Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клиническое значение исследования компонентов активации плазминогена в опухолях толстой кишки

Актуальность темы исследования. В последние годы частота заболевания раком толстой кишки неуклонно возрастает, и по темпам роста заболеваемости эта опухоль занимает первое место среди злокачественных новообразований различных локализаций (Н.Н. Трапезников и Е.М. Аксель, 2001). Вместе с тем, несмотря на успехи, достигнутые в клинической диагностике и совершенствовании хирургических методов лечения, смертность от рака толстой кишки остаётся довольно высокой. При этом у 60%-75% больных при выявлении опухоли одновременно обнаруживаются регионарные и отдалённые метастазы, и продолжительность жизни этих пациентов составляет в среднем 2,2 года (А.М.Гарин, 1980; В.И.Кныш и соавт., 1994).

Многие исследователи дальнейший прогресс в повышении эффективности лечения рака толстой кишки связывают не только с рациональным использованием комбинированных и комплексных методов лечения, но и с разработкой принципиально новых патогенетических методов терапии, основанных на современных достижениях в изучении биохимии и молекулярной биологии опухолей.

В последние годы внимание многих исследователей привлечено к системе активации плазминогена - протеолитическому каскаду, участвующему в разрушении окружающей опухоль базальной мембраны и внеклеточного матрикса, способствуя выходу опухолевых клеток из их первоначального окружения и образованию опухолевых узлов в отдалённых участках (Ellis et al.,1991; Graeff et al., 1992; Mignatti & Rifkin, 1993; Duggan et al., 1995; Bell, 1996). Ключевым звеном этого каскада является сериновая протеаза - активатор плазминогена уро-киназного типа (иРА) - расщепляющая плазминоген до плазмина, уменьшающего уровень внеклеточных матричных гликопротеидов и активирующего некоторые про-металлопротеазы, что играет решающую роль в процессах инвазии и метастазирования. Помимо иРА в образовании плазмина может участвовать также активатор тканевого типа (tPA) (Damjanovich et al., 1994). Активность обоих ферментов подавляется двумя белковыми ингибиторами, принадлежащими к семейству серпинов-PAI-l, PAI-2 (Andreasen et al., 1990).

Результаты ряда клинических исследований свидетельствуют о том, что изучение компонентов активации плазминогена является весьма перспективным с клинической точки зрения при опухолях различных локализаций (Е.С.Герштейн и Н.Е.Кушлинский, 2001; Duffy, 1999), главным образом при раке молочной железы (Look et al., 2000; Kim et al., 1998). При этом наиболее значимыми показателями являются, по-видимому, иРА и PAI-1, повышенный уровень которых свидетельствует о неблагоприятном прогнозе заболевания (Schmitt et al., 1997; Thomssen et al., 1998; Harbeck et al., 1998).

Работы, посвященные изучению роли системы активации плазминогена при раке толстой кишки, многообразны и неоднозначны, однако предварительные результаты (Gelister J.S. et al.,1986; Bruin

P.A. et al.,1988; Naitoh, H. et al., 1995 и др.) свидетельствуют о том, что высокий уровень иРА в опухолевой ткани и высокое соотношение uPA/tPA в макроскопически неизменённой слизистой толстой кишки являются признаками неблагоприятного прогноза заболевания.

Цель исследования: оценить клинические перспективы определения содержания компонентов системы активации плазминогена (uPA, PAI-1 и tPA) в опухолях толстой кишки.

Задачи исследования:

1. Иммуноферментным методом определить концентрации uPA, tPA и PAI-1 в цитозолях опухолей и гистологически неизмененной слизистой толстой кишки на расстоянии 3 см дистально и 10 см проксимально от опухоли.

2. Сопоставить уровни uPA, tPA и PAI-1 в злокачественных опухолях толстой кишки, в непоражённой опухолевым процессом слизистой толстой кишки на различном расстоянии от первичной опухоли и в доброкачественных полипах толстой кишки.

3. Оценить влияние предоперационного лучевого лечения на содержание uPA, tPA и PAI-1 в опухолях и в неизменённой слизистой толстой кишки.

