Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Матриксные металлопротеазы и их тканевые ингибиторы в опухолях и плазме крови больных раком толстой кишки

На правах рукописи

КОРОТКОВА ЕКАТЕРИНА АНДРЕЕВНА

МАТРИКСНЫЕ МЕТАЛЛОПРОТЕАЗЫ И ИХ ТКАНЕВЫЕ ИНГИБИТОРЫ В ОПУХОЛЯХ И ПЛАЗМЕ КРОВИ БОЛЬНЫХ РАКОМ ТОЛСТОЙ КИШКИ

(специальность 14.01.12-онкология) ..... 005056441

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

б ЛЕК 2012

Москва - 2012 г.

005056441

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук

Директор академик

РАН и РАМН, профессор Давыдов Михаил Иванович

Научные руководители:

Д. б.п., профессор Д. м. н., профессор Официальные оппоненты: Горбачева Лора Борисовна

Герштейн Елена Сергеевна Пророков Василий Васильевич

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимической физики имени Н.М. Эмануэля Российской академии наук, главный научный сотрудник лаборатории количественной онкологии

Делекторская Вера Владимировна доктор медицинских наук, ФГБУ

«РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН, заведующая лабораторией гистохимии и электронной микроскопии

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздрава РФ

Защита диссертации состоится «_»_2012 г. в_часов на заседании диссертационного совета (Д001.017.02) Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РОНЦ им. H.H. Блохипа» РАМН по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24.

Автореферат разослан «_»_2012 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета профессор, д.м.н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Несмотря на успехи, достигнутые в диагностике, и совершенствование хирургических методов лечения, смертность от рака толстой кишки (РТК) остается довольной высокой. При этом у значительного числа больных при выявлении опухоли одновременно обнаруживаются регионарные и отдаленные метастазы. Трудности ранней диагностики и высокий метастатический потенциал определяют необходимость углубленного изучения механизмов распространения опухоли, знание которых могло бы стать основой для создания новых препаратов, целенаправленно воздействующих на процессы метастазирования и инвазии.

Одним из основных механизмов инвазии злокачественных опухолей является разрушение окружающей базальной мембраны и внеклеточного мат-рикса (ВКМ) ассоциированными с опухолью протеазами, играющими также важную роль в процессах метастазирования и неоангиогенеза (Duffy M.J., 2008). В опухолевой инвазии задействовано несколько классов протеаз, к важнейшим из которых следует отнести группу матриксных металлопротеи-наз (ММП) или матриксинов, названных так именно за свою способность специфически гидролизовать все основные белки внеклеточного матрикса, в первую очередь, коллаген (A. Nelson и соавт., 2000; E.Derygina и соавт., 2010). ММП — это мультигенное семейство, состоящее из более 20 секрети-руемых и связанных с поверхностью клетки цинк-зависимых эндопептидаз. Помимо большинства компонентов ВКМ, их субстратами могут быть также другие протеазы, хемотаксические молекулы, латентные формы факторов роста, растворимые и мембранно-ассоциированные белки, связывающие факторы роста. Важнейшими представителями семейства ММП являются различные неспецифические (ММП-1, ММП-8, ММП-13) и специфические (ММП-2/желатиназа А и ММП-9/желатиназа В) коллагеназы, матрилизин (ММП-7), стромелизины (ММП-3 и ММП-10). Активность ММП в межклеточном пространстве специфически подавляется тканевыми ингибиторами (ТИМП) - четырьмя структурно родственными белками, три из которых (ТИМП-1, -2 и -4) секретируются в растворимой форме, а один (ТИМП-3) -связан с ВКМ (Ramnath N., с соавт.,2004)

Для многих ММП продемонстрировано увеличение экспрессии в опухолях различного генеза, причем активация происходит по паракринному ме-

ханизму с участием факторов роста и цитокинов, секретируемых инфильтрирующими опухоль макрофагами и лимфоцитами, а также клетками опухолевой стромы (Ahmed N., с соавт., 2006). В последнее время появляются данные, свидетельствующие о том, что ТИМП, в первую очередь, ТИМП-1 и ТИМП-2, играют важную самостоятельную роль в регуляции роста и диффе-ренцировки опухолевых и нормальных клеток, а также обладают антиангио-генными свойствами (Ramnath N., с соавт 2004). В связи с этим различные ММП и ТИМП рассматриваются в настоящее время в качестве возможных биологических маркеров прогноза и лекарственной чувствительности злокачественных опухолей, в частности, рака толстой кишки (Lübbe W.J., с соавт., 2006; Roeb Е., с соавт., 2004; Zucker S., с соавт., 2004), а использование природных и синтетических ингибиторов ММП считается перспективным подходом к противоопухолевой терапии (Adachi Y., с соавт., 2001; Mimori К., с соавт., 2004; ОЬа К., с соавт., 2002).

Цель работы: Сравнительная оценка содержания различных матрикс-ных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в опухолях, гистологически неизмененной слизистой толстой кишки и плазме крови больных коло-ректальным раком в зависимости от различных клинико-морфологических особенностей для выявления наиболее перспективных биологических маркеров этого заболевания.

Задачи исследования:

1. Иммуноферментными методами определить содержание различных ММП (2, 3, 7, 9, 13) и их тканевых ингибиторов 1, 2 и 4 типов в опухолях и неизмененной слизистой больных раком толстой кишки, а также в доброкачественных полипах толстой кишки.

2. Определить концентрацию ММП и ТИМП в плазме крови больных раком толстой кишки до начала лечения и через 1-2 недели после операции, сопоставить полученные результаты с соответствующими показателями здоровых доноров и проанализировать взаимосвязь концентрации изучаемых белков в плазме крови с уровнем их экспрессии в опухолевой ткани.

