 23,27±3,72 23,17±2,86

НСТ-тест спонтанный, у.е. 0,29±0,03 0,32±0,03 0,27±0,04 0,28±0,04

НСТ-тест активированный,0/« 39,31±2,99 37,75±2,44 41,91±3,52 35,П±3,4б

НСТ-тест активированный, у.е. 0,57±0,05 0,49±0,04 0,53±0,04 0,48±0,05

Функциональный резерв нейтрофилов, у.е. 2,03±0,14 2,ЗОЯ),28 2,42±0,30 2,02±0,17

Активность фагоцитоза нейтрофилов, % 61,69±2,79 51,10±1,85 р<0,001 44,60±3,81 р<0,001 46,78±2,75 р<0,001

Интенсивность фагоцитоза нейтрофилов, у.е. 2,56±0,20 1,66±0,11 р<0,001 1,39±0,15 р<0,001 1,33±0,12 р<0,001 р1-3=0,03

Фагоцитарное число, у.е. 3,84±0,21 3,15±ОД4 р=0,005 2,86±0,20 р=0,003 2,92±0,21 р=0,001

Примечание к таблицам 2-4: п - количество обследованных женщин; р — достоверные отличия показателей женщин с ПВИ от показателей практически здоровых женщин; р1-2 -достоверные отличия показателей группы с персистирующим течением ПВИ длительностью б месяцев от показателей группы с транзаторным течением ПВИ; р1-3 - достоверные отличия показателей группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев от показателей группы с траизиторньм течением ПВИ; р2-3 - достоверные отличия показателей группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев от показателей группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев.

обусловлено массивной антигенной нагрузкой в данной группе, что приводит к истощению функциональных гранул нейтрофилов. При персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев зарегистрировано снижение интенсивности фагоцитоза нейтрофилов по сравнению с транзиторным течением ПВИ.

Таблица 3

Показатели гуморальных факторов иммунитета цервикальной слизи _^_ у обследованных женщин, М ± m _

Показатели Группа контроля п=32 Группа I Группа 2 Группа 3

Транзиторное течение ПВИ, п=68 Персистирующее течение ПВИ, 6 месяцев, п=3 2 Персистирующее течение ПВИ, 12 месяцев, п=52

slg А, г/л 0,022±0,006 0,027±0,007 0,037±0,012 0,076±0,013 р<0,001 pl-3<0,001 р2-3=0,005

Ig А, г/л 0,11±Ю,03 0,09±0,02 0,14±0,04 0,28±0,05 р=0,01 pl-3=0,001 р2-3=0,04

Ig М, г/л 0,01±0,002 0,03±0,01 0,01 ±0,001 0,0б±0,02 р2-3=0,02

Ig G, г/л 0,52±0,06 0,40±0,0б 0,60±0,05 р 1-2=0,03 0,54±0,06

Изучение гуморальных факторов цервикальной слизи (табл.3) показало, что при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев организм реагировал подключением гуморальных факторов иммунитета, которое проявлялось в увеличении уровня Ig G — важнейшего иммуноглобулина, определяющего завершенность и эффективность иммунного ответа [Семенов Д.М. и др., 2008] и, в итоге, способствующего элиминации ВПЧ из организма. В то время как персистирующее течение ПВИ длительностью 12 месяцев характеризовалось повышенными концентрациями slg A, Ig А и Ig М.

При изучении цитокинового профиля цервикальной слизи (табл. 4) установлено повышение экспрессии ИЛ-2 во всех исследуемых группах, что свидетельствует об активации иммунекомпетентных клеток в ответ на ПВИ [Кетлинский С.С., Симбирцев А.С., 2008]. Транзиторное и персистирующее течении ПВИ длительностью 6 месяцев характеризовались однонаправленными изменениями уровней цитокинов, что выражалось в повышении концентрации ИФН-а и ИФН-у в цервикальной слизи. Повышенная экспрессия интерферонов в группах с транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев свидетельствует о работе противовирусных механизмов, а ИФН-у, выступая в качестве провоспалительного цитокина, обеспечивает запуск цитокинового каскада, направленного на формирование очага воспаления с привлечением эффекторных клеток. При персистирующем течении ПВИ длительностью

12 месяцев нами зарегистрирован дефицит ИНФ-а в цервикальной слизи.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев угнетение нейтро-фильного звена иммунитета цервикальной слизи в условиях повышенной вирусной нагрузки обусловливает персистенцию ВПЧ высокого риска, но ее срок ограничивается, благодаря запуску О-иммунного ответа на фоне повышенной экспрессии ИФН -а и ИФН -у. Тогда как в группе женщин с персистирующем течением ПВИ длительностью 12 месяцев дефицит ИФН -а, который может быть обусловлен как нарушениями в функционировании иммунной системы женщины, так и способностью ВПЧ высокого риска подавлять синтез ин-терферонов и работу интерферон-сигнальных путей, способствует длительной персистснции ВПЧ. При этом, высокие уровни А, ^ А и 1§ М, обеспечивающие первую линию иммунной защиты слизистых оболочек ¡Картов Э.В. и др., 2008; Кишкун А.А., 2009], по нашему мнению, сопровождают вирусоноси-тельство, сдерживая чрезмерную агрессивность свободных вирусов.

Таблица 4

Уровни цитокинов цервикальной слизи у обследованных женщин, М±т

Показатели Группа контроля, п=32 Группа 1 Группа 2 Группа 3

Трашиторное течение ПВИ, п=68 Персистирующее течение ПВИ, 6 месяцев,п=32 Персистирующее течение ПВИ, 12 месяцев,п=52

ИФН-а, пг/мл 785,40*164,61 2382,95±372,14 р=0,009 1983,73±405,70 р=0,03 994,78± 160,62 pl-3=0,01 р2-3=0,04

ИФН-у, пг/мл 803,50±65,66 1166,29± 100,03 р=0,02 1123,32±101,29 р=0,01 1009,05±98,91

ИЛ-lß, пг/мл 4091,25±727,84 6766,95±1345,49 5654,32± 1901,12 4244,3 8±1204,44

РАИЛ-1, пг/мл 4623,84±762,62 6186,69±1046,66 5722,82±1187,12 5181,86±580,07

ИЛ-2, пг/мл 178,60±П,37 325,61±41,38 р<0,001 351,35±79,41 р=0,01 245,98±19,23 р=0,007

ИЛ-4, пг/мл 281,51±53,66 453,70±76,96 350,70±68,92 231,47±28,68

ИЛ-8, пг/мл 8904,22±1718,08 14908,42±2221,30 11197,23±3583,08 11550,61±2002,03

ИЛ-10, пг/мл 212,64±11,34 283,44±38,10 182,54±14,33 222,91±26,77

ФНО-а, пг/мл 381,41±73,15 350,05±37,67 365,17±69,85 348,69±52,18

Помимо определения изменений количественных параметров, одной из существенных характеристик функционирования иммунной системы является баланс взаимосвязей ее компонентов [Кологривова E.H. и др., 2005; Петленко C.B. и др., 2010]. По данным литературы, активация и вовлечение в процесс тех

или иных механизмов иммунного ответа, а, следовательно, и исход инфекционного процесса, определяется не только степенью патогенности возбудителя, но и его количеством [Железникова Г.Ф., 2006; Новиков Д.К., Новиков П.Д., 2009; Devi P.U. et al., 2009; Faust H. et al., 2011]. В нашей работе исследуемые группы отличались по показателям вирусной нагрузки ВПЧ высокого риска. В связи с этим, для установления влияния количества ДНК ВПЧ на механизмы иммунного ответа был проведен корреляционный анализ между уровнем вирусной нагрузки ВПЧ высокого риска и показателями местного иммунитета в исследуемых группах.

Анализ взаимосвязей показал, что во всех исследуемых группах установлены связи вирусной нагрузки преимущественно с иммуноглобулинами и цито-кинами цервикальной слизи, что подтверждает ключевую роль гуморальных факторов врожденного иммунитета в реализации процессов пролиферации, дифференцировки и активации иммунокомпетентных клеток при включении противовирусного иммунитета. Учитывая полученные данные, следующим этапом мы проанализировали взаимосвязи между уровнями цитокинов, как основных регуляторов иммунного ответа, и другими иммунологическими показателями цервикальной слизи.

Рис. 1. Корреляционные связи показателей в группе с транзиторным течением

ПВИ

Примечание для рис. 1-3: — положительные связи, — отрицательные связи

При сопоставлении результатов корреляционного анализа вирусной нагрузки и цитокинов с иммунологическими факторами цервикальной слизи мы установили, что в группе с транзиторным течением ПВИ концентрация вирусной ДНК коррелировала с б^А и ИФН-у (рис.1). В свою очередь б^А и ИФН-у связаны с уровнем ФНО-а, который является одним из ключевых цитокинов в реализации противовирусного иммунного ответа, а также в регуляции интенсивности воспаления и эффективности иммунной защиты [Рязанцева Н.В. и др.,

2006; Зима А.П. и др., 2007; Кетлинский С.С., Симбирцев A.C., 2008]. В ходе дальнейшего анализа установлено, что ФНО-а чаще других был задействован в иммунологических взаимосвязях, среди которых обращают на себя внимание, с одной стороны, положительные связи ФНО-а - РАИЛ-1, ФНО-а - ИФН-у, с другой стороны - отрицательные связи ФНО-а - ИФН -а, ФНО-а - ИЛ-4. Полученные результаты свидетельствуют о сохранении баланса про- и противовоспалительных цитокинов у женщин данной группы. По данным литературы, ФНО-а может оказывать ингибирующий эффект на рост ВПЧ-инфицировашшх клеток, который усиливается действием интсрферонов [Семенов Д.М. и др., 2008]. Следовательно, установленная положительная взаимосвязь ФНО-а — ИФН-у может свидетельствовать о сопряженности противовирусной активности данных цитокинов в ответ на ПВИ. Таким образом, в данной группе создаются благоприятные условия для реализации полноценного иммунного ответа, направленного на элиминацию ВПЧ высокого риска.

