Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клиническое значение системы активации плазминогена у больных раком желудка

На правах рукописи

Р Г Б ОД 2 9 ЯНВ 2004

КАЗЬМИН АЛЕКСАНДР ИВАНОВИЧ

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ СИСТЕМЫ АКТИВАЦИИ ПЛАЗМИНОГЕНА У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЖЕЛУДКА

(специальность 14.00.14 - онкология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 2003

Работа выполнена на кафедре онкологии с лучевой терапией и диагностикой Воронежской государственной медицинской академии им. H.H. Бурденко (ректор - доктор медицинских наук, профессор И.Э. Есауленко)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Н.А. Огнерубов л доктор биологических наук Е.С. Герштейн

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор С.О. Подвязников доктор биологических наук Г.И. Потапова

Ведущая организация: Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена МЗ РФ

Защита состоится »( Диссертационного совета { научном центре им. H.H. шоссе, д.24)

Ъ-/ 2004 года в

So

на заседании

i.001.17.01) при ГУ Российском онкологическом Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН

Автореферат разослан

года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук,

профессор Ю.А. Барсуков

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Рак желудка - широко распространенное злокачественное новообразование, занимающее одно из первых мест среди онкологических заболеваний. Длительное время это грозное заболевание оставалось ведущей причиной смертности от онкологической патологии во всем мире. В последнее время частота рака желудка в экономически развитых странах постепенно снижается и в настоящее время он занимает второе место в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди мужчин (12,7%) и третье место - среди женщин (8,9%) в России (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2002). Однако, несмотря на стабильное снижение заболеваемости и смертности, проблема раннего выявления рака желудка и разработка новых подходов к адъювант-ному лечению этого заболевания, мало чувствительного к традиционным видам химио- и лучевой терапии, на сегодняшний день остается актуальной.

В связи с этим не теряет своей значимости разработка новых подходов к общему прогнозу заболевания и выбору наиболее адекватных схем лечения для каждого больного. Большое внимание в этой области уделяется различным молекулярным и клеточным маркерам, характеризующим биологические свойства опухоли. Они могут быть полезны, по крайней мере, в трех ситуациях. Во-первых, для выявления пациентов с очень хорошим прогнозом, для которых осложнения и стоимость адъювантного лечения не будут оправданы имеющимся риском рецидива. Во-вторых, для выявления группы больных с плохим прогнозом, которым требуется более агрессивное адъювантное лечение. И, в-третьих, для определения чувствительности или резистентности к конкретным видам терапии. Кроме того, на основании исследований молеку-лярно-биологических особенностей опухоли может быть создана новая стратегия лечения, непосредственно влияющая на определенные молекулярные и биологические процессы.

Знание специфических биологических характеристик опухоли может помочь в усовершенствовании существующих схем терапии, а также в разработке новых подходов к лечению и общему прогнозу. К таким биологическим характеристикам злокачественной опухоли относится ее способность к инвазии и метастазированию, основным механизмом которой является разрушение окружающей базальной мембраны и внеклеточного матрикса ассоциированными с

опухолью протеазами. Как известно, протеазы также участвуют в процессах метастазирования и неоангиогенеза. Центральное место среди протеолитиче-ских систем, регулирующих метастазирование и инвазию, безусловно, принадлежит каскаду активации плазминогена, в первую очередь, активатору плазми-ногена урокиназного типа (uPA) (Mignatti P., Rifkin D., 1993, 1996; E.C. Гер-штейн, Н.Е.Кушлинский, 2000).

Определение уровня и соотношения экспрессии различных компонентов системы активации плазминогена в опухолевой ткани может служить показателем инвазивной и метастатической активности опухоли, являясь биологически значимым фактором прогноза. В тоже время подавление активации плазминогена на различных уровнях (ингибирование активаторов, торможение их связывания с рецепторами) может стать одним из подходов к разработке новых схем противоопухолевой антиметастатической терапии.

В настоящее время при некоторых локализациях (рак молочной железы, рак яичников, рак толстой кишки) показано клиническое и прогностическое значение активаторов плазминогена (Duffy M.J., 1999, Герштейн Е.С. с соавт., 2000, 2001, 2002, 2003). Однако при раке желудка подобного рода изыскания практически не проводились. Это и послужило основанием для проведения данного исследования.

Цель исследования: изучить клиническое значение различных компонентов системы активации плазминогена - активаторов плазминогена урокиназного (uPA) и тканевого (tPA) типов и их ингибитора (PAI-1) в опухолях больных раком желудка.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

1. Определить концентрацию uPA, PAI-1 и tPA в цитозолях опухолей больных раком желудка и неизмененных тканей желудка.

2. Провести сравнительную оценку состояния системы активации плазминогена в опухолевых и гистологически неизмененных тканях желудка.

3. Сопоставить полученные данные с клиническими особенностями и результатами морфологических исследований у больных раком желудка.

4. Определить прогностическое значение компонентов системы активации плазминогена при раке желудка.

Научная новизна

Впервые в отечественной практике на большом клиническом материале исследовано состояние системы активации плазминогена в опухолях и гистологически неизмененных тканях больных раком желудка. Изучена взаимосвязь этих показателей с основными клинико-морфологическими особенностями опухолей и выживаемостью больных после оперативного лечения.

В результате проведенных исследований выявлена взаимосвязь инва-зивной и метастатической активности рака желудка с состоянием системы активации плазминогена в опухоли и оценена возможность клинического и прогностического использования иммуноферментного определения активаторов плазминогена у больных раком желудка.

Практическая значимость

Полученные результаты иммуноферментного исследования компонентов системы активации плазминогена у больных раком желудка свидетельствуют о том, что повышенная по сравнению с нормальной тканью экспрессия иРА и его ингибитора РА1-1 в опухоли, а также пониженная экспрессия 1РА являются характерными особенностями рака желудка. Показано, что с повышением уровня иРА и РА1-1 в цитозолях опухолей происходит снижение общей продолжительности жизни больных раком желудка. Данный факт является теоретическим обоснованием для определения инвазивной и метастатической активности опухолей данной локализации, а в соответствии с этим, можно оценивать прогноз течения заболевания и планировать проведение адъювантной терапии, что, безусловно, будет способствовать увеличению продолжительности жизни пациентов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных раком желудка отмечается повышение экспрессии иРА и РА1-1 и снижение уровня ?РА в опухолевой ткани по сравнению с неизмененной тканью желудка.

2. По мере увеличения стадии заболевания в опухоли значительно возрастает активация плазминогена по урокиназному типу с параллельным увеличением уровня РА1-1.

3. Увеличение уровня экспрессии иРА и РА1-1 в опухолевой ткани достоверно сопровождается снижением общей продолжительности жизни больных раком желудка.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции сотрудников кафедр онкологии с лучевой терапией и диагностикой, биохимии, общей хирургии Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко и отделения клинической химии Воронежского областного клинического лечебно-диагностического центра 17 октября 2003 года. Материалы работы представлены на VI и VII Российской онкологической конференции (Москва, 2002, 2003), ISFP/IFRS Conference (Мюнхен, 2002), 14 International congress on anti-cancer chemotherapy (Париж, 2003), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы онкогаст-роэнтерологии» (Барнаул, 2003).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 3 в зарубежной печати.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, клинической характеристики материала и методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 10 отечественных и 104 зарубежных источников. Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 15 рисунков.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика больных. В исследование включено 97 больных раком желудка I - IV стадий, лечившихся в Воронежском областном клиническом онкологическом диспансере в период с апреля 2000 года по февраль 2002 года. Из них мужчин было 59, а женщин - 38. Возраст больных находился в пределах от 32 до 82 лет (медиана - 62 года).

