Автореферат и диссертация по медицине (14.00.46) на тему:Клиническая значимость ключевых маркеров ангиогенеза, апоптоза и системы активации плазминогена в сыворотке крови и опухоли больных колоректальным раком

На правах рукописи

головков

Дмитрий Анатольевич

Клиническая значимость ключевых маркеров ангиогенеза, апоптоза и системы активации плазминогена в сыворотке крови и опухоли больных колоректальным раком

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика 14.00.14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

0034В0003

Москва - 2009 г.

003460003

Работа выполнена на кафедре клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПДО «Московский государственный медико-стоматологический университет» Росздрава

Научные консультанты:

член-корреспондент РАМН, профессор Н.Е.Кушлинский

доктор медицинских наук

В.В.Делекторская

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Н.Ю.Полонская доктор медицинских наук, профессор Ю.А.Барсуков

Ю.А.Барсуков М.Н.Обушева

доктор медицинских наук

Ведущая организация: Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова

Диссертационного Совета (Д.2( едицинской

академии последипломного образования по адресу: (123995, г.Москва, ул.Баррикадная 2/1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российской медицинской академии последипломного образования (125445, г. Москва, ул. Беломорская

Защита диссертации состоится

заседании

19).

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор

В.Т.Морозова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В последние годы в большинстве стран мира, в том числе и в нашей стране, наблюдается рост заболеваемости колоректальным раком (Г.И.Воробьев и соавт., 2005; Hawk Е.Т. et al., 2002; Levin В. et al., 2005). Ежегодно в мире регистрируется около 1 млн. новых случаев рака прямой и ободочной кишки (3-й по частоте показатель заболеваемости среди онкологических болезней), а умирает почти 500 тыс. человек (4-е место по показателю смертности) (В.В.Мартынюк, 2000; Н.Н.Симонов и соавт., 2000; Н.Н.Трапезников и соавт., 2000; Parkin D.M. et al., 1999; Engstrom P.F., 2000).

По прогнозу ожидается, что в XXI веке в России рак данной локализации займет первое место в структуре онкологической заболеваемости (Н.Н.Симонов и соавт., 1997; Н.А.Яицкий и соавт., 2004; Е.М.Аксель и соавт., 2004). В России ежегодно колоректальным раком заболевают 50 тыс. человек (3-е место у мужчин после рака легких и желудка и 2-е место у женщин после рака молочной железы) при ежегодной смертности, равной 35 тыс.

Метастазы являются основным фактором, отягощающим прогноз колоректального рака. Поэтому в настоящее время проводится активный поиск дополнительных маркеров, которые предсказывают высокий риск опухолевой прогрессии (В.И.Киселев и соавт., 2005).

В настоящее время бурно развивается направление молекулярной , диагностики и оценки прогноза этих опухолей, а исследование особенностей биологического поведения опухоли является в настоящее время одной из наиболее актуальных областей онкологии (А.А.Новик и соавт., 2004; Von Kleist S., 2008). Расширяются возможности иммуногистохимического выявления в клетках колоректального рака и в структурах внеклеточного матрикса особенностей экспрессии молекулярных маркеров, отражающих специфику биологической активности опухоли (В.В.Делекторская и соавт., 2008; Muller W. et al., 1998; Sarris M. et al., 2001; Ahmed F.E. et al., 2005). Среди опухолеассоциированных протеолитических ферментов ведущую роль играет ^ система активаторов плазминогена, представленная двумя протеазами -л \ тканевым и урокиназным активаторами плазминогена (иРА и tPA), а также Р

металлопротеиназная система, состоящая из 25 представителей (Н.Е.Кушлинский и соавт., 2008). Ключевую роль в семействе металлопротеиназ играют ММР-2 и ММР-9, функция которых связана с гидролизом коллагена базальных мембран (Е.С.Герштейн и соавт., 2008). иРА и tPA превращают неактивный зимоген плазминоген в плазмин, расщепляющий фибрин и белки внеклеточного матрикса, а также активирующий ММР-2 и ММР-9. Эти процессы способствуют разрушению базальных мембран и облегчают инвазию опухолевых клеток. При этом важную роль в опухолевой профессии играют и их эндогенные ингибиторы (TIMP и PAI), которые могут способствовать протеолитическому действию ферментов (Gershtein Е. et al., 2007). ММР, сериновые протеазы (uPA, tPA) не только облегчают опухолевый рост, раковую инвазию и метастазирование, но и могут являться мишенью для противоопухолевой терапии и лечения метастазов (Е.С.Герштейн и соавт., 2007; Mysliwill A.G. et al., 2002; Waas E.T. et al., 2002; Gontero P. et al., 2004).

Основные белки базальных мембран (коллаген IV типа и ламинин) являются не только структурным барьером для метастатического распространения раковых клеток, но и важной функциональной единицей, участвующей в опухолевой прогрессии (Galbavy S. et al., 2002).

При этом деградирующие матрикспротеиназы не только ремоделируют архитектуру внеклеточного матрикса, но и воздействуют на различные пути передачи сигнала в клетке, усиливают ангиогенез и способствуют уклонению опухоли от программы апоптоза (Г.И.Абелев и соавт., 2008). Так, известно, что ключевым проангиогенным фактором является фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) - гликопротеин, стимулирующий пролиферацию эндотелиальных клеток. Этот фактор усиленно продуцируется также клетками ряда новообразований, способствуя неоваскуляризации опухоли и усилению проницаемости сосудов (Gershtein E.S. et al., 2006; Shin J.E. et al., 2007).

Апоптоз или его отдельные элементы выполняют важные физиологические функции, при этом преодоление апоптоза является необходимым условием успешного развития опухоли (С.Г.Аббасова и соавт., 2007). Один из механизмов, регулирующих эти процессы в опухоли, связан с

активностью апоптоз-специфических белков системы Fas/FasL (Bennett M.W. et al., 2001; O'Connell J. et al. 2000; Zhu Q. et al., 2005; Song E. et al., 2001).

Относительно недавно получены первые клинические исследования по неоангиогенезу и Fas-зависимому апоптозу при солидных опухолях, в том числе и колоректальном раке (С.Г.Аббасова и соавт., 2007). Показано, что повышенный уровень продукции ключевого активатора ангиогенеза - VEGF и ингибитора апоптоза - растворимого Fas (sFas) у больных некоторыми злокачественными новообразованиями может свидетельствовать о высоком «метастатическом потенциале» опухоли, что является неблагоприятным прогностическим фактором (А.А.Фильченков и соавт., 1999; С.М.Киселев и соавт., 2003). Однако эти данные основаны пока на незначительном числе наблюдений. Кроме того, не изучали одновременно факторы ангиогенеза и апоптоза с использованием малоинвазивных биохимических методов исследования в сыворотке крови, что также затрудняет обсуждение представленных в литературе результатов.

Влияние молекулярных факторов при раке толстой кишки на клиническое течение и прогноз заболевания изучено недостаточно, несмотря на то, что накапливается все больше данных о нарушениях их нормальной экспрессии и функционирования. Многие вопросы, касающиеся корреляции клинико-морфологических характеристик опухоли и изменений биологических показателей, происходящих в процессе прогрессирования рака толстой кишки, нуждаются в уточнении. Этим определяется актуальность изучения молекулярных критериев, прогнозирующих агрессивность течения колоректального рака.

Цель работы - изучить особенности экспрессии молекулярно-биологических маркеров внеклеточного матрикса, ангиогенеза, апоптоза в опухоли, сыворотке крови больных раком толстой кишки и роли комплекса этих факторов в оценке прогноза заболевания.

Задачи исследования. 1. Изучить биохимические и иммуногистохимические особенности экспрессии ММР-9 в первичных опухолях больных раком толстой кишки и в

прилежащей к опухоли непораженной слизистой оболочке.

2. Исследовать особенности экспрессии структурных компонентов базальных мембран (коллагена IV типа) в злокачественных опухолях толстой кишки.

3. Провести сравнительный анализ особенностей экспрессии ферментов внеклеточного матрикса и компонентов базальных мембран и выявить их взаимосвязь с основными клиническими и морфологическими параметрами заболевания.

4. Провести иммуноферментное определение молекулярно-биологических маркеров неоангиогенеза (УЕСБ) и апоптоза (зБаБ) в сыворотке крови больных раком толстой кишки и изучить корреляцию биохимических показателей с основными клинико-морфологическими параметрами заболевания.

5. Провести иммуноферментное определение содержания компонентов системы активации плазминогена (иРА, 1РА, РА1-1) в опухоли больных колоректальным раком и изучить корреляцию биохимических показателей с основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания.

6. Определить прогностическую значимость биохимических и иммуногистохимических особенностей экспрессии белковых маркеров у больных раком толстой кишки.

7. Провести статистическую обработку данных и на основании многофакторного анализа результатов исследования выделить значимые и независимые прогностические показатели при раке толстой кишки.

Научная новизна.

Проведен комплексный клинический, морфологический и биохимический анализ современных молекулярно-биологических маркеров у больных раком толстой кишки, таких как протелитические ферменты и компоненты внеклеточного матрикса, факторы неоангиогенеза и апоптоза.

Обнаружена повышенная экспрессия ММР-9 в ткани опухоли больных раком толстой кишки у 48,7% пациентов. При этом, частота выявления высокой экспрессии белка достоверно повышалась до 80% у больных при метастазах в печени, при низкой степени дифференцировки опухоли (80%) и

при наличии инвазии опухоли в кровеносных сосудах (82,4%).

У 57,2% больных раком толстой кишки выявлена низкая экспрессия коллагена IV типа в опухоли, причем частота выявления низкой экспрессии белка достоверно повышалась у пациентов с метастазами в печени (85%), при низкой степени дифференцировки опухоли (76%), при выраженной глубине инвазии в стенку кишки (75%), а также при наличии инвазии клеток рака в кровеносные сосуды (86,3%).

Обнаружено, что уровень ключевого активатора неоангиогенеза УЕБР в сыворотке крови больных раком толстой кишки был достоверно выше по сравнению с контролем. Причем, достоверно более высокое содержание УЕвР выявлено в сыворотке крови больных при местнораспространенной и IV стадии колоректального рака, тогда как концентрация УЕвР у больных раком толстой кишки при I и Иа стадиях опухоли не отличалась от содержания маркера у практически здоровых людей.

Содержание маркера достоверно повышалось при увеличении глубины инвазии опухоли в стенку кишки и при наличии инвазии опухоли в кровеносных сосудах. Содержание УЕвР при низкой степени дифференцировки колоректального рака было достоверно выше, чем при высокой. Одновременно с увеличением концентрации УЕвР в сыворотке крови больных раком толстой кишки обнаружено достоверное повышение в опухоли уровня неблагоприятно высокой экспрессии ММР-9 и одновременно низкая экспрессия коллагена IV типа.

Впервые обнаружено, что эРаэ выявлялся в 2 раза чаще у больных колоректальным раком по сравнению с контролем, а его содержание в сыворотке крови практически здоровых людей было ниже, чем у больных. При этом уровни БраБ в сыворотке крови больных раком толстой кишки зависели от стадии заболевания, хотя при I стадии не отличались от содержания маркера у практически здоровых людей. Достоверно выше было содержание Браэ при значительной глубине инвазии, при наличии инвазии в кровеносные сосуды, при неблагоприятных уровнях экспрессии белков ММР-9 и коллагена IV типа.

Обнаружено, что содержание иРА и 1РА в ткани опухоли больных раком

толстой кишки было достоверно выше, чем в неизмененной слизистой. При этом, уровни иРА и 1РА в ткани первичной опухоли зависели от ряда клинико-морфологических характеристик опухоли.