3. Проанализировать взаимосвязь содержания исследованных маркеров в опухолях и плазме крови с основными клинико-морфологическими особенностями рака толстой кишки (стадией процесса, локализацией и гисто-

логическим строением опухоли, глубиной инвазии, наличием лимфоген-ных и отдаленных метастазов, полом и возрастом больных). 4. Проанализировать взаимосвязь уровня исследованных маркеров в опухолях и плазме крови больных колоректальным раком с выживаемостью пациентов и оценить их значение для прогноза заболевания в различных клинических группах.

Научная новизна и практическая значимость исследования:

Впервые количественными иммуноферментными методами исследован спектр экспрессии различных матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в опухолях и гистологически неизмененной слизистой больных раком толстой кишки и показано, что уровни всех исследованных ММП и их тканевых ингибиторов 1 и 2 типа достоверно повышены в опухолях по сравнению с неизмененной слизистой. Проанализирована концентрация соответствующих белков в плазме крови пациентов и прослежена динамика ее изменения на фоне проводимого лечения, в результате чего показано, что ММП-7 является перспективным маркером РТК, коррелирующим с распространенностью процесса.

Впервые продемонстрировано неблагоприятное значение высоких уровней ММП-7 и ТИМП-1 в плазме крови для прогноза общей выживаемости больных РТК различных стадий, а также достоверное неблагоприятное влияние повышенной экспрессии ММП-7 в опухоли на выживаемость больных с диссеминированным опухолевым процессом.

В результате многофакторного анализа выживаемости пациентов выявлено, что уровни концентрации ММП-7 и ТИМП-1 в плазме крови до оперативного вмешательства являются независимыми прогностическими факторами и могут быть рекомендованы в качестве дополнительных маркеров прогноза рака толстой кишки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Достоверное увеличение содержания ключевых матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в опухолях большинства больных раком толстой кишки по сравнению с гистологически неизмененной слизистой.

2. Матрилизин (ММП-7) как перспективный серологический маркер колоректального рака, коррелирующий с распространенностью процесса.

3. Уровни ММП-7 и ТИМП-1 в плазме крови, как независимые прогностические факторы, влияющие на течение заболевания.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции сотрудников лабораторий клинической биохимии, клинической иммунологии, иммунологии гемопоэза централизованного кли-нико-лабораторного отдела, хирургического отделения проктологии, хирургического отделения абдоминальной онкологии, кафедры клинической биохимии и лабораторной диагностики ФПДО МГМСУ и кафедры онкологии РМАПО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 15 июня 2012 г. Материалы диссертации представлены на IV и V Съездах онкологов и радиологов СНГ (Баку, 2006 г., Ташкент, 2008 г.), XIV Российском Национальном Конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2007 г.), XII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2008 г.), VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009 г.), 18th International Congress on Anti-cancer Chemotherapy (Paris, France, 2007), 35th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine (Prague, 2007), 36th Meeting of the International Society of Oncology and BioMarkers (Tokyo, Japan, 2008), BIT Life Sciences' 2nd Annual World Cancer Congress-2009 (Пекин, 2009), Международной конференции "Diagnostics and therapy for advanced gastrointestinal tumors (Vrnjacka Banja, Serbia, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в т.ч. 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах, состоит из введения, обзора литературы, характеристики клинического материала и методов исследования, собственных результатов исследования, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 8 отечественных и 162 зарубежных источника. Работа иллюстрирована 34 таблицами и 19 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ Характеристика больных. В исследование вошли 99 больных злокачественными опухолями и 9 больных с доброкачественными новообразова-

ниями толстой кишки, оперированных в отделении проктологии РОНЦ РАМН за период 2005-2008г. Возраст больных колоректальным раком составил 38 - 80 лет, медиана - 61 год. По локализации опухоли больные распределились следующим образом: у 37 больных (37,4%) опухоль локализовалась в сигмовидной кишке, у 35 (35,3%) - в прямой кишке, у 11 (11,1%) - в восходящем отделе ободочной кишки, рак нисходящего отдела толстой кишки диагностирован у 7 больных (7,1%), рак поперечного отдела ободочной кишки у 6 больных (6,1%), опухоль печеночного и селезеночного изгибов обнаружены у 1 (1,0%) и у 2 (2,0%) больных соответственно. Наиболее часто встречавшийся тип гистологического строения опухоли - умереннодифференциро-ванная аденокарцинома - обнаружен у (74,7%) больных. У 14% больных была диагностирована аденокарцинома различной дифференцировки, 6 опухолей (6%) имели структуру низкодифференцированной и 5 (5%) - высокодиф-ференцированной аденокарциномы. Наибольшее число обследованных нами больных раком толстой кишки было в IV (28,3%) стадии заболевания и примерно одинаковое количество во IIa (26,3%) и Шб (24,2%) стадиях.

Биохимические исследования. Содержание исследуемых белков определяли в плазме крови, полученной по стандартной методике до операции, лизатах опухолей и неизмененной слизистой толстой кишки. Опухолевый материал брали во время операции и хранили при —70°С до начала исследования. Для проведения иммуноферментного анализа образцы тканей лизиро-вали в соотношении 1:3 в буфере следующего состава: 20 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ЭГТА, 1% Тритон Х-100, 2,5 мМ пи-рофосфат натрия, 1 мМ ß- глицерофосфат, 1 мМ ортованадат натрия, 1 мкг/мл леупептина. Полученные лизаты центрифугировали в течение 30 мин при 20000 об/мин, 4°С (центрифуга Optima™ TLX, Beckman, США).

Маркеры определяли с помощью стандартных наборов для прямого иммуноферментного анализа: «Human/Mouse/Rat ММП-2 (total)», «Human ММП-3 Instant ELISA», «Human ММП-7 (total)», «Human ММП-9 (total)», «Human ММП-13 ELISA», «Human ТИМП-1» и «Human ТИМП-2» (Quanti-kine®, R&D Systems, США) - в соответствии с инструкциями производителей. Содержание ММП-2, 7, 9, и ТИМП-1, было определено в опухолях и плазме крови всех больных, содержание ТИМП-2 - у 26, а ТИМП-4 у 20 пациентов, ММП-3 было определено у 38 больных, ММП-13 у 20. Измерения

проводили на автоматическом универсальном ридере для микропланшет ELX800 (Bio-Tek Instruments Inc., США). Концентрацию исследованных показателей в плазме крови выражали в нг/мл, в тканях — в нанограммах (нг) на 1 мг общего белка, определенного по методу Лоури.