Рис. 2. Корреляционные связи показателей в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев

При персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев установлены положительные связи между вирусной нагрузкой ВПЧ высокого риска и активностью индуцированного НСТ-теста нейтрофилов, ИЛ-2, ИФН-у и ^ М и отрицательные связи - с лизосомальной активностью нейтрофилов, общим количеством лейкоцитов и абсолютным содержанием жизнеспособных нейтрофилов (рис. 2). В свою очередь, ИЛ-2 и lg М коррелировали с уровнем ИЛ-1Р, а ИФН-у был связан с РАИЛ-1 и ИЛ-10. К тому же, взаимосвязь ИЛ-8 - РАИЛ-1, которая прослеживается во всех трех группах обследованных женщин, в

Рис.3. Корреляционные связи показателей в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев

данном случае меняет свое направление и становится отрицательной. Интересно обратить внимание и на взаимосвязь вирусной нагрузки с ИФН-у, которая была отрицательной в группе с транзиторным течением ПВИ и стала положительной при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев. ИФН-у, обладая прямой противовирусной активностью и являясь важнейшим иммуно-регулятором, усиливает синтез НЬА-антигенов клетками, что приводит к ускорению процессов распознавания и переработки антигенов, активирует другие клетки иммунной системы, участвующие в элиминации патогена. Таким образом, персистирующее течение ПВИ длительностью 6 месяцев характеризовалось как увеличением корреляционных связей, так и изменением их характера по сравнению с транзиторным течением ПВИ. Учитывая, что вирусная нагрузка в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев была

выше порога прогрессии (более 5 lg на 105 клеток человека), увеличение количества взаимосвязей отражает напряженность и согласованную работу факторов местного иммунитета в ответ на массивную антигенную атаку, что обусловливает элиминацию ВПЧ высокого риска, но в течение более длительного времени.

При анализе корреляционных связей в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев установлена только одна положительная взаимосвязь между вирусной нагрузкой ВПЧ высокого риска и уровнем Ig А, который был связан положительной корреляционной связью с ИЛ-4 (рис.3). Обращает на себя внимание отсутствие взаимосвязей IgA и ИЛ-4 с другими иммунологическими показателями цервикальной слизи. По нашему мнению, снижение числа и отсутствие связанности компонентов локального иммунитета при высокой дозе антигена препятствует удалению вируса, поддерживая его персистенцию. Более того, отмечено исчезновение связей между ФНО-а и другими цитокинами и появление отрицательных связей между провоспалитель-ными цитокинами (ИЛ1-р и Ю1-8) и противовоспалительным ИЛ-10, для которого выявлено максимальное количество связей. По данным литературы, направленность цитокинового профиля в сторону формирования гуморального иммунного ответа при вирусных инфекциях является прогностически неблагоприятным признаком течения заболевания [Наследникова И.О. и др., 2007; Маркелова Е.В. и др., 2008; Сотниченко С.А. и др., 2009]. Поэтому, установленные нами взаимосвязи можно рассматривать как патогенетический механизм, опосредующий формирование персистенции ВПЧ высокого риска у женщин этой группы.

Таким образом, корреляционный анализ взаимосвязей между уровнем вирусной нагрузки ВПЧ высокого риска и иммунологическими показателями цервикальной слизи показал наличие существенных различий в состоянии локальной иммунной системы женщин в зависимости от дозы антигена, что доказывает участие этого молекулярно-биологического маркера в иммунологических процессах, определяющих течение и исход ПВИ.

Установленные молекулярно-биологические и иммунологические особенности исследуемых групп были использованы для выявления маркеров риска развития и длительности персистенции ВПЧ высокого риска.

Построение прогностических моделей проводилось с помощью метода бинарной логистической регрессии. В качестве наиболее информативных показателей в математические модели вошли:

1. Для прогноза риска развития персистирующего течения ПВИ длительностью 6 месяцев: вирусная нагрузка ВПЧ высокого риска и ИНФ-а цервикальной слизи.

2. Для прогноза риска развития персистирующего течения ПВИ длительностью 12 месяцев: IgA и ИНФ-а цервикальной слизи.

Модель логистической регрессии для определения риска развития персистирующего течения ПВИ длительностью 6 месяцев: Логит (Р) = -

22,3341+(4,2036) * вирусная нагрузка ВПЧ высокого риска (!§ ВПЧ на Ю5 клеток)+ (0,0008) х ИФН-а цервикальной слизи (иг/мл).

Модель логистической регрессии для определения риска развития перси-стирующего течения ПВИ длительностью 12 месяцев: Логит (Р) = -1,2352+(17,8125) х А цервикальной слизи (г/л) + (-0,0012)х ИФН-а цервикальной слизи (пг/мл).

Зная Логит (Р), расчитывается само значение Р - вероятность отнесения пациента к группе риска:

Р = (_I_)

где е - константа, равная 2,718281828. При подстановке значений указанных показателей, полученных при обследовании каждой пациентки, вычисляется значение вероятности отнесения ее к группе риска. Если Р<0,5 пациентку следует причислить к группе отсутствия риска, если Р>0,5 - к группе наличия риска.

Параметры уравнений логистической регрессии с оценкой статистической значимости и диагностической эффективности полученных моделей представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Параметры и характеристики логистической регрессии для прогноза развития и длительности персистирующего течения папилломавирусной инфекции

Показатели Коэффициент регрессии ± стаяд. ошибка Отношение шансов (95% ДИ) Оценка значимости, Р

Траюиторное течение ПВИ - Персистирующее течение ПВИ длительностью 6 месяцев

Вирусная нагрузка ВПЧ высокого риска (1ё ВПЧ на 105 клеток человека1} 4,2036±1,8849 5,8 (1,17-28,76) 0,026

ИФН-а цервикальной слизи (пг/мл) 0,0008 ±0,0005 0,9887 (0,98-1,00) 0,092

Константа -22,3341

2 Модель полностью-. Х[2] =27,058; Р<0,0001; Чувствительность - 85,71%, Специфичность -83,33 %; Площадь под ЮС-кривой - 0,940 ± 0,0463.

Транзиторное течение ПВИ - Персистирующее течение ПВИ длительностью 12 месяцев

IgA цервикальной слизи (г/л) 17,8125 ± 06,9563 54,4Е+006 (65,25 ± 5,4Е+012) 0,010

ИФН-а цервикальной слизи (пг/мл) -0,0012 ±0,0007 0,9988 (0,99 - 1,00) 0,063

Константа -1,2352

2 Модель полностью: Х[2] =22,707; Р=0,0001; Чувствительность - 88,89 %, Специфичность -75%; Площадь под КОС-кривой - 0,917 ± 0,0501

Полученные результаты дают возможность использовать показатели, вошедшие в данные модели, в качестве дополнительных лабораторных маркеров

риска развития персистиругащего течения ПВИ, а также прогнозировать длительность персистенции ВПЧ высокого риска в репродуктивном тракте женщины.

ВЫВОДЫ

1. У женщин с транзиторным и персистирующим течением папиллома-вирусной инфекции установлена высокая частота встречаемости вируса папилломы человека 16 типа. На втором месте при транзиторном течении папилло-мавирусной инфекции находится вирус папилломы человека 52 типа и вообще не определяется вирус папилломы человека 35 типа. При персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 6 месяцев наравне с вирусом папилломы человека 16 типа определяется вирус папилломы человека 52 типа, второе место занимают 31 и 51 типы вируса папилломы человека и не обнаруживаются вообще 39 и 58 типы вируса папилломы человека. При персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 12 месяцев вторым по частоте встречаемости является вирус папилломы человека 31 типа, и в разном проценте случаев выявляются все 12 определяемых типов вируса папилломы человека высокого риска.

2. У женщин с персистирующим течением папилломавирусной инфекции установлена высокая частота инфицирования двумя и более типами вируса папилломы человека высокого риска: при персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 6 месяцев - 50% случаев, при персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 12 месяцев -57,7% случаев.

3. У пациенток с транзиторным и персистирующим течением папилломавирусной инфекции имеются однонаправленные изменения факторов местного иммунитета, заключающиеся в снижении активности, интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа нейтрофилов, увеличении лизосомальной активности этих клеток и уровня ИЛ-2.

4. У женщин с персистирующим течением папилломавирусной инфекции длительностью 6 месяцев отличительными особенностями являются снижение лизосомальной активности полиморфноядерных лейкоцитов и повышение уровней ИФН-а, ИФН-у, [£ С в цервикальной слизи.

5. У женщин с персистирующим течением папилломавирусной инфекции длительностью 12 месяцев установлено снижение интенсивности фагоцитоза нейтрофилов, дефицит ИФН -а и повышение концентраций А, ^ А и М в цервикальной слизи.

