Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Активаторы плазминогена урокиназного и тканевого (u-PA и t-PA) типов и их ингибитор (PAI-1) при опухолях костей

Изучение механизмов канцерогенеза и метастазирования раковых клеток за последнее десятилетие привело к открытию ряда биологически активных веществ, которые играют важную роль в этих процессах. Как известно, для возникновения метастазов необходимо, чтобы опухолевые клетки могли выйти из первичного места расположения и проникнуть в сосуды. Для этого опухоль продуцирует ферменты, растворяющие строму и базальные мембраны. Было показано, что в этот процесс вовлечен сложный каскад протеолитических ферментов, наиболее известными из которых являются активаторы плазминогена урокиназного и тканевого типов и некоторые матриксные металлопротеазы такие, как коллагеназа и стромелизины.

Активатор плазминогена урокиназного типа (u-РА), являющийся сериновой протеазой, может играть ключевую роль в инвазии и метастазировании клеток, так как он превращает плазминоген в плазмин. Плазмин способен непосредственно разрушать некоторые белки внеклеточного матрикса, а также активировать другие металлопротеазы (van Roozenaal и соавт., 1996).

Исследования, проведенные при раке молочной железы, показали, что эти опухоли содержат также ингибиторы активатора плазминогена - PAI-1 и PAI-2. Однако, хотя PAI-1 способен блокировать действие активатора плазминогена иРА, наличие его было ассоциировано с увеличением количества рецидивов. С другой стороны, уровень PAI-1 отрицательно коррелирован с наличием в опухоли рецепторов эстрогенов, прогестерона и эстроген регулируемым pS2 белком, которые, как известно, связаны с благоприятным прогнозом.

Наоборот, обнаружение PAI-2 в опухолях больных было связано с лучшими показателями выживаемости.

Таким образом, уровень ингибиторов плазминогена урокиназного типа в ткани оказался важным показателем в оценке метастатических возможностей рака (John A. Foekens, 1994).

Jan Grondahl-Hansen и соавт. (1995) изучая прогностическую значимость рецептора активатора плазминогена урокиназного типа (uPAR) в опухолях молочной железы пришли к выводу, что высокие уровни этого белка в опухоли связаны с худшими результатами лечения этих пациентов.

Большинство вышеуказанных исследований проведены при раке молочной железы, однако, есть данные об экспрессии u-PA стромальными клетками рака толстой кишки, а также синтезе некоторых металлопротеаз клетками рака кожи и другими новообразованиями человека.

Цель настоящего исследования: - изучение экспрессии активаторов плазминогена урокиназного (u-PA) и тканевого (t-PA) типов, а также ингибитора активатора плазминогена урокиназного типа 1 (PAI-1) в опухолях костей и оценка их взаимосвязи с основными клинико-морфологическими особенностями заболевания, и их роли в клиническом течении, терапии и прогнозе болезни. Достижение указанной цели требует решения следующих задач:

1. Иммуноферментным методом определить содержание активаторов плазминогена урокиназного и тканевого (u-PA, t-PA) типов, а также ингибитора активатора плазминогена урокиназного типа 1 (PAI-1) в цитозольной фракции различных морфологических вариантов опухолей и опухолеподобных поражений костей: при остеогенной и хондросаркоме, саркоме Юинга, злокачественной фиброзной гистиоцитоме, гигантоклеточной опухоли, фибросаркоме, костно-хрящевых экзостозах и других доброкачественных поражениях.

2. Оценить значение активаторов плазминогена и их ингибиторов, в клиническом течении и прогнозе заболевания.

3. Оценить влияние предоперационного химиотерапевтического лечения на содержание t-PA, u-PA и PAI-1 в опухолях костей.

4. Оценить взаимосвязь содержания t-PA, u-PA и PAI-1 в опухолях костей с основными клинико-морфологическими факторами прогноза (нозологической формой, гистологическим вариантом, размером опухоли, возрастом, наличием метастазов и процентов местных рецидивов).

5. Выявить возможные варианты опухолей, отличающиеся по содержанию активаторов плазминогена урокиназного и тканевого (u-PA и t-PA) типов, а также ингибитора активатора плазминогена урокиназного типа 1 (PAI-1) в цитозольной фракции и их роль в прогнозе заболевания.