Степень распространения опухолевого процесса оценивалась в соответствии с международной классификацией TNM 5 пересмотра (1997 г.). IA стадия (pTINOMO) была диагностирована у 2 (2%) пациентов, 1Б стадия (pT2N0M0) - у 8 (8%) больных, II стадия (PT2N1M0, pT3N0M0) - у 32 (33%) пациентов, IIIА стадия (pT2N2M0, pT3NlM0, pT4N0M0) - у 24 (25%) больных, ШБ стадия (pT3N2M0, pT4N!-2M0) - у 20 (21%) пациентов, IV стадия

(pTl-3N3MO, pTl-4N0-3Ml) - 11 (11%) больных. Отдаленные метастазы в печени обнаружены в 5 случаях, а по брюшине у 4 больных. У 1 пациента выявлены одновременно множественные метастазы в печень и по брюшине.

Всем больным после проведения предоперационной подготовки, включающей инфузионную терапию и коррекцию сопутствующих заболеваний по показаниям, произведены оперативные вмешательства в различном объеме, причем радикальное оперативное лечение проведено 88 пациентам. С паллиативной целью выполнено 6 операций, а у 3 пациентов была проведет экс-плоративная лапаротомия.

При гистологическом исследовании удаленных макропрепаратов высо-кодифференцированная аденокарцинома (G1) наблюдалась в 4 случаях, уме-реннодифференцированная аденокарцинома (G2) - у 37 пациентов, низко-дифференцированная аденокарцинома (G3) обнаружена в 44 наблюдениях, а недифференцированная аденокарцинома (G4) - в 12 случаях.

Получение и обработка тканей. Материал для исследования брали непосредственно после оперативного вмешательства из удаленного макропрепарата. В 5 случаях кусочки опухоли были получены при гастротомии. Для исследования брали участки опухоли, включающие центральную и периферическую ее части, а также участки неизмененной ткани желудка. Кусочки опухоли и неизмененной ткани весом 300-500 мг непосредственно после операции замораживали на сухом льду, а затем доставляли в лабораторию, где их хранили при -70°С, а затем подвергали гомогенизации. Перед гомогенизацией ткань тщательно очищали от участков жира и некроза, взвешивали, а затем измельчали ножницами и растирали в жидком азоте. Полученный порошок переносили в центрифужные пробирки, помещенные в ледяную баню, и добавляли TED-буфер (10 мМ трис-НС1, 1,5 мМ ЭДГА, 0,5 мМ дитиотрейгол; рН 7,4), содержащий 10% глицерина (по объему), из расчета 1 мл буфера на 100 мг ткани. Тщательно перемешивали гомогенат и центрифугировали 30 мин, 105.000xg при 4°С (центрифуга OptimaTM TLC, Beckman, США). Удалив при необходимости липидный слой, надосадочную жидкость (цигозоль) использовали для определения концентрации белка, а аликвоты по 0,5 мл замораживали в полиэтиленовых пробирках и хранили при -70°С до определения концентрации компонентов системы активации плазминогена (как правило, не более 1 месяца).

Лабораторные методы исследования. Концентрации uPA, tPA и PAI-1 определяли в цитозолях опухолевой и гистологически неизмененной ткани с помощью стандартных наборов реактивов для иммуноферментного анализа (ELISA), разработанных в Католическом университете г. Наймеген (Нидерланды).

Статистический анализ данных. Достоверность отличия средних значений оценивали по t-критерию Стыодента, частот распределения - по критерию у2. Корреляционные зависимости оценивали с помощью непараметрических критериев: корреляции рангов Spearman, медианного теста Kruscal-Wallis, критерия подобранных пар Wilcoxon. Выживаемость больных раком желудка высчигывалась по методу Каплана-Мейера. Во всех случаях различия считали достоверными при р<0,05. Расчеты проводили на персональном компьютере с помощью пакета программ "Статистика для Windows" (Version 5.5A, StatSoft Inc., США, 1999).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Содержание uPA, tPA и PAI-1 в опухолевой ткани у больных раком желудка

При исследовании опухолевой ткани у больных раком желудка было выявлено, что у всех 97 (100%) пациентов в опухоли определяется uPA в различной концентрации. Диапазон концентраций данного фермента в цитозолях опухолей колебался от 0,10 до 4,10 нг/мг белка. Содержание uPA в опухолевой ткани в среднем равнялось 0,75±0,08 нг/мг белка (медиана - 0,37 нг/мг белка).

Активатор плазминогена тканевого типа (tPA) при исследовании опухолевой ткани был обнаружен у 72 (74,2%) больных раком желудка. В остальных 25 (25,8%) случаях концентрация данного фермента в опухоли равнялась нулю. Максимальный же уровень tPA в цитозолях опухолей составлял 3,03 нг/мг белка. Средняя его концентрация в опухолевой ткани была 0,45±0,06 нг/мг белка, а медиана - 0,29 нг/мг белка.

Ингибитор активатора плазминогена 1 типа (РАН) при иммунофер-ментном анализе образцов опухолевой ткани был обнаружен у 91 (93,8%) больного раком желудка. При этом содержание его в опухоли колебалось от 0

нг/мг белка у 6 (6,2%) пациентов до 11,46 нг/мг белка, составляя в среднем 1,72±0,25 нг/мг белка (медиана - 0,75 нг/мг белка).

Корреляционный анализ содержания исследуемых компонентов системы активации плазминогена в цитозолях опухолей больных раком желудка показал их тесную взаимосвязь. Так, сильно выраженная корреляция (11=0,74, р<0,01) наблюдалась между содержанием в опухоли иРА и РА1-1. Для 1РА была выявлена менее выраженная взаимосвязь его экспрессии в опухолевой ткани с уровнем в ней иРА (Я=0,36, р<0,01) и РАМ (11=0,33, р<0,01).

Таким образом, у больных раком желудка содержание в опухолевой ткани иРА и РА1-1 тесно сопряжено друг с другом и превышает соответствующий уровень 1РА. Обнаруженное усиление активации плазминогена по урокиназному типу с параллельным увеличением уровня РА1-1 и уменьшением содержания 1РА, соответствует сложившимся в последнее время представлениям об изменении соотношения этих ферментов при злокачественной трансформации клеток, что обуславливает в дальнейшем усиление инвазив-ного и метастатического потенциала опухоли.

Сравнение концентраций иРА, 1РА и РА1-1 в опухолях и гистологически неизмененной ткани желудка

У 21 больного мы сопоставили показатели концентрации компонентов системы активации плазминогена в опухолях и гистологически неизмененной ткани желудка. Практически во всех образцах опухолевой и нормальной ткани желудка обнаружены три компонента системы активации плазминогена, концентрации которых варьировали в широких пределах (табл. 1). Измеримые количества иРА выявлены во всех исследованных образцах опухоли и неизмененной ткани желудка. Как отмечено выше, в опухолевой ткани РА1-1 и гРЛ выявлены у 93,8 и 74,2% больных, соответственно. Частота выявления РА1-1 и 1РА в гистологически неизмененной ткани желудка составила 80,9 и 95,2%, соответственно.

Таблица 1.

Содержание иРА, (РА и РА1-1 в цитозолях опухолей и гистологически неизмененной ткани у больных раком желудка

Исследованная ткань Концентрация (нг/мг белка) М + ш (медиана) разброс

иРА 1РА РАМ

Опухоль 0,72±0,08* (0,37) 0,01-4,10 0,55±0,12 (0,29) 0,00- 10,00 1,59±0,24* (0,67) 0,00-11,46

Неизмененная ткань желудка 0,09±0,01 (0,09) 0,02-0,18 0,61±0,08 (0,53) 0,00-1,39 0,17±0,04 (0,10) 0,00 - 0,77

* - р<0,01 по сравнению с неизмененной тканью желудка (по тесту Стью-дента)

Таким образом, частота выявления РА1-1 в опухолях была выше, чем в неизмененной ткани желудка. И наоборот, 1РА в неизмененной ткани желудка определялся чаще, чем в опухоли. Однако статистически значимых различий в частоте выявления компонентов системы активации плазминогена между опухолевой и гистологически неизмененной тканью желудка обнаружено не было.

При исследовании содержания иРА средняя его концентрация в опухолевой ткани была достоверно выше (р<0,05), чем в неизмененной ткани желудка, равняясь 0,72±0,08 и 0,09±0,01 нг/мг белка, соответственно (табл. 1). У 76,2% больных уровень иРА в ткани опухоли был выше в 1,1 - 9,3 раза (медиана - 2,7), чем в окружающей неизмененной ткани желудка (рис. 1).