6. Персистирующее течение папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины ассоциировано с клинически значимыми показателями вирусной нагрузки вируса папилломы человека высокого риска: при персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 6 месяцев -5,64±0,22 ^ вируса папилломы человека на 105 клеток человека, при персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 12 месяцев -

4,28±0,33 lg вируса папилломы человека на 105 клеток человека.

7. Выявлены корреляционные связи между вирусной нагрузкой вируса папилломы человека высокого риска и иммунологическими показателями цер-викапьной слизи: при транзиторном течении папилломавирусной инфекции -положительная взаимосвязь вирусной нагрузки вируса папилломы человека высокого риска с slg А и отрицательная - с ИФН-у, при персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 6 месяцев - положительные связи между вирусной нагрузкой вируса папилломы человека высокого риска и активностью индуцированного НСТ-теста нейтрофилов, ИЛ-2, ИФН-у и Ig М, отрицательные связи - между вирусной нагрузкой вируса папилломы человека высокого риска и лизосомальной активностью нейтрофилов, общим количеством лейкоцитов и абсолютным содержанием жизнеспособных нейтрофилов, при персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 12 месяцев - между вирусной нагрузкой вируса папилломы человека высокого риска и Ig А цервикальной слизи.

8. Маркерами риска развития персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины длительностью 6 месяцев являются вирусная нагрузка вируса папилломы человека высокого риска и уровень ИФН -а цервикальной слизи. Маркерами риска развития персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины длительностью 12 месяцев являются уровни lg А и ИФН -а цервикальной слизи.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Абрамовских, О.С. Анализ частоты выявления ВПЧ у женщин с пред-раком и раком шейки матки, проживающих в Челябинской области / О.С. Абрамовских, И.Ю. Орнер, Л.Ф.Телешева, К.В. Никушкина, М.А. Беренда // Генодиагностика инфекционных заболеваний: сб.тр. / под ред. В.И.Покровского.-М.: Универ. Книга, Пайс, 2007. - Т.З. - С.75-76.

2. Беренда, М.А. Выявление ВПЧ ВКР у женщин с доброкачественными заболеваниями шейки матки, проживающих в Челябинской области / М.А. Беренда, О.С. Абрамовских, А.Н.Ахматова, Л.Ф.Телешева, К.В. Никушкина // Материалы VII итоговой науч.-практ. конф. молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии. - Челябинск, 2009. - С.16-18.

3. Летяева, О.И. Иммунологические особенности *персистирующей папилломавирусной инфекции шейки матки / О.И. Летяева, О.С. Абрамовских, Л.Ф. Телешева, И.Ю. Орнер, ИЛ. Батурина, М.А. Беренда // Вести. Урал. мед. акад. науки. - 2009. -№2/í. - С.119-120.

4. Долгушина, В.Ф. Клинико-иммунологическая эффективность применения препарата «Ликопид» в лечении хронического цервицита, аасоциирован-ного с ВПЧ-инфекцией / В.Ф. Долгушина, О.С. Абрамовских, И.В. Бойко, А.Н. Ахматова, М.А. Беренда // Всероссийская научно-практическая конференция

«Амбулаторно-поликлиническая практика - платформа женского здоровья»: сб.тез. - М., 2009. - С.62-63.

5. Абрамовских, О.С. Особенности местного иммунитета цервикаль-ного канала у женщин с доброкачественными заболеваниями шейки матки, ассоциированными с одним и более типами ВИЧ ВКР / О.С. Абрамовских, Л.Ф. Телешева, М.А. Беренда, А.Н. Ахматова // Мед. иммунология. -2009. -Т.11, №4-5. - С. 400.

6. Абрамовских, О.С. Особенности состояния местного иммунитета у женщин с хроническим цервицитом, ассоциированным с ВПЧ-инфекцией / О.С. Абрамовских, И.В. Бойко, А.Н. Ахматова, М.А. Беренда // Всероссийская научно-практическая конференция «Амбулаторно-поликлиническая практика -платформа женского здоровья»: сб.тез. - М., 2009- С.3-4.

7. Абрамовских, О.С. Анализ спектра генотипов вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска при цервикальной патологии / О.С. А.6-рамовских, М.А.Зотова, Л.Ф.Телешева // Материалы II Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням. — М., 2010. - С.4.

8. Абрамовских, О.С. Ассоциация вируса папилломы человека высокого канцерогенно риска с сопутствующими урогенитальными инфекциями вирус-но-бактериальной природы / О.С. Абрамовских, Л.Ф. Телешева, М.А. Зотова, О.И. Летяева // Современные аспекты дерматовенерологии: Всерос. науч.-практ.конф.: тез.докл. - М.: Анахарсис, 2010. - С.55-56.

9. Абрамовских, О.С. Вирусная нагрузка при цервикальной патологии, ассоциированной с вирусом папилломы человека / О.С. Абрамовских, Л.Ф. Телешева, М.А. Зотова, B.C. Насонова // Материалы II Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням. - М., 2010. - С. 122.

10. Абрамовских, О.С. Вирусная нагрузка при эктопии шейки матки, ассоциированной с вирусом папилломы человека высокого канцерогенного риска / О.С. Абрамовских, Л.Ф. Телешева, М.А. Зотова, В.Ф. Долгушина, Д.А. Куев-да, Л.В. Плаксина // Молекулярная диагностика: сб.тр. / под ред. В.И.Покровского.- М.: Киселева Н.В., 2010,- Т.З.- С.350-352.

11. Абрамовских, О.С. Инновационный подход к диагностике папилло-мавирусной инфекции урогенитального тракта женщин Челябинской области / О.С. Абрамовских, М.А. Беренда, Л.Ф. Телешева, ИЛО. Орнср, И.Л. Батурина // Оптимизация высшего медицинского и фармацевтического образования: менеджмент качества и инновации: материалы I науч.-практ. конф. —Челябинск: Изд-во ЧелГМА, 2010. - С.11-13.

12. Абрамовских, О.С. Оптимизация диагностики папилломавирусной инфекции в Челябинской области / О.С. Абрамовских, М.А. Зотова, Л.Ф. Телешева, И.Ю. Орнер, И.Л. Батурина, А.Н. Ахматова, К.В. Никушкина, Л.Г. Хав-люк И Материалы Российской науч.-практ. конф. «Стратегия развития онкора-диологической службы в регионах РФ». - Челябинск, 2010. — С.5-6.

13. Зотова, М.А. Особенности течения папилломавирусной инфекции при эктопии шейки матки, ассоциированной с хроническим цервицитом / М.А. Зотова, О.С. Абрамовских, В.Ф. Долгушина, Л.Ф. Телешева, B.C. Насонова //

Молекулярная диагностика: сб.тр. / под ред. В.И.Покровского.- М.: Киселева Н.В., 2010.-T.3.-C.364-366.

14. Абрамовских, О.С. Перспективы использования иммуннокорриги-рующей терапии в лечении папилломавирусной инфекции в сочетании с дис-биозом вагинального биотопа у женщин репродукивного возраста / О.С. Абрамовских, О.И. Летяева, М.А. Зотова // Материалы итоговой юбилейной научной сессии кафедры акушерства и гинекологии ФПК ГОУ ВПО УрГМА Росздрава и ФГУ «НИИ ОММ» Минздравсоцразвтия России. - Екатеринбург, 2010. - С.9-11.

15. Абрамовских, О.С. ПЦР-диагностика папилломавирусной инфекции у девочек подросткового возраста / О.С. Абрамовских, М.А. Зотова, Л.Ф. Телешева, Л.В. Плаксина // Молекулярная диагностика: сб.тр. / Под ред. В.И. Покровского- М.: Киселева Н.В., 2010,- Т.З.- С.352-354.

16. Абрамовских, О.С. Результаты иммунокорригирующей терапии в лечении папилломавирусной инфекции в сочетании с бактериальным вагинозом / О.С. Абрамовских, М.А. Зотова, О.И. Летяева // Современные аспекты дерматовенерологии: Всерос.я науч.-практ. конф.: тез.докл. - М.:Анахарсис, 2010. -С.84-85.

17. Долгушин, И.И. Содержание цитокинов в цервикальной слизи женщин с хроническим цервицитом, ассоциированным с папилломавирусной инфекцией, в зависимости от вирусной нагрузки / И.И. Долгушин, В.Ф. Долгушина, Л.Ф. Тслсшева, О.С. Абрамовских, М.А. Зотова, А.Н. Ахматова II Цнтокины и воспаление. - 2010. -Т.9, №4. - С.20-22.

18. Зотова, М.А. Спектр генотипов и вирусная нагрузка у женщин с эктопией шейки матки и хроническим цервицитом / М.А. Зотова, О.С. Абрамовских, Л.Ф. Телешева, О.И. Летяева // Современные аспекты дерматовенерологии: Всеросс. науч.-практ. конф.: тез. докл. - М.:Анахарсис, 2010. - С.85-86.

19. Зотова, М.А. Факторы врожденного иммунитета цервикального секрета при эктопии шейки матки, ассоциированной с папилломавирусной инфекцией / М.А. Зотова, О.С. Абрамовских, Л.Ф. Телешева // Мед. наука и образование Урала. - 2010. -№3. - С.100-102.