Полученные данные свидетельствуют о том, что новый подход к прогнозированию клинического течения колоректального рака основан на использовании комплексного анализа согласованных изменений экспрессии изученных молекулярно-биологических маркеров в опухоли и сыворотке крови больных с целью определения связи данных показателей с инвазивным и метастатическим потенциалом опухоли, а стало быть, и выживаемостью пациентов. На основании исследования молекулярно-биологических характеристик колоректального рака разработаны критерии, позволяющие идентифицировать случаи с повышенным риском развития отдаленных метастазов.

Впервые при раке толстой кишки изучена корреляция между экспрессией белков базальных мембран, факторов неоангиогенеза, апоптоза, активностью матриксных металлопротеиназ и компонентов системы активации плазминогена. Изучение особенностей экспрессии белковых маркеров в опухоли и сыворотке крови больных колоректальным раком позволило уточнить некоторые патогенетические механизмы прогрессирования опухоли.

Практическая значимость.

На основе анализа некоторых молекулярно-биологических характеристик опухоли определены критерии для выявления наиболее прогностически неблагоприятных случаев и предрасположенности больных колоректальным раком к развитию метастазов. Так, показатели общей выживаемости больных колоректальным раком при высоком уровне экспрессии ММР-9 в первичной опухоли в 3 раза достоверно ниже, чем при низкой экспрессии белка, а 5-летняя безрецидивная выживаемость пациентов ниже в 1,5 раза. Показатели общей 5-летней выживаемости больных раком толстой кишки зависели от уровня исходной концентрации ключевого активатора неоангиогенеза УЕСТ7 в сыворотке крови и при высоких его значениях (от 800 пг/мл и более), они были достоверно ниже, чем при значении УЕвР менее 400 пг/мл. При этом высокий

уровень экспрессии ММР-9 в первичной опухоли больных колоректальным раком был связан с повышенными исходными уровнями УЕвИ в сыворотке крови. Общая 5-летняя выживаемость больных колоректальным раком при уровнях Брав в сыворотке крови от 10 нг/мл и более была достоверно ниже. Кроме того, обнаружено, что безрецидивная выживаемость больных раком толстой кишки достоверно различалась между больными по пороговому уровню 3 нг/мг белка для иРА, 2 нг/мг белка для 1РА и 2 нг/мг белка для РА1-1. Многофакгорный анализ выявил наиболее неблагоприятные сочетания маркеров при оценке общего прогноза рака толстой кишки: ММР-9-коллаген IV типа, ММР-9-иРА, ММР-9-РА1-1, коллаген IV типа-РА1-1 и при прогнозе отдаленных метастазов ММР-9-зРаБ.

Таким образом, настоящее исследование представляет практический интерес для оценки послеоперационного прогноза больных раком толстой кишки и выделения групп повышенного риска развития метастазов и рецидивов, требующих дополнительного лечения или более тщательного динамического наблюдения.

Апробация работы.

Апробация диссертации проведена на совместной научной конференции с участием сотрудников кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики Московского государственного медико-стоматологического университета, лаборатории клинической биохимии, хирургического отделения проктологии, отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН 12 июня 2008г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе в изданиях, рекомендуемых ВАК - 7 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 173 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и практических рекомендаций. Текст иллюстрирован 58 таблицами и 23 рисунками. Указатель

литературы содержит 74 работы отечественных авторов и 186 - зарубежных.

Положения, выносимые на защиту.

1. Наиболее высокие уровни экспрессии ММР-9 выявлены в опухоли у преобладающего большинства больных раком толстой кишки при поздних стадиях заболевания, при низкой степени дифференцировки опухоли, а также при наличии инвазии карциномы в кровеносных сосудах. При этом общая 5-летняя выживаемость больных раком толстой кишки при высоком уровне экспрессии ММР-9 достоверно ниже, чем при низкой экспрессии белка.

2. Низкий уровень экспрессии коллагена IV типа достоверно чаще выявляли в опухолях у больных колоректальным раком при распространенном процессе, при низкой степени дифференцировки опухоли, при выраженной глубине инвазии опухоли в стенку кишки, а также при наличии инвазии опухоли в кровеносные сосуды. Показатели общей 5-летней выживаемости больных с низкой экспрессией коллагена IV типа в опухоли были достоверно ниже, чем при высокой экспрессии маркера.

3. Исходная концентрация ключевого активатора неоангиогенеза VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки была достоверно выше по сравнению с практически здоровыми людьми. При этом уровень маркера достоверно повышался в сыворотке крови больных с увеличением глубины инвазии опухоли в стенку кишки, при прорастании опухоли в кровеносные сосуды, при низкой степени дифференцировки опухоли.

4. Самые низкие показатели общей 5-летней выживаемости отмечены среди больных раком толстой кишки с высокими уровнями \ТЮР (от 800 пг/мл и более). При этом высокий уровень экспрессии ММР-9 в первичной опухоли был связан с повышенными исходными показателями ХТЮР в сыворотке крови, тогда как при низких исходных значениях VEGF чаще выявляли высокую экспрессию коллагена IV типа в первичной опухоли.

5. Почти в 2 раза чаще Браэ выявляли в сыворотке крови больных колоректальным раком, а его уровни были достоверно выше по сравнению с практически здоровыми людьми, при этом, общая 5-летняя

выживаемость больных раком толстой кишки при уровнях ББаз в сыворотке крови от 10 нг/мл и более была достоверно ниже.

6. Содержание иРА и 1РА в ткани опухоли больных раком толстой кишки было достоверно выше, чем в неизмененной слизистой и зависело от основных клинико-морфологических характеристик заболевания, а именно, распространенности опухолевого процесса, степени дифференцировки опухоли, глубины прорастания в стенку кишки и наличия инвазии кровеносных сосудов.

7. Безрецидивная выживаемость больных колоректальным раком достоверно различалась по порогу уровню 3 нг/мг белка для иРА, 2 нг/мг белка для 1РА и 2 нг/мг белка для РА1-1.

8. Выявлены наиболее неблагоприятные сочетания маркеров при оценке общего прогноза у больных раком толстой кишки: ММР-9/коллаген IV типа, ММР-9/иРА, ММР-9/РА1-1, коллаген IV типа/РА1-1 и при прогнозе отдаленных метастазов - ММР-9/зРаз.

Содержание диссертации Материал и методы исследования Общая характеристика больных раком толстой кишки. В исследование включено 187 больных раком толстой кишки в возрасте от 34 по 79 лет, проходивших обследование и лечение в ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН в период с 1986 по 2006 гг.

Количество больных мужского и женского пола составило 86 (46%) и 101 (54%), соответственно, средний возраст пациентов - 60,5±0,8 лет, медиана - 62 года. Средний возраст больных мужчин и женщин не различался и составил 60,8±1,0 и 60,2±1,1 лет, соответственно.

Распределение больных раком толстой кишки с учетом стадии заболевания представлено в таблице 1. Как видно из данных, приведенных в таблице 1, в группе больных в 1УЬ стадии количество пациентов мужского и женского пола было примерно равным (55 мужчин и 50 женщин), тогда как в группах пациентов с более ранними стадиями преобладали женщины.

Минимальный средний возраст был характерен для больных раком толстой кишки IV стадии.

Таблица 1.

Распределение больных раком толстой кишки с учетом стадии

заболевания

Стадия Кол-во Частота (%) Пол (абс.) Возраст, годы

больных м/ж (М±ш)

1 3 1,6 0/3 63,3±3,0

Па 9 4,8 3/6 64,4±1,6

ИЬ 29 15,5 13/16 65,8±1,5

Ша 11 5,9 4/7 64,2±3,0

ШЬ 21 ИД 8/13 59,3±2,4

IVa 9 4,8 3/6 58,8±ЗД

IVb 20 10,7 6/14 59,9±2,0

IVb с резекцией 85 45,5 49/36 58,3±1,2

печени

Всего: 187 100 86/101 60,5±0,8

Все больные раком толстой кишки подвергнуты хирургическому лечению различного объема: право/левосторонней гемиколэктомии, резекции сигмовидной, поперечно-ободочной, прямой кишки.

Отметим, что у 141 (75,4%) больного раком толстой кишки выявлены единичные и множественные регионарные метастазы в лимфатических узлах. У 98 (52,4%) пациентов были обнаружены метастазы в печени. При этом 85 пациентам выполнена резекция печени по поводу метастазов, эти пациенты выделены нами в отдельную группу с целью анализа прогноза заболевания.

Морфологическую характеристику опухолей толстой кишки проводили в соответствии с Международной гистологической классификацией опухолей кишечника ВОЗ (2000). Для определения гистологического типа и варианта строения опухоли, степени ее дифференцировки, глубины инвазии в кишечную стенку, наличия сосудистой инвазии изучали парафиновые срезы, окрашенные гематоксилином и эозином. Слизеобразование оценивали с помощью окраски альциановым синим по Крейбергу. Исследовали также наличие участков некроза, лимфоидной и воспалительной инфильтрации в опухоли.

При гистологическом исследовании материала у всех больных были диагностированы аденокарциномы, которые были представлены различными вариантами строения: железистым, папиллярным, трабекулярным и солидно-альвеолярным. Из 187 больных раком толстой кишки у 124 (66,3%) пациентов наблюдали железистый вариант строения опухоли, у 43 (23,0%) - преобладали папиллярные структуры, у 7 (3,7%) - выявлен трабекулярный вариант строения аденокарциномы, у 13 (7%) - опухоль была представлена солидными или солидно-альвеолярными структурами.

Высокодифференцированные аденокарциномы выявлены у 24 (12,8%) пациентов, умереннодифференцированные - у 138 (73,8%) больных, низко -дифференцированные - у 25 (13,4%) пациентов.

Опухоли больных раком толстой кишки имели различную глубину инвазии в кишечную стенку: прорастание слизистого и подслизистого слоев наблюдали у 6 (3,2%) больных, врастание опухоли в мышечную оболочку -у 21 (11,2%) пациента, прорастание всех слоев стенки кишки - у 61 (32,6%) больного, опухоль прорастала все слои и врастала в жировую клетчатку - 87 (46,5%) пациентов. Глубина инвазии была достоверно связана со стадией заболевания (р=0,0001). Прорастание опухоли в соседние органы и ткани обнаружили у 12 (6,6%) больных раком толстой кишки.

Важной клинико-морфологической характеристикой рака толстой кишки является наличие у больного инвазии опухоли в кровеносные и лимфатические сосуды. У 51 из 187 (27,3%) больных раком толстой кишки обнаружена сосудистая инвазия в первичной опухоли. Существенное повышение частоты выявления сосудистой инвазии (более чем у половины больных) обнаружено у больных раком толстой кишки при ШЬ и IV стадиях по сравнению с более ранними стадиями заболевания.

Слизеобразование в той или иной степени выраженности выявлено в опухолях 61 из 107 пациентов (57%), страдающих раком толстой кишки, при этом частота его обнаружения не была связана со стадией заболевания.

Методы определения иммуногистохимических маркеров. Определение иммуногистохимических показателей содержания белковых маркеров в опухоли

больных раком толстой кишки проведено в лаборатории иммуногистохимии и электронной микроскопии НИИ клинической онкологии ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

Таблица 2.

Характеристика антител

Антиген Антитело, клон Фирма Рабочее разведение Функция белка

ММР-9 Mouse mAb 15W2 Novocastra 1:80 Фермент внеклеточного матрикса

Коллаген IV типа Mouse mAb PHM-12 Novocastra 1:200 Компонент базальных мембран

Иммуногистохимическое исследование белковых маркеров в опухолях больных раком толстой кишки выполняли на серийных парафиновых срезах с помощью биотин-стрептавидинового иммунопероксидазнош метода с применением антител к ММР-9 и коллагену IV типа (фирма «Novocastra», Великобритания). Характеристика использованных в исследовании антител дана в таблице 2.