Исследование содержания 1РА в опухолевой и неизмененной ткани желудка показало, что разброс концентрации данного показателя в опухоли (010,00 нг/мг белка) больше, чем в окружающей неизмененной ткани (0-1,39 нг/мг белка). Однако частота выявления 1РА в ткани, незатронутой опухолевым процессом (95,2%), была выше, чем в опухоли (74,2%). При этом средняя концентрация гРА в неизмененной ткани желудка достоверно не отличалась от его уровня в опухолевой ткани, составляя 0,61±0,08 и 0,55±0,12 нг/мг белка, соответственно (табл. 1). Тем не менее, выявлено, что у 76,2% пациентов уровень 1РА в гистологически неизмененной ткани желудка был выше в 1,5-

131,4 раза (медиана - 5,0), чем в опухоли (р<0,001 по критерию подобранных пар Вилкоксона, рис. 2).

1,4 1,2 1 0,8 0,6

0.4 0,2

0

Рис. 1. Попарное сравнение концентрации иРА (по оси ординат) в цитозо-лях опухолей и гистологически неизмененных тканях желудка при раке (нг/мг цитозольного белка; сравнение показателей для каждого больного): □ - неизмененная ткань; ■ - опухоль. По оси абсцисс -номер больного раком желудка.

1,в 1,4 1,2

1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

Рис. 2. Попарное сравнение концентрации 1РА (по оси ординат) в цитозо-лях опухолей и гистологически неизмененных тканях желудка при раке (нг/мг цитозольного белка; сравнение показателей для каждого больного): □ - неизмененная ткань; ■ - опухоль. По оси абсцисс -номер больного раком желудка.

1 1 11 1 4

г ДгапгНгНгЬп.тпГШЛп.Г J

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

— —--—

1 ,и.И 111 г:.:.:

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

При исследовании содержания РА1-1 средняя его концентрация в опухолевой ткани была достоверно выше (р<0,05), чем в окружающей неизмененной ткани, составляя 1,59±0,24 и 0,17±0,04 нг/мг белка, соответственно (табл. 1). При попарном сравнении концентраций РА1-1 в опухолевой и гистологически неизмененной ткани желудка выявлено, что у 71,4% больных уровень РАМ в опухоли был выше в 1,1-15,2 раза (медиана - 2,8), чем в окружающей ткани (р<0,001 по критерию Вилкоксона, рис. 3).

1,4 1,2 1

0,8 0,6 0,4 0,2 0

Рис. 3. Попарное сравнение концентрации РА1-1 (по оси ординат) в цито-золях опухолей и гистологически неизмененных тканях желудка при раке (нг/мг цитозольного белка; сравнение показателей для каждого больного): □ - неизмененная ткань; ■ - опухоль. По оси абсцисс - номер больного раком желудка.

Согласно полученным данным, средние концентрации иРА и РАН в опухолевой ткани были достоверно выше, чем в неизмененной ткани. Достоверное увеличение экспрессии этих белков по сравнению с окружающей гистологически неизмененной тканью отмечено также в опухолях большинства больных раком желудка. В то же время, средняя концентрация 1РА в опухолевой и гистологически неизмененной ткани желудка достоверно не отличалась, хотя у большинства больных она была снижена в опухоли по сравнению с окружающей тканью.

" I 111 г лЛМШ

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Наблюдалась также достоверная прямая корреляция между уровнями PAI-1 в опухолевой и неизмененной ткани (R=0,51; р<0,05), при этом концентрации иРА и tPA в опухоли не коррелировали с уровнями соответствующих белков в нормальной ткани желудка. Прослеживалась достоверная положительная взаимосвязь между концентрациями PAI-1 и tPA в гистологически неизмененной ткани желудка (R=0,46; р<0,05), а также, как отмечено выше, между концентрациями PAI-1 и иРА в опухолевой ткани (R=0,74; р<0,01).

Таким образом, можно отметить, что для рака желудка характерно независимое от нормальной ткани усиление экспрессии иРА, взаимосвязанное в увеличением концентрации PAI-1. С другой стороны, повышенный уровень PAI-1 в опухоли взаимосвязан с содержанием этого белка в нормальной ткани желудка, что указывает на устойчивые регулирующие свойства этого ингибитора. Подавление в опухоли экспрессии tPA происходит независимо от окружающей неизмененной ткани желудка и слабо коррелирует с изменениями экспрессии других компонентов системы активации плазминогена. По-видимому, для больных раком желудка характерна значительная несбалансированность протеолитических процессов в опухолевой ткани, что и определяет инвазивную активность опухоли, связанную с исследуемыми компонентами системы активации плазминогена.

Зависимость концентраций uPA, tPA и PAI-1 в опухолях больных раком желудка от стадии заболевания

При раке желудка, как и при большинстве злокачественных новообразований, стадия опухолевого процесса является клинически значимым прогностическим фактором. В связи с этим нами проведен анализ содержания компонентов системы активации плазминогена в цитозолях опухолей больных раком желудка в зависимости от этого показателя (табл. 2).

Не обнаружено достоверных отличий уровней компонентов системы активации плазминогена между группами больных I и II, II и III, III и IV стадий заболевания, однако установлено достоверное увеличение в 2,3 раза (р=0,02) уровня PAI-1 в опухолях больных с IV стадией относительно II стадии. Наиболее значимым является отличие концентраций иРА и PAI-1 в опухолевой ткани больных I и IV стадий: внутриопухолевая концентрация иРА на поздней стадии заболевания достоверно выше в 3,2 раза (р=0,02), чем при I стадии, а уровень PAI-1 - выше в 9,4 раза (р=0,01).

Таблица 2.

Концентрации tPA, иРА и РА1-1 в цитозолях опухолей больных раком желудка в зависимости от стадии заболевания

Стадия Концентрация (нг/мг белка) М ± ш (медиана) разброс

иРА 1РА РАН

I (п = 10) 0,27±0,15 (0,11) 0,03-1,41 1,5611,10(0,32) 0,00-10,00 0,3410,14 (0,12) 0,00-1,24

II (п = 32) 0,82+0,17 (0,35)* 0,01-4,10 0,5810,13 (0,38) 0,00-2,40 1,3910,36(0,79)* 0,00-8,31

III (п = 44) 0,7810,13(0,47)* 0,05-3,35 0,33+0,08 (0,14)** 0,00-2,25 1,7710,43 (0,62)* 0,00-11,46

IV (п=11) 0,8610,18(0,81)* 0,17-2,15 0,5810,15 (0,48) 0,04-1,73 3,2110,89(1,62)* 0,50-9,76

* - р<0,01 по сравнению с неизмененной тканью желудка

** -р<0,05 по сравнению с неизмененной тканью желудка

В тоже время, экспрессия гРА в ткани рака желудка имеет тенденцию к снижению с увеличением стадии заболевания. Различия по сравнению с нормальной тканью достоверны только у больных III стадии (р=0,02). Следует отметить также высокий уровень 1РА в опухолях больных IV стадии, что может быть связано с активизацией некротических процессов на поздних стадиях заболевания.

У больных II, III, IV стадий содержание иРА в опухоли было достоверно выше, чем в неизмененной ткани желудка (р<0,01). Для группы больных I стадии концентрация иРА в опухоли также была выше, чем в гистологически неизмененной ткани, однако эти различия статистически недостоверны. Содержание РА1-1 в опухолевой ткани по сравнению с окружающей нормальной тканью желудка также было достоверно выше у больных с II, III и IV стадиями заболевания (р<0,01).

Таким образом, прослеживается взаимосвязь содержания компонентов системы активации плазминогена в ткани рака желудка со стадией заболевания. На поздних стадиях в опухоли значительно возрастает активация плазминогена по урокиназному типу с параллельным увеличением уровня РАН.

Полученные данные подтверждают роль изучаемых белков в инвазии и мета-стазировании злокачественных опухолей.