20. Абрамовских, О.С. Характеристика нейтрофилов цервикальной слизи у женщин с хроническим цервицитом, ассоциированным с папилломавирусной инфекцией в зависимости от вирусной нагрузки / О.С. Абрамовских, А.Н. Ахматова, В.Ф. Долгушина, М.А. Зотова, К.В. Никушкина, Л.Ф. Телешева // Рос. аллергол. журн. - 2010. - №5, Вып.1. - С.3-4.

21. Абрамовских, О.С. Характеристика цитокинового статуса при латентной папилломавирусной инфекции / О.С. Абрамовских, В.Ф.Долхушина, И.В.Бойко, М.А.Зотова, К.В. Никушкина, Е.А.Мезенцева // Рос. иммунол. журн. - 2010. - Т. 4 (13), №4 - С.428.

22. Зотова, М.А. Цитокиновый профиль цервикальной слизи у женщин с латентной папилломавирусной инфекцией / М.А.Зотова, В.ФДолгушина, А.Н. Ахматова, Л.Ф.Телешева, И.Ю. Орнер, Е.А.Мезенцева // Вести. Урал. мед. акад. науки. - 2010. - №2/1 (29). - С. 85.

23. ЛСрамовских, О.С. Частота встречаемости вируса папилломы человека высокого канцерогенного риска при патологии шейки матки в Челябинской области / О.С. Абрамовских, В.Ф. Долгушина, Л.Ф. Телеше-ва, М.А. Зотова, Д.А. Куевда // Вестн. Урал. мед. акад. науки. — 2010. -№3 (31).-С. 122-125.

24. Зотова, М.А. Папилломавирусная инфекция у женщин при цитологической норме и цервикальпом эктопии / М.А.Зотова, О.С. Абрамовских // Вестн. Новосиб. Гос. Ун-та. - 2011. - Т.9, Вып.2. - С.48-52.

ДЛЯ ЗАМЕТОК

На правах рукописи

ЗОТОВА Мария Александровна

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ПЕРСИСТИРУЮЩЕГО ТЕЧЕНИЯ ПАПИЛЛОМАВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск-2011

Подготовлено и отпечатано в ПЦ «ПРИНТМЕД». Подписано в печать 18.05.11 г. Формат 60x84 '/,6. Гарнитура Times New Roman Суг. Бумага офсетная. Печать на ризографе. Объем 1 усл. п.л. Тираж 100 экз.

Актуальность проблемы

Папилломавирусная инфекция (ПВИ) является одной из наиболее распространенных инфекций, передаваемых половым путем (Ш11Ш). По данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) число инфицированных за последние десять лет увеличилось более чем в 10 раз, достигнув 23,5% [Белокриницкая Т.Е. и др., 2005; Козаченко В.П. и др., 2009; WHO, 2006]. Чрезвычайно важной представляется проблема ПВИ-в связи с онкогенным потенциалом вируса папилломы человека (ВПЧ) высокого риска, который по данным ВОЗ признан этиологическим агентом рака шейки матки (РШМ)' [WHO, 2006]. Несмотря на высокую распространенность и онкогенный потенциал ВПЧ, высокий процент самопроизвольного регресса ПВИ свидетельствуют о том, что инфицирование является^ необходимым, но недостаточным условием для возникновения РШМ [Новик В.И., 2006]. По данным литературы, главным фактором риска развития неопластической патологии является персистенция онкогенных типов ВПЧ1 [Манухин И.Б., Минкина Г. Н., 2006; Вергейчик Г.И., 2008; Кузнецова Ю.Н. и др., 2009; Schiffinan M., Castle P.E., 2003; Einstein M.H., 2008; Manavi M. et al., 2008; Carcopino X. et al., 2011]. Считается, что канцерогенез является следствием "персистентных инфекций ВПЧ высокого риска" продолжительностью более 6 месяцев [Современные подходы., 2009; Вакцины для профилактики., 2011; Song S.H. et al., 2006; Woodman C.B. et al., 2007; Koshiol J. et al., 2008; Bhat P. et al., 2011]. Тем не менее, понятие "персистирующая инфекция" - это только условное определение и не включает никакого функционального или механистического критерия, который бы опирался на молекулярные события, необходимые для развития канцерогенеза, вызванного ВПЧ. И хотя в настоящее время данный термин широко используется, крайне необходимо дифференцировать точно клинически значимые фазы течения инфекций ВПЧ высокого риска на основе молекулярных показателей [Doeberitz М. К., 2009].

Большую важность приобретают исследования, направленные на поиск вирусологических маркеров, ответственных за развитие персистирующего течения ПВИ [Современные подходы., 2009]. В настоящее время, в качестве таких вирусологических факторов рассматриваются: инфекция, вызванная онкогенными типами ВИЧ, а таюке несколькими типами вируса одновременно; высокая вирусная нагрузка на момент инфицирования; повышенная экспрессия онкобелков Е6 и Е7 ВПЧ; сверхэкспрессия циклин-зависимых киназ pl6INK4a [Шипицына Е.В. и др., 2004; Кубанов A.A., 2005; Мынбаев O.A. и др., 2009; Комплексная борьба., 2010; Вакцины для профилактики., 2011].

Клинические наблюдения, а также данные экспериментальных исследований свидетельствуют о ведущей роли иммунной системы в контроле возникновения, течения и исхода ПВИ [Радионов В.Г. и др., 2002; Баткаев Э.А., Рюмин Д.В., 2003, Роговская С.И., 2005; Сергеева C.JI. и др., 2006; Кузнецова Ю.Н. и др., 2009; Stanley М., 2006]. Поскольку ВПЧ эпителиотропен, особо важное значение имеет состояние системы местной защиты органов репродуктивной системы. У здоровых женщин в результате нормальной работы иммунной системы и механизмов контроля над пролиферацией ВПЧ-инфекция часто имеет транзиторный характер, и вирус спонтанно элиминируется в течение 6-12 месяцев, не вызывая серьезных поражений эпителия. Стойкое угнетение местного иммунитета обусловливает способность ВПЧ к длительной персистенции, что, в свою очередь, может приводить к появлению и разрастанию участков пораженного эпителия по типу тяжелой дисплазии.

Несмотря на многочисленные исследования роли местного, иммунитета в защите от ВПЧ, недостаточно изучены механизмы действия клеточных и гуморальных компонентов мукозального иммунитета на формирование персистенции данного вируса. Учитывая тот факт, что персистенция ВПЧ высокого риска является ключевым событием в малигнизации клеток, необходимо установить факторы, инициирующие этот процесс, и, следовательно, способствующие реализации онкогенного потенциала ВПЧ.

Углубление знаний о природе ВПЧ и механизмах иммунного ответа против данного вируса позволят контролировать течение ПВИ и повысить эффективность лечения ВПЧ-индуцированных заболеваний шейки матки, а своевременное выявление персистирующего инфекционного процесса -повысить эффективность первичного скрининга РШМ.

Цель исследования

Установление иммунологических, молекулярно-биологических особенностей транзиторного и персистирующего течения папилломавирусной инфекции и выявление маркеров персистенции вируса папилломы человека высокого риска.

Задачи исследования

1. Установить типы вируса папилломы человека высокого риска, ассоциированные с транзиторным и персистирующим течением папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

2. Определить показатели вирусной нагрузки вируса папилломы человека высокого риска при транзиторном и персистирующем течении папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

3. Изучить иммунологические показатели цервикальной слизи при транзиторном и персистирующем течении папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

4. Определить взаимосвязи между молекулярно-биологическими и иммунологическими показателями цервикальной слизи при транзиторном и персистирующем течении папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

5. Установить маркеры персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

Научная новизна

Впервые установлен широкий спектр генотипов ВПЧ высокого риска при транзиторном и персистирующем течении ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев. Показано преобладание ВПЧ 16 типа независимо от течения и длительности ПВИ. Впервые установлено, что транзиторное течение ПВИ ассоциировано с ВПЧ 52 типа и инфицированием 1 типом вируса. Персистирующее течение ПВИ характеризуется высокой частотой встречаемости микстинфекции ВПЧ высокого риска и моноинфекции ВПЧ 16 типа. Установлено, что при персистирующем течении ПВИ длительностью 121 месяцев- в> разном проценте случаев определяются 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы ВПЧ высокого риска, в то время как при транзиторном течении ПВИ не установлено случаев инфицирования 35 типом ВПЧ, при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев -39 и 58 типами ВПЧ.

Впервые проведена оценка иммунологических факторов цервикальной слизи в зависимости от длительности персистенции ВПЧ высокого риска. Выявлены общие изменения факторов местного иммунитета, сопровождающие наличие ВПЧ высокого риска в цервикальном канале обследованных женщин: снижение активности, интенсивности фагоцитоза и фагоцитарного числа нейтрофилов, увеличение лизосомальной активности нейтрофильных гранулоцитов и уровня ИЛ-2. Установлено, что персистирующее течение ПВИ длительностью 6 месяцев характеризуется снижением лизосомальной активности нейтрофилов и повышением уровня в на фоне высоких уровней ИФН-а и ИФН-у в цервикальной слизи относительно транзиторного течения ПВИ. Персистирующее течение ПВИ длительностью 12 месяцев сопровождается снижением интенсивности фагоцитарных реакций нейтрофилов, дефицитом ИФН-а и повышенными концентрациями А, ^Аи^Мв цервикальной слизи.