Научная новизна

Впервые в отечественной литературе проведено определение содержания активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типов (u-PA и t-PA) и ингибитора активатора плазминогена урокиназного типа 1 (PAI-1) в цитозольной фракции опухолей и опухолеподобных поражений костей.

На основании лабораторных и клинических исследований выяснена связь между экспрессией активаторов плазминогена урокиназного типа (u-PA и t-PA) и ингибитора активаторов плазминогена типа 1 (PAI-1) в цитозольной фракции опухолей костей и основными клинико-морфологическими характеристиками заболевания. Исследована корреляционная связь между клиническими и морфологическими факторами прогноза опухолей костей.

Впервые показано, что опухолеподобные заболевания костей содержат значительно меньшие количества u-РА, чем злокачественные новообразования.

Впервые продемонстрировано повышенное содержание активатора плазминогена (u-РА) при метастазирующих опухолях остеосаркомы по сравнению с неметастазирующими, а также повышенное содержание PAI-1 при ранних сроках метастазирования опухолей.

Впервые показана корреляционная взаимосвязь между уровнем PAI-1 и размером опухолей костей, а именно, остеосаркомы, хондросаркомы и гигантоклеточной опухоли.

Практическое значение исследования Работа представляет не только теоретический интерес для анализа роли активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типа (u-РА и t-PA) и ингибитора активаторов плазминогена типа PAI-1, их связь со степенью злокачественности и дифференцировки клеток, способности к метастазированию, но и выяснения прогностического значения исследованных показателей. Анализ результатов, возможно, позволит обосновать и представить новые критерии клинического течения, а также прогноза заболевания, и, учитывая абсолютные значения вышеназванных показателей, позволит дифференцированно подходить к выбору адьювантных методов лечения у конкретного больного.

Подобные исследования могут быть основой для создания новых групп препаратов - лекарств, влияющих на экспрессию ингибиторов и активаторов плазминогена, синтетических ингибиторов и антител против плазминогена (плазмина), и других литических ферментов выделяемых опухолью - препаратов которые будут влиять на распространение опухоли, а именно на процессы ее инвазии и метастазирования.

Публикации исследования: Материалы диссертации опубликованы в 4 научных работах.

Апробация диссертации: Материалы диссертации доложены на VII и VIII Национальных Конгрессах "Человек и лекарство" (Москва, 2000, 2001гг.) и на II конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс медицины" (Москва, 2001г.).

Диссертация апробирована 6 марта 2001 года на совместной научной конференции лаборатории клинической биохимии, хирургического отделения общей онкологии, хирургического отделения опухолей молочных желез, отделения изучения новых противоопухолевых лекарств (с однодневным стационаром химиотерапии) НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН, кафедры онкологии ММА им. И.М.Сеченова.

Структура и объем работы. Диссертация включает введение, обзор данных литературы, главу "Материалы и методы", собственные данные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, список литературы (140 наименований). Работа изложена на 108 страницах машинописного текста, содержит 15 таблиц и 8 рисунков.

ВЫВОДЫ

1. В опухолях костей иммуноферментым методом обнаружен активатор плазминогена тканевого типа (t-PA) в количестве 0-28,6 нг/мг белка, среди них в остеосаркоме (0,28, 0,78±1,38), в хондросаркоме (0,46, 2,43±5,34), в гигантоклеточной опухоли (0,33, 0,79±1,36), в опухоли Юинга (0,9, 1,17+0,84), в костно-хрящевых экзостозах (4,9, 11,87+13,35); активатор плазминогена урокиназного типа (u-PA) - 0-3,05 нг/мг, среди них в остеосаркоме (0,41,0,50±0,59), в хондросаркоме (0,19, 0,42±0,51), в гигантоклеточной опухоли (0,71, 0,68±0,42), в опухоли Юинга (0,08, 0,37+0,68), в костно-хрящевых экзостозах (0,01, 0,02+0,04) и ингибитор активаторов плазминогена 1-го типа (PAI-1) в количестве 0-39,05 нг/мг среди них в остеосаркоме (2,08,2,49+1,98), в хондросаркоме (4,6, 9,58±10,05), в гигантоклеточной опухоли (3,50, 4,45+3,83), в опухоли Юинга (1,27, 5,05±8,94,), в костно-хрящевых экзостозах (2,66, 4,60±6,63). (В общей группе больных наблюдалась слабая, но достоверная корреляция между уровнями u-PA и PAI-1 (г=0,29; р<0,01).