Зависимость концентрации иРА, 1РА и РА1-1 в опухолях от возраста больных раком желудка Нами изучено содержание компонентов системы активации плазмино-гена в опухолевой ткани больных раком желудка в зависимости от возраста пациентов (табл. 3).

При анализе полученных данных установлено, что у больных раком желудка с возрастом усиливается экспрессия иРА. Так у пациентов в возрасте от 71 года и старше обнаружены максимальные показатели концентрации иРА в опухоли. Уровень экспрессии иРА у больных других возрастных групп был значительно ниже. При этом нами выявлена положительная корреляционная связь содержания иРА в опухоли с возрастом пациентов (Я = 0,21, р<0,05, табл. 3).

Таблица 3.

Концентрации 1РА, иРА и РА1-1 в цитозолях опухолей больных раком желудка в зависимости от возраста

Возраст Концентрация (нг/мг белка) М ± ш (медиана) разброс

иРА 1РА РАН

До 40 лет (п = 3) 0,55±0,22 (0,74) 0,12-0,80 0,69±0,44 (0,39) 0,12-1,56 3,15+2,08 (2,05) 0,24-7,17

41-50 лет (п = 18) 0,60±0,15 (0,29) 0,02-1,91 0,4310,16(0,06) 0,00-2,36 1,89+0,79 (0,56) 0,00-11,46

51-60 лет (п = 21) 0,74+0,18 (0,31) 0,07-3,34 0,48±0,16 (0,28) 0,00-3,03 1,88±0,50 (0,89) 0,09-8,31

61-70 лет (п = 37) 0,65+0,11 (0,37) 0,01-2,42 0,43±0,08 (0,34) 0,00-1,73 1,28+0,39 (0,55) 0,00-11,08

71 год и старше (п=18) 1,12+0,25 (0,85) 0,05—4,10 0,44+0,17 (0,16) 0,00-2,40 1,48+0,37 (1,27) 0,04-6,61

При исследовании содержания 1РА в опухолевой ткани у больных разных возрастных групп обнаружено уменьшение его экспрессии с возрастом, о чем свидетельствует обнаруженная нами отрицательная корреляционная за-

висимость уровня данного активатора в опухоли от возраста пациента (Я=-0,32, р<0,001, табл. 3).

Изучение содержания РА1-1 в опухоли также показало уменьшение уровня экспрессии данного ингибитора в старших возрастных группах больных раком желудка (табл. 3). Однако статистически достоверной корреляции уровня РА1-1 с возрастом не обнаружено.

Таким образом, в старших возрастных группах больных раком желудка проявляется тенденция к усилению в опухоли активации плазминогена по урокиназному типу и параллельному уменьшению концентрации в опухоли 1РА. Полученные данные могут указывать на усиление инвазивной способности опухоли у больных старших возрастных групп.

Зависимость концентрации иРА, 1РА и РА1-1 в опухолях от гистологического строения рака желудка При сравнении содержания иРА в опухолях различной степени диффе-ренцировки вьмвлена тенденция к снижению уровня экспрессии данного активатора при увеличении степени злокачественности рака желудка. Так, у больных с высокодифференцированным раком желудка медиана концентрации иРА равнялась 0,74 нг/мг белка, а у пациентов с недифференцированным раком она была в 2,1 раза меньше - 0,35 нг/мг белка. Однако содержание иРА значительно и достоверно (р=0,01) различалось только между двумя наиболее репрезентативными группами больных с умеренно- и низкодифференциро-ванными опухолями (в2 и 03). Уровень иРА в первой группе был выше в 1,8 раза и составил в среднем 0,98±0,17 нг/мг белка (медиана - 0,70 нг/мг белка) против 0,54±0,10 нг/мг белка (медиана - 0,31 нг/мг белка) у пациентов второй группы (табл. 4). В настоящее время трудно объяснить эту парадоксальную зависимость, в соответствии с которой низкодифференцированные и недифференцированные опухоли должны быть менее инвазивными, чем умеренно- и высокодифференцированные.

Анализ содержания 1РА в цитозолях в зависимости от степени диффе-ренцировки рака желудка выявил столь же парадоксальную тенденцию: концентрация этого белка возрастала в менее дифференцированных опухолях. Так, у больных с высокодифференцированным раком желудка средняя концентрация активатора плазминогена тканевого типа составляла 0,24±0,18 нг/мг белка (медиана - 0,10 нг/мг белка). В тоже время у пациентов с недиф-

ференцированным раком желудка уровень этого активатора равнялся 0,50+0,18 нг/мг белка (медиана - 0,37 нг/мг белка) (табл. 4), однако обнаруженные различия не были статистически достоверными.

Таблица 4.

Концентрации 1РА, иРА и РАН в цитозолях опухолей больных раком желудка в зависимости от гистопатологической градации опухоли

Степень Концентрация (нг/мг белка)

дифференцировки М ± ш (медиана) разброс

(С) иРА 1РА РАН

а 0,71+0,18(0,74) 0,24+0,18 (0,10) 0,61+0,17(0,57)

(п=4) 0,24-1,13 0,00-0,77 0,26-1,07

в2 0,9810,17(0,70)* 0,53+0,15 (0,13) 1,9610,44(1,27)

(п=37) 0,08^,10 0,00-3,03 0,00-11,08

вз 0,54±0,10(0,31) 0,43±0,08 (0,33) 1,7810,47 (0,48)

(п=44) 0,03-3,34 0,00-2,36 0,00-11,46

в4 0,81+0,24 (0,35) 0,50±0,18 (0,37) 0,8710,24 (0,85)

(п=12) 0,04-1,72 0,00-1,58 0,00-2,13

* - р=0,01 по сравнению с СЗ

При исследовании уровня экспрессии РА1-1 обнаружено, что по мере снижения степени дифференцировки опухоли концентрация РА1-1 имеет тенденцию к снижению, но наблюдаемые различия не достигают уровня статистической значимости (табл. 4).

Таким образом, анализ взаимосвязи экспрессии компонентов системы активации плазминогена со степенью дифференцировки, свидетельствует о том, что инвазивный потенциал рака желудка, определяемый по состоянию этой протеолитической системы, напрямую не связан с дифференцировкой опухоли. Можно лишь предположить, что реализация эффекта системы активации плазминогена при этом осуществляется опосредованно.

Выживаемость больных раком желудка в зависимости от стадии заболевания

Пациенты, включенные в исследование, были прослежены на протяжении двух лет от момента оперативного лечения. Медиана общей двухлетней выживаемости составила 15 месяцев.

- -----++•-----

_ 64 !

I 4

Ц !

I о-г 6-

О О—Н--—tf +—J

L-

i-.................

- I стадия

----II стадия

— Ill стадия

— IV стадия

8 12 16 о Complete + Censored

20 24

Месяцы

о++----

Рис. 4. Общая выживаемость больных раком желудка в зависимости от стадии.

При анализе продолжительности жизни пациентов в зависимости от стадии заболевания оказалось, что лучшие показатели выживаемости наблюдались у больных с I и II стадией заболевания. Медиана общей продолжительности жизни при этом составила '22,5 и 17,2 месяцев соответственно. При III стадии рака желудка медиана общей выживаемости равнялась 10,8 месяцев, а при IV стадии заболевания - 7,9 месяцев (рис. 4).

Общая выживаемость больных раком желудка в зависимости от содержания иРА, 1РА и РА1-1 в опухолевой ткани

В ходе анализа выживаемости в зависимости от содержания иРА пациенты были разделены на две группы. За основу деления взята медиана концентрации данного фермента в опухоли, которая составила 0,37 нг/мг белка. При этом в первую группу было включено 52 больных с уровнем иРА более 0,37 нг/мг белка, а в другую - 45 пациентов с меньшим или равным медиане содержанием этого фермента в опухолевой ткани. Сравнительное исследование этих групп показало, что у пациентов первой группы общая продолжительность жизни была заметно хуже, чем во второй (р=0.03). Медиана выживаемости больных первой группы составила 12,8 месяца. К концу первого года наблюдения данной

группы в живых осталось 52,5% пациентов, а общая двухлетняя выживаемость составила 19,8%. Во второй группе пациентов медиана выживаемости составила 16,6 месяца. К концу первого года наблюдения после оперативного лечения общая выживаемость равнялась 61,2%, а общая двухлетняя выживаемость составляла 22,1% (рис. 5).