Для иммуногистохимического окрашивания образцы тканей рака толстой кишки и пограничных с опухолью участков слизистой оболочки толстой кишки фиксировали в 10% забуференном формалине (pH 7.2), проводили по спиртам и ксилолам, заливали в парафин и готовили серийные срезы толщиной 3-5 мкм, которые наносили на стекла с адгезивным покрытием (Polysine Menzel-Glaser). Срезы депарафинировали и регидратировали по стандартной схеме. Для демаскировки антигенов проводили предварительную обработку парафиновых срезов в микроволновом режиме при мощности 650W 2 раза по 5' с использованием восстанавливающего раствора pH 6,0 (фирма «Dako», Дания) с перерывом 2' между процедурами для охлаждения. Для выявления коллагена IV типа дополнительно проводилась обработка трипсином (фирма «Dako», Дания) в течение 30". Срезы инкубировали с первичными антителами на протяжении 18 часов при +4°С. В качестве вторичных антител и пероксидазного комплекса

использовали стандартный набор реагентов LSAB + Kit (фирма «Dako», Дания). Для визуализации реакции применяли раствор диаминобензидина DAB+ (фирма «Dako», Дания). Ядра клеток докрашивали гематоксилином Майера. Контрольный срез оставляли без первой инкубации.

Оценка реакции проводилась полуколичественным методом с учетом интенсивности окрашивания и количества антиген-позитивных клеток, которые в совокупности определяли уровень экспрессии белковых маркеров (высокий или низкий). Иммуногистохимическая реакция оценивалась как негативная («-»- нет реакции), слабопозитивная («+» - <10% окрашенных клеток), умеренно позитивная («++» - >10% клеток средней интенсивности окраски) и сильно позитивная или сверхэкспрессия («+++» - >10% клеток высокой интенсивности окраски). Для дальнейшего сравнительного иммуногистохимического исследования опухолей выделяли два основных уровня иммунореактивности: низкий уровень, включающий опухоли с отсутствием реакции и слабо позитивной экспрессией (-/+), и высокий уровень, включающий опухоли с умеренной реакцией и сверхэкспрессией маркеров (++/+++).

Для каждого антигена оценивали тип специфического окрашивания, который зависел от локализации продукта реакции в клетках или строме опухоли. Специфическую реакцию маркеров в волокнах и клетках стромы опухолей расценивали как позитивную или негативную. Иммунореактивность коллагена IV типа выявляли по модели экспрессии бежа в базальных мембранах опухолей.

Методы определения биохимических маркеров. Определение биохимических показателей активности белковых маркеров в опухоли и сыворотке крови больных раком толстой кишки проведено в лаборатории клинической биохимии НИИ клинической онкологии ГУ Российского онкологического научного центра им. Н.Н.Блохина РАМН.

Для биохимического исследования VEGF и sFas использовали образцы сыворотки крови больных раком толстой кишки, включенных в исследование, и в качестве контроля - образцы сыворотки крови 60 практически здоровых людей (30 мужчин и 30 женщин) в возрасте 19-70 лет (средний возраст - 61,3±8,6 года).

Кровь для определения концентрации VEGF и sFas у больных РТК до начала лечения и у практически здоровых лиц брали натощак из локтевой вены с 800 до 9°° часов утра. После свертывания крови пробирки центрифугировали при 2500xg в течение 10', сыворотку отбирали и хранили при -20°С до проведения исследования.

sFas в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом, разработанным в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН и лаборатории клинической биохимии ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН (С.Г.Аббасова и соавт., 1999,2007).

Концентрацию sFas определяли с использованием моноклональных антител против Fas SA-8 (IgGl-k); (8.8±0.6)хЮ7, которые сорбировали на планшетах (Linbro) в 0.05М карбонатном буфере (рН 9.6) в концентрации 5.0 мкг/мл в течение ночи при 4°С. Для инактивации свободных центров связывания планшеты инкубировали с 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) в фосфатно-солевом буфере (PBS) (рН 7.2) 1 ч при 37°С. Затем в планшеты вносили сыворотки. В качестве положительного контроля в каждый планшет вносили последовательные двукратные разведения полноразмерного рекомбинантного Fas от 40.0 до 0.15 нг/мл. Планшеты инкубировали 1.5 ч при 37°С. После инкубации планшеты 6 раз интенсивно промывали раствором PBS, содержащим 0.1% Tween 20 («Sigma», США) (буфер для отмывки). Процедуру отмывки далее повторяли после каждой стадии теста. После отмывки в планшеты вносили биотинилированные моноклональные антитела против Fas SA-7 (IgGl-k); (9.52±1.4)х10н в концентрации 12 мкг/мл в буфере для отмывки, содержащем 0.1% БСА. Планшеты с биотинилированными антителами инкубировали 2 ч при 37°С или ночь при 4°С. Затем в планшеты вносили раствор стрептавидин-пероксидазы («Amersham») в рабочем разведении в буфере для отмывки. Планшеты инкубировали 1 ч при 37°С. Далее в планшеты вносили свежеприготовленный раствор 0.04% ортофенилендиамина в 50мМ цитрат-фосфатном буфере (рН 5.0), содержащем 0.03% перекиси водорода. Планшеты инкубировали 15-20' при комнатной температуре до развития окраски. Реакцию останавливали добавлением в каждую лунку 50 мкл 10% серной кислоты,

оптическую плотность измеряли по длине волны 492 нм на спектрофотометре MR 700 Microplate Reader («Dynatech Labs»). Концентрацию sFas определяли по калибровочной кривой, соответствующей каждому планшету.

Концентрацию VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки определяли иммуноферментным методом с использованием реактивов фирмы «DRG» (США).

Определение uPA, tPA, PAI-1 в опухоли проводили иммуноферментным методом с использованием наборов реактивов, разработанных в лаборатории проф. T.Benraad'a (г. Наймеген, Нидерланды).

Кусочки опухолевой ткани доставляли на льду и сразу же подвергали гомогенизации в лаборатории клинической биохимии НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Перед гомогенизацией ткань тщательно очищали от участков некроза и жира, взвешивали, а затем измельчали и растирали в жидком азоте. Полученный порошок переносили в центрифужные пробирки, помещенные в ледяную баню и добавляли TED-буфер (10 мМ Трис-НС1, 1,5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ дитиотреитол; рН 7,4), содержащий 10% глицерина (по объему), из расчета 1 мл буфера на 100 мг ткани. Гомогенат центрифугировали 30' (центрифуга Optima TM-TLC, «Весктап», США). Надосадочную жидкость (цитозоль) использовали для определения концентрации белка, а аликвоты по 0,5 мл замораживали в полиэтиленовых пробирках и хранили при -70°С до определения концентрации соответствующих маркеров (не более 1 месяца). Порядок проведения анализа был одинаков для всех наборов: по 0,1 мл растворов стандартов (лунки Au-Gu) и разведенных цитозолей инкубировали при +4°С в течение ночи. Промывали 4 раза и добавляли в лунки по 0,1 мл рабочих растворов соответствующих "фиксирующих" антител. Инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Промывали и добавляли в каждую лунку по 0,1 мл рабочего раствора детекторных антител. Инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов. Промывали и добавляли в лунки по 0,1 мл раствора субстрата. Инкубировали в течение 30' в темноте при комнатной температуре. Останавливали реакцию, добавляя в каждую лунку по 0,1 мл 1М H2S04. Измеряли оптическую плотность растворов в лунках

при 492/620 им. Измерения проводили на автоматическом универсальном ридере для микроплашек ELxSOO фирмы «Bio-Tek Instruments Inc.» (США). В соответствии с инструкциями производителя, обработку результатов измерений проводили по формуле Y=a+bX+cX2, где X - концентрация анализируемого белка (нг/мл), а Y - оптическая плотность при 492 нм. При окончательных расчетах учитывали десятикратное разведение цитозолей и выражали концентрации анализируемых белков в нг/мг цитозольного белка.

Статистический анализ результатов исследования. Математический анализ полученных результатов проводили с использованием пакета статистических программ SPSS 7.0 for Windows и Microsoft® Office Excel 2003. Рассчитывали среднее значение показателей, стандартную ошибку среднего, а также их медианы. Определение достоверности различий частот признаков в изучаемых группах проводили с использованием критерия Различия между показателями считались статистически значимыми при р<0,05.

Анализ прогностической значимости содержания маркеров и построение кривых выживаемости проводили методом Каплан-Майера (Kaplan E.L., Meier Р. // J.Am.Stat.Assn.-1958.-Vol.53.-p.457-481). Достоверность различий в выживаемости оценивали с помощью "JIor-ранк теста" ("Log-rank test"). Многофакторный анализ проводили методом регрессионного анализа по Сох (Proportional hazard (Сох) regression model). На основе данных однофакторного анализа проведен многофакторный анализ прогностической значимости комплекса клинико-морфологических признаков с учетом показателей экспрессии биохимических и иммуногистохимических маркеров.

Результаты исследования и их обсуждение Иммуногистохимические и биохимические маркеры в опухоли и сыворотке крови больных раком толстой кишки

Содержание ММР-9 в опухоли больных раком толстой кишки.

Экспрессия ММР-9 определена в первичной опухоли у 187 больных раком толстой кишки. Больные раком толстой кишки по уровню экспрессии ММР-9 разделились примерно поровну. Так 51,3% пациентов были с низкой экспрессией

ММР-9 в опухоли и 48,7% пациентов - с высокой экспрессией этого белка. Накопление фермента в опухоли больных раком толстой кишки происходило в цитоплазме раковых клеток и компонентах стромы вокруг опухолевых комплексов (фибробластах, макрофагах, стенках сосудов, лейкоцитарных элементах). Цитоплазматическая реакция высокой интенсивности часто наблюдалась в низко - и умереннодифференцированных аденокарциномах толстой кишки, а редуцированная или очаговая экспрессия маркера - в структурах высокодифференцированных аденокарцином. Как правило, выявлялось гомогенное окрашивание цитоплазмы раковых клеток (рис. 1). Интенсивность окрашивания компонентов внеклеточного матрикса не была связана со степенью дифференцировки опухоли и зависела от характера стромы и выраженности десмопластической реакции.

Экспрессия протеазы в нормальных тканях толстой кишки была слабопозитивной.

Рис. 1. Экспрессия ММР-9 в структурах умеренннодифференцированной аденокарциномы толстой кишки (х150). Стрептавидин-биотииовый иммунопероксидазный метод. Ядра клеток докрашены гематоксилином Майера.

Экспрессия фермента в опухолях больных раком толстой кишки зависела от ряда клинико-морфологических характеристик заболевания. В таблице 3 представлены данные об экспрессии ММР-9 в опухоли больных раком толстой кишки с учетом основных клинико-морфологических признаков болезни.

Отметим, что высокая экспрессия ММР-9 выявлена достоверно чаще в опухоли пациентов при 1УЬ стадии рака толстой кишки (в 2 раза), при солидном и солидно-альвеолярном гистологическом варианте строении

опухоли (в 2 раза), при низкой степени дифференцировки опухоли (в 4 раза), при прорастании опухолью всех слоев стенки кишки и врастании в жировую клетчатку (в 1,7 раза чаще), при наличии инвазии опухоли в сосуды (в 4 раза).

Таблица 3.