В статистическом анализе использовали непараметрические критерии: Манна-Уитни - при сравнении двух независимых подгрупп, медианный тест или тест Краскелла-Уоллиса - при сравнении нескольких подгрупп (оценка роли признака в целом), тест корреляции рангов Спирмена (R) при анализе взаимосвязей между различными показателями. Различия и корреляции считали достоверными при р<0,05. Выживаемость больных оценивали методом Каплана-Мейера (при сравнении кривых использовали F-тест Кокса), а также с помощью регрессионной многофакторной модели Кокса. Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью программного пакета «Statistica 7.0» (StatSoft Inc).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Содержание ММП и ТИМП в опухолях и гистологически неизмененной слизистой больных РТК.

На первом этапе статистического анализа мы провели сравнительный анализ экспрессии ММП и ТИМП в опухоли и неизмененной слизистой толстой кишки и показали, что уровень экспрессии большинства исследуемых нами металлопротеиназ и их ингибиторов в опухолевой ткани достоверно повышен по сравнению с неизмененной слизистой: ММП-2 у 90% (р<0,00001), ММП-3 у 78% (р<0,001), ММП-7 у 88% (р<0,00001), ММП-9 у 83% (р<0,001), ММП-13 у 90% (р<0,001), ТИМП-1 у 92% (р<0,00001) и ТИМП-2 у 73% (р<0,05) пациентов (табл. 1). В полипах статистически значимое снижение концентрации исследуемых белков по сравнению со злокачественными опухолями наблюдалось только для ММП-2 (р<0,004). Достоверное повышение экспрессии в полипах по сравнению с неизмененной слизистой было отмечено для ММП-7 (р<0,04) и ТИМП-1 (р<0,001).

Мы проанализировали также корреляционные взаимосвязи между уровнями изучаемых маркеров в опухолях. Выявлена достоверная положительная корреляция содержания ТИМП-1 с ММП-9 (R=0,23; р=0,02), ММП-13 (R=0,47; р=0,04), ММП-2 (R=0,31; р=0,002), а также содержания ТИМП-2 с

содержанием ММП-2 (11=0,54; р=0,005) в ткани рака толстой кишки. При этом показатели содержания ММП-2, 9 и 13 не коррелировали между собой.

Таблица 1.

Содержание ММП и ТИМП (нг/мг белка) в опухоли и неизмененной

слизистой толстой кишки.

Маркер Кол-во Опухоль (Т) Неизмененная слизистая ОТ

ММП-7 99 2,3* (0,6-7,8) 0,1 (0,0-0,5)

ММП-9 99 102,2* (65,4-168,5) 48,4 (27,3 - 76,0)

ММП-2 99 31,1* (22,9-54,4) 15,4(11,5-20,8)

ММП-3 38 11,9* (7,7-19,3) 2,7 (0,7 - 8,9)

ММП-13 20 0,32* (0,26-0,37) 0,23 (0,18-0,18)

ТИМП-1 99 46,8* (34,2-59,0) 15,2 (0,24-83,3)

ТИМП-2 26 21,8* (16,6-28,4) 15,8 (5,4-31,2)

ТИМП-4 20 44,9 (33,6-60,9) 0,06 (0,02-0,10)

Представлены медианы и диапазоны значений.

*р<0,0001; **р<0,01; ***р<0,05

В неизмененной слизистой толстой кишки отмечена высокодостоверная

(р<0,0001) прямая корреляционная зависимость только между концентрациями ТИМП-1 и ММП-7 (11=0,46) и ММП-2 (11=0,35). В то же время выявлена достаточно четкая взаимосвязь между уровнями ТИМП-1 и ММП-9 в доброкачественных новообразованиях толстой кишки (11=0,67; р=0,05). Выявлена также достоверная положительная корреляционная взаимосвязь содержания белков в опухоли и окружающей ткани: ММП-2 (11=0,42; р=0,000012), ММП-9 (11=0,33; р=0,0009), ММП-7 (11=0,25; р=0,01) и ТИМП-1 (11=0,22; р=0,003).

Взаимосвязь экспрессии ММП и ТИМП в опухолях с клинико-морфологическими особенностями рака толстой кишки. Среди обследованных больных было 49 женщин и 50 мужчин. Содержание опухолевых маркеров в исследованных тканях мужчин и женщин было практически одинаковым. Разделив обследованных больных, на пять возрастных групп: моложе 40 лет, 41-50 лет, 51-60 лет, от 61 до 70 и старше 71

года - мы обнаружили только достоверное снижение концентрации ММП-9 в возрастной группе 61-70 лет по сравнению с группой больных в возрасте от 51 до 60 лет.

Таблица 2.

Содержание ММП-2, 7, 9, ТИМП-1 и 2 (нг/мг белка) в опухолях больных РТК в зависимости от клинико-морфологнческнх особенностей опухоли.