2. При сравнений различий в группах достоверные различия для u-PA были обнаружены между ГКО и хондросаркомы, КХЭ и ГКО, ГКО и остеосарком, опухолей Юинга и костно-хрящевых экзостозов, и остеосаркомой и КХЭ; для PAI-1 наибольшие различия обнаружены между хондросаркомой и остеосаркомой, ГКО и хондросаркомой экспрессия t-PA наиболее достоверно отличалась у костно-хрящевых экзостозах и ГКО и остеосарком.

3. Неоадьювантная предоперационная химиотерапия при остеосаркоме не влияет достоверно на уровни экспрессии t-PA, u-PA и PAI-1.

4. Количество u-PA в тканях доброкачественных новообразований (КХЭ) достоверно ниже, чем в злокачественных опухолях костей. Количество t-PA, наоборот выше в КХЭ по сравнению с другими опухолями. По отношению к уровням PAI-1 подобных наблюдений не обнаружено.

5. Экспрессия u-PA в опухолях больных с метастазами остеосаркомы в 2 раза превышала его количество у безметастатических больных (р<0,05), экспрессия других протеаз в зависимости от метастазирования достоверно не отличалась. Количество PAI-1 у больных остеосаркомой в несколько раз выше при сроках метастазирования до 12 мес. (р<0,05). В тканях больных опухолью Юинга все три протеазы были выше у больных с метастазами.

6. Между содержанием u-PA, t-PA и PAI-1, а также возрастом и полом больных не обнаружено четкой взаимосвязи

7. Установлена корреляция между размером опухоли и количеством протеаз (PAI-1) для остеосаркомы, хондросаркомы и гигантоклеточной опухоли.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

До сих пор не удалось добиться принципиального улучшения действенности существующих методов или найти новые пути, способные обеспечить получение удовлетворительного терапевтического эффекта. Подобная ситуация является следствием целого ряда обстоятельств, из которых наиболее важными представляются следующие.

Во-первых, чрезвычайно высокий инвазивный и метастатический потенциал костных клеток. Во-вторых, неприемлемость традиционных принципов абластики из-за некоторых, пока трудно преодолимых моментов технического характера. В-третьих, относительно ограниченные возможности современных консервативных методов лечения костных опухолей в силу, с одной стороны, определенных особенностей васкуляризации костной ткани, и, с другой стороны, отсутствием способов достаточно эффективного воздействия на малигнизированные клетки костного гистогенеза (Аббасов Ф.А., 2000).

Одним из наиболее важных свойств опухоли является способность выделять протеолитические ферменты, которые играют важную роль в инвазии опухолевых клеток в окружающие ткани и сосуды (Kim W.Yu. et al., 1998). По-видимому, центральную роль в этих процессах играют ферменты регуляции активности плазминогена: активаторы плазминогена урокиназного (u-PA) и тканевый активатор плазминогена (t-PA), а также их ингибиторы: PAI-1 и PAI-2. По представленным в литературе данным u-PA имеет важное значение в процессах деградации межклеточного вещества соединительной ткани как в нормальном организме, так и в опухоли, в то время как t-PA участвует в тромбо-и фибринолизе (Pollanen J. et al., 1987; Roozendaal С. et al., 1996).

Предполагается, что u-PA играет центральную роль в регуляции межклеточного протеолиза в различных физиологических и патологических процессах, включающих деструкцию ткани и миграцию клеток, таких как инволюцию органов, воспалительные реакции, инвазивный рост трофобласта и опухолевых клеток (Pollanen J. et al., 1987). В последнее время приводятся также доказательства важной роли u-PA в процессах ангиогенеза в опухолях. Активность u-PA непосредственно регулируется PAI-1 и PAI-2, относящихся к классу серпинов. Некоторые исследователи предполагают защитную роль PAI-1 для ткани опухоли в процессе деградации (Руке С. et al., 1991.). Другая группа исследователей выдвинула гипотезу о том, что уровень PAI-1 в ткани может быть биохимическим показателем степени неоваскуляризации, так как PAI-1 может иметь важную роль в ангиогенезе (Montescano R. et al., 1990).