Экспрессия ММР-9 в опухоли больных раком толстой кишки

с учетом основных клинических признаков

Признак Градация Число больных Экспрессия ММР-9 Р

+++/++ Высокая +/-Низкая

Пол мужской 86 46 (53,5) 40 (46,5) 0,5

женский 101 50 (49,5) 51 (50,5)

Возраст <60 82 37(45,1) 45 (54,9) 0,1

>60 105 59 (56,2) 46 (43,8)

Стадия I 3 - 3(100) 0,001

На 9 3 (33,3) 6 (66,7)

ИЬ 29 11(37,9) 18(62,1)

Illa 11 4 (36,4) 7(63,6)

шь 21 6 (28,6) 15 (71,4)

IVa 9 3 (33,3) 6 (66,7)

IVb 20 16(80,0) 4 (20,0)

IVb с р. п. 85 53 (62,4) 32 (37,7)

Гистологический вариант строения опухоли железистый 124 60 (48,4) 64 (51,6) 0,1

папиллярный 43 21 (48,8) 22(51,2)

трабек-ный 7 6 (85,7) 1 (14,3)

солидный 13 9(69,2) 4 (30,8)

Степень дифференцировки опухоли высокая 24 7 (29,2) 17(70,8) 0,001

умеренная 138 69 (50,0) 69 (50,0)

низкая 25 20 (80,0) 5 (20,0)

Глубина инвазии опухоли Р1 6 1 (16,7) 5 (83,3) 0,03

Р2 21 11(52,4) 10(47,6)

РЗ 61 24 (39,3) 37 (60,7)

Р4 87 54 (62,1) 33 (37,9)

Наличие инвазии опухоли в сосуды Да 51 42 (82,4) 9(17,7) 0,0001

Нет 136 54 (39,7) 82 (60,3)

Всего: 96 (51,3) 91 (48,7)

Таким образом, экспрессия белка ММР-9 в опухоли достоверно отражала наиболее важные клинические признаки рака толстой кишки (табл. 3).

Содержание коллагена IV типа в опухоли больных раком толстой кишки. Экспрессия коллагена IV типа определена в опухоли у 187 больных

раком толстой кишки. У 42,8% больных раком толстой кишки выявлена высокая экспрессия коллагена IV типа, у 57,2% пациентов - низкая экспрессия белка.

Рис. 2. Экспрессия коллагена IV типа в базальных мембранах вокруг железистых структур и сосудов высокодифференцированной аденокарциномы толстой кишки (х150). Стрептавидин-биотиновый иммунопероксидазный метод. Ядра клеток докрашены гематоксилином Майера.

В опухолях больных раком толстой кишки коллаген IV типа был выявлен в базальных мембранах вокруг железистых раковых комплексов, а также кровеносных сосудов (рис. 2). Эпителий нормальной слизистой оболочки толстой кишки не был окрашен маркером. Экспрессия белка в части высоко- и умереннодифференцированных аденокарцином толстой кишки была представлена непрерывными линиями или отдельными фрагментами коллаген 1У-содержащих базальных мембран.

В низкодифференцированных опухолях в большинстве случаев контуры базальных мембран не выявлялись, а структуры коллагена IV типа в большом количестве присутствовали в тонких волокнах внеклеточного матрикса опухоли.

В таблице 4 представлены данные об экспрессии коллагена IV типа в опухоли больных раком толстой кишки с учетом основных клинико-морфологических признаков заболевания. Отметим, что низкая экспрессия коллагена IV типа выявлялась достоверно чаще в опухоли пациентов при 1Уа и 1УЬ стадиях заболевания (примерно в 2-5 раз), при солидном варианте гистологического строения (в 2-3 раза чаще), при низкой степени

дифференцировки опухоли (в 3 раза чаще), при прорастании опухолью всех слоев стенки кишки и жировой клетчатки (в 2-2,5 раза чаще), при наличии инвазии опухоли в сосуды (в 6 раз).

Таблица. 4.

Экспрессия коллагена IV типа в опухоли больных раком толстой кишки

с учетом основных клинических признаков

Признак Градация Кол-во больных Экспрессия Coll IV Р

•невысокая ++ Низкая

Пол мужской 86 34 (39,5) 52 (60,5) 0,4

женский 101 46 (45,5) 55 (54,5)

Возраст <60 82 40 (48,8) 42(51,2) 0,1

>60 105 40(38,1) 65 (61,9)

Стадия I 3 3 (100) - 0,005

Па 9 6 (66,7) 3 (33,3)

Ilb 29 17(58,6) 12(41,4)

Ша 11 6 (54,6) 5 (45,5)

шь 21 12(57,1) 9(42,9)

IVa 9 3 (33,3) 6 (66,7)

IVb 20 3 (15,0) 17(85,0)

IVb с р. п. 85 30 (35,3) 32 (64,7)

Гистологический вариант строения опухоли железистый 124 62 (50,0) 62 (50,0) 0,04

папиллярный 43 12 (27,9) 31 (72,1)

трабек-ный 7 2 (28,6) 5(71,4)

солидный 13 4 (30,8) 9(69,2)

Степень дифференцировки опухоли высокая 24 14 (58,3) 10(41,7) 0,049

умеренная 138 60 (43,5) 78 (56,5)

низкая 25 6 (24,0) 19(76,0)

Глубина инвазии опухоли 1 6 5 (83,3) 1 (16,7) 0,1

2 21 11(52,4) 10(47,6)

3 61 28 (45,9) 33 (54,1)

4 87 33 (37,9) 54(62,1)

5 12 3 (25,0) 9(75,0)

Наличие инвазии опухоли в сосуды да 51 7(13,7) 44 (86,3) 0,0001

нет 136 73 (53,7) 63 (46,3)

Всего: 96 (51,3) 91 (48,7)

Таким образом, экспрессия коллагена IV типа в опухоли достоверно отражала наиболее важные клинические признаки рака толстой кишки. При этом, слабая реактивность или отсутствие коллаген 1У-содержащих базальных

мембран часто сочетались с повышенной экспрессией ММР-9 в цитоплазме клеток рака толстой кишки.

Содержание УЕвЕ в сыворотке крови больных раком толстой кишки. УЕвР определен в сыворотке крови 187 больных раком толстой кишки. Содержание маркера колебалось от 100 до 1800 пг/мл, в среднем составляя 752,2±26,2 пг/мл, медиана показателя равнялась 700 пг/мл.

В группе практически здоровых людей содержание УЕвР в сыворотке крови в среднем составило 311,4±18,9 пг/мл, медиана 301 пг/мл и было достоверно ниже, чем в сыворотке крови больных раком толстой кишки

О=о,ооо1).

Таблица 5.

Содержание УЕСЕ в сыворотке крови больных раком толстой

кишки с учетом стадии заболевания

Стадия Кол-во больных VEGF, пг/мл (М±ш) Пределы колебания Медиана

I 3 220,0±60,0 100,0-280,0 280

IIa 9 375,9±39,2 240,0-610,0 380

IIb 29 509,1 ±24,0 290,0-760,0 520

Illa 11 610,5 ±49,0 400,0-910,0 600

Illb 21 839,3 ±66,6 420,0-1610,0 810

IVb 20 957,5 ±102,9 390,0-1780,0 930

Iva 9 961,1 ±144,3 500,0-1690,0 800

IVb с резекцией печени 85 820,1 ±37,0 280,0-1800,0 780

Всего: 187 752,2±26,2 100-1800 700

Таблица 6.

Содержание УЕвЕ в сыворотке крови больных раком толстой

кишки с учетом показателя Т системы TNM

Стадия Кол-во VEGF, пг/мл Пределы Медиана

Т (TNM) больных (М±т) колебания

1 3 220,(Ш>0,0 100,0-280,0 280

2 38 477,6±22,3 240,0-760,0 495

3 126 810,2±31,5 280,0-1800,0 770

4 20 988,5±76,7 500,0-1690,0 910

Всего: 187 752,2±26,2 100-1800 700

Следует отметить, что содержание УЕвР в сыворотке крови больных раком толстой кишки по половому признаку не различалось и составило 735,8±38,0 пг/мл в группе мужчин и 766,1±36,3 пг/мл в группе женщин.

Анализ содержания УЕОР в сыворотке крови больных раком толстой кишки с учетом стадии заболевания показал, что концентрация маркера отражает стадию опухолевого процесса (р=0,0001) (табл. 5). При этом концентрация УЕОР у больных раком толстой кишки I и Иа стадии не отличалась от содержания маркера у здоровых людей и, таким образом, показатель не обладал диагностической способностью при ранних стадиях заболевания.

Медиана содержания маркера достоверно повышалась при увеличении показателя местной распространенности Т (система ТЫМ) (табл. 6).

Концентрация маркера в сыворотке крови больных раком толстой кишки повышалась по мере увеличения количества регионарных метастазов -показателя N (система ТММ), однако все выявленные различия не были статистически достоверными (р>0,05) (табл. 7). При наличии у больного раком толстой кишки отдаленных метастазов в печени содержание УЕСЕ в сыворотке крови было достоверно выше. Отметим, что у больных раком толстой кишки с отсутствием отдаленных метастазов содержание маркера могло быть высоким при значительной распространенности заболевания (показатель Т3-Т4).

Таблица 7.

Содержание \TEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки

с учетом показателя N системы TNM

Стадия Кол-во УЕвР, пг/мл Пределы Медиана

N СШМ) больных (М±ш) колебания

0 46 672,1±59,3 100,0-1690,0 540

1 118 740,3±131,5 280,0-1800,0 632,5

2 14 939,3±74,6 700,0-1710,0 880

3 9 1026,7± 174,4 780,0-1520,0 970

Всего: 187 752,2±126,2 100-1800 700

Выявлено достоверно более высокое содержание УЕОР в сыворотке

крови больных раком толстой кишки в возрасте до 60 лет по сравнению с пациентами старше 60 лет (901,9±44,0 и 635,3±26,6 пг/мл, соответственно) (р=0,001), что косвенно может свидетельствовать о более агрессивном течении заболевания у пациентов моложе 60 лет.

Дисперсионный анализ содержания УЕвР в сыворотке крови больных раком толстой кишки показал достоверно более высокие его значения в группе пациентов с тубулярным вариантом гистологического строения опухоли по сравнению с группой больных с солидным гистологическим вариантом (р=0,02) (табл. 8). Однако эти гистологические варианты относятся к редким, в то же время наиболее частые варианты гистологического строения опухоли не отличались достоверно по содержанию УЕСР в сыворотке крови.

Таблица 8.

Содержание УЕСЕ в сыворотке крови больных раком толстой кишки

с учетом варианта гистологического строения опухоли

Вариант гистологического строения опухоли Количество больных УЕвЕ, пг/мл (М±т) Пределы колебания Медиана

1 124 751,5±31,5 100,0-1800,0 700

2 43 765,1±56,8 290,0-1710,0 680

3* 7 1067,1±178,8 500,0-1780,0 910

4* 13 546,2±47,3 260,0-800,0 560

Всего: 187 752,2±26,2 100-1800 700

Примечание: *р=0,02.

Таблица 9.

Содержание УЕвЕ в сыворотке крови больных раком толстой кишки с учетом степени дифференцировки опухоли

Степень дифференцировки опухоли Количество больных УЕвЕ, пг/мл (М±т) Пределы колебания Медиана

Высокая * 24 660,0±44,8 250,0-1000,0 690

Умеренная 138 747,7±30,1 100,0-17100,0 670

Низкая** 25 865,6±92,6 350-1800 700

Всего: 187 752,2±26,2 100-1800 700

Примечание: *р =0,045.

Достоверно выше был уровень УЕОБ у больных раком толстой кишки с

низкой степенью дифференцировки опухоли по сравнению с группой пациентов с высокой степенью дифференцировки опухоли (табл. 9).

Содержание VEGF достоверно повышалось по мере увеличения глубины инвазии опухоли в кишечную стенку и при наличии инвазии опухоли в кровеносные сосуды (р=0,001).