Показатель п ММП-2 ММП-7 ММП-9 ТИМП-1 ТИМП-2

Стадия ВОЗ

I 6 35,6 27,7-23,9 5,9 0,7-15,3 113 74,4-148 53,2 39,5-63,0 15,7 15,7-15,7

Па 26 34,7 15,2-52,4 1,3 0,2-8,3 137 73,7-182 42,8 33,6-53,5 25,4 17,2-27,9

Пб 12 44,3 19,7-64,5 3,5 0,9-10,1 122 87,8-297 52,5 34,7-69,3 16,2 11,6-20,8

Ша 2 36,8 26,9-46,7 4,9 0,2-9,6 97,8 75,3-120 49,2 44,6-53,8 17,2 17,2-17,2

Шб 24 34,7 23,8-59,9 2,4 0,6-6,6 70,2 45,3-107 51,1 40,4-54,6 24,0 11,2-36,1

Шс 1 57,7 57,7-57,7 2,4 2,4-2,4 287 287-287 70,8 70,8-70,8 -

IV 28 29,5 23,4-47,2 1,9 0,9-7,0 93,7 70,2-117 44,4 30,7-60,7 25,8 17,2-38,1

Глубина инвазии

Т2 3 41,8 28,6-46,7 3,6 0,7-9,6 93,0 74,4-120 48,6 45,7-57,8 17,2 15,7-44,7

ТЗ 57 28,7 20,2-51,1 1,8 0,5-7,8 90,5 55,0-149 43,2' 33,1-53,9 24,3 14,4-29,2

Т4 27 43,1 21,3-69,7 3,4 10,0-6,9 119 71,3-241 54,73 37,4-77,7 17,7 16,6-20,8

Локализация опухоли

Восх. отдел ободочной кишки 11 37,0 19,0-63,1 0,9 0,5-2,6 71,0 60,2-122 44,9* 23,3-59,0 23,4 19,0-35,6

Печеном, изгиб обод, кишки 1 37,9 37,9-37,9 0,7 0,7-0,7 45,1 45,1-45,1 53,9 53,9-53,9 10,9 10,9-10,9

Поперечный отд. обод. КИШКИ 6 29,4 25,3-32,5 2,1 0,4-3,7 102 83,0-187 40,1 37,4-43,2 -

Селезеночный изгиб обод. КИШКИ 2 61,5 48,2-74,8 13,2 1,2-25,2 170 122-217 68,1 57,9-78,4 -

Ннсход. отдел ободочной К11ШКН 7 24,1 14,9-48,3 1,6 10,0-7,8 109 78,1-153 51,8 42,2-56,2 36,1 36,1-36,1

Сигмовидная кишка 37 29,1 20,8-55,7 2,7 0,6-6,3 119 72,2-184 42,8 32,9-63,1 22,7 17,2-27,9

Прямая кишка 35 31,6 23,6-53,4 4,0 0,7-10,7 80,9 55,1-166 47,9 38,4-60,2 17,7 11,7-31,5

Степень диффе ренцировки

Высокая 5 30,0 22,8-70,6 0,4 0,1-2,3 124 55,6-294 57,2 34,6-93,4 17,2 17,2-17,2

Умеренная 74 30,9 22,1-52 ,4 2,7 0,8-7,9 98 ,5 61,3-167 46,8 33,6-57,0 23,0 13,7-30,7

Низкая 6 26,9 25,3-30,5 0,4 0 ,2-0,5 102,0 75,3-109 43 ,2 42,2-53,8 22,8 17,2-28,4

Различная 14 46,7 20,9-57,5 2,4 0,5-9,6 119 90,5-218 54,6 42,2-67,5 22,3 14,1-34,0

Распространение опухолевого процесса

Тм^М0 44 39,4 18,5-53,4 3,0 0,6-9,4 1331'2 74,5-183 45,2 34,2-59,0 19,0 13,6-2 6,6

Т,.4^.2Мо 27 34,7 24,0-58,8 2,2 0,6-6,1 71,02 48,2-114 52,1 40,9-54,6 22,1 14,2-30,8

Ты N0-2 М] 28 29,5 23,4-47,2 1,9 0,9-7,0 93,7' 70,2-117 44,4 30,7-60,7 25,8 17,2-38,1

Представлены показатели медианы и 25-75% квартилей; р<0,01; 2р<0,05

В табл. 2 представлены результаты анализа уровней наиболее значимых из исследованных маркеров с учетом основных клинико-морфологических особенностей РТК. Достоверных различий в зависимости от таких показателей, как стадия заболевания, глубина инвазии (Т), локализация и степень дифференцировки опухоли не обнаружено. При разделении пациентов на группы с различной распространенностью опухолевого процесса: пациенты без метастазов (Т^ИоМо; 41 человек); больные с метастазами только в лимфатические узлы (Т|.4Ы+М0; 23); больные с диссеминированным процессом (Т1.4 N0 . + М+; 23) - выявлено парадоксальное увеличение уровня ММП-9 в опухолях пациентов без метастазов по сравнению с двумя другими группами.

Таким образом, закономерностей, свидетельствующих об увеличении уровня маркеров по мере распространения опухолевого процесса, выявить не удалось. Наоборот, в большинстве случаев наблюдается снижение уровня ММП и их ингибиторов при распространении опухоли, исключением является ТИМП-2 уровень экспрессии, которого увеличивается при диссеминиро-

ванном процессе. В этой связи можно предположить, что продукция ММП в

11

большей степени необходима опухолям на начальных или промежуточных стадиях развития, а при распространенном процессе потребность в протеоли-тической деградации внеклеточного матрикса снижается.

Содержание матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в плазме крови больных раком толстой кишки.

В практическом плане важен вопрос о том, в какой мере изменение продукции матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в опухолевой ткани отражается на их концентрации в периферической крови, так как при наличии корреляции между этими показателями появляется возможность оценки метастатического и инвазивного потенциала опухоли до хирургического вмешательства.

В таблице 3 представлены показатели содержания исследованных ММП и ТИМП в плазме крови здоровых доноров и больных колоректальным раком до и после оперативного вмешательства. Содержание ММП-7 в плазме крови больных РТК до оперативного вмешательства было достоверно выше, чем показатели контрольной группы (р<0,001; медианы 1,1 и 2,7 нг/мл соответственно), а содержание ТИМП-1 - достоверно ниже (медианы соответственно 322 и 244 нг/мл; р<0,0001). Уровни других исследованных ММП, а также ТИМП-2 и 4 не отличались от нормы.

Таблица 3.