Впервые получены данные по показателям вирусной нагрузки ВПЧ высокого риска в зависимости от длительности персистенции вируса. Установлено влияние вирусной нагрузки ВПЧ высокого риска на факторы локального иммунитета репродуктивного тракта женщины, определяющее развитие и длительность персистирующего течения ПВИ.

Впервые с помощью бинарной логистической регрессии определены маркеры, риска развития и длительности персистирующего течения ПВИ в репродуктивном тракте женщины.

Теоретическая и практическая значимость

Проведенные исследования молекулярно-биологических показателей и иммунологических факторов цервикальной слизи расширяют представление о роли генотипа, концентрации: ВПЧ высокого риска, факторов локальною иммунной системы, в частности, полиморфноядерных лейкоцитов, цитокиновой регуляции и иммуноглобулинов, в развитии и длительности персистирующего течения ПВИ в репродуктивном тракте женщины.

Установленные взаимосвязи между вирусной нагрузкой ВПЧ высокого риска и иммунологическими показателями цервикальной слизи отражают влияние количественного содержания вируса на работу иммунной системы.

На основании комплексного молекулярно-биологического и иммунологического исследования выделены основные маркеры, определяющие риск развития и длительность персистенции ВПЧ высокого риска в репродуктивном тракте женщины. Это позволяет сузить спектр необходимых иммунологических исследований при ведении женщин с ПВИ, а также дает возможность своевременно формировать группы риска по развитию персистирующего течения ПВИ, что, в свою очередь, будет способствовать предотвращению возникновения и прогрессирования пролиферативного процесса.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Транзиторное течение папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины ассоциировано с вирусом папилломы человека 52 типа и инфицированием 1 генотипом вируса, персистирующее течение папилломавирусной инфекции характеризуется высокой частотой встречаемости микстинфекции вируса папилломы человека высокого риска и моноинфекции вируса папиллома человека 16 типа. Персистирующее течение папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины сопровождается высокими концентрациями вируса папилломы человека высокого риска и преобладанием случаев вирусной нагрузки выше 5 1§ на 105 клеток человека.

2. Наличие вируса папилломы человека высокого риска в цервикальном эпителии характеризуется угнетением нейтрофильного звена местного иммунитета, в то время как развитие и длительность персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины определяется состоянием гуморального иммунитета и уровнем интерферонов в цервикальной слизи.

3. Развитие персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины сопровождается изменением не только показателей вирусной нагрузки и местного иммунитета, но и взаимосвязей между ними.

4. Выявленные особенности молекулярно-биологических факторов и иммунологических показателей цервикальной слизи позволяют определить маркеры риска развития и длительности персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований внедрены в клиническую практику женской консультации, МУЗ ГКБ №2 г.Челябинска, в лабораторную диагностику НИИ иммунологии ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава, в педагогическую практику кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, кафедры акушерства и гинекологии №2 ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы на:. VI Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2007); VII-итоговой научно-практической конференции молодых ученых Челябинской государственной медицинской академии (Челябинск, 2009); VII Российской конференции иммунологов Урала (Архангельск, 2009); Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009); VIII Всероссийском форуме «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге - 2009» (Санкт-Петербург, 2009); II-ом Ежегодном конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010); VIII Российской конференции иммунологов Урала (Сыктывкар, 2010), на межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии — междисциплинарные проблемы» (Санкт-Петербург, 2010); VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2010» (Москва,

2010); 4-ой Всероссийской конференции «Иммунология репродукции» (Пермь, 2010).

По теме диссертации опубликовано 24 научные работы, в том числе 9 из перечня изданий, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего работы 155 отечественных и 77 иностранных авторов. Диссертация изложена на 145 страницах компьютерного текста и включает 12 таблиц, 4 рисунка.

выводы

У женщин с транзиторным и персистирующим течением папилломавирусной инфекции установлена высокая частота встречаемости вируса папилломы человека 16 типа. На втором месте при транзиторном течении папилломавирусной инфекции находится вирус папилломы человека 52 типа и вообще не определяется вирус папилломы человека 35 типа. При персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 6 месяцев наравне с вирусом папилломы человека 16 типа определяется вирус папилломы человека 52 типа, второе место занимают 31 и 51 типы вируса папилломы человека и не обнаруживаются вообще 39 и 58 типы вируса папилломы человека. При персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 12 месяцев вторым по частоте встречаемости является вирус папилломы человека 31 типа, и в разном проценте случаев выявляются все 12 определяемых типов вируса папилломы человека высокого риска.

У женщин с персистирующим течением папилломавирусной инфекции установлена высокая частота инфицирования двумя и более типами вируса папилломы человека высокого риска: при персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 6 месяцев - 50% случаев, при персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 12 месяцев -57,7% случаев.

У пациенток с транзиторным и персистирующим течением папилломавирусной инфекции имеются однонаправленные изменения факторов местного иммунитета, заключающиеся в снижении активности, интенсивности: фагоцитоза и фагоцитарного числа нейтрофилов, увеличении лизосомальной активности этих клеток и уровня ИЛ-2.

4. У женщин: с персистирутощим течением, папилломавирусной инфекции длительностью 6 месяцев отличительными особенностями являются снижение лизосомальной активности полиморфноядерных лейкоцитов и повышение уровней ИФН-сц ИФН-у, О в цервикальной слизи.

5. У женщин с персистирующим течением папилломавирусной инфекции . длительностью 12 месяцев установлено; снижение интенсивности фагоцитоза нейтрофилов, дефицит ИФН-а и повышение концентраций А, ^ А и ^ М в цервикальной слизи.

6. Персистирующее течение папилломавирусной; инфекции в репродуктивном-" тракте женщины ассоциировано? с клинически значимыми показателями вирусной- нагрузки; вируса; папилломы человека высокого риска: при персистирующем течении папилломавирусной)инфекции длительностью 6 месяцев - 5,64±0,22 1§ вируса папилломы человека на 105 клеток человека; при персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 12 месяцев - 4,28±0,33 ^ вируса папилломы человека на 105 клеток человека.

7. Выявлены корреляционные связи между вирусной нагрузкой; вируса папилломы человека высокого риска и- иммунологическими показателями; цервикальной слизи: при транзиторном- течении папилломавирусной инфекции - положительная взаимосвязь вирусной нагрузки вируса папилломы человека высокого риска с А и отрицательная — с ИФН-у, при персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 6 месяцев положительные связи между вирусной нагрузкой вируса папилломы человека высокого риска и активностью индуцированного НСТ-теста нейтрофилов, ИЛ-2, ИФН-у и 1§ М, отрицательные связи - между вирусной нагрузкой вируса папилломы человека высокого риска и лизосомальной активностью нейтрофилов, общим количеством лейкоцитов и абсолютным содержанием жизнеспособных нейтрофилов, при персистирующем течении папилломавирусной инфекции длительностью 12 месяцев - между вирусной нагрузкой вируса папилломы человека высокого риска и А цервикальной слизи.

8. Маркерами риска развития персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины ^ длительностью 6 месяцев являются вирусная нагрузка вируса папилломы человека высокого риска и уровень ИФН-а цервикальной слизи. Маркерами риска развития персистирующего течения папилломавирусной инфекции в репродуктивном тракте женщины длительностью 12 месяцев являются уровни ^ А и ИФН-а цервикальной слизи.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Инфицирование ВПЧ ассоциировано со спектром эпителиальных пролиферативных заболеваний урогенитального тракта, способных прогрессировать до инвазивного рака, заболеваемость и смертность от которого продолжает оставаться стабильно высокой в мире [Stanley М., 2003; Muñoz N. et al., 2004; Tong S.Y. et al., 2007]. Тем не менее, РШМ является поздним и редким осложнением ПВИ и возникает на фоне цепи взаимосвязанных процессов, протекающих в течение многих лет. В ходе многочисленных исследований было показано, что в качестве серьезной предпосылки для развития РШМ выступает персистенция ВПЧ высокого риска в цервикальных эпителиоцитах [Song S.H. et al., 2006; KoshioLJ. et al4., 2008; Bhat P. et al., 2011]. В настоящее время нет четкой определенности в отношении факторов, обуславливающих возможность и различные темпы прогрессирования ПВИ [Современные подходы., 2009]. Продолжаются поиски надежных маркеров, как вирусологических, так и иммунологических, позволяющих прогнозировать исход ПВИ.

На основании вышеизложенного, целью нашей работы стало установление иммунологических, молекулярно-биологических особенностей транзиторного и персистирующего течения папилломавирусной инфекции и выявление маркеров персистенции вируса папилломы человека высокого риска.

Для решения поставленных задач было проведено обследование 152 женщин, у которых с помощью молекулярно-биологических методов исследования в соскобе из цервикального канала был обнаружен ВПЧ высокого риска. Для установления факта персистенции ВПЧ высокого риска всем женщинам проводили ВПЧ-тестирование через 6 и 12 месяцев после первичного обнаружения вируса.

При повторном обследовании через 6 месяцев после первичного обнаружения ВПЧ высокого риска у 84 женщин (55,3%) вновь определялась ДНК ВПЧ высокого риска в цервикальном канале шейки матки, через 12 месяцев - у 52 женщин (34,2%). Наши данные совпадают с исследованиями других авторов, в которых показано, что в 70% случаев ПВИ заканчивается спонтанным выздоровлением в течение 1 года [Кулаков В.И. и др., 2005; Роговская С.И., 2005; Прилепская В.Н. и др., 2007; Логунов О.В. и др., 2008; Мынбаев O.A. и др., 2009; Bosh F.X. et al., 2008; Rapóse A., 2009].