Месяцы

— иРА > 0,37 нг/мг белка ......иРА < 0,37 нг/мг белка

Рис. 5. Общая выживаемость больных раком желудка в зависимости от концентрации иРА в опухолевой ткани (основа деления - показатель медианы).

При изучении общей продолжительности жизни больных раком желудка в зависимости от содержания иРА в опухолевой ткани проведено также разделение пациентов на группы на основании показателя верхнего квартиля, значение которого для иРА равнялось 1,03 нг/мг белка. При этом в первую группу пациентов с уровнем иРА>1,03 нг/мг белка было включено 26 человек. Соответственно, вторая группа состояла из 71 больного, у которых концентрация иРА<1,03 нг/мг белка. Анализ полученных данных показал, что общая продолжительность жизни была выше у пациентов второй группы: медиана общей выживаемости составляла для первой и второй групп больных

9,7 и 15 месяцев, соответственно. Однако данное различие статистически не достоверно (рис. 6).

Месяцы

— иРА>1,03 нг/мг белка ...... иРА<1,03 нг/мг белка

Рис. 6. Общая выживаемость больных раком желудка в зависимости от концентрации иРА в опухолевой ткани (основа деления - показатель верхнего квартиля).

Нами также проведено изучение выживаемости в зависимости от содержания в опухолевой ткани РАН. Сначала все пациенты были также разделены на 2 группы на основании медианы концентрации данного ингибитора в опухоли, которая равнялась 0,67 нг/мг белка. В первую группу было включено 52 больных с уровнем РА1-1>0,67 нг/мг белка, а во вторую - 45 пациентов с концентрацией РА1-1<0,67 нг/мг белка. При этом у больных первой группы общая продолжительность жизни была достоверно меньше, чем во второй группе (рис. 7; р=0,01): медианы общей выживаемости составили 12,7 и 15 месяцев, соответственно.

100% 90% 80%

л 70%

ь

| 60%

(и

2 50%

г

2 40%

ш

30% 20% 10% 0%

0 4 8 12 16 20 24

Месяцы

— РАМ >0,67 нг/мг белка

— РАМ <0,67 нг/мг белка

Рис. 7. Общая выживаемость больных раком желудка в зависимости от концентрации РА1-1 в опухолевой ткани (основа деления - показатель медианы).

На следующем этапе анализа больные были разделены на группы на основании показателя верхнего квартиля концентрации РА1-1 в опухолях, который составил 1,61 нг/мг белка. При этом первая груши больных с уровнем РА1-1>1,61 нг/мг белка включала 27 пацгагнтов, а вторая группа состояла из 70 больных с содержанием РА1-1<1,61 нг/мг белка. Анализ полученных данных показал, что общая продолжительность жизни у пациентов первой группы по сравнению со второй значительно ниже (рис. 8; р=0,004): медиана общей выживаемости в первой группе равнялась 9,7 месяца, а во второй группе -16,6 месяцев.

-А

т

— РА1-1 >1,61 нг/мг белка -РАМ <1,61 нг/мг белка

Рис. 8. Общая выживаемость больных раком желудка в зависимости от концентрации РА1-1 в опухолевой ткани (основа деления - показатель верхнего квартиля).

Неоднозначные результаты были получены нами при исследовании общей продолжительности жизни больных раком желудка в зависимости от содержания в опухолевой ткани 1РА. При разделении на основании показателя верхнего квартиля (0,55 нг/мг белка), в первую группу было включено 23 больных с уровнем 1РА>0,55 нг/мг белка, а во вторую группу - 74 пациента с более низким уровнем этого белка. Согласно полученным данным общая продолжительность жизни в первой группе больных раком желудка была ниже, чем во второй. Медиана выживаемости при этом равнялась, соответственно, 12,7 и 15 месяцам. В тоже время, двухлетняя выживаемость была выше у пациентов с уровнем 1РА>0,55 нг/мг белка и составила 22,8% против 17,7% у больных второй группы. Полученные различия при этом не были статистически значимы. Не обнаружено статистически достоверных различий общей выживаемости больных и при разделении их на группы в зависимости от показателя медианы концентрации 1РА.

Нами также проведено изучение продолжительности жизни в зависимости от соотношения концентраций иРАЛРА в опухоли у больных раком желудка. При

этом оказалось, что в группе пациентов с соотношением иРАЛРА>1 общая выживаемость была ниже (медиана выживаемости - 11,5 месяца), чем при соотношении иРАЛРА<1 (медиана выживаемости - 17 месяцев), но эти различия статистически недостоверны.

Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что содержание иРА и РА1-1 в опухолевой ткани при раке желудка является важным прогностическим фактором: высокие уровни концентрации иРА и РА1-1 в опухолевой ткани больных раком желудка можно расценивать как прогностически неблагоприятные. При этом наиболее значимым критерием для иРА является показатель медианы, а для РА1-1 - показатель верхнего квартиля.

Подводя общий итог проведенных исследований, необходимо отметить, что выявленные закономерности могут иметь как теоретическое, так и практическое значение. С одной стороны, они подтверждают тот факт, что усиление активации плазминогена по урокиназному типу сопровождается усилением защиты опухолевых клеток от саморазрушения (за счет увеличения уровня РА1-1) и является достаточно универсальным признаком малигни-зации. С другой стороны, повышенная экспрессия иРА в ткани рака желудка по сравнению с окружающей неизмененной тканью делает этот фермент перспективной избирательной мишенью для направленной (с использованием специфических ингибиторов) антиметастатической противоопухолевой терапии рака желудка - заболевания с достаточно низкой чувствительностью к химиотерапии.

ВЫВОДЫ

1. Концентрация иРА в цитозолях опухолей первичных больных раком желудка (0,01—4,10 нг/мг белка) обнаружена в 100% случаев, РА1-1 (0,0111,46 нг/мг белка) - в 93% опухолей, а 1РА (0,01-3,03 нг/мг белка) - в 76%.

2. При сравнительном исследовании опухолей и гистологически неизмененных тканей желудка показано, что концентрация иРА в опухолях у 76% больных в 1,1-9,3 раза выше, чем в неизмененной ткани; концентрация РА1-1 в опухолях 71% больных превышает его концентрацию в неизменной ткани в 1,115,2 раза, а концентрация 1РА, напротив, в опухолях 76 % больных была в 1,5-131,4 раза ниже, чем в гистологически неизмененных тканях желудка.

3. Обнаружена достоверная прямая корреляция между уровнями РАН в опухоли и неизмененной ткани желудка (Я=0,51; р<0,05), тогда как концентрации иРА и 1РА в опухоли не коррелировали с соответствующими показателями в неизмененной ткани желудка. Выявлена также достоверная положительная взаимосвязь концентраций РА1-1 и 1РА в гистологически неизмененной ткани желудка (11=0,46; р<0,05), а также концентраций РА1-1 и иРА в опухоли (11=0,74; р<0,05).

4. На поздних стадиях в опухоли значительно возрастает концентрация иРА с параллельным увеличением уровня РА1-1 и наблюдается тенденция к уменьшению содержания 1РА в опухоли.

5. Уровень иРА в опухоли положительно коррелирует с возрастом пациентов (11=0,21, р<0,05), а концентрация 1РА находится в обратной зависимости от возраста больных раком желудка (Л= - 0,32, р<0,001).

6. Концентрация иРА достоверно отличается у больных с умеренно (02)- и низкодифференцированными (03) опухолями. Причем уровень иРА в первой группе был выше в 1,8 раза (р=0,01).

7. Высокая концентрация РА1-1 в опухолевой ткани больных раком желудка является неблагоприятным прогностическим фактором и коррелирует с низкой выживаемостью данных пациентов, при этом наиболее значимым пороговым уровнем является показатель верхнего квартиля - 1,61 нг/мг белка.