Таким образом, содержание VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки достоверно было связано с определяющими клиническими признаками - стадией заболевания, глубиной инвазии опухоли, наличием инвазии опухоли в кровеносные сосуды, возрастом больных, степенью дифференцировки опухоли.

Кроме того, наряду с увеличением концентрации VEGF в сыворотке крови больных раком толстой кишки обнаружено достоверное повышение в опухоли уровня неблагоприятно высокой экспрессии ММР-9 и одновременно низкая экспрессия коллагена IV типа.

В группе из 58 больных раком толстой кишки с одновременно благоприятными уровнями ММР-9 и коллагена IV типа содержание VEGF в сыворотке крови было минимальным и составило 658,0±45,5 пг/мл, напротив, при одновременно неблагоприятных уровнях этих маркеров (74 пациента) -максимальным (823,6±42,6 пг/мл), различия достоверны (р=0,008). В то же время, если уровни экспрессии белков были противоположны, то содержание VEGF практически не различалось (762,6±67,5 и 750,5±63,3 пг/мл) (р=0,9). Таким образом, у большей части больных раком толстой кишки - 132 (70,6%), изменение VEGF происходит синхронно с такими маркерами как ММР-9 и коллаген IV типа, что указывает на неблагоприятное течение заболевания.

Содержание sFas в сыворотке крови больных раком толстой кишки. sFas определен в сыворотке крови 187 больных раком толстой кишки. sFas обнаружен у 108 больных (57,8%), его содержание колебалось от 0,8 до 28,9 нг/мл, в среднем составляя 10,1±0,5 нг/мл, медиана показателя равнялась 9,1 нг/мл.

27

Таблица 10.

Содержание бЕэб в сыворотке крови больных раком толстой кишки с учетом стадии процесса

Стадия Количество sFas, нг/мл Пределы Медиана

больных (М±ш) колебания

I 3(100%) 1,0+0,1 0,8-1,2 0,9

На 5 (55,6%) 2,8±0,8 1,3-5,6 2,1

IIb 14(48,3%) 8,7±0,9 4,6-14,0 9,1

Illa 4 (36,4%) 7,0±1,0 4,7-9,0 7,1

Illb 15(71,4%) 10,6±1,2 5,1-19,4 8,0

IVb 13 (65,0%) 12ДЫ.1 6,8-20,4 10,6

Iva 4 (44,4%) 12,9±4,2 7,4-25,4 93

IVb с резекцией 50 (58,8%) 11,1±0,8 4,0-28,9 9,8

печени

Всего: 108(57,8%) 10,шз 0,8-28,9 9,1

В группе практически здоровых людей содержание Браэ в сыворотке крови выявлено с частотой 28,6%, средний уровень составил 1,2±0,9 нг/мл, медиана - 0,9 нг/мл и был достоверно ниже, чем в сыворотке крови больных раком толстой кишки (р=0,0001).

Анализ содержания БраБ в сыворотке крови больных раком толстой кишки с учетом стадии заболевания показал, что концентрация маркера отражает стадию опухолевого процесса (р=0,0001) (табл. 10).

Однако частота выявления БраБ в сыворотке крови больных раком толстой кишки не была связана со стадией заболевания. При этом концентрация БРаБ у больных раком толстой кишки I стадии не отличалась от содержания маркера у практически здоровых людей.

Медиана содержания маркера бРэб достоверно повышалась при увеличении показателя распространенности Т (система ТЫМ) с 1,0 нг/мл в группе больных с распространением Т| до значения 12,9 нг/мл в группе больных с распространением Т4 (р=0,001).

Обнаружена выраженная тенденция к повышению концентрации БРаБ в сыворотке крови больных раком толстой кишки по мере увеличения количества регионарных метастазов - показатель N (система ТИМ) (р=0,06).

Отметим, что в группе больных раком толстой кишки с отсутствием регионарных метастазов в лимфатических узлах могли выявляться высокие значения Браэ (максимальное значение - 25,4 нг/мл) при значительной местной распространенности заболевания (показатель Т3-Т4).

Таблица 11.

Содержание вРая в сыворотке крови больных раком толстой кишки

с учетом глубины инвазии опухоли

Глубина инвазии Количество вРав, нг/мл Пределы Медиана

опухоли больных (М±т) колебания

1 4 1,6±0,6 0,8-3,4 1Д

2 9 6,4±1,1 2,1-12,1 5,0

3 38 9,7±0,7 1,6-19,4 9,0

4 50 11,6±0,8 1,3-28,9 10,2

5 7 11,1±2,4 7-25,4 9,5

Всего: 108 10,1+0,5 0,8-2 8,9 9,1

При наличии у больного раком толстой кишки отдаленных метастазов в печени содержание бРэб в сыворотке крови было достоверно выше (медиана 10,1 нг/мл), чем без таковых (медиана 7,4 нг/мл) (р=0,003).

Содержание эРаэ достоверно повышалось по мере увеличения глубины инвазии опухоли в окружающие ткани (р=0,0001) (табл. 11).

Достоверно выше было содержание БРаэ в сыворотке крови больных раком толстой кишки при наличии инвазии опухоли в кровеносные сосуды (р=0,0008).

Таким образом, содержание Браэ в сыворотке крови больных раком толстой кишки достоверно было связано с основными клиническими признаками: стадией заболевания, глубиной инвазии опухоли, наличием инвазии опухоли в кровеносные сосуды, возрастом пациентов.

В то же время содержание БРаэ не было связано со степенью дифференцировки опухоли, а также с наличием и отсутствием слизеобразования, с наличием лимфоидной инфильтрации.

Кроме того, обнаружено, что при неблагоприятной (высокой)

экспрессии ММР-9 содержание бРйб в сыворотке крови больных раком толстой кишки было достоверно выше (р=0,01). При значениях БраБ выше 10 нг/мл, почти у 3/4 больных раком толстой кишки обнаружена высокая экспрессия ММР-9.

При неблагоприятной низкой экспрессии белка коллагена IV типа содержание Браэ в сыворотке крови больных раком толстой кишки достоверно выше (р=0,02).

В группе из 30 больных раком толстой кишки с одновременно благоприятными уровнями ММР-9 и коллагена IV типа содержание эРаБ в сыворотке крови было минимальным и составило 8,0±0,9 нг/мл, напротив, при одновременно неблагоприятных уровнях белков (49 пациентов) максимальным (11,5±0,8 нг/мл), различия достоверны (р=0,005). В то же время, если уровни экспрессии белков были противоположны, то содержание БРаБ практически не различалось (10,2±1,3 и 10,0±1,3 нг/мл) (р=0,9).

Таким образом, у большинства больных раком толстой кишки (73,1%) изменение бРэб в сыворотке крови происходило синхронно с изменением уровня экспрессии ММР-9 и коллагена IV типа в опухоли.

Содержание иРА, 1РА и РА1-1 в ткани опухоли и неизмененной слизистой оболочке толстой кишки. Иммуноферментное определение содержания иРА проведено в ткани опухоли 187 больных раком толстой кишки. Уровни маркера в опухоли колебались от 0,17 до 8,9 нг/мг белка, составив в среднем 3,5±0,2 нг/мг белка, медиана была равна 4,0 нг/мг белка. Распределение маркера отличалось от распределения Гаусса, поэтому в качестве центральной характеристики использовали медиану.

Содержание иРА в неизмененной ткани (пограничной с опухолью слизистой оболочке толстой кишки) 35 больных раком толстой кишки составило 0,71±0,14 нг/мг белка, медиана - 0,6 нг/мг белка. Различие содержания иРА в неизмененной и опухолевой ткани больных раком толстой кишки статистически достоверны (р=0,001). При иммуноферментном определении 1РА содержание белка в ткани опухоли 187 больных раком толстой кишки достоверно отличалось от распределения Гаусса. Для анализа различий применяли непараметрические

критерии, в качестве центральной характеристики показателя применяли медиану. У 89 (47,6%) больных раком толстой кишки содержание tPA в ткани опухоли не превышало 2 нг/мг белка, среднее содержание составило 4,3±0,4 нг/мг белка, медиана - 2,3 нг/мг белка. Содержание tPA в неизмененной ткани 187 больных раком толстой кишки составило 4,98±0,79 нг/мг белка, медиана -2,68 нг/мг белка. Различия содержания tPA в неизмененной и опухолевой ткани больных раком толстой кишки были статистически недостоверными (р=0,18). При иммуноферментном определении PAI-1 у 9 из 187 (4,8%) больных раком толстой кишки маркер не был выявлен, у 54 (28,9%) его содержание не превышало 0,5 нг/мг белка. Таким образом, у трети обследованных пациентов содержание маркера было невысоким, либо белок полностью отсутствовал в ткани опухоли. Среднее содержание PAI-1 у 178 больных раком толстой кишки составило 1,6±0,1 нг/мг белка, медиана - 1,9 нг/мг белка. Содержание PAI-1 в неизмененной ткани 35 больных раком толстой кишки составило 0,99±0,1 нг/мг белка, медиана - 0,61 нг/мг белка. Различия содержания PAI-1 в неизмененной и опухолевой тканях больных раком толстой кишки были статистически достоверными (р=0,001).

Выявлена корреляционная зависимость высокой степени тесноты связанности между содержанием uPA, tPA и PAI-1 в ткани опухоли больных раком толстой кишки (г=0,76; р=0,001).

Содержание компонентов системы активации плазминогена в опухоли больных раком толстой кишки с учетом клинико-морфологических признаков заболевания. Оценили содержание основных компонентов системы плазминогена в опухоли больных раком толстой кишки с учетом клинико-морфологических признаков заболевания.

При изучении содержания компонентов системы активации плазминогена с учетом возраста больных раком толстой кишки выявлено достоверно более высокое их содержание в опухоли больных в возрасте до 60 лет по сравнению с группой пациентов от 60 лет и старшее, что косвенно может указывать на более агрессивное течение заболевания у пациентов моложе 60 лет.

Наибольший интерес для практикующих врачей представляет изучение связи показателей системы активации плазминогена в опухолевой ткани больных раком толстой кишки со стадией заболевания. Выявлено достоверное повышение иРА при увеличении местной распространенности заболевания (Т) - более чем в 10 раз, при наличии отдаленных метастазов (М) -более чем в 4 раза. Обнаружено повышение 1РА при увеличении местной распространенности опухолевого процесса (показатель Т), при наличии отдаленных метастазов (М). Выявлено достоверное повышение РА1-1 в первичной опухоли больных раком толстой кишки при увеличении местной распространенности процесса (Т) - более чем в 3 раза, при наличии регионарных метастазов (Ы) - примерно в 2 раза и отдаленных метастазов (М) - более чем в 3 раза.

Степень дифференцировки опухоли была достоверно связана с содержанием активатора плазминогена иРА в ткани опухоли больных раком толстой кишки. При низкой степени дифференцировки опухоли содержание иРА и РА1-1 в опухоли было наибольшим, однако достоверные различия обнаружены только для иРА.

Гистологический вариант строения опухоли не был достоверно связан с содержанием компонентов системы активации плазминогена в ткани опухоли больных раком толстой кишки. Содержание иРА и РА1- было наибольшим в опухолях с преобладанием железистого варианта строения.

Все показатели системы активации плазминогена в опухоли больных раком толстой кишки были достоверно связаны с одним наиболее важным клинико-морфологических фактором заболевания - глубиной инвазии опухоли в кишечную стенку (р<0,001).

Обнаружено, что при наличии инвазии опухоли в кровеносные сосуды содержание иРА и РА1-1 также достоверно повышается.