На основании полученных данных для выполнения поставленных цели и задач исследования ретроспективно все пациентки с ПВИ были разделены на 3 группы: I группу составили 68 пациенток с отрицательными результатами ВПЧ-тестирования через 6 и 12 месяцев после первичного выявления-ВПЧ высокого риска (транзиторное течение ПВИ), II группу - 32 женщины с персистирующим течением ПВИ, у которых вирус выявлялся только через 6 месяцев после первичного обследования и не выявлялся через 12 месяцев (персистирующее течение ПВИ длительностью 6 месяцев), в III группу вошли 52 женщины с положительным ВПЧ-тестом через 6 и 12 месяцев после первичного обследования (персистирующее течение ПВИ длительностью 12 месяцев). Контрольную группу составили 32 женщины без ВПЧ высокого риска, клинико-морфлогических изменений на шейке матки и иной гинекологической патологии.

Всем ВПЧ-позитивным женщинам было проведено молекулярное генотипирование - дифференциация 12 типов ВПЧ высокого риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы) и количественное определение ДНК вируса методом ПЦР в режиме реального времени. Для оценки состояния местного иммунитета всем пациенткам было проведено иммунологическое исследование цервикальной слизи.

Анализ частоты встречаемости генотипов ВПЧ высокого риска показал преобладание ВПЧ 16 типа как в группе с транзиторным течением ПВИ, так и в группах с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев. Полученные нами результаты согласуются с данными мировых исследований о высокой распространенности ВПЧ 16 типа в популяции [Александрова Ю.Н. и др., 2000; Катханова О.А., 2003; Кубанов А.А., 2005; Евстигнеева Н.П., 2007; Видяева И.Г. и др., 2008, 2009; Никитина Е.Г. и др., 2009; Современные подходы., 2009; Munoz N. et al., 2004; de Sanjose S. et al., 2007; Bosh F.X. et al., 2008]. При персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев наравне с ВПЧ 16 типа выявлялся ВПЧ 52 типа.

На втором месте при транзиторном течении ПВИ находился ВПЧ 52 типа, при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев - ВПЧ 31 и 51 типов, при персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев — ВПЧ 31 типа. Характерной особенностью персистирующего течения ПВИ длительностью 12 месяцев было снижение частоты встречаемости ВПЧ1 52 типа относительно как группы с транзиторным течением ПВИ, так и группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев. Аналогичные результаты получены в работе Е.А. Золотоверхой и соавт. (2007), в которой не было обнаружено персистенции ВПЧ 52 типа [Золотоверхая Е.А. и др., 2007]. Вероятно, инфицирование 52 типом ВПЧ ассоциировано с элиминацией, либо с краткосрочной персистенцией ВПЧ высокого риска.

У женщин с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев в разном проценте случаев встречались все 12 определяемых типов ВПЧ высокого риска, тогда как при транзиторном течении ПВИ не выявлялся ВПЧ 35 типа, при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев - ВПЧ 39 и 58 типов.

Характеризуя частоту встречаемости количества типов ВПЧ высокого риска в исследуемых группах необходимо отметить, что при транзиторном течении ПВИ в 70,6% случаев выявлено инфицирование 1 типом ВПЧ. Особенностью персистирующего течения ПВИ длительностью 6 месяцев была одинаковая частота встречаемости моно- и микстинфекции. В то время как персистирующее течение ПВИ длительностью 12 месяцев было ассоциировано с инфицированием 2 и более типами ВПЧ и встречалось в 57,7% случаев. Сочетание различных генотипов ВПЧ высокого риска снижает скорость элиминации и способствует персистенции вируса. Наши данные согласуются с результатами других исследователей, которые в своих работах пришли к выводу, что инфицирование несколькими типами ВПЧ обеспечивает менее благоприятный прогноз течения ПВИ [Евстигнеева Н.П., 2009; Евстигнеева Н.П., Кузнецова Ю.Н., 2009; Современные подходы., 2009].

Анализ частоты встречаемости типов ВПЧ высокого риска при моноинфекции показал преобладание ВПЧ 16 типа в группах с транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев. Лидирующую позицию при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев занимал ВПЧ 51 типа, частота встречаемости которого в этой группе была выше по сравнению с транзиторным течением ПВИ. При персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев отмечена наиболее высокая частота инфицированности моноинфекцией ВПЧ 16 типа относительно остальных исследуемых групп. По данным литературы, моноинфекция ВПЧ, в особенности высокоагрессивного 16 типа, является неблагоприятным прогностическим фактором течения инфекционного процесса [Коломиец Л.А. и др., 2004; Yamada Т. et al., 1997]. Отраженное в некоторых работах предположение о повышенном риске развития персистенции в случае инфицирования ВПЧ 16 типа [Nielsen А. et al., 2010] нашло подтверждение в нашей работе.

Интересно отметить, что при персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев в виде моноинфекции выявлялось только 4 типа ВПЧ - 16, 31,33 и58 типы. Учитывая, что большая часть определяемых нами генотипов ВПЧ персистировало в кооперации, можно предположить, что способность к персистенции одного типа должна определяться его наиболее мощными функциональными особенностями, позволяющими выработать высокую степень адаптации к иммунной системе организма-хозяина.

Характеризуя типовой состав микстинфекции ВПЧ высокого риска, установлено, что в группах с транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев наиболее часто был идентифицирован ВПЧ 52 типа, в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев - ВПЧ 31 типа. Микстинфекция при персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев характеризовалась низкой частотой встречаемости ВПЧ 52 типа по сравнению с остальными исследуемыми группами. У женщин всех исследуемых групп ВПЧ 18 типа встречался только в виде микстинфекции.

Изучение биологических особенностей транзиторного и персистирующего течения ПВИ в нашем исследовании показало, что лидирующую позицию независимо от исхода ПВИ занимал ВПЧ 16 типа. При этом транзиторное течение было ассоциировано с ВПЧ 52 типа и инфицированием 1 генотипом вируса, в то время как персистирующее течение ПВИ характеризовалось высокой частотой встречаемости микстинфекции ВПЧ высокого риска и моноинфекции ВПЧ 16 типа. В то же время, в большинстве случаев, как при транзиторном, так и при персистирующем течении ПВИ определялись одни и те же генотипы вируса, а при персистирующем течении ПВИ были выявлены все 12 исследуемых типов. Вероятно, для понимания этого факта необходимо более детальное изучение каждого генотипа вируса, так как в некоторых исследованиях показано, что разные внутритиповые варианты ВИЧ, определяемые на основании генетического полиморфизма, различаются* по своей способности вызывать персистирующую инфекцию [Евстигнеева Н.П., Кузнецова Ю.Н., 2009; Xi L.F. et al., 1995; Villa L.L. et al.,,2000; Gagnon S. et al., 2004; Wyant P.S. etal.,2011].

Таким образом, молекулярное генотипирование ВЕЧ высокого риска является эффективным методом установления факта персистенции вируса, что имеет большое практическое значение для своевременного предотвращения прогрессирования патологических изменений цервикального эпителия и развития необратимой неопластической трансформации.

Тем не менее, только тип вируса не является определяющим в развитии персистенции, существуют и другие факторы, влияющие на исход ПВИ. В качестве одного них рассматривается вирусная нагрузка ВПЧ высокого риска [Stanley М., 2003; Song S.H. et al., 2006]. На. сегодняшний день установлено, что количество ВПЧ высокого риска может отражать тяжесть и прогноз течения папилломавирусной инфекции. При правильном и стандартизированном заборе клинического материала вирусная нагрузка менее 105 геномных эквивалентов (ГЭ) ВПЧ высокого риска в соскобе или

3 5

10 ГЭ, приходящихся на 10 клеток человека, считается клинически малозначимой, так как практически не встречается при тяжелой дисплазии и РШМ, а так же ассоциирована с минимальным риском их развития. Напротив, количество вируса более 105 ГЭ, приходящихся на 105 клеток, при установленном факте персистирующего течения инфекции обозначается, как повышенная нагрузка ВПЧ, которая ассоциирована с повышенным риском развития тяжелой дисплазии и чаще встречается при РШМ [Snijders J., 2003].

В нашем исследовании результаты полученных концентраций ДНК ВПЧ высокого риска выражались в 1§ (ВПЧ на 105 клеток человека) и трактовались следующим образом: менее 3 ^ - малозначимая, от 3 до 5 ^ - значимая и более 5 ^ — повышенная вирусная нагрузка.

Исследование показателей и распределения малозначимой, значимой и повышенной вирусной нагрузки ВПЧ высокого рискае в изучаемых группах женщин показало, что средняя концентрация вируса при транзиторном течении ПВИ была 3,26±0,32 ^ ВПЧ на 105 клеток, что- сочеталось с преобладанием в этой группе случаев малозначимой нагрузки (41,2%).

У женщин с персистирующимс течением ПВИ длительностью 6 месяцев средний показатель вирусной нагрузки был достоверно^ выше (5,64±0,22 ВПЧ на 105 клеток), а повышенная вирусная нагрузка встречалась чаще (65,6%), чем в группе с транзиторным течением ПВИ. При этом малозначимая вирусная нагрузка в-данной группе не обнаружена.

При персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев средняя концентрация вирусной ДНК определялась на уровне 4,28±0,33 ^ ВПЧ на 105 клеток, что выше по сравнению с группой транзиторного течения ПВИ, но ниже относительно персистирующего течения ПВИ длительностью 6 месяцев. При этом преобладала значимая1 вирусная- нагрузка, а частота встречаемости повышенной снижалась по сравнению с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что высокая вирусная нагрузка может способствовать персистенции вируса, но не всегда является признаком неблагоприятного исхода ПВИ. В нашем исследовании в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев, несмотря на повышенную вирусную нагрузку у пациенток в итоге.произошла элиминация ВПЧ высокого риска, но для этого потребовалось больше времени по сравнению с группой транзиторного течения ПВИ.

Интраэпителиальный жизненный цикл ВПЧ, отсутствие виремии и продукция вирусных частиц в поверхностных клетках слизистой, расположенных далеко от кровеносного и лимфатического русла, определяют ведущую роль факторов локального иммунитета в процессах инфицирования и, самое главное, вероятности последующего развития заболевания (элиминация или персистенция ВПЧ) [Современные подходы., 2009; Stanley М., 2009; Bhat P. et al., 2011]. Нами было проведена оценка клеточных и гуморальных факторов, уровней цитокинов цервикальной слизи у женщин с транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев.

Полученные результаты показали, что в цервикальной слизи женщин как с транзиторным, так и с персистирующим течением ПВИ установлены однонаправленные изменения* показателей местного иммунитета, характеризующиеся достоверным снижением активности и интенсивности фагоцитоза нейтрофилов, их фагоцитарного числа, увеличением лизосомальной активности нейтрофилов и уровня ИЛ-2.

Нейтрофилы являются« важными функциональными элементами компонентов врожденного иммунитета. Именно они осуществляют первую встречу с патогеном и являются мощными эффекторами воспаления [Олиферук Н.С., 2005; Пинегин Б.В., Маянский А.Н., 2007]. Выявленные нами изменения фагоцитарной реакции нейтрофилов отражают нарушение поглотительной и переваривающей способностей, а также неэффективность их внутриклеточной киллерной функции при ПВИ. В то же время; высокое содержание лизосомальных энзимов свидетельствует об активности и способности нейтрофилов к реагированию на внешние воздействия, посредством реализации кислороднезависимой биоцидности, направленной на уничтожение ВПЧ [Цыганкова О.В., 2009].

Во всех исследуемых группах зарегистрировано повышение уровня

ИЛ-2, который является мощным эндогенным индуктором пролиферации эффекторных клеток, что обеспечивает восстановление их количества при борьбе с инфекцией, и биорегулятором, имеющим определяющее значение для повышения цитотоксичности специфических и естественных киллеров [Ярилин A.A., 1999; Кубанов A.A., 2005; Олина A.A., Падруль В.М., 2006; Кетлинский С.С., Симбирцев A.C., 2008; Новиков Д.К., Новиков П.Д., 2009]. Следовательно, выявленные изменения* свидетельствуют об активации иммунекомпетентных клеток в ответ на присутствие антигенов ВПЧ высокого риска.

В группах с транзиторным и персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев установлено повышение общего количества лейкоцитов и абсолютного содержания жизнеспособных нейтрофилов относительно группы контроля. В группе с персистирующим течением ПВИ* длительностью 6 месяцев эти изменения были на уровне тенденции. Вероятно, полученные данные отражают активацию воспалительного процесса при ПВИ, так как ключевым этапом в защите организма от внедрения антигена является выход нейтрофилов из- кровяного русла по направлению к месту инвазии микроорганизма, где они решают свои эффекторные задачи либо с помощью фагоцитоза, либо путем выделения биологических активных веществ и ДНК в окружающую среду [Тотолян A.A., Фрейдлин И.С., 2000; Долгушин И.И и др., 2009]. Однако при персистирующем течении ПВИ длительностью 6 и 12 месяцев эта активация была менее выражена, о чем свидетельствует снижение абсолютного количества жизнеспособных нейтрофилов в этих группах по сравнению с транзиторным течением ПВИ.

При изучении цитокинового профиля цервикальной слизи установлены однонаправленные изменения, которые заключались в повышении уровней ИФН-а и ИФН-у при транзиторном и персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев. Как известно, интерферонам принадлежит ключевая роль в защите от вирусных инфекций. При этом, противовирусные свойства наиболее выражены у ИФН I типа, в частности ИФН-а, который способен ингибировать практически любую стадию вирусного цикла [Плехова Н.Г., Сомова Л.М., 2010]. Иммуномодулирующее действие ИФН-а проявляется в активации CD-8+ цитотоксических Т-лимфоцитов, NK-клеток, усилении дифференцировки B-лимфоцитов и продукции ими антител со сменой» их изотипа и повышением аффинности, активацией моноцитарно-макрофагальной системы и фагоцитоза, а также- усилении экспрессии молекул MHC-I, что способствует, в первую очередь, амплификации клеточно-опосредованных реакций иммунной системы, которые играют основную роль в противовирусной и противоопухолевой защите организма [Кетлинский С.С., Симбирцев A.C., 2008]. Удельная противовирусная активность ИФН-у ниже, чем у ИФ№а. Несмотря на.то, что ИФН-у обладает прямой антивирусной активностью, основные его- свойства связаны с активацией и регуляцией клеточного иммунитета: являясь продуктом Thl-клеток, он стимулирует активность макрофагов, включает секрецию ими цитокинов, опосредующих развитие воспаления. Следовательно, повышенная экспрессия ИФН-а в группах с транзиторным и персистирующим течение ПВИ длительностью 6 месяцев свидетельствует о работе противовирусных механизмов, а ИФН-^у, выступая в качестве провоспалительного цитокина обеспечивает запуск цитокинового каскада, направленного на формирование очага воспаления с привлечением эффекторных клеток.

Отличительными особенностями группы с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев стало снижение лизосомальной активности полиморфноядерных лейкоцитов и повышение уровня Ig G. Низкие показатели лизосомальных энзимов в цитоплазме нейтрофильных гранулоцитов, по нашему мнению, обусловлены массивной антигенной нагрузкой в этой группе, что приводит к истощению функциональных гранул нейтрофилов. В такой ситуации для успешной борьбы с инфекцией организм реагирует подключением гуморальных факторов иммунитета, что проявлялось в увеличении уровня в - важнейшего иммуноглобулина, определяющего завершенность и эффективность иммунного ответа [Семенов Д.М. и др., 2008] и, в итоге, будет способствовать элиминации ВПЧ из организма. Таким образом, угнетение нейтрофильного звена иммунитета цервикальной слизи в условиях повышенной вирусной нагрузки обуславливают персистирующее течение ПВИ в этой группе, но срок персистенции ВПЧ ограничивается, благодаря запуску 1§ в-иммунного ответа на фоне повышенной экспрессии ИФН-а и ИФН-у.

Персистирующее течение ПВИ длительностью 12 месяцев характеризовалось угнетением интенсивности фагоцитоза нейтрофилов, дефицитом ИФН-а и повышенными концентрациями А, ^ А и ^ М. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что дефицит ИФН-а в цервикальной слизи, который может быть обусловлен как нарушениями в функционировании иммунной системы женщины, так и способностью ВПЧ высокого риска подавлять синтез интерферонов и работу интерферон-сигнальных путей, способствует длительному персистирующему течению ПВИ. Высокие уровни А, А, и М, обеспечивающие первую линию иммунной защиты слизистых оболочек [Евстигнеева В.П., Левчик Н.К., 2007; Карамов. Э.В. и др., 2008; Кишкун А.А., 2009], по нашему мнению, в данной ситуации, малоэффективны против инфекции и сопровождают вирусоносительство, маскируя вирусы и сдерживая их чрезмерную агрессивность [Маянский А.Н. и др., 1998; Чурина Е.Г. и др., 2009].

Таким образом, развитие персистирующего течения ПВИ сопровождается угнетением нейтрофильного звена иммунитета, а длительность персистенции ВПЧ высокого риска - дефицитом ИФН-а в цервикальной слизи.

Одной из существенных характеристик функционирования иммунной системы, помимо определения изменений количественных параметров, является баланс взаимосвязей ее компонентов [Кологривова E.H. и др., 2005; Петленко C.B. и др., 2010]. Картина таких взаимосвязей очень сложна и зависит от большого количества разнонаправленных влияний, следовательно, охарактеризовать всю сеть взаимодействий практически невозможно [Лебедев К.А., Понякина И.Д., 2003]. Учитывая, что ключевая роль в реализации процессов, пролиферации, дифференцировки и активации иммунокомпетентных клеток при включении противовирусного иммунитета принадлежит цитокин-рецепторной сети [Рязанцева Н.В. и др., 2006; Привалова М.А., 2008; Вакцины для профилактики., 2011], мы проанализировали взаимосвязи между уровнями цитокинов и другими иммунологическими показателями цервикальной слизи с помощью непараметрического корреляционного анализа по Спирману.