4. Оценить взаимосвязь содержания uPA, tPA и PAI-1 в опухолях толстой кишки с основными клинико-морфологическими особенностями заболевания (стадией процесса, локализацией и гистологическим строением опухоли, полом и возрастом больных).

5. Выявить возможные варианты рака толстой кишки, отличающиеся по содержанию различных компонентов системы активации плаз-миногена, и обосновать возможность использования этих показателей для повышения эффективности терапии заболевания.

Научная новизна и практическая значимость исследования: впервые исследовано содержание трех важнейших компонентов системы активации плазминогена (uPA, tPA и PAI-1) в опухолях и двух разноудаленных участках слизистой толстой кишки больных РТК. На основании статистического анализа полученных данных впервые показано, что уже при ранних стадиях заболевания РТК характеризуется значительным усилением активации плазминогена по урокиназному типу по сравнению с гомологичной нормальной тканью и доброкачественными полипами толстой кишки. На более поздних стадиях происходит также увеличение экспрессии PAI-1 и снижение экспрессии tPA. Приоритетным является также исследование корреляционных взаимоотношений различных компонентов системы активации плазминогена в опухолевой и гстологически неизмененной ткани толстой кишки.

Полученные результаты могут стать основанием для использования специфических ингибиторов uPA, обладающих антиметастатическим и антиангиогенным эффектом, в адъювантном лечении РТК.

Апробация работы: материалы диссертации доложены на VIII и X Национальном Конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001 и

2003 г.г.), на Ученом совете НИИ КО РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН (май 2001 г.), на Всероссийской конференции «Проблемы медицинской энзимологии» (Москва, 2002), представлены на Конференции Международного общества специалистов в области фибринолиза и протеолиза (ISFP; Мюнхен, 2002).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Основные положения, выносимые на защиту: Усиление активации плазминогена по урокиназному типу в ткани РТК как основа для целенаправленного использования специфических антиметастатических препаратов.

-98 -ВЫВОДЫ

1. В опухолях 78-80% больных раком толстой кишки уровни активатора плазминогена урокиназного типа (uPA) и ингибитора активаторов плазминогена первого типа (PAI-1) достоверно повышены по сравнению с непораженной слизистой на расстоянии 3 см дистально и 10 см проксимально от опухоли; уровень активатора плазминогена тканевого типа (tPA) снижен по сравнению с непораженной слизистой в опухолях 75% больных.

2. Концентрации изученных компонентов системы активации плазминогена в непораженной опухолью слизистой больных РТК на расстоянии 3 и 10 см от края опухоли достоверно не отличаются.

3. В доброкачественных полипах толстой кишки концентрация uPA ниже, чем в РТК, но выше, чем в неизмененной слизистой, концентрация PAI-1 не отличается от нормы, а концентрация tPA выше, чем в злокачественных опухолях и неизмененной слизистой толстой кишки.

4. Концентрации tPA в опухолевой ткани и неизмененной слизистой толстой кишки положительно коррелируют (г=0,77 для расстояния 3 см; г=0,86 для расстояния 10 см; р<0,0001), а концентрации uPA и PAI-1 в опухолевой ткани не связаны с уровнем соответствующих белков в окружающей слизистой, но положительно коррелируют между собой (R=0,39; р<0,001).

5. Предоперационная лучевая терапия не влияет на концентрацию компонентов системы активации плазминогена в опухолях и слизистой толстой кишки больных РТК. Эти показатели не зависят также от пола и возраста больных, локализации опухоли, наличия или отсутствия рецидива в первый год после операции.

6. Увеличение экспрессии uPA и PAI-1 в ткани рака толстой кишки по сравнению с непораженной слизистой происходит уже на II стадии заболевания; концентрации этих белков в опухоли и слизистой не зависят от стадии заболевания. Экспрессия tPA в опухолевой ткани достоверно снижена по сравнению с непораженной слизистой только при III и IV стадиях РТК, но при этом общий уровень tPA как в слизистой, так и в опухоли достоверно увеличивается со стадией.

7. Иммуноферментное исследование состояния системы активации плазминогена в опухолях и окружающей слизистой больных РТК показало, что уже на ранних стадиях заболевания проявляется характерное для большинства злокачественных опухолей усиление активации плазминогена по урокиназному типу, которое может быть основой для использования антиметастатических препаратов направленного действия.

Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработка новых патогенетических методов адъювантной терапии рака толстой кишки является одним из наиболее перспективных направлений в области исследования данного заболевания, поскольку, несмотря на значительные достижения хирургии и улучшение диагностических методов, большинство больных поступают на лечение с распространенным процессом, требующим комплексного лечения. В то же время, РТК относится к числу заболеваний, мало чувствительных к традиционным видам химиотерапии.

В последние годы большое внимание исследователей привлекает так называемая направленная биотерапия злокачественных опухолей, суть которой сводится к избирательному воздействию на ключевые биологические системы, участвующие в регуляции пролиферации, дифференцировки, метастазирования и инвазии опухолей.

Система активации плазминогена - это каскад протеолитиче-ских реакций, который играет одну из ведущих ролей в инвазии и метастазировании злокачественных опухолей различной локализации и тканевого происхождения. В последние годы показано, что протеазы, входящие в систему активации плазминогена, способствуют также распространению новых сосудов в опухоли и являются важными составляющими процесса неоангиогенеза.

В связи с этим вся система активации плазминогена в целом и ее отдельные компоненты, в первую очередь uPA, являются перспективными мишенями направленной антиметастатической и ан-тиангиогенной биотерапии опухолей. В экспериментальных и предклинических исследованиях уже проходит испытания ряд подобных препаратов: это природные или синтетических ингибиторы ферментативной активности uPA, антисмысловые олигонуклеоти-дов к uPA, PAI-1 или uPA-рец, моноклональные антитела к uPA или его рецептору для предотвращения их взаимодействия и др.

В то же время, для эффективного использования подобных препаратов в клинике необходимо выявить нозологические формы опухолей и группы больных, у которых можно ожидать наибольшего эффекта. Важным моментом является также соотношение содержания белка-мишени в опухоли и окружающей неизмененной ткани. Представленные в литературе экспериментальные и клинические данные об исследовании системы активации плазминогена при раке толстой кишки достаточно многообразны и свидетельствуют о потенциальной клинической значимости этих показателей как для выбора стратегии и тактики лечения самого РТК, так и для оценки риска малигнизации доброкачественных полипов. Тем не менее, многие вопросы до сих пор не имеют однозначного ответа.

Кроме того, для внедрения исследования показателей системы активации плазминогена в клиническую практику необходима стандартизация методических подходов и выработка адекватных количественных критериев прогноза и лекарственной чувствительности.

Все это и определило цели и задачи настоящего исследования, в которое вошли 79 больных РТК оперированных в отделении проктологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, и несколько больных доброкачественными полипами толстой кишки. Для установления специфичности наблюдаемых изменений для опухолевой ткани у больных РТК одновременно с опухолью исследовали также два участка непораженной опухолевым процессом слизистой на расстоянии 3 см в дистальном направлении и 10 см в проксимальном направлении от края опухоли.

Определение трех компонентов системы активации плазминогена: двух активаторов (uPA и tPA) и их ингибитора первого типа мы проводили с помощью чувствительных, хорошо воспроизводимых наборов для иммуноферментного анализа, разработанных в Лаборатории эндокринологии Католического университета г. Най-меген (Нидерланды) специально для исследования цитозолей тканей (Grebenschikov N. и соавт., 1997). Ранее эти наборы хорошо зарекомендовали себя при исследовании различных злокачественных опухолей (Е.С.Герштейн, Н.Е.Кушлинский, 1999, 2001; Е.С. Гер-штейн и соавт., 2000, 2001а,б).

Как и предполагалось, средние и медианные уровни uPA и PAI-1 были достоверно повышены в опухолях больных РТК по сравнению с гистологически неизмененной слизистой на расстоянии как 10, так и 3 см от опухоли. При этом при индивидуальном анализе оказалось, что повышение уровня uPA отмечается у 78% обследованных больных, а повышение уровня PAI-1 - у 80%. Средние и медианные уровни tPA были достоверно снижены в опухолях по сравнению со слизистой толстой кишки, причем такое соотношение отмечено у 75% больных. Таким образом, мы показали, что РТК так же, как многие другие злокачественные опухоли (Е.С.Герштейн, Н.Е.Кушлинский, 2001) характеризуется значительным усилением активации плазминогена по урокиназному типу и может оказаться чувствительным к препаратам, направленным на подавление этого процесса. Эти результаты согласуются также с данными многих исследователей, работавших как количественными биохимическими, так и полуколичественными иммуногистохи-мическими методами (см. Главу 1).