Наличие слизеобразования, участков некроза, лимфоидной и воспалительной инфильтрации в опухоли не изменяло достоверно показатели содержания компонентов системы активации плазминогена в опухоли больных раком толстой кишки.

Связь содержания компонентов системы активации плазминогена с экспрессией ММР-9 и коллагена IV типа в опухоли больных раком толстой кишки. При неблагоприятных (высоких) уровнях экспрессии ММР-9 содержание иРА в ткани опухоли было достоверно выше, чем при благоприятных (табл. 12).

Таблица 12.

Содержание компонентов системы активации плазминогена в опухоли

больных раком толстой кишки с учетом уровня экспрессии ММР-9

Показатель Уровень экспрессии ММР-9

Высокий +++/++ Низкий +/-

N М±ш (медиана) Пределы колебания N М±ш (медиана) Пределы колебания

иРА* 96 4,1 ±0,2 (4,3) 0,17-8,9 91 2,9±0,3 (1,6) 0,17-8,6

1РА* 96 5,3 ±0,5 (4,9) 0,14-22,1 91 3,3 ±0,5 (0,2) 0,14-19,4

РА1-1 * 49 1,9 ±0,1 (2,1) 0,05-3,6 129 1,3±0,1 (1,3) 0,05-3,5

Примечание: *р=0,01.

Таблица 13.

Содержание компонентов системы активации плазминогена в опухоли

больных раком толстой кишки с учетом экспрессии коллагена IV типа

Показатель Уровень экспрессии коллагена IV типа

Высокий +++/++ Низкий +/-

N М±ш (медиана) Пределы колебания N М±т (медиана) Пределы колебания

иРА* 96 2,9±0,3 (1,5) 0,17-8,2 91 3,9±0,2 (4,1) 0,17-8,9

еРА* 96 3,5 ±0,5 (0,2) 0,14-19,4 91 4,9±0,5 (4,0) 0,14-22,1

РАМ * 49 1,3 ±0,1 (1,2) 0,05-3,5 129 1,8±0,1 (2,0) 0,05-3,6

Примечание: *р=0,01.

При неблагоприятных (низких) уровнях экспрессии коллагена IV типа содержание компонентов системы активации плазминогена также было достоверно выше (табл. 13).

Связь содержания компонентов системы активации плазминогена в опухоли уровнями белков УЕвЕ и вЕав в сыворотке крови больных раком толстой кишки. Обнаружены корреляционные зависимости средней степени тесноты связанности между содержанием УЕСР в сыворотке крови и иРА в опухоли (г=0,51; р=0,001), а также между УЕвР и РА1-1 (г=0,42; р=001). Важно отметить, что данная корреляционная зависимость выявлена только в группе больных раком толстой кишки Ш-1У стадий заболевания.

Содержание бРэб в сыворотке крови не было связано с показателями содержания компонентов системы активации плазминогена в ткани опухоли больных раком толстой кишки.

Подводя итоги настоящему разделу исследования, следует отметить, что показатели компонентов системы активации плазминогена, определенные в ткани опухоли больных раком толстой кишки, тесно взаимосвязаны между собой, отражают основные клинико-морфологические характеристики рака толстой кишки, но не обладают достаточной информативностью при начальных стадиях заболевания. При этом при поздних (1П-ГУ) стадиях заболевания выявлена корреляционная зависимость между компонентами системы активации плазминогена и белковыми маркерами: ММР-9, коллаген IV типа и УЕСК Отдаленные результаты лечения с учетом содержания иммуногистохимических и биохимических маркеров

Отдаленные результаты лечения проанализированы у 187 больных раком толстой кишки. Обследованные пациенты прослежены от 2 до 6 лет от начала проводимого лечения. Из 187 пациентов в течение 1-го года наблюдения после лечения умерло 20 (10,7%) больных, на 2-м году жизни - 29 (15,5%) больных.

Медиана общей выживаемости больных раком толстой кишки составила 76,7±11,3 мес., то есть примерно 6 лет. 5-летняя общая выживаемость составила 57,6+4,1%. Анализ функции риска смерти у больных раком толстой кишки показал, что наибольший риск обнаружен в первый год после проведенного лечения, в последующие 5 лет риск смерти неуклонно снижался.

Общая выживаемость больных раком толстой кишки достаточно хорошо изучена. В таблице 14 приведены краткие данные по общей выживаемости

больных раком толстой кишки, включенных в настоящее исследование (в общей группе и с учетом наиболее важных клинико-морфологических признаков, достоверно связанных с отдаленными результатами лечения).

Так, стадия заболевания была достоверно связана с отдаленными результатами лечения больных раком толстой кишки (р=0,0001). У пациентов в I-Ilb стадиях 5-летняя общая выживаемость была 84,5% и выше, а медиана не была достигнута на 5-летнем сроке наблюдения.

Существенно снижались показатели общей выживаемости у больных при Illa стадии (около половины больных умерло в течение 5-лет после проведенного лечения). Медиана длительности жизни после проведенного лечения в данной группе больных составила 34,7 мес. (около 3-х лет), а у пациентов в IVb стадии - всего 14,4 мес., то есть чуть более одного года.

Отметим, что при выполнении резекции печени больным раком толстой кишки в IVb стадии медиана выживаемости увеличивалась примерно в 4 раза и приближалась к 5 годам, а 5-летняя общая выживаемость была сопоставима с выживаемостью больных при Illb стадии.

Вариант гистологического строения опухоли не был достоверно связан с отдаленными результатами лечения больных раком толстой кишки (р=0,1), а степень дифференцировки опухоли была достоверно связана с отдаленными результатами лечения больных раком толстой кишки (р=0,0002). Так, в группе больных с низкой степенью дифференцировки опухоли медиана выживаемости составила 20,1 мес., а 5-летняя общая выживаемость -11,2±9,2%.

Отдаленные результаты лечения больных раком толстой кишки достоверно ухудшались при увеличении глубины инвазии опухоли в кишечную стенку (р=0,0001). Так, при наибольшей глубине инвазии, при прорастании опухолью всех слоев стенки кишки и врастании в жировую клетчатку медиана общей выживаемости составила всего 33,3 мес., а 3-х летняя выживаемость -38,1±14,7%.

Достоверно различалась общая выживаемость больных раком толстой кишки при наличии и отсутствии инвазии опухоли в кровеносные и лимфатические сосуды (р=0,0001). Медианы выживаемости и 5-летняя

выживаемость различались в этих группах более чем в 5 раз. Пол и возраст больных раком толстой кишки, наличие слизеобразования, участков некроза, лимфоидной и воспалительной инфильтрации в опухоли не были достоверно связаны с отдаленными результатами лечения больных раком толстой кишки.

Таблица 14.

Общая выживаемость больных раком толстой кишки

Клиническ ий признак Градация признака N Медиана выживаемости, мес. Общая выживаемость, %

1-летняя 3-летняя 5-летняя

Вся группа 187 76,7± 11,3 89,3+2,3 70,2 ±3,4 57,6±4,1

Стадия р=0,0001 I+IIa 3 Не достигнута 100 100 -

Ilb 29 Не достигнута 100 92,1 ±5,3 84,5 ±8,8

Illa 11 Не достигнута 100 90,0±9,5 53,3 ±17, 6

шь 21 Не достигнута 100 80,4±8,8 -

IVa 9 34,7 77,8±13, 9 40±13,4 -

IVb 20 14,4 60±11 20±8,9 -

IVb с рез. печени 85 54,9 88,2±3,5 62,7 ±5,3 47,1 ±6,2

Вариант гистологиче ского строения опухоли 1 124 82,4 91,9 ±2,4 71,4±4,1 60,8 ±4,8

2 43 Не достигнута 83,7±5,6 63,5±7,6 52,3 ±9,4

3 7 22,8 57,1+18, 7 28,6+17,1 0

4 13 Не достигнута 76,9±11, 9 57,7±18,8 55,4±19, 1

Степень дифференц ировки опухоли Высокая 24 Не достигнута 95,8±4,1 87,1 ±7,0 64,8±11, 0

Умеренная 138 83,0 89,9±2,6 72,0 ±3,9 61,5±4,8

Низкая 25 20,1 68,0+9,3 30,6±9,8 11,2 ±9,2

Глубина инвазии опухоли в кишечную стенку Слиз./подс лизистый 6 Не достигнута 100 100 -

Мышечн. 21 Не достигнута 95,2±4,6 90,2±6,6 7.8,9 ±12, 1

Все слои 61 Не достигнута 95,1 ±2,8 81,4±5,1 65,9±7,3

Жировая клетчатка 87 50,6 81,6±4,2 55,9±5,4 45,8±5,8

Инвазия в сосуды Есть 51 18,9 68,6±6,5 24,5 ±6,4 14,4 ±6,1

Нет 136 96,0 95,6±1,8 85,0 ±3,1 71,9±4,6

Обнаружено, что медиана общей выживаемости при неблагоприятной высокой экспрессии ММР-9 была в 3 раза меньше, а 5-летняя общая выживаемость в 3,1 раза меньше, чем при благоприятной низкой его экспрессии. Таким образом, данный белок при иммуногистохимическом определении в опухоли больных раком толстой кишки обладает выраженной прогностической способностью.

Выявлено, что медиана и 5-летняя общая выживаемость при неблагоприятной низкой экспрессии коллагена IV типа в опухоли была почти в 3 раза меньше, чем при благоприятной высокой его экспрессии. Таким образом, данный белок при иммуногистохимическом определении в ткани опухоли больных раком толстой кишки также обладает выраженной прогностической способностью.

Проанализировали отдаленные результаты лечения больных раком толстой кишки с учетом содержания УЕвР в сыворотке крови. Больные разделены на 3 группы: 1) группа - уровень VEGF в сыворотке крови менее 400 пг/мл; 2) группа - уровень УЕвИ от 400 до 800 пг/мл; 3) группа - уровень УЕвР 800 и более пг/мл. Отметим, что у пациентов со значениями УЕвР, равными 400-600 пг/мл и 600-800 пг/мл, отдаленные результаты лечения были сходны и эти пациенты были объединены в одну группу.

Убедительно доказано, что исходные уровни УЕвР в сыворотке крови достоверно связаны с отдаленными результатами лечения больных раком толстой кишки (р=0,019). Так, неблагоприятными следует считать уровни УЕСБ в сыворотке крови выше 400 пг/мл (5-летняя общая выживаемость снижается в 1,3 раза) и, особенно, выше 800 пг/мл (5-летняя общая выживаемость снижается почти в 2 раза). Таким образом, содержание УЕвР в сыворотке крови, определенное до начала лечения, может являться фактором прогноза и учитываться при выборе объема и методов лечения больных раком толстой кишки.

Кроме того, показано, что исходный уровень эРаэ в сыворотке крови больных раком толстой кишки выше 10 нг/мл также является высокоинформативным неблагоприятным фактором прогноза заболевания.

{КарИл-Мв*г) о уы«р набпммется

сроки жизни, иве.

Рис. 3. Общая выживаемость больных раком толстой кишки с учетом содержания 1РА в ткани опухоли.

Обнаружено, что низкие (менее 0,85 нг/мг белка) уровни иРА в ткани опухоли больных раком толстой кишки, соответствующие его содержанию в неизмененной ткани, можно считать прогностически благоприятными. Отметим, что наиболее часто такие уровни выявляли в опухоли больных при 1-ИЬ стадиях (31 пациент из 36, 86,1%) и реже у больных с III стадией (10 из 32, 31,3%), у больных IV стадии низкие значения иРА в опухоли не были выявлены.

Показано, что высокие (более 2 нг/мг белка) уровни 1РА в ткани опухоли больных раком толстой кишки можно считать прогностически благоприятными (рис. 3).