Содержание ММП-2,7,9 и ТИМП-1 в плазме крови больных колоректальным раком и группы здоровых доноров.

группы Соде ржание, нг/мл (медиана, квартили)

п ММП-2 п ММП-7 п ММП-9 п ТИМП-1

I гр 8 281 255 - 326 15 1 1,1 0,0 - 2,3 24 277 153 - 366 27 2 322 267 -426

II гр. 99 180 144-228 99 1 2,7 1,7-4,0 99 205 114-298 99 2,3 244 142-347

Шгр. 89 220 177-263 90 1 3,9 2,7-5,4 89 202 127 -283 90 ззо3 225 - 449

1гр,- доноры; Игр.- плазма до операции;, III гр,- плазма после операции, р КО, 001; р2 <0,0001; р3 <0,002

Не сильная, но достоверная положительная корреляция (11=0,38; р=0,001) между внутриопухолевым и плазматическим содержанием выявлена только для ММП-9, которая в отличие от других маркеров не отличается от нормы ни до, ни после операции.

Рис. 1. Изменения содержания ММП-7 и ТИМП-1 в плазме крови (нг/мл) больных РТК после удаления опухоли: 1 - до операции; 2 - через 5-27 дней после операции.

После удаления опухоли происходят разнонаправленные изменения уровней маркеров у отдельных больных (рис.1). В целом по группе, уровень ММП-7 продолжал достоверно увеличиваться по сравнению с нормой, и после удаления первичной опухоли и даже достоверно превышал дооперацион-ный показатель (табл. 3). В то же время концентрации ММП-9 и ММП-2 в плазме крови больных РТК после удаления первичной опухоли не отличались от концентрации этих белков до специфического лечения.

Особый интерес представляло исследование диагностического значения уровня ТИМП-1 в плазме крови, поскольку группой исследователей (Нокеп-АпЛепеп е/ а1, 2005) он был предложен в качестве маркера РТК. Нами выявлены принципиально иные закономерности: исходный уровень ТИМП-1 в плазме крови больных РТК был достоверно снижен (р<0,001) по сравнению с контрольной группой, а после удаления опухоли он достоверно возрастал, приближаясь к нормальному.

ММП-7

ТИМП-1

700

2

2

Таким образом, мы не получили ожидаемого снижения концентрации маркеров в плазме крови после удаления первичной опухоли, а уровень концентрации некоторых из них наоборот увеличивался, что свидетельствует о неопухолевом происхождении, по крайней мере, части ММП, циркулирующих в периферической крови. Это подтверждается и отсутствием корреляции исходно повышенных уровней ММП-7 в плазме с содержанием этого маркера в опухоли. Можно предположить, что высокий плазматический уровень металлопротеиназ и их ингибиторов в послеоперационном периоде вероятнее всего связан с посттравматическим воспалительным процессом.

В целом, анализ содержания матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов в плазме крови показал, что единственным перспективным серологическим маркером РТК является ММП-7. Оптимальное соотношение специфичности (70%) и чувствительности (71%) отмечается при использовании порогового уровня 1,8 нг/мл. Попытки увеличить специфичность за счет увеличения порогового значения до 95% процентиля нормы резко снижали чувствительность теста. Несколько снижает потенциальную значимость ММП-7 как серологического маркера, в особенности непосредственно в послеоперационном периоде, и то, что ее уровень в плазме продолжает возрастать и после удаления опухоли.

При анализе взаимосвязи показателей плазмы крови с клинико-морфологическими особенностями рака толстой кишки отмечено достоверно более низкое содержание ММП-9 и ТИМП-1 у пациентов с метастазами в лимфатических узлах по сравнению с больными без лимфогенных метастазов, а также увеличение уровней ММП-7 и ТИМП-1 при наличии отдаленных метастазов.

Ассоциации с другими клинико-морфологическими факторами, включая глубину инвазии опухоли и стадию РТК, степень дифференцировки опухоли не обнаружено (табл. 4). Наблюдалась только некоторая тенденция к увеличению уровня концентрации ММП-7 в плазме крови больных IV стадией. Достоверное увеличение уровня ММП-7 в плазме крови отмечено в группе больных с отдаленными метастазами по сравнению с больными без отдаленных метастазов, что может послужить критерием оценки степени распространенности опухолевого процесса и фактором прогноза.

Таблица 4.

Содержание ММП-2, 7, 9, ТИМП-1 и2 (нг/мл) в плазме крови больных РТК в зависимости от клннико-морфологических особенностей опухоли.