Интересные закономерности были выявлены при анализе корреляционных взаимоотношений между различными показателями в опухолевой и гистологически неизмененной тканях толстой кишки. Так, концентрации tPA в опухолевой ткани и неизмененной слизистой высоко достоверно (р<0,0001) положительно коррелировали (г=0,77 для расстояния 3 см; г=0,86 для расстояния 10 см), что свидетельствует о том, что уровень tPA в опухоли, хотя и снижается, но зависит от состояния слизистой.

В то же время, концентрации иРА и PAI-1 в опухолевой ткани не были взаимосвязаны с уровнем соответствующих белков в окружающей слизистой толстой кишки, но положительно коррелировали между собой. Такие корреляционные соотношения позволили предположить, что усиление экспрессии иРА и PAI-1 в опухолевой ткани взаимосвязано, но не зависит от их исходного уровня в слизистой толстой кишки. Это наблюдение свидетельствует о взаимосвязи повышенной экспрессии этих белков со злокачественным перерождением слизистой толстой кишки.

Высокий уровень tPA в нормальной слизистой может указывать на противоположную, по сравнению с активатором уроки-назного типа, роль tPA в процессах инвазии и метастазирования опухолей: он может, например, разрушать опухолевые клетки, защищая окружающие ткани от их инвазии (Huber К. и соавт., 1988).

Противоположная роль активаторов плазминогена уроки-назного и тканевого типов особенно наглядно прослеживалась при сравнении соотношения uPA/tPA в опухолевых и нормальных тканях. В 57% образцов РТК это соотношение было больше единицы, а в 78 из 79 (99%) образцов нормальной слизистой на обоих расстояниях от опухоли оно было меньше единицы, т.е. в большинстве злокачественных опухолей преобладала экспрессия иРА, а практически во всех образцах нормальной слизистой толстой кишки преобладала экспрессия tPA.

Можно предположить, что именно опухоли с высоким соотношением uPA/tPA окажутся наиболее чувствительными к ингибиторам активации плазминогена по урокиназному типу. Наибольшей избирательности при этом следует ожидать в тех случаях, когда уровень uPA в опухоли максимально превышает его концентрацию в нормальной слизистой.

Включение в наше исследование доброкачественных полипов толстой кишки имело своей целью установление возможности выявления полипов с высоким риском малигнизации на основании определения уровня протеаз, стимулирующих и/или подавляющих инвазию. О такой возможности свидетельствовал целый ряд опубликованных работ (например, Protiva Р. и соавт., 1998). К сожалению, из-за небольшого количества исследованных полипов эту задачу полностью решить не удалось, хотя было показано, что полипы характеризуются промежуточными между злокачественными опухолями и неизмененной слизистой показателями uPA, таким же, как РТК уровнем PAI-1 и самым высоким уровнем tPA.

Таким образом, можно предположить, что в доброкачественных полипах существует баланс между двумя активаторами плазминогена, играющими противоположную роль в опухолевом процессе: инвазивное действие uPA уравновешивается высокой активностью tPA, защищающего окружающую ткань от проникновения опухолевых клеток. По-видимому, полипы с повышенным соотношением uPA/tPA могут оказаться наиболее склонными к малигни-зации. Для подтверждения этой гипотезы необходим дальнейший набор материала по доброкачественным полипам и длительное динамическое наблюдение за больными.

Еще одним важным приложением результатов исследования компонентов системы активации плазминогена в опухолях и окружающих тканях может быть использование их в качестве факторов индивидуального прогноза течения заболевания. Известно, в частности, что высокий уровень uPA и PAI-1 в опухоли является фактором неблагоприятного прогноза рака молочной железы даже на ранних стадиях и в группах с хорошим прогнозом по другим показателям (например, при рецепторположительных опухолях) (Look et al., Harbeck et al., 1997).