8. Концентрация иРА в ткани рака желудка, превышающая медианный показатель - 0,37 нг/мг белка, достоверно ухудшает выживаемость больных раком желудка (р=0,03).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Сосудистый эндотелиалъный фактор роста и система активации плаз-миногена при раке желудка // VI Ежегодная Российская онкологическая конференция, 26-28 ноября, 2002. - Москва, 2002. - С. 155 (в соавторстве с Герштейн Е.С., Огнерубовым H.A., Кушлинским Н.Е.).

2. Компоненты системы активации плазминогена при раке желудка // VI Ежегодная Российская онкологическая конференция, 26-28 ноября 2002. - Москва, 2002. - С. 169 (в соавторстве со Щербаковым A.M., Герштейн Е.С., Огнерубовым H.A., Кушлинским U.E.).

3. Сосудистый эндотелиальный фактор роста, активаторы плазминогена урокиназного и тканевого типов и их ингибитор РАМ у больных раком желудка // Тюменский медицинский журнал. - 2002. - № 3-4. - С. 45-47 (в соавторстве с Огнерубовым H.A., Герштейн Е.С., Кушлинским Н.Е.).

4. Компоненты системы активации плазминогена при раке желудка // Тюменский медицинский журнал. - 2002. - № 3-4. - С. 33-36 (в соавторстве с Огнерубовым H.A., Герштейн Е.С., Кушлинским Н.Е.).

5. Активаторы плазминогена урокиназного и тканевого типов и их ингибитора PAI-1 при раке желудка // Вопросы онкологии . - 2003. Т. 49, №2. - С. 165-169 (в соавторстве с Герштейн Е.С., Щербаковым A.M., Огнерубовым H.A., Кушлинским Н.Е.).

6. Plasminogen activation system components in various tumors: clinico-pathologic evaluation. // ISFP/IFRS Conference. - Munich, 2002. - T. 11-32 (в соавторстве с Герштейн Е.С., Щербаковым A.M., Клокотовой Е.А., Гончаровым Д.Ю., Голубченко О.В., Кушлинским Н.Е.).

7. Система активации плазминогена при раке желудка // Успехи современного естествознания. - 2003. - № 8. - С. 25-28 (в соавторстве с Огнерубовым H.A., Герштейн Е.С., Кушлинским Н.Е.).

8. Система активации плазминогена и сосудистый эндотелиальный фактор роста у больных раком желудка // Системный анализ и управление в биомедицинских системах. - 2003. - Т.2, № 1. - С. 45-49 (в соавторстве с Огнерубовым H.A., Герштейн Е.С., Кушлинским Н.Е.).

9. Vascular endothelial growth factor, plasminogen activator system, and gastric cancer // 14 International congress on anti-cancer chemotherapy. - Paris-

France, 2003. - P. 232 (в соавторстве с Огнерубовым Н.А., Герштейн Е.С., Кушлинским Н.Е.).

10.Urokinase-type and tissue-type plasminogen activators, and plasminogen activator inhibitor type-1 in gastric cancer //14 International congress on anticancer chemotherapy. - Paris-France, 2003. - P. 231 (в соавторстве с Огнерубовым Н.А., Герштейн Е.С., Кушлинским Н.Е.).

11.Активаторы плазминогена урокиназного и тканевого типов и их ингибитор PAI-1 при раке желудка // Актуальные вопросы онкогастроэнте-рологии: материалы межрегиональной научно-практической конференции, 6-7 июня 2003. - Барнаул, 2003. - Т.1. - С. 78-80 (в соавторстве с Герштейн Е.С., Щербаковым A.M., Огнерубовым Н.А., Кушлинским Н.Е.).

12.Состояние системы активации плазминогена у больных раком желудка при различных стадиях // VII Российский онкологический конгресс, 2527 ноября, 2003. - Москва, 2003. - С. 218 (в соавторстве с Огнерубовым Н.А., Герштейн Е.С., Кушлинским Н.Е.).

Актуальность проблемы

Рак желудка - широко распространенное злокачественное новообразование, занимающее одно из первых мест среди онкологических заболеваний. Длительное время это грозное заболевание оставалось ведущей причиной смертности от онкологической патологии во всем мире. В последнее время частота рака желудка в экономически развитых странах постепенно снижается и в настоящее время он занимает второе место в структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями среди мужчин (12,7%) и третье место - среди женщин (8,9%) в России (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2002). Однако, несмотря на стабильное снижение заболеваемости и смертности, проблема раннего выявления рака желудка и разработка новых подходов к адъювантному лекарственному лечению этого заболевания, мало чувствительного к традиционным видам химиотерапии, на сегодняшний день остается актуальной.

В связи с этим не теряет своей значимости разработка новых подходов к общему прогнозу заболевания и выбору наиболее адекватных схем лечения для каждого больного. Большое внимание в этой области уделяется различным молекулярным и клеточным маркерам, характеризующим биологические свойства опухоли. Они могут быть полезны, по крайней мере, в трех ситуациях. Во-первых, для выявления пациентов с очень хорошим прогнозом, для которых осложнения и стоимость адъювантного лечения не будут оправданы имеющимся риском рецидива. Во-вторых, для выявления группы больных с плохим прогнозом, которым требуется более агрессивное адъювантное лечение. И, в-третьих, для определения чувствительности или резистентности к конкретным видам терапии. Кроме того, на основании исследований молекулярно-биологических особенностей опухоли может быть создана новая стратегия лечения, непосредственно влияющая на определенные молекулярные и биологические процессы.

Знание специфических биологических характеристик опухоли может помочь в усовершенствовании существующих схем терапии, а также в разработке новых подходов к лечению и общему прогнозу. К таким биологическим характеристикам злокачественной опухоли относится ее способность к инвазии, основным механизмом которой является разрушение окружающей базальной мембраны и внеклеточного матрикса ассоциированными с опухолью протеазами. Как известно, протеазы также участвуют в процессах метастазирования и неоангиогенеза. Центральное место среди протеолитических систем, регулирующих метастазирование и инвазию, безусловно, принадлежит каскаду активации плазминогена, в первую очередь, активатору плазминогена урокиназного типа - иРА (Mignatti P., Rifkin D., 1993, 1996; E.C. Герштейн, Н.Е.Кушлинский, 1999). Определение уровня и соотношения экспрессии различных компонентов системы активации плазминогена в опухолевой ткани может служить показателем инвазивной и метастатической активности опухоли, являясь биологически значимым фактором прогноза. В тоже время подавление активации плазминогена на различных уровнях (ингибирование активаторов, торможение их связывания с рецепторами) может стать одним из подходов к разработке новых схем противоопухолевой антиметастатической терапии.

В настоящее время при некоторых локализациях (рак молочной железы, рак яичников, рак толстой кишки и др.) показано клиническое и прогностическое значение активаторов плазминогена (Duffy M.J., 1999, Герштейн Е.С. с соавт., 2000, 2001, 2002, 2003). Однако при раке желудка подобного рода изыскания практически не проводились. Это и послужило основанием для проведения данного исследования.

Цель исследования

Изучить клиническое значение различных компонентов системы активации плазминогена - активаторов плазминогена урокиназного (иРА) и тканевого (tPA) типов и их ингибитора (PAI-1) в опухолях больных раком желудка.

Задачи исследования

1. Определить концентрацию uPA, PAI-1 и tPA в цитозолях опухолей больных раком желудка и неизмененных тканей желудка.

2. Провести сравнительную оценку состояния системы активации плазминогена в опухолевых и гистологически неизмененных тканях желудка.

3. Сопоставить полученные данные с клиническими особенностями и результатами морфологических исследований у больных раком желудка.

4. Определить прогностическое значение компонентов системы активации плазминогена при раке желудка.

Научная новизна

Впервые в отечественной практике на большом клиническом материале исследовано состояние системы активации плазминогена в опухолях и гистологически неизмененных тканях больных раком желудка. Изучена взаимосвязь этих показателей с основными клинико-морфологическими особенностями опухолей и выживаемостью больных после оперативного лечения.