Показатель п ММП-2 ММП-7 ММП-9 ТИМП-1 ТИМП-2

Стадия ВОЗ

I 6 221 191-236 2,7 1,8-3,2 251 163-371 266 176-346 49,7 49,7-49,7

Па 26 181 139-237 2,0 1,0-3,5 221 148-317 194 108-373 50,6 19,9-80,5

Пб 12 183 140-227 2,4 1,8-3,0 256 114-448 299 223-362 61,9 61,3-62,6

Ша 2 190 146-233 1Д 0,8-1,5 132 16,2-247 179 110-247 49,7 49,7-49,7

Шб 24 182 143-225 2,9 1,8-3,4 128 71,7-176 152 125-233 59,4 41,5-80,1

IV 28 171 133-202 4,6 2,3-7,1 234 131-344 279 164-429 45,4 34,4-67,6

Глубина инвазии

Т2 9 221 155-236 2,3 1,7-3,0 207 131-295 177 110-260 49,7 49,7-88,4

ТЗ 57 176 135-225 3,1 1,6-4,7 208 113-297 194 125-324 55,0 29,9-74,4

Т4 27 176 152-206 2,6 1,9-3,6 194 112-340 278 162-399 51,8 39,1-61,3

Степень дифференцировки

Высокая 5 179 146-215 2,3 1,3-3,0 227 209-384 386 212-443 83,5 83,5-83,5

Умеренная 74 188 144-228 2,7 1,7-4,0 205 103-311 192 138-337 46,0 29,9-65,0

Низкая 6 124 97,2-146 3,0 1,5-7,2 135 34,3-299 247 229-331 58,0 49,7-66,3

Различная 14 176 169-195 2,8 0,9-4,2 262 191-320 252 171-374 56,5 46,7-70,9

Распространение опухолевого процесса

Тм1Ч0М0 44 191 144-236 2,34 1,4-3,3 225' 148-368 2592 171-348 55,9 34,8-71,5

Тм^^Мо 27 188 156-227 2,85 1,7-3,4 128й 64,3-197 \521Л 111-233 54,5 41,9-70,6

28 171 132-201 4,б4'5 2,3-7,1 2343 131-344 2794 164-429 45,4 34,4-67,6

Примечание: - исследование не выполнялось. ММП-9: 'р<0,0013р<0,05; ММП-7 4р<0,01; 'р<0,001; ТИМП-1 р1 <0.0009;р1 <0.001.

Прогностическое значение матриксных металлопротеиназ и их ингибиторов у больных колоректальным раком: результаты 5-летнего

наблюдения.

Для выявления прогностической значимости содержания ММП и ТИМП в опухолях и плазме крови больных колоректальным раком нами был проведен анализ их взаимосвязи с выживаемостью пациентов различных клинических групп. 5-летнюю безрецидивную выживаемость удалось проследить у 54 больных, исключив группу больных с диссеминированным процессом (28 человек) она составила 70%. Рецидив заболевания обнаружен только у 13 из прослеженных пациентов (19,7%), поэтому статистически значимо оценить влияние уровней исследуемых показателей на безрецидивную выживаемость больных различных клинических групп не удалось.

Общую выживаемость 99 обследованных больных удалось проследить в течение 1,0-66 мес. (медиана прослеженности — 25,6 мес). За время наблюдения умерло 24 человека, общая 5-летняя выживаемость во всей обследованной группе составила также 70%. Медиана выживаемости достигнута не была. Прогностическое значение мы оценивали для маркеров, уровни которых, по нашим данным, в наибольшей степени изменены у больных РТК, а именно - ММП-2, 7, 9 и ТИМП-1. В качестве дискриминационных уровней для оценки влияния маркеров на выживаемость пациентов были выбраны показатели верхних квартилей исследованной выборки.

При этом высокие уровни обоих маркеров в плазме крови являются факторами неблагоприятного прогноза: при содержании ММП-7, равном или выше 4,0 нг/мл, 5-летняя выживаемость пациентов составила 32,6% (медиана - 15 мес), а при более низком уровне ММП-7 - 85,8%; для ТИМП-1 соответствующие показатели в подгруппах с высоким и низким уровнем маркера составили 48,5 (медиана - 18,3 мес.) и 77,6% соответственно (медиана не достигнута) (рис. 2).

Следует отметить, что прогноз РТК достоверно зависел и от характера изменения уровня ММП-7 в плазме крови после удаления опухоли: он был более благоприятным у тех пациентов, у которых уровень маркера после операции возрастал (рис. 3).

-ММП-7<4,0 нг/мл -• ММП-7>=4,0 нг/мл

Время жизни, месяцы

Время жизни, месяцы

Рис. 2. Выживаемость больных раком толстой кишки в зависимости от уровня ММП- 7 (а) и ТИМП-1 (б) в плазме крови.

о Умершие + Живы

10 20 30 40 50 60 70 80—Конц. после операции>конц до операции

..... Конц после операции<конц. до операции

Время жизни, месяцы

Рис.3. Выживаемость больных КРР в зависимости от изменения уровня концентрации ММП-7 в плазме крови после удаления первичной опухоли.

Таким образом, при анализе всей группы пациентов без учета их кли-нико-морфологических особенностей наиболее значимым прогностическим маркером оказался предоперационный уровень ММП-7 в плазме крови.

Далее мы проанализировали, каким образом концентрация ММП и ТИМП в плазме крови и опухоли влияет на выживаемость в группах с различной распространенностью опухолевого процесса: 1 - пациенты без метастазов (Т1-4М)М0; 41 человек); 2 - больные с метастазами только в лимфатические узлы (Т1-4И+М0; 23); 3 - больные с диссеминированным процессом (Т1-4 N0 - + М+; 23).

В группе 1 общая 5-летняя выживаемость пациентов составила 91%. При исследовании взаимосвязи с маркерами достоверные различия выявлены только для подгрупп с различным уровнем ММП-7 в плазме крови, причем кумулятивная 5-летняя выживаемость больных с низким содержанием ММП-7 составила 100%, а выживаемость пациентов с высоким уровнем маркера -всего 60% (р=0,0003). Все 3 умерших пациента этой подгруппы имели высокий уровень ММП-7 в плазме крови.

В группе 2 (общая выживаемость - 74%) ни один из маркеров не оказывал значимого влияния на выживаемость.

умерли + живы

£ Л

ш

20 30 40 Месяцы

70--ММ Г1-7<7,8 нг/мг белка

-ММП-7>=7,8 нг/мг белка

Рис. 4. Общая выживаемость больных РТК Т1_41Ч+М+ в зависимости от содержания ММП-7 в опухоли

В то же время выживаемость больных с диссеминированным процессом зависела не только от уровня ММП-7 и в плазме крови, но и от содержа-

ния этой протеазы в опухоли. В подгруппе с низким содержанием ММП-7 в опухоли (менее 7,8 нг/мг белка) медиана выживаемости составила 19,6 мес, а при уровне ММП-7 выше этого значения - 9,2 мес (рис. 4; р=0,03).

Все пациенты с высокой концентрацией ММП-7 в плазме крови умерли или выбыли из наблюдения в течение первых двух лет после циторедуктив-ной операции и их 2-летняя выживаемость составила всего 12% (медиана - 8 мес), а выживаемость пациентов с низкой концентрацией ММП-7 в плазме составила 65% (рис. 5; р=0,007) и приближалась к показателям радикально оперированных больных без отдаленных метастазов.