В ходе исследования установлено, что в группе с транзиторным течением ПВИ чаще всего во взаимосвязях был задействован ФНО-а, который является одним из ключевых цитокинов в реализации противовирусного иммунного ответа, а также в регуляции интенсивности воспаления и эффективности иммунной защиты [Ильина Н.И., Гудима Г.О., 2005; Кривожихина Л.В., Осиков М.В., 2005; Рязанцева Н.В. и др., 2006; Зима А.П. и др., 2007; Кетлинский С.С., Симбирцев A.C., 2008]. Среди связей, установленных для ФНО-а, обращают на себя внимание, с одной стороны, положительные связи ФНО-а - РАИЛ-1, ФНО-а - ИФН-у, с другой стороны . - отрицательные связи ФНО-а - ИФН-а, ФНО-а - ИЛ-4, что свидетельствует о сохранении баланса про- и противовоспалительных цитокинов у женщин данной группы. По данным литературы, ФНО-а может оказывать ингибирующий эффект на рост ВПЧ-инфицированных клеток, который усиливается действием интерферонов [Семенов Д.М. и др., 2008]. Следовательно, установленная положительная взаимосвязь ФНО-а - ИФН-у может свидетельствовать о сопряженности противовирусной активности данных цитокинов в ответ на ПВИ. Таким образом, в данной группе создаются благоприятные условия для реализации полноценного иммунного ответа, направленного на элиминацию ВПЧ высокого риска.

Персистирующее течение ПВИ длительностью 6 месяцев характеризовалось увеличением корреляционных связей по сравнению с транзиторным течением ПВИ. При этом отмечено снижение количества взаимосвязей с участием ФНО-а и увеличение корреляционных связей, установленных для ИЛ-1р. Обращает на себя внимание их положительная -направленность и отсутствие связей ИЛ-1Р с противовоспалительными цитокинами. К тому же, взаимосвязь ИЛ-8 - РАИЛ-1, которая прослеживается во всех трех группах обследованных женщин, в данном случае меняет свое направление и становится отрицательной. Установленные взаимосвязи отражают высокую степень функционального напряжения иммунной системы на фоне активного воспаления, что, по нашему мнению, может быть связано с повышенной вирусной нагрузкой в этой группе.

При персистирующем течении ПВИ длительностью 12 месяцев происходит исчезновение связей между ФНО-а и другими цитокинами и появление отрицательных связей между провоспалительными цитокинами (ИЛ-1р и ИЛ-8) и противовоспалительным ИЛ-10, для которого выявлено максимальное количество связей. Это свидетельствует об изменении баланса системы цитокинов ТЫ и ТЫ типов в пользу последних и угнетении клеточного иммунного ответа. По данным литературы, направленность цитокинового профиля в сторону формирования гуморального иммунного ответа при вирусных инфекциях является прогностически неблагоприятным признаком течения заболевания [Наследникова И.О. и др., 2007; Маркелова Е.В. и др., 2008; Сотниченко С.А. и др., 2009; Konya J., Dillner J., 2001; Stanley M., 2009]. Поэтому, установленные нами взаимосвязи можно рассматривать как патогенетический механизм, опосредующий формирование персистенции ВПЧ высокого риска у женщин этой группы.

Главный принцип функционирования иммунной системы, выработанный в ходе длительной эволюции, состоит в многообразии факторов иммунной защиты, действующих в синергизме или антагонизме друг с другом, обеспечивая два противоположных, но приемлемых исхода взаимоотношений с инфекционным агентом — его элиминацию или «мирное сосуществование», являющееся, по сути, состоянием персистенции. По данным литературы, активация и вовлечение в процесс тех или иных механизмов иммунного ответа, а,, следовательно, и исход инфекционного процесса, определяется-не только степенью патогенности возбудителя, но й зависит от его количества [Железникова Г.Ф., 2006; Наследникова И.О. и др., 2005, 2007; Новиков Д!К., Новиков П.Д., 2009; Devi P.U. et al., 2009; Faust H. et al., 2011]. В нашей работе исследуемые группы отличались по показателям вирусной нагрузки ВПЧ высокого риска. В связи с этим, для установления влияния количества ДНК ВПЧ на механизмы иммунного ответа нами1 был проведен корреляционный анализ между уровнем вирусной нагрузки ВПЧ высокого риска и показателями местного иммунитета в исследуемых группах.

В группе с транзиторным течением ПВИ вирусная нагрузка коррелировала с slg А и ИФН-у. В свою очередь, по результатам корреляционного анализа иммунологических показателей мы установили, что slg А и ИФН-у связаны с уровнем ФНО-а, что свидетельствует о вовлеченности вирусной нагрузки ВПЧ высокого риска в работу иммунных механизмов.

При персистирующем течении ПВИ длительностью 6 месяцев установлены положительные связи между вирусной нагрузкой ВПЧ высокого риска и активностью индуцированного НСТ-теста нейтрофилов, ИЛ-2, ИФН-у и^Ми отрицательные связи - с лизосомальной активностью нейтрофилов, общим количеством лейкоцитов и абсолютным содержанием жизнеспособных нейтрофилов. В свою очередь, ИЛ-2 и М коррелировали с уровнем ИЛ-1(3, а ИФН-у был связан с РАИЛ-1 и ИЛ-10. Интересно обратить внимание на взаимосвязь вирусной нагрузки с ИФН-у, которая была отрицательной, в группе с транзиторным течением ПВИ и стала положительной при персистирующем течении ПВИ. длительностью 6 месяцев. ИФН-у, обладая прямой противовирусной активностью и являясь важнейшим иммунорегулятором, усиливает синтез НЬА-антигенов клетками, что приводит к ускорению процессов распознавания, и переработки антигенов, активирует другие клетки иммунной системы, участвующие в элиминации патогена. Это позволяет сделать вывод об адекватной реакции иммунной системы в ответ на увеличение антигенной нагрузки в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев. Учитывая, что вирусная нагрузка в группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 6 месяцев была выше порога прогрессии (более 5 на 105 клеток человека), увеличение количества взаимосвязей отражает напряженность и согласованную работу факторов местного иммунитета в ответ на массивную антигенную атаку, что, в итоге, обуславливает элиминацию ВПЧ высокого риска, но в течение более длительного времени.

В группе с персистирующим течением ПВИ длительностью 12 месяцев установлено снижение количества взаимосвязей до одной с исчезновением связей, характерных для транзиторного и персистирующего течения ПВИ длительностью 6 месяцев, и появлением новой положительной взаимосвязи между вирусной нагрузкой ВПЧ высокого риска и А. Обращает на себя внимание тот факт, что влияние вирусной нагрузки на иммунологические показатели ограничивалось корреляциями с^Аи ИЛ-4 (через А). Это отражает практически полное отсутствие активации факторов местного иммунитета на выявленную в данной группе женщин дозу антигена (4,28±0,33 ^ ВПЧ на 105 клеток) и препятствует удалению вируса, поддерживая хроническое течение ПВИ.

Таким образом, корреляционный анализ взаимосвязей между уровнем вирусной нагрузки ВПЧ высокого- риска и иммунологическими показателями цервикальной слизи показал наличие существенных различий * в состоянии локальной иммунной системы женщин в зависимости от дозы антигена, что доказывает участие этого4 молекулярно-биологического маркера в иммунологических процессах, определяющих течение и исход ПВИ.

Учитывая, что персистенция ВПЧ высокого риска является основным фактором риска злокачественной трансформации цервикального эпителия, большое значение приобретает поиск прогностических маркеров, определяющих развитие и длительность персистирующего течения ПВИ. Установленные молекулярно-биологические и иммунологические особенности исследуемых групп были использованы для выявления предикторов персистенции ВПЧ высокого риска. Построение прогностических моделей проводилось с помощью метода бинарной логистической регрессии.

Обе модели для интересующих нас переходов содержат по два показателя, для каждого из которых приводится коэффициент регрессии. Для прогноза перехода из группы с транзиторным течением ПВИ в группу персистирующего течения ПВИ длительностью 6 месяцев этими показателями стали вирусная нагрузка ВПЧ высокого риска и ИФН-а цервикальной слизи. Полученная модель является статистически значимой л

X [2]=27,058, р<0,0001) и правильно классифицирует 85,71% случаев развития персистирующего течения ПВИ длительностью 6 месяцев.

Для прогноза перехода из группы с транзиторным течением ПВИ в группу персистирующего течения ПВИ длительностью 12 месяцев этими показателями стали ^Аи ИФН-а цервикальной слизи. Полученная модель л является статистически значимой (% [2]=22,707, р=0,0001) и правильно классифицирует 88,89% случаев развития персистирующего течения ПВИ длительностью 12 месяцев. О высоком качестве разработанных моделей свидетельствует площадь под ЯОС-кривой, равная 0,940±0,0463 для первой модели и 0,917 ± 0,0501 - для второй.

Зная коэффициенты регрессии для полученных показателей, рассчитывается Логит{Р) и далее — само значение Р: где Р — вероятность отнесения пациента к группе риска, а,- -коэффициенты регрессии, Х{ - значения вошедших в модель показателей.

Логит(Р) = Константа + а\Х\ + а2Х2 +. + апХ) п

1) р=

2) где е - константна, равная 2,718281828

При подстановке значений указанных показателей, полученных при обследовании каждой пациентки, вычисляется значение вероятности отнесения ее к группе риска. Если Р<0,5 пациента следует причислить к группе 0 - отсутствие риска, если Р>0,5 - к группе 1- наличие риска.

Полученные результаты дают возможность использовать показатели, вошедшие в данные модели, в качестве дополнительных лабораторных маркеров риска развития персистирующего течения ПВИ, а также прогнозировать длительность персистенции ВПЧ высокого риска в репродуктивном тракте женщины.