В результате проведенных исследований выявлена взаимосвязь инвазивной и метастатической активности рака желудка с состоянием системы активации плазминогена в опухоли и оценена возможность клинического и прогностического использования иммуноферментного определения активаторов плазминогена у больных раком желудка.

Практическая значимость

Полученные результаты иммуноферментного исследования компонентов системы активации плазминогена у больных раком желудка свидетельствуют о том, что повышенная по сравнению с нормальной тканью экспрессия иРА и его ингибитора PAI-1 в опухоли, а также пониженная экспрессия tPA являются характерными особенностями рака желудка. Показано, что с повышением уровня иРА и PAI-1 в цитозолях опухолей происходит снижение общей продолжительности жизни больных раком желудка. Данный факт является теоретическим обоснованием для определения инвазивной и метастатической активности опухолей данной локализации, а в соответствии с этим, можно оценивать прогноз течения заболевания и планировать проведение адъювантной терапии, что, безусловно, будет способствовать увеличению продолжительности жизни пациентов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У больных раком желудка отмечается повышение экспрессии uPA и PAI-1 и снижение уровня tPA в опухолевой ткани по сравнению с неизмененной тканью желудка.

2. По мере увеличения стадии заболевания в опухоли значительно возрастает активация плазминогена по урокиназному типу с параллельным увеличением уровня PAI-1.

3. Увеличение уровня экспрессии uPA и PAI-1 в опухолевой ткани достоверно сопровождается снижением общей продолжительности жизни больных раком желудка.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась на совместной научной конференции сотрудников кафедр онкологии с лучевой терапией и диагностикой, биохимии, общей хирургии Воронежской государственной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко и отделения клинической химии Воронежского областного клинического лечебно-диагностического центра 17 октября 2003 года. Материалы работы представлены на VI и VII Российской онкологической конференции

Москва, 2002, 2003), ISFP/IFRS Conference (Мюнхен, 2002), 14 International congress on anti-cancer chemotherapy (Париж, 2003), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы он-когастроэнтерологии» (Барнаул, 2003).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 3 в зарубежной печати.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора данных литературы, клинической характеристики материала и методов исследования, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 10 отечественных и 104 зарубежных источников. Работа изложена на 113 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 15 рисунков.

ВЫВОДЫ

1. Концентрация uPA в цитозолях опухолей первичных больных раком желудка (0,01-4,10 нг/мг белка) обнаружена в 100% случаев, РАМ (0,01-11,46 нг/мг белка) - в 93% опухолей, a tPA (0,01-3,03 нг/мг белка) — в 76%.

2. При сравнительном исследовании опухолей и гистологически неизмененных тканей желудка показано, что концентрация uPA в опухолях у 76% больных в 1,1-9,3 раза выше, чем в неизмененной ткани; концентрация PAI-1 в опухолях 71% больных превышает его концентрацию в неизменной ткани в 1,1-15,2 раза, а концентрация tPA, напротив, в опухолях 76 % больных была в 1,5-131,4 раза ниже, чем в гистологически неизмененных тканях желудка.

3. Обнаружена достоверная прямая корреляция между уровнями PAI-1 в опухоли и неизмененной ткани желудка (R=0,51; р<0,05), тогда как концентрации uPA и tPA в опухоли не коррелировали с соответствующими показателями в неизмененной ткани желудка. Выявлена также достоверная положительная взаимосвязь концентраций PAI-1 и tPA в гистологически неизмененной ткани желудка (R=0,46; р<0,05), а также концентраций PAI-1 и uPA в опухоли (R=0,74; р<0,05).

4. На поздних стадиях в опухоли значительно возрастает концентрация uPA с параллельным увеличением уровня PAI-1 и наблюдается тенденция к уменьшению содержания tPA в опухоли.

5. Уровень uPA в опухоли положительно коррелирует с возрастом пациентов (R=0,21, р<0,05), а концентрация tPA находится в обратной зависимости от возраста больных раком желудка (R= -0,32, р<0,001).

6. Концентрация иРА достоверно отличается у больных с умеренно (G2)- и низкодифференцированными (G3) опухолями. Причем уровень иРА в первой группе был выше в 1,8 раза (р=0,01).

7. Высокая концентрация PAI-1 в опухолевой ткани больных раком желудка является неблагоприятным прогностическим фактором и коррелирует с низкой выживаемостью данных пациентов, при этом наиболее значимым пороговым уровнем является показатель верхнего квартиля -1,61 нг/мг белка.

8. Концентрация иРА в ткани рака желудка, превышающая медианный показатель - 0,37 нг/мг белка, достоверно ухудшает выживаемость больных раком желудка (р=0,03).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди злокачественных новообразований человека рак желудка занимает по уровню заболеваемости и смертности одно из ведущих мест в большинстве регионов. В последние годы многие исследователи указывают на целесообразность разработки новых методов лечения рака желудка, основанных на современных достижениях в области молекулярной биологии и биохимии опухолей, что позволит повысить эффективность терапии и уменьшить уровень смертности от этого заболевания, малочувствительного к традиционным видам химио- и лучевой терапии.

Известно, что одним из основных механизмов инвазии злокачественных опухолей является разрушение окружающей опухоль базаль-ной мембраны и внеклеточного матрикса ассоциированными с опухолью протеазами. Протеазы также участвуют в процессах метастазирования (Dano К. et al., 1985; Mignatti P., Rifkin D.B., 1993; Герштейн E.C., Кушлинский H.E., 2001). Центральную роль в этих процессах играет се-риновая протеаза - активатор плазминогена урокиназного типа. Данный фермент является ключевым звеном протеолитического каскада, приводящего к образованию плазмина и разрушающего компоненты опухолевой стромы (Liotta L.A. et al., 1990). В последнее время доказано также, что система активации плазминогена и, в частности иРА, имеет непосредственное отношение к процессам неоангиогенеза в опухолях (Hil-denbrand R. et al., 1995). Активность uPA регулируется несколькими способами: в частности, подавляется двумя белковыми ингибиторами, принадлежащими к семейству серпинов, - PAI-1 и PAI-2 (Andreasen Р.А. et al., 1990). При этом роль PAI-1 сводится преимущественно к защите опухолевых клеток от разрушающего действия uPA (Bianchi Е. et al.,1995).

Результаты ряда клинических исследований свидетельствуют о том, что изучение компонентов системы активации плазминогена в злокачественных опухолях различной локализации является весьма перспективным с клинической точки зрения (Foekens J.A. et al., 1996; Thomssen С. et al., 1997; Kim S. et al., 1998, и др.). Причем наиболее значимыми показателями являются, по-видимому, иРА и PAI-1, повышенный уровень которых свидетельствует о неблагоприятном прогнозе заболевания. Соответственно определение уровня и соотношения экспрессии данных компонентов системы активации плазминогена в опухолевой ткани может служить показателем инвазивной и метастатической активности опухоли, являясь биологически значимым фактором прогноза. В тоже время подавление активации плазминогена на различных уровнях (ингибирование активаторов, торможение их связывания с рецепторами) может стать одним из подходов к разработке новых схем противоопухолевой антиметастатической терапии.

Все вышеизложенное и послужило основанием для проведения настоящего исследования, в которое вошли 97 больных раком желудка оперированных в Воронежском областном клиническом онкологическом диспансере. Содержание uPA, tPA и PAI-1 в цитозолях опухолей и гистологически неизмененной ткани больных раком желудка было определено с помощью чувствительных, хорошо воспроизводимых наборов для иммуноферментного анализа, разработанных в Лаборатории эндокринологии Католического университета г. Наймеген (Нидерланды). Ранее эти наборы хорошо зарекомендовали себя при исследовании различных злокачественных опухолей (Герштейн Е.С., Кушлин-ский Н.Е., 2001; Е.С. Герштейн и соавт., 2001, 2002). Проведенное им-муноферментное определение концентрации данных компонентов системы активации плазминогена в цитозолях опухолей и гистологически неизмененных тканей больных раком желудка позволило выявить следующие закономерности.