умерли 1 живы

О 10 20 30 40 50 Месяцы

ММП-7<4,0 нг/мл - ММП-7>=4,0 нг/мл

Рис. 5. Общая выживаемость больных РТК ТмМ+М+ в зависимости от содержания ММП-7 в плазме крови.

умерли живы

- ТИМП-К347 нг/мл

0 10 20 30 40 50 60 70 - ТИ МП-1 >=347 Нг/мл

Месяцы

Рис. 6. Общая выживаемость больных РТК Т,.4]\+М+ в зависимости от содержания ТИМП-1 в плазме крови.

У больных диссеминированным РТК проявилось и прогностическое значение содержания ТИМП-1 в плазме крови: при низком уровне'маркера медиана выживаемости не была достигнута, а при высоком она составила всего 10 мес, 2-летняя выживаемость соответственно — 57% и 11% (р=0,01). В целом 5-летняя выживаемость обследованных больных диссеминированным раком составила 37%, медиана— 17 мес (рис.6).

Таблица 5.

Результаты многофакторного анализа 5-летней выживаемости 99 больных раком толстой кишки с использованием регрессионной модели Кокса.

Параметр Ве1а Стандартная ошибка 1 Р

Стадия -0,008 0,01 -0,69 0,49

Т -0,49 0,47 -1,05 0,29

N 1,02 0,83 1,22 0,22

М 1,39 0,71 1,97 0,05

Степень дифференци-ровки опухоли 0,004 0,04 0,09 0,93

Локализация опухоли 1,10 0,72 1,53 0,13

ММП-7 в опухоли 0,65 0,57 1,14 0,25

ММП-7 в норме -0,07 0,69 -0,11 0,91

ММП-7 в плазме 1,50 0,67 2,24 0,02

ММП-9 в опухоли -0,75 0,68 -1,11 0,27

ММП-9 в норме 0,92 0,76 1,22 0,22

ММП-9 в плазме -0,39 0,82 -0,47 0,64

ТИМП-1 в опухоли -0,18 0,64 -0,28 0,78

ТИМП-1 в норме 0,34 0,69 0,50 0,62

ТИМП-1 в плазме 1,58 0,58 2,73 0,006

При многофакторном анализе, включавшем стадию заболевания, локализацию, гистологическое строение (степень дифференцировки), глубину инвазии опухоли, наличие лимфогенных или отдаленных метастазов, а также все исследованные биохимические показатели, уровни ММП-7 и ТИМП-1 в плазме крови оказались независимыми факторами прогноза общей выживаемости больных РТК наряду с показателем отдаленного метастазирования М (табл. 5).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Иммуноферментное исследование содержания нескольких матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов в опухолевой ткани, гистологически неизмененной слизистой и плазме крови больных коллоректальным раком показало, что содержание большинства ММП и их тканевых ингибиторов 1 и 2 типа высоко достоверно повышено по сравнению с неизмененной слизистой в опухолях 73-92% больных. Достоверной взаимосвязи уровней большинства исследованных маркеров в опухолях с основными клинико-морфологическими особенностями и прогнозом РТК не выявлено. Исключение составляет ММП-7: высокий уровень этой протеиназы в опухолевой ткани имеет неблагоприятное значение для прогноза общей выживаемости больных с диссеминированным процессом. Содержание ММП-7 в плазме крови больных РТК до операции достоверно выше, а содержание ТИМП-1 достоверно ниже, чем показатели контрольной группы. ММП-7 может рассматриваться в качестве возможного серологического маркера РТК с диагностической чувствительностью 71% при уровне специфичности 70%. Анализ результатов 5-летнего наблюдения показал, что высокие уровни ММП-7 и ТИМП-1 в плазме крови являются независимыми факторами неблагоприятного прогноза общей выживаемости больных раком толстой кишки.

Таким образом, анализ взаимосвязи содержания нескольких ключевых ММП и их тканевых ингибиторов в опухолях и плазме крови больных РТК с основными клинико-морфологическими особенностями заболевания и 5-летней выживаемостью пациентов показал, что наиболее перспективным прогностическим, а, возможно, и диагностическим маркером этого заболевания является ММП-7 (матрилизин) - металлопротеиназа, которая помимо разрушения компонентов внеклеточного матрикса, участвует также в процес-синге некоторых биологически важных молекул клеточной поверхности.

21

выводы

1. Содержание ключевых матриксных металлопротеиназ (ММП-2, 3, 7, 9 и 13) и их тканевых ингибиторов 1 и 2 типа достоверно повышено по сравнению с гистологически неизмененной слизистой в опухолях 73%-92% больных раком толстой кишки. Выраженной взаимосвязи уровней исследуемых маркеров в опухолях с основными клинико-морфологическими особенностями заболевания не обнаружено.

2. Концентрация ММП-7 в плазме крови больных раком толстой кишки достоверно повышена, а концентрация ТИМП-1 достоверно снижена по сравнению с показателями контрольной группы; уровни других исследованных маркеров достоверно не отличаются от нормы. Положительная корреляционная связь плазматической и внутриопухолевой концентрации выявлена только для ММП-9.

3. После хирургического удаления опухоли в плазме крови отдельных пациентов происходят разнонаправленные изменения уровней исследованных ММП и ТИМП; при оценке группы в целом отмечена достоверная нормализация (повышение) уровня ТИМП-1 и дальнейшее увеличение содержания ММП-7 в плазме, что свидетельствует о неопухолевом происхождении, по крайней мере, части циркулирующих в крови маркеров.

4. Содержание ММП-9 и ТИМП-1 в плазме крови пациентов с метастазами в лимфатических узлах достоверно ниже, чем у больных без лимфогенных метастазов, а у больных с отдаленными метастазами достоверно повышены уровни ММП-7 и ТИМП-1. Взаимосвязи уровней исследованных маркеров в плазме крови с другими клинико-морфологическими факторами, включая глубину инвазии опухоли и стадию РТК, не обнаружено.