Наиболее адекватным методом оценки прогностической значимости, безусловно, является сравнение безрецидивной и общей выживаемости в группах с различным уровнем изучаемых показателей, однако, определенное представление о ней можно получить и исследуя взаимосвязь их экспрессии с известными клиническими и морфологическими факторами прогноза.

Самым значимым прогностическим фактором является клиническая стадия заболевания. Большинство обследованных нами больных имели распространенный процесс: у 59,5% была III стадия заболевания, у 31,6% - IV стадия.

Оказалось, что уже на ранних стадиях заболевания уровень uPA в опухоли достоверно повышен по сравнению со слизистой толстой кишки, удаленной на 3 и 10 см от опухоли. Эти различия сохраняются и при более поздних стадиях, при этом степень активации uPA по сравнению со слизистой на расстоянии 3 см от опухоли не зависит от стадии опухолевого процесса, а по сравнению со слизистой на расстоянии 10 см — увеличивается при более поздних стадиях.

Уровень PAI-1 в ткани РТК был также достоверно повышен уже на ранних стадиях, и эти изменения сохранялись и при распространенном процессе.

Более сложная картина наблюдалась для tPA. На ранних стадиях РТК уровень этой протеазы в опухоли достоверно не отличался от показателей гистологически неизмененной слизистой. При III и IV стадии экспрессия tPA в опухоли достоверно снижалась по сравнению с окружающей слизистой данного больного, однако, в целом концентрация tPA как в опухоли, так и в слизистой увеличивалась с увеличением стадии заболевания. В результате этого проявилась достоверная отрицательная взаимосвязь стадии заболевания и соотношения uPA/tPA в опухоли (R= -0,37) и отношения концентрации uPA в опухоли к концентрации tPA в слизистой на расстоянии 3 см (R= -0,40) и 10 см (R= -0,32).

Таким образом, увеличение экспрессии иРА и PAI-1 на ранних стадиях РТК свидетельствует о высокой инвазивности этой опухоли даже на ранних этапах ее развития. На поздних стадиях сохраняется высокий инвазивный потенциал, обусловленный высоким уровнем иРА и защитного ингибитора PAI-1, но одновременно в опухоли и окружающей ткани усиливается активация плазминогена по тканевому типу, что свидетельствует об индукции защитных механизмов в окружающей ткани и некротических процессов в опухоли. Эти изменения наиболее выражены при IV стадии РТК.

К сожалению, нам практически не удалось провести значимый статистический анализ взаимосвязи экспрессии компонентов системы активации плазминогена с таким важнейшим морфологическим фактором прогноза, как степень дифференцировки опухоли. Это связано с преобладанием умереннодифференцированных опухолей в исследованном нами материале. Тем не менее, можно было отметить более высокий уровень иРА и более низкий - tPA при низкодифференцтрованных опухолях по сравнению с высоко- и умереннодифференцированными. Это косвенно свидетельствует в пользу предположения о неблагоприятной роли высокой экспрессии иРА в прогнозе онкологических заболеваний, в частности, при раке толстой кишки (Mulcahy Н.Е. и соавт., 1994).

Были проанализированы также возможные взаимосвязи экспрессии компонентов системы активации плазминогена с такими факторами, как пол и возраст больных, локализация опухоли, использование облучения в предоперационном периоде, однако, значимых в теоретическом и практическом плане закономерностей выявлено не было. Сопоставление изучаемых показателей в группах больных с ранним рецидивом РТК и больных, прослеженных в течение года и находящихся в ремиссии, обнаружено лишь достоверное повышение уровня PAI-1 в слизистой на расстоянии 3 см от опухоли в группе рецидивировавших больных. Мы полагаем, что дальнейшее наблюдение за больными позволит выявить более значимые для прогноза закономерности.

Подводя общий итог проведенного исследования состояния системы активации плазминогена в опухолях и окружающей слизистой толстой кишки больных РТК, можно заключить, что уже на ранних стадиях РТК проявляется характерное для большинства злокачественных опухолей усиление активации плазминогена по урокиназному типу, которое может быть основой для использования препаратов направленного действия. Есть основания полагать также, что уровень и соотношение экспрессии двух типов активаторов плазминогена могут стать значимыми показателями для выявления полипов толстой кишки с высоким риском малигнизации и для прогнозирования течения РТК после радикальной операции.