В первую очередь, было убедительно продемонстрировано многократное увеличение концентрации uPA и его ингибитора PAI-1 в злокачественных опухолях желудка по сравнению с окружающей их гистологически неизмененной тканью. При этом средние концентрации uPA и PAI-1 в опухолевой ткани были достоверно выше, чем в неизмененной ткани, а концентрация tPA, напротив, была выше в неизмененной ткани желудка, чем в опухолевой. Так, уровень uPA в ткани опухоли был выше в среднем в 2,7 раза, чем в окружающей неизмененной ткани желудка. Концентрация PAI-1 также была выше в опухолевой ткани в среднем в 2,8 раза, чем в окружающей неизмененной ткани желудка. И наоборот, уровень tPA в опухолевой ткани был ниже в среднем в 5 раз по сравнению с окружающей неизмененной тканью желудка.

Это наблюдение согласуется с предполагаемой ролью данных белков в злокачественной трансформации клеток желудка и последующем распространении опухоли. Как известно, uPA является ключевым звеном протеолитической цепочки, обеспечивающей разрушение базальной мембраны и внеклеточного матрикса и последующий выход опухолевых клеток из их первоначального окружения. В то же время, основной функцией PAI-1, в отличие от ингибитора 2 типа (PAI-2), по мнению ряда авторов (Constantini V. et al., 1996), является защита самих опухолевых клеток от разрушающего действия uPA. Причем с увеличением уровня ингибитора 1 типа связывают повышенный риск возникновения метастазов и рецидивов опухоли.

Одновременное увеличение содержания этих компонентов системы активации плазминогена (uPA и PAI-1) является, по-видимому, характерной особенностью большинства злокачественных опухолей различной локализации (Герштейн Е.С., Кушлинский Н.Е., 2001). И в нашем исследовании лишь в единичных случаях содержание uPA и/или PAI-1 оказалось в нормальной ткани желудка выше или таким же, как в опухолевой, причем все эти случаи отличались низкой концентрацией исследуемых компонентов, как в опухолевой, так и в нормальной ткани (менее 0,2 нг/мг белка).

При сопоставлении средних значений уровня tPA в неизмененных тканях и опухолях тех же пациентов концентрация tPA в опухолевой ткани оказалась достоверно ниже, чем в нормальной ткани желудка.

Таким образом, нам удалось продемонстрировать, что при раке желудка происходят изменения в экспрессии отдельных компонентов системы активации плазминогена, наблюдавшиеся ранее при различных злокачественных новообразованиях, а именно, усиление активации плазминогена по урокиназному типу с параллельным увеличением уровня PAI-1, а также снижение экспрессии tPA.

Также было показано, что экспрессия uPA - ключевого компонента протеолитического каскада, обеспечивающего инвазию, возрастает на поздних стадиях рака желудка. При этом обнаружено, что внут-риопухолевая концентрация иРА на поздней стадии заболевания достоверно выше в 3,2 раза (р=0,02), чем на I стадии. Такая же тенденция характерна и для PAI-1. Его концентрация в опухолевой ткани при IV стадии рака желудка выше в 9,4 раза (р=0,01), чем в ткани опухоли у больных с I стадией заболевания, и в 2,3 раза выше (р=0,02), чем при II стадии рака желудка.

Отмечено также достоверное увеличение содержания иРА и PAI-1 в опухолевой ткани по сравнению с неизмененной тканью желудка у больных II, III и IV стадиями заболевания (р<0,01), в то время как для группы больных I стадии содержание иРА и PAI-1 в опухоли достоверно не отличалось от неизмененной ткани желудка. Одновременно медиана соотношения концентрации иРА в ткани опухоли желудка к его концентрации в неизмененной ткани возрастала на поздних стадиях заболевания. Подобная тенденция наблюдалась и для PAI-1. Содержание tPA в опухоли по сравнению с неизмененной тканью желудка было достоверно ниже только у больных III стадией заболевания (р=0,02), в других группах не выявлено достоверного отличия этого показателя в ткани опухоли желудка от неизмененной ткани.

Таким образом, прослеживается тенденция к взаимосвязи содержания компонентов системы активации плазминогена в опухолевой ткани желудка со стадией заболевания. На поздних стадиях в опухоли значительно возрастает активация плазминогена по урокиназному типу с параллельным увеличением уровня PAI-1, что, по-видимому, связано с прогрессированием заболевания. Значимая взаимосвязь концентрации активатора плазминогена тканевого типа в опухоли и стадии заболевания пока не установлена, однако наблюдается тенденция к уменьшению содержания tPA в опухоли на поздних стадиях.

Результаты нашего исследования показывают, что с увеличением возраста больных раком желудка происходит повышение уровня экспрессии иРА. Так, содержание иРА в опухоли слабо положительно коррелировало с возрастом пациентов (R=0,21, р<0,05). С другой стороны, обнаружена слабая отрицательная корреляция концентрации tPA в опухоли с возрастом больных раком желудка (R=-0,32, р<0,001).

Таким образом, в старших возрастных группах больных раком желудка прослеживается тенденция к усилению в опухолевой ткани активации плазминогена по урокиназному типу и параллельному уменьшению концентрации в опухоли активатора плазминогена тканевого типа. По-видимому, полученная взаимосвязь указывает на усиление протеазной активности опухоли, способствующей ее инвазии у больных старших возрастных групп.

В тоже время нами не было обнаружено достоверной взаимосвязи уровней tPA и PAI-1 в опухолевой ткани и их соотношения со степенью дифференцировки опухоли. Концентрации иРА значительно и достоверно различались только между двумя наиболее репрезентативными группами больных с умеренно- и низкодифференцированны-ми опухолями (G2 и G3). При этом уровень иРА в ткани умеренно-дифференцированной опухоли был выше более чем в 2 раза. Полученное соотношение уровней активатора плазминогена урокиназного типа свидетельствует о том, что активация этой протеазы, по-видимому, не связана напрямую с увеличением степени злокачественности рака желудка, а следовательно указывает на относительную независимость изменений в системе активации плазминогена от степени дифферен-цировки рака желудка.

При изучении отдаленных результатов лечения больных раком желудка, включенных в исследование, были получены интересные данные об общей продолжительности жизни пациентов в зависимости от концетрации компонентов системы активации плазминогена в опухолевой ткани. Так, общая выживаемость больных раком желудка с более низким (менее 0,37 нг/мг белка) содержанием в опухолевой ткани uPA была выше, чем у пациентов с содержанием uPA в опухолевой ткани большим 0,37 нг/мг белка (медиана выживаемости - 16,6 и 12,8 месяцев соотвественно, р=0,03). Такая же тенденция отмечалась и для PAI-1. При этом с увеличением концентрации PAI-1 в опухолевой ткани показатели общей продолжительности жизни больных раком желудка ухудшались. Медиана выживаемости составляла 16,6 и 9,7 месяцев соответственно при меньшем и большем 1,61 нг/мг белка содержанием PAI-1 в опухолевой ткани (р=0,004).

Неоднозначные результаты получены для активатора плазминогена тканевого типа. Так, общая продолжительность жизни больных раком желудка была ниже при большей концентрации tPA в опухолевой ткани. Медиана выживаемости при этом равнялась 12,7 и 15 месяцам, соответственно при уровне tPA более и менее 0,55 нг/мг белка. В тоже время двухлетняя выживаемость была выше у пациентов с уровнем tPA более 0,55 нг/мг белка и составила 22,8% против 17,7% у больных с меньшей концентрацией фермента в опухоли. Однако полученные результаты статистически недостоверны.

Сравнение соотношений концетраций активаторов плазминогена урокиназного и тканевого типов (uPA/tPA) в опухолевой ткани у больных раком желудка показало, что в группе пациентов с соотношением uPA/tPA>l общая продолжительность жизни была ниже, чем у пациентов с соотношением иРАЛРА<1 (медиана выживаемости -11,5 и 17 месяцев соответственно). Однако полученные различия общей продолжительности жизни не достигали уровня статистической значимости.

Следует отметить, что определенное влияние на ухудшение выживаемости при высоких показателях иРА и PAI-1, по-видимому, оказывает тот факт, что в эти подгруппы попадают большинство больных с IV стадией заболевания, а больные с I стадией в основном находятся в