5. Высокие уровни ММП-7 и ТИМП-1 в плазме крови являются факторами неблагоприятного прогноза общей выживаемости больных раком толстой кишки: при содержании ММП-7> 4,0 нг/мл 5-летняя выживаемость составила 32,6%, а при более низком ее уровне - 85,8%; для ТИМП-1 5-летняя выживаемость в подгруппах с высоким и низким уровнем маркера (пороговое значение — 346,8 нг/мл) составила 48,5 и 77,6% соответственно. На выживаемость больных РТК с отдаленными метастазами неблагоприятно влияет также высокий (более 7,8 нг/мг белка) уровень ММП-7 в опухоли.

6. При многофакторном анализе, включавшем стадию заболевания, локализацию, степень дифференцировки и глубину инвазии опухоли, наличие лимфогенных или отдаленных метастазов, продемонстрировано, что высокие уровни ММП-7 и ТИМП-1 в плазме крови являются независимыми факторами неблагоприятного прогноза рака толстой кишки.

Список работ, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Герштейн Е.С., Матриксные металлопротеиназы 7 и 9 и их тканевые ингибиторы 1 и 4 типа в опухолях и плазме крови больных раком толстой кишки/ Е.С.Герштейи, Е.А.Короткова, А.М.Щербаков, В.В.Пророков, Д.А.Головков, Н.Е.Кушлинскин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т.143. - №4. - С. 438-444.

2. Герштейн Е.С., Матриксные металлопротеиназы 2, 3, 13 и их тканевой ингибитор 2-го типа в опухолях и плазме крови больных раком толстой кишки/ Е.С.Герштейи, Е.А.Короткова, В.В.Пророков, Н.Е.Кушлинскнй // Бюллетень экспериментальной биологин и медицины. - 2008. - Т.145. -№3. - С. 337-341.

3. Короткова Е.А., Тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ 1 типа (ТИМП-1) при раке толстой кишки: взаимосвязь с клинико-морфологическими факторами/ Е.А. Короткова, Е.С. Герштейн, В.В. Пророков, Н.Е.Кушлинскнй // Вопросы онкологии. - 2009. -Т. 55. - №2. - С. 171-176.

4. Кушлинский Н.Е., Прогностическое значение ассоциированных с опухолью протеаз при раке толстой кишки/ Н.Е. Кушлинский, Е.С. Герштейн, Е.А. Короткова, В.В. Пророков // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. — Т.154. -№9. - С. 350-355.

5. Короткова Е.А., Клинические перспективы исследования матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов у больных раком толстой кишки/ Е.А. Короткова, Е.С. Герштейн, В.В. Пророков, Н.Е. Кушлинский // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии.- 2012.- №10.- С. 41-46.

Список других работ, опубликованных по теме диссертации

6. Герштейн Е.С., Протеазы, участвующие в процессах метастазирования и инвазии, в опухолях больных раком толстой кишки/ Е.С.Герштейн, Е.А.Короткова, В.В.Пророков, Н.Е.Кушлинский // V Съезд онкологов и радиологов СНГ. Материалы съезда. 14 - 16 мая - 2008. - Ташкент. - С. 46.

7. Герштейн Е.С., Тканевой ингибитор матриксных металлопротеиназ 1 типа (ТИМП-1) при РТК: взаимосвязь с клинико-морфологическими факторами/ Е.С. Герштейн, Е.А. Короткова, В.В. Пророков, Н.Е. Кушлинский // XII Российский онкологический конгресс. Научный совет по комплексной проблеме «Злокачественные новообразования» РАМН и МЗ и CP РФ. ГУ Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН 1820 ноября 2008 Москва. С. 191-192.

8. Gershtein E.S., Quantitative ELISA study of ММПв and ТИМШ expression pattern in the tumors and plasma of colorectal cancer patients/ E.S. Gershtein, E.A.Korotkova, A.M. Scherbakov, V.V. Prorokov, N.E.Kushlinsky // Journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, Tumor Biology - 2007. -N28. - Suppl. 1. -P. 83.

9. Gershtein E.S., Matrix metalloproteinases and tissue inhibitors in the tumors and plasma of colon cancer patients/ E.S. Gershtein, E.A.Korotkova, A.M.Scherbakov, V.V.Prorokov, N.E.Kushlinsky // 18th International Congress on Anti-cancer Chemotherapy. Paris, France, February 6-9. - 2007. - # 252.

10. Gershtein E.S., Matrix metalloproteinases 2, 3, 13 and their type 2 tissue inhibitor in tumors and plasma of patients with colorectal cancer/ E.S.Gershtein, E.A.Korotkova, V.V.Prorokov, N.E.Kushlinsky // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2008. -V.145. - N3. - P. 362-366.

11. Gershtein E.S., Metalloproteinases (MM№) and their tissue inhibitors (ТИМШ) in tumors and plasma of gastric and colorectal cancer patients: relationship and clinico-pathologic implication/ E.S.Gershtein, E.A.Korotkova, Li Sini, A.B.Ryabov, V.V.Prorokov N.E.Kushlinsky // Tumor Biology. - 2008. -V. 29.-Suppl. l.-P. 63.

12. Kushlinsky N.E., Quantitative ELISA study of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in tumors and plasma of gastric and colorectal cancer patients/ N.E.Kushlinsky, E.S.Gershtein, E.A.Korotkova, Li Sini, A.B.Ryabov, V.V.Prorokov, I.S.Stilidi // BIT Life Sciences' 2nd Annual World Cancer Con-gress-2009. June 22-25. - 2009. - Beijing. - China

Подписано в печать 14.11.12 Формат 60x84/16. Бумага офисная «БуеЮСору». Тираж 100 экз. Заказ №1076 Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское ш., 24