Активатор плазминогена тканевого типа - t-PA также принимает участие в активации плазминогена в опухолях, что подтверждают высокие уровни его, обнаруженные в тканях опухолей молочной железы (De Witte J. et al., 1999).

Таким образом, результаты клинических исследований при многих типах опухолей свидетельствуют о важной роли ферментов системы плазминогена в процессах инвазии и метастазирования. По данным многих исследователей эти вещества также перспективны с клинической точки зрения. При этом наиболее значимыми показателями с точки зрения прогноза заболевания и оценки злокачественного потенциала опухоли, скорее всего, являются u-PA и PAI-1. С другой стороны, исследуется значение t-PA, PAI-2, uPAR и, кроме того, соотношения PAI-1/u-PA и PAI-2/u-PA в клиническом течении и исходе заболевания.

Основу нашего клинического материала составили 83 больных различными злокачественными, доброкачественными и опухолеподобными заболеваниями костей, находившихся на обследовании и лечении в Российском онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН в период с 1990 по 2000 гг.

Данные, полученные после обработки клинического материала, в основном, отражают уже ранее установленные тенденции. Согласно этим данным процент больных в возрасте от 16 до 20 лет, т.е. во второй декаде жизни, оказался достоверно выше по сравнению с другими возрастными группами. Этот факт хорошо согласуется с многочисленными данными литературы. Вместе с тем, в настоящем наблюдении эта тенденция особенно ярко была выражена в группе больных остеосаркомой, опухолью Юинга и доброкачественными новообразованиями. При других нозоологических формах костных сарком аналогичная тенденция особенно не проявлялась, что также подтверждается литературными данными. Например, при хондросаркоме и ГКО преобладали больные в возрасте от 21 до 30 лет.

Проведенное нами количественное определение концентрации некоторых компонентов системы активации плазминогена в цитозолях опухолей иммуноферментным методом позволило нам ответить на поставленные вопросы и подтвердить ряд закономерностей, существование которых можно было предположить на основании данных экспериментальных исследований и анализа последних публикаций.

Сравнительный анализ межгрупповых различий для активаторов плазминогена и PAI-1 выявил очень сложную картину. Уровни экспрессии t-PA, u-PA и PAI-1 в общих группах достоверно отличались, однако, межгрупповые различия были достоверны не всегда. Несмотря на это, было убедительно показано, что экспрессия u-РА в доброкачественных новообразованиях, а именно, в костно-хрящевых экзостозах была значительно ниже, чем в других группах опухолей. Это наблюдение согласуется с предполагаемой ролью этого вещества в развитии злокачественного процесса. Как известно, u-РА является ключевым звеном в превращении плазминогена в плазмин, и таким образом, запуская разрушение межклеточных компонентов и проникновение опухолевых клеток в окружающие ткани.

Сложнее выглядит ситуация с активатором плазминогена тканевого типа -t-PA и ингибитором PAI-1. При сопоставлении медиан и средних значений t-PA и u-РА в различных группах наблюдается, на первый взгляд, обратная зависимость: минимальному количеству u-РА КХЭ соответствуют максимальные количества t-PA. И наоборот, максимальные количества u-РА, отмеченные в тканях остеосарком и ГКО соответствовали минимальные количества t-PA в этих группах. Что касается PAI-1, то наибольшие количества его обнаруживались в хондросаркомах и опухолях Юинга, наименьшие - в остеосаркомах.

Таким образом, учитывая картину межгрупповых отличий и различную природу нозологических форм заболеваний, дальнейший анализ решено было провести раздельно в каждой группе.