Обнаружено, что медиана общей выживаемости больных раком толстой кишки при неблагоприятных значениях РА1-1 (>0,5 нг/мг белка) составила немного более 3-х лет, а количество пациентов, проживших 5 лет, сократилось в 1,7 раза по сравнению с больными с благоприятными низкими значениями РА1-1 (<0,5 нг/мг белка) в ткани опухоли, соответствующими значениям маркера в неизмененной слизистой.

Многофакторным анализом обнаружено, что из 7 изучаемых показателей независимыми факторами прогноза можно считать ММР-9, коллаген IV типа и иРА.

Следует также отметить, что только у 6 (3,2%) больных раком толстой кишки все исследованные биохимические маркеры были неблагоприятными, при

этом медиана выживаемости в данной группе пациентов составила 37,9 месяцев. У 6 (3,2%) больных все исследованные маркеры были благоприятными.

Среди наиболее неблагоприятных сочетаний следует выделить:

высокие значения ММР-9 с низким значением коллагена IV типа (74 пациента, 39,6%; медиана 23,5 мес., 5-летняя выживаемость 15,7±5,5%);

высокие значения ММР-9 с высоким значением иРА (80 пациентов, 42,8%; медиана 22,0 мес., 5-летняя выживаемость 20,1±5,9%);

высокие значения ММР-9 с высоким значением РА1-1 (75 пациентов, 40,1%, медиана 22,0 мес., 5-летняя выживаемость 17,3±5,7%);

низкие значения коллагена IV типа с высоким значением РА1-1 (82 пациентов, 43,9%, медиана 26,4 мес., 5-летняя выживаемость 25,8±5,9%).

Эти сочетания можно рекомендовать для применения в клинической практике с целью определения индивидуального прогноза клинического течения рака толстой кишки.

Тканевые и сывороточные маркеры у больных раком толстой кишки и риск развития метастазов в печени

Наиболее частой причиной смерти больных раком толстой кишки является прогрессирование заболевания в виде метастазов в печени. Развитие метастазов в печени оценено у 187 больных раком толстой кишки. Из 187 пациентов в течение 1-го года наблюдения после лечения метастазы в печени развились у 24 (12,8%) больных, на 2-м году жизни - у 19 (10,2%) пациентов.

Медиана безрецидивной выживаемости больных раком толстой кишки составила 84,7±3,1 мес. 5-летняя общая выживаемость составила 63,8±4,8%.

Анализ функции риска развития метастазов в печени у больных раком толстой кишки показал, что наибольший риск обнаружен в первые два года после проведенного лечения, в последующие 3 года риск развития метастазов был существенно ниже и вновь возрастал только на 7 году наблюдения.

В таблице 15 приведены данные по выживаемости без метастазов больных раком толстой кишки, включенных в настоящее исследование (в общей группе и с учетом наиболее важных клинических признаков, достоверно связанных с отдаленными результатами лечения).

Так, стадия заболевания была достоверно связана с безрецидивной выживаемостью больных раком толстой кишки (р=0,01). При этом у больных при 1-Ша стадиях 3-летняя безрецидивная выживаемость составила 100%. Существенно снижались показатели безрецидивной выживаемости у больных при ШЬ стадии (5-летняя безрецидивная выживаемость снижалась до 69,7±14,6%).

Таблица 15.

Безрецидивная выживаемость больных раком толстой кишки с учетом

основных клинико-морфологических признаков опухолевого процесса

Клиническ ий признак Градация признака N Медиана выживаемости, мес. Безрецидивная выживаемость, %

1 -летняя 3-летняя 5-летняя

Вся группа 187 84,7 ±3,1 86,0±2,6 70,3 ±3,7 63,8±4,8

Стадия р=0,01 I+IIa 12 Не достигнута 100 100 -

НЬ 29 Не достигнута 100 100 100

Illa 11 Не достигнута 100 100 -

ШЬ 21 Не достигнута 89,2±7,2 75,4±11,8 69,7±14, 6

IVa 9 Не достигнута 82,6±10, 5 74,1 ±16,1 -

IVb 20 Не достигнута 82,1 ±9,4 70,1 ±12,7 -

IVb с рез. печени 85 33,7 77,0±4,6 46,4±6,1 29,9±9,5

Степень дифферен цировки опухоли высокая 24 Не достигнута 91,7±5,6 77,9±8,8 64,9±8,8

умеренная 138 84,6 87,1 ±2,9 71,9 ±4,2 60,5 ±10, 9

низкая 25 46,1 71,3±10, 0 50,5±12,6 -

Глубина инвазии слизист. 6 Не достигнута 100 100 -

мышечн. 21 Не достигнута 95,0±4,9 94,2±5,0 94,0 ±5,1

все слои 61 Не достигнута 86,4± 4,5 81,4±5,1 65,9±7,3

жир. клет. 87 62,1 80,2 ±4,4 62,0±6,0 48,8±7,9

Инвазия в сосуды есть 51 34,0 74,6±6,5 43,5 + 11,4 30,4±16, 7

нет 136 86,4 88,8±2,7 74,6 ±3,9 68,9±5,1

В группе больных раком толстой кишки в 1УЬ стадии с резекцией печени по поводу единичных метастазов опухоли медиана безрецидивной выживаемости

была минимальной (33,7 мес.), а 5-летняя безрецидивная выживаемость составила 29,9±9,5%.

Вариант гистологического строения опухоли не был достоверно связан с показателем безрецидивной выживаемости больных раком толстой кишки (р=0,7). Так, 3-летняя безрецидивная выживаемость составила в группах больных с опухолями железистого, папиллярного, тубулярного и солидно-альвеолярного строения рака толстой кишки 69,9±4,6%, 69,9±7,7%,66,7±19,2% и 72,4±12,% соответственно.

Выявлена сильная тенденция к различию в показателях безрецидивной выживаемости больных раком толстой кишки в группах с различной степенью дифференцировки опухоли (р=0,08). Так, в группе больных раком толстой кишки с низкой степенью дифференцировки опухоли медиана безрецидивной выживаемости составила 20,1 мес., а 5-летняя безрецидивная выживаемость составила 11,2±9,2%.

Большая глубина инвазии опухоли в кишечную стенку достоверно ухудшала безрецидивную выживаемость больных раком толстой кишки (р=0,02). Так, при наибольшей глубине инвазии, при прорастании всех слоев стенки кишки и врастании опухоли в жировую клетчатку 5-летняя безрецидивная выживаемость составила 48,8+7,9%.

Экспрессия беям ММРв

(Кар1ап-МЫ*г) о развился итс •;• нет мтс

■ л

0,1

0.0

20

40 «0 ео 100 120

срок наблюдения, мес

Рис. 4. Безрецидивная выживаемость больных раком толстой кишки с учетом уровня экспрессии ММР-9 в опухоли.

Достоверно различалась безрецидивная выживаемость у больных раком толстой кишки при наличии и отсутствии инвазии опухоли в кровеносные и лимфатические сосуды (р=0,01). Так, медиана безрецидивной выживаемости в группе больных с наличием сосудистой инвазии не достигала 3-х лет, а показатель 5-летней безрецидивной выживаемости составил 30,4±16,7%.

Пол, возраст больных раком толстой кишки, наличие слизеобразования, участков некроза, лимфоидной и воспалительной инфильтрации в опухоли не были достоверно связаны с безрецидивной выживаемостью больных раком толстой кишки.

На рисунке 4 представлены данные безрецидивной выживаемости больных раком толстой кишки с учетом экспрессии ММР-9 в ткани опухоли (р=0,001). Так, медиана безрецидивной выживаемости при неблагоприятной (высокой) экспрессии ММР-9 в опухоли была в 1,5 раза, а 5-летняя - в 1,7 раза меньше, чем при благоприятной (низкой) экспрессии маркера. Таким образом, данный белок при иммуногистохимическом определении в опухоли больных раком толстой кишки обладает способностью прогнозировать развитие метастазов в печени.

Показатели безрецидивной выживаемости при неблагоприятно низкой экспрессии коллагена IV типа в ткани опухоли были почти в 3 раза ниже, чем при благоприятно высоком уровне его экспрессии. Однако данный белок при иммуногистохимическом определении в опухоли больных раком толстой кишки обладает недостаточно выраженной прогностической способностью относительно раннего развития метастазов в печени.

Показано, что исходные уровни \TiGF в сыворотке крови достоверно связаны с безрецидивной выживаемостью больных раком толстой кишки (р=0,0001). Неблагоприятными следует считать уровни УЕвР в сыворотке крови более 800 пг/мл, когда показатель 5-летней выживаемости снижается в 2,7 раза, а медиана времени выявления метастазов в печени составила чуть более 2-х лет. Таким образом, содержание УЕСР в сыворотке крови, определенное до начала лечения, может служить фактором прогноза безрецидивной выживаемости и учитываться при выборе объема и методов лечения у больных раком толстой

КИШКИ.

Получены достоверные различия в показателях безрецидивной выживаемости больных раком толстой кишки с учетом исходных уровней бРэб в сыворотке крови (р=0,0001). Показано, что содержание бРэб более 10 нг/мл в сыворотке крови больных раком толстой кишки также является высокоинформативным неблагоприятным фактором прогноза у этой категории пациентов относительно развития метастазов в печени.

Также выявлено, что уровни иРА в ткани опухоли больных раком толстой кишки менее 3,0 нг/мг белка можно считать благоприятными в оценке прогноза риска развития отдаленных метастазов. Высокие (более 2 нг/мг белка) уровни 1РА в ткани опухоли больных раком толстой кишки следует считать прогностически благоприятными относительно развития метастазов в печени. Анализ связи содержания РА1-1 в ткани опухоли больных раком толстой кишки с развитием отдаленных метастазов показал достоверные различия по пороговому уровню маркера равному 2,0 нг/мг белка (р=0,0001). Медиана безрецидивной выживаемости больных раком толстой кишки при неблагоприятных значениях РА1-1 (более 2,0 нг/мг белка) составила немного более 2-х лет. Следовательно, высокие значения РА1-1 (более 2,0 нг/мг белка) в ткани опухоли следует считать неблагоприятным прогностическим фактором относительно развития метастазов в печени у больных раком толстой кишки.

Многофакторным анализом обнаружено, что из 7 изученных нами показателей независимыми факторами прогноза следует считать ММР-9, БРаБ и иРА. Среди наиболее неблагоприятных сочетаний маркеров у больных раком толстой кишки необходимо выделить высокие значения экспрессии ММР-9 в первичной опухоли с высокими исходными уровнями бРзб в сыворотке крови (71 пациент, 39,6%, медиана 24,9 мес., 5-летняя безрецидивная выживаемость 21,2±15,4%). Сочетание вышеуказанных маркеров следует рекомендовать в клинической практике для определения индивидуального прогноза течения рака толстой кишки.

Выводы

1. При иммуногистохимическом исследовании в 48,7% опухолей толстой кишки выявили высокий (неблагоприятный) уровень экспрессии ММР-9, при этом частота выявления высокой экспрессии маркера в опухоли достоверно повышалась: при 1УЬ стадии заболевания (80,0%), при низкой степени дифференцировки опухоли (80,0%), при наличии инвазии опухоли в кровеносные сосуды (82,4% больных).

2. Выявлено достоверное снижение показателей выживаемости среди больных раком толстой кишки с высокими уровнями экспрессии ММР-9 в опухоли по сравнению с низким содержанием фермента: общей 5-летней выживаемости примерно в 3 раза, а безрецидивной 5-летней выживаемости - в 1,5 раза.