В этой связи представляло интерес проследить зависимость содержания иРА, t-PA и PAI-1 в опухолях костей от клинических параметров заболевания, таких как размер и гистологический тип опухоли, наличия отдаленных метастазов и рецидива заболевания, а также от клинических параметров больных, таких как пол и возраст.

Как известно, в настоящее время в лечении остеосаркомы широко приметается неоадьювантная терапия. Применение сочетания наиболее активных противоопухолевых препаратов ведет к частичной или полной регрессии опухоли у многих больных. При эффективности химиотерапевтического лечения большая часть опухолевых клеток гибнет. Некроз опухолевых клеток приводит к необратимым биохимическим сдвигам, что может повлиять на результат исследования. Поскольку половина больных остеосаркомой получали неоадьювантную химиотерапию, необходимо было оценить ее влияние на показатели уровня протеаз и при обнаружении различий в группах "леченых" и "нелеченых" больных, дальнейший анализ провести раздельно. Проведенное исследование показало, что хотя уровни экспрессии протеаз часто и выше были у "нелеченных" больных, различия эти статистически незначимы, и поэтому в дальнейшем, при проведении других исследований, предоперационная химиотерапия больных не учитывалась.

В группе остеосарком проводили исследование количеств t-PA, u-PA и PAI-1 в зависимости от пола и возраста больных. В преобладающей группе мужчин были обнаружены немногим более высокие значения активаторов и ингибитора активаторов Pig (медианы были выше для всех трех показателей, средние только для t-PA и u-PA). Достоверных различий между этими группами не было выявлено. Для выяснения зависимости экспрессии протеаз от возраста группа больных остеосаркомой была разделена на две группы с "точкой среза" 18 лет.

По данным некоторых исследователей количество протеолитических ферментов системы плазминогена, а именно u-PA и PAI-1, влияет на 5-летнюю безрецидивную и общую выживаемость. При этом согласно данным регрессионного анализа по мере превышения количества u-PA некоторого значения, т.н. "точки среза", происходит резкое повышение процента рецидивов. У 6 больных остеосаркомой в среднем за 1,5 лет наблюдался местный рецидив заболевания, но сравнительный анализ экспрессии протеаз в группах с и без рецидива не выявил достоверных различий.

Остеосаркома известна как опухоль, образующая ранние гематогенные метастазы, частота которых составляет более 75%. Чаще всего диссеминация происходит в легкие, множественное поражение которых и является причиной смерти. Из исследованных нами 20 больных остеосаркомой метастазы наблюдались у 10. Сравнительный анализ u-PA, t-PA и PAI-1 в цитозолях больных с метастазами и безметастатических больных показал двукратное превышение u-PA у диссеминированных по сравнению с больными с локализованной опухолью.

Так как остеосаркомы метастазировали в разные сроки, представляло интерес выяснить зависимость экспрессии протеаз от сроков метастазирования. Из результатов этого исследования следует, что уровень PAI-1 в опухолях с ранним метастазированием достоверно в несколько раз выше по сравнению с группой остеосарком с более длительными сроками метастазирования.

Другим интересным наблюдением была достоверная и высокая корреляция между уровнем PAI-1 и объемом остеосаркомы. Для этого на основании патоморфологических данных вычислялся объем опухоли и критерий ранговой корреляции Спирмена (г>0,65). На корреляцию между размером опухоли и экспрессией тканевых протеаз указывали и другие исследователи (Foekens J. et al., 1995). Но в этих работах при оценке размера опухоли использовали данные TNM классификации, а не истинный размер (объем) опухолей. В отличие от опухолей молочной железы для опухолей костей, в частности для остеосаркомы и хондросаркомы, можно с большей степени точности измерить размер (объем) опухоли, а значит и степень корреляции. Учитывая тот факт, что изучению протеаз системы плазминогена в мировой литературе посвящены единичные работы, корреляция между уровнем PAI-1 и размером опухоли костей вероятней всего обнаружена нами впервые.

Хондросаркома является второй по частоте встречаемости среди злокачественных опухолей костей, и ее изучение представляет не меньший интерес, чем исследование других опухолей.

Изучение возрастной зависимости экспрессии тканевых протеаз в ХС не дало положительных результатов. В двух группах больных с возрастной границей до и более 27 лет наблюдалась незначительная и недостоверная разница. Группа хондросарком состояла из 20 больных с равным количеством мужчин и женщин. И хотя уровень экспрессии PAI-1 в группе женщин более чем в 2 раза превышал аналогичный уровень у мужчин, эта разница оказалась статистически незначимой.

Известна склонность ХС в 33-36% случаев к рецидивированию. Обнаружены факторы, влияющие на частоту возникновения рецидивов. Среди них пол, возраст, локализация и объем опухоли, тип проведенной операции. С учетом вышеуказанных факторов представляло интерес исследовать взаимосвязь частоты рецидивирования и количества t-PA, u-PA и PAI-1 в опухоли. Для этого был проведен сравнительный анализ количеств активаторов Pig и их ингибитора в группе больных с рецидивами (5 пациентов) с группой больных, у которых на данный момент рецидивы не были обнаружены. При этом медиана экспрессии t-РА в группе с рецидивами была в три раза выше, чем в безрецидивной группе. Медианы u-PA и PAI-1 были немного выше в безрецидивной группе, хотя среднее значение u-PA в группе с рецидивами превышало таковое в безрецидивной. Все различия между группами статистически незначимы.

Возможная общность функций ферментов системы плазминогена при опухолях костей подтверждается также тем фактом что, корреляционная взаимосвязь между количеством PAI-1 и размером опухоли наблюдается и в случае хондросаркомы. Более того, если при остеосаркоме только PAI-1 коррелирует с размером опухоли, в случае хондросаркомы аналогичная корреляция наблюдается и для t-PA. Хотя для хондросаркомы больший коэффициент корреляции и достоверный результат наблюдается, если использовать линейный параметр размера опухоли и логарифм PAI-1.

Исследование больных ГКО было ограниченным, вследствие небольшого числа рецидивов и отсутствия метастазов за время изучения. Корреляция между размером опухоли и количеством PAI-1 в ней была меньше, чем в случае остеосаркомы и хондросаркомы, но изучение аналогичной корреляции в объединенной группе ГКО и ХС показало, что одновременно с некоторым снижением коэффициента корреляции по сравнению только с группой хондросарком, следует повышение статистической достоверности.

В настоящее исследование были включены 5 больных опухолью Юинга. У трех из них наблюдались метастазы, у одного рецидив заболевания. Несмотря на малое количество наблюдений в данной группе, средние значения всех трех, исследованных нами протеаз, в цитозолях больных с метастазами оказались в несколько раз выше соответствующих показателей у больных без метастазов, что, возможно, подтверждает неблагоприятный прогноз у пациентов с повышенной экспрессией тканевых протеаз.

В качестве группы контроля для сравнения со злокачественными новообразованиями были использованы 7 случаев костно-хрящевых экзостозов. Согласно полученным результатам, КХЭ продуцировали в несколько раз больше t-PA , чем злокачественные опухоли. С другой стороны, КХЭ отличались сильно заниженным количеством экспрессии u-PA. Низкий уровень экспрессии u-PA в этой группе новообразований находится в согласии с той концепцией, что u-PA является ключевым ферментом, регулирующим протеолиз в ткани, и, таким образом, способствуя инвазии и деструкцирующему росту характерному для злокачественных опухолей.

В заключении следует отметить, что результаты изучения системы регуляции плазминогена при разных морфологических вариантах новообразований костей подтверждают связь экспрессии активаторов плазминогена t-PA и u-PA и их ингибитора PAI-1 со степенью злокачественности опухоли, предполагая активное участие исследованных протеаз в биологии опухоль-трансформированных тканей. Последующее наблюдение за обследованными группами больных и изучение их выживаемости, с учетом выявленных рецидивов и метастазов, позволит

90 проверить и обосновать представленные гипотезы. Дальнейшие исследования должны быть направлены на разработку патогенетических методов лечения вышеуказанных заболеваний костей, направленных на нормализацию процессов регуляции активности плазминогена, на изучение их роли в прогнозе заболевания, а также использование этих показателей как факторов повышенного риска малигнизации костной и хрящевой тканей при некоторых опухолеподобных процессах и доброкачественных новообразованиях костей.