3. Обнаружили низкий (неблагоприятный) уровень экспрессии коллагена IV типа в опухоли у 57,2% больных раком толстой кишки, при этом частота выявления низкой экспрессии белка достоверно повышалась: при 1УЬ стадии заболевания (85,0%), при низкой степени дифференцировки опухоли (76,0%), при большой глубине инвазии опухоли в кишечную стенку с прорастанием всех слоев и врастанием в жировую клетчатку (75,0%), при наличии инвазии опухоли в сосуды (86,3% больных).

4. Показатель общей 5-летней выживаемости больных раком толстой кишки был достоверно ниже (примерно в 3 раза) при низкой экспрессии коллагена IV типа в опухоли, по сравнению с пациентами с высокой экспрессией маркера, а безрецидивная 5-летняя выживаемость достоверно не различалась между этими группами больных.

5. Обнаружен достоверно высокий исходный уровень ключевого активатора неоангиогенеза УЕвР в сыворотке крови больных раком толстой кишки (медиана 700 пг/мл) относительно группы контроля (медиана 301 пг/мл), при этом концентрация маркера достоверно повышалась: при IV стадии заболевания по сравнению с I и На стадиями (показатели не отличались от группы контроля), при низкой степени дифференцировки опухоли по сравнению с высокой, при увеличении глубины инвазии опухоли в кишечную

стенку, достигая максимальных значений при врастании в жировую клетчатку и при наличии инвазии опухоли в сосуды.

6. Показатели выживаемости больных раком толстой кишки достоверно снижались при высоких исходных уровнях УЕвР в сыворотке крови (800 пг/мл и более) по сравнению с низкими его значениями (менее 400 пг/мл), а общая 5-летняя выживаемость составила 46,2±6,2% и 80,1 ±9,1%, соответственно, при этом 5-летняя безрецидивная выживаемость снизилась в 2,5 раза.

7. Наряду с увеличением концентрации УЕвР в сыворотке крови больных раком толстой кишки обнаружено достоверное повышение в опухоли уровня неблагоприятно высокой экспрессии ММР-9 и одновременно низкая экспрессия коллагена IV типа.

8. Обнаружено более частое выявление бРэб в сыворотке крови больных раком толстой кишки (57,8%) по сравнению с практически здоровыми людьми (28,6%), а содержание маркера было достоверно выше у больных (медиана -9,1 нг/мл), чем в контроле (медиана - 0,9 нг/мл). При этом показатели БРаБ были тесно связаны с основными клинико-морфологическими характеристиками болезни и достоверно повышались при неблагоприятной высокой экспрессии белков ММР-9 и низкой экспрессии коллагена IV типа в опухоли (медианы -10,4 и 10,0 нг/мл, соответственно).

9. При высоком исходном уровне БраБ в сыворотке крови больных раком толстой кишки (10 нг/мл и более) выявлены достоверно низкие показатели выживаемости: общая 5-летняя выживаемость составила 37,6±7,1% (медиана 25,4 мес.), а безрецидивная 5-летняя выживаемость - 43,9±8,2% (медиана 18,3 мес.).

10. Содержание активатора плазминогена урокиназного типа (иРА) и его ингибитора (РАН) в ткани опухоли больных раком толстой кишки было достоверно выше, чем в неизмененной слизистой оболочке толстой кишки. Их уровни достоверно повышались: при IV стадии болезни, при низкой степени дифференцировки опухоли и ее прорастании всех слоев стенки кишки, при наличии инвазии опухоли в сосуды, а также при

неблагоприятно высоких уровнях экспрессии ММР-9 и низком содержании коллагена IV типа.

11. Общая 5-летняя выживаемость больных раком толстой кишки достоверно уменьшалась: при значениях иРА в ткани опухоли более 0,85 нг/мг белка (47,8±4,7%, медиана - 58,9 мес.); при значениях РА1-1 более 0,5 нг/мг белка (44,3±5,0%, медиана - 39,1 мес.), при значениях 1РА менее 2 нг/мл (44,1±5,4%, медиана - 38,8 мес.). Безрецидивная 5-летняя выживаемость больных раком толстой кишки достоверно различалась при пороговых значениях маркеров, которые составляли: для иРА - 3 нг/мг белка; для 1РА - 2 нг/мг белка; для РА1-1 -2 нг/мг белка

12. Установлены наиболее значимые комбинации маркеров, сочетания которых указывают на: неблагоприятный прогноз общей выживаемости - ММР-9/коллаген IV типа, ММР-9/иРА, ММР-9/РА1-1, коллаген IV типа/РА1-1; высокий риск развития отдаленных метастазов - ММР-9/Браз.

Практические рекомендации

На основе анализа некоторых молекулярно-биологических характеристик опухоли определены критерии для выявления наиболее прогностически неблагоприятных случаев и предрасположенности больных колоректальным раком к развитию метастазов. Так, показатели общей 5-летней выживаемости больных колоректальным раком при высоком уровне экспрессии ММР-9 в первичной опухоли в 3 раза достоверно ниже, чем при низкой экспрессии белка, а 5- летняя безрецидивная выживаемость пациентов ниже в 1,5 раза. Показатели общей 5-летней выживаемости больных раком толстой кишки зависели от уровня исходной концентрации ключевого активатора неоангиогенеза УЕвР в сыворотке крови, и при высоких его значениях (от 800 пг/мл и более) они были достоверно ниже, чем при значении УЕвР менее 400 пг/мл. При этом высокий уровень экспрессии ММР-9 в первичной опухоли больных колоректальным раком был связан с повышенными исходными уровнями УЕвР в сыворотке крови. Общая 5-летняя выживаемость больных колоректальным раком при уровнях эРаэ в сыворотке крови от 10 нг/мл и более была достоверно ниже. Кроме того,

обнаружено, что безрецидивная 5-летняя выживаемость больных раком толстой кишки достоверно различалась между больными по пороговому уровню 3 нг/мг белка для иРА, 2 нг/мг белка для 1РА и 2 нг/мг белка для РА1-1. Многофакторный анализ выявил наиболее неблагоприятные сочетания маркеров при оценке общего прогноза рака толстой кишки: ММР-9-коллаген IV типа, ММР-9-иРА, ММР-9-РА1-1, коллаген IV типа-РА1-1 и при прогнозе отдаленных метастазов ММР-9-вРаэ.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Иммуногистохимическое исследование экспрессии Е-кадхерина, р-катенина и СЭ44у6 в клетках первичного рака толстой кишки и его метастазов // Архив патологии. - 2005. - том 67, №6 - с.34-38.

2. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Экспрессия молекул клеточной адгезии Е-кадхерина, Р-катенина и СЭ-44\'6 в первичных опухолях и метастазах аденокарциномы толстой кишки // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2005. - том 139, №6. - с.675-679.

3. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Экспрессия молекул клеточной адгезии в первичных опухолях и метастазах рака толстой кишки // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Новые технологии в онкологии» (Барнаул, 7-8 июня 2005 г.). - Барнаул. - 2005. - с.219-220.

4. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Экспрессия молекул клеточной адгезии в метастазах аденокарциномы толстой кишки // В материалах VI Всероссийского съезда онкологов (Ростов-на-Дону, 914 октября 2005г.). Ростов-на-Дону - 2005. - с.ЗОЗ.

5. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Экспрессия молекулярно-биологических факторов прогноза и метастазирования при раке толстой кишки // В материалах II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 20-21 октября 2005г.). - М. - 2005. - с. 115.

6. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Прогностическая значимость молекул межклеточной адгезии при раке толстой кишки // В материалах XIII Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 3-7 апреля 2006г.). - М. - 2006. - с.116.

7. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Гольдберг В.Е., Кушлинский Н.Е. Иммуногистохимическое исследование межклеточных и клеточно-матриксных взаимодействий в аденокарциномах толстой кишки // Сибирский онкологический журнал. - 2006. - № 3(19). - с.99.

8. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Прогностическая значимость молекул межклеточной адгезии при раке толстой кишки // В тезисах международной научно-практической конференции «Ведущий многопрофильный госпиталь страны: основные функции, достижения и направления развития» (Москва, 1-2 июня 2006г.) // Вопросы клинической онкологии и онкогематологии. - М. - 2006. - том 1-2, №6. - с. 169.

9. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Значение системы межклеточной и клеточно-матриксной адгезии в метастазирующих адеиокарииномах толстой кишки // В материалах Российской научно-практической конференции с международным участием: «Современные методы лечения онкологических больных: достижения и неудачи» (Барнаул. 4-5 июля 2006г.). - Барнаул. -2006. - с. 182-183.

10. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г.. Головков Д.А.. Кушлинский Н.Е. Молекулярные маркеры инвазии и метастазирования при раке толстой кишки // В материалах IV съезда онкологов и радиологов СНГ (Баку, 28 сентября - 1 октября 2006г.). - Баку. - 2006. - с.41.

11. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Особенности экспрессии матриксиых металлопротеиназ в аденокарциномах толстой кишки и их метастазах // В материалах X Российского онкологического конгресса (Москва. 21-23 ноября 2006г.). - М. - 2006. - с.217.

12. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Молекулы межклеточной адгезии как факторы инвазии и метастазирования при раке толстой кишки // Молекулярная медицина. - 2007. - №1 - с.50-54.

13. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г.. Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Прогностическая значимость экспрессии матриксных металлопротеиназ в аденокарциномах толстой кишки и их метастазах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2007. - том 143, №4. - с.434-438.

14. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А. Роль компонентов базальных мембран в процессе метастазирования аденокарцином толстой кишки // В материалах XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007г.). - М. - 2007. - с.85.

15. Делекторская В.В., Перевощиков А.Г., Головков Д.А., Кушлинский Н.Е. Влияние матриксных металлопротеиназ на инвазивно-метастатический потенциал клеток рака толстой кишки // В материалах XIV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 16-20 апреля 2007г.). -М. - 2007. - с.85-86.

16. Герштейн Е.С., Короткова Е.А., Щербаков А.М., Пророков В.В., Головков Д.А.. Кушлинский Н.Е. Матриксные металлопротеиназы 7 и 9 и их тканевые ингибиторы 1 и 4 типа в опухолях и плазме крови больных раком толстой кишки // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины - 2007. - том 143, №4. -с.438-442.

17. Делекторская В.В.. Кушлинский Н.Е., Головков Д.А. Молекулярные маркеры инвазии и особенности прогноза рака толстой кишки // Тезисы докладов в материалах XV Российского национального конгресса «Человек и лекарство» (Москва, 14-18 апреля 2008г.). - М. - 2008. - с.395.

18. Делекторская В.В., Головков Д.А., Николаев A.A.. Кушлинский Н.Е. Прогностическая значимость содержания белка nm23 в опухолях больных раком толстой кишки // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - 2008. - №6.- с.99-103.

19. Делекторская В.В., Головков Д. А., Кушлинский Н.Е. Иммуногистохимические, биохимические и ультраструктурные особенности метастазирующих аденокарцином толстой кишки // Клиническая лабораторная диагностика,- 2008. - №9. - с. 19-20.

Список условных сокращений

ИЛ - интерлейкин

ИФА - иммуноферментный анализ

ИГХ - иммуногистохимическое исследование

КРР - колоректальный рак

НК - натуральные киллеры

МА - моноклональные агонистические антитела

ПКГ - программированная клеточная гибель

РТК - рак толстой кишки

ЦТЛ - цитотоксические лимфоциты

VEGF - фактор роста эндотелия сосудов

FasL - Fas-лиганд

sFas - растворимый Fas

uPA - активатор плазминогена урокиназного типа

tPA - активатор плазминогена тканевого типа

PAI-1 - ингибитор активатора плазминогена 1 типа ММР-9 - матриксная металлопротеиназа 9

TIMP - тканевой ингибитор металлопротеиназ

Подписано в печать 15.12.08 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

_Тираж 100 экз. Заказ № 881_

Отпечатано в службе множительной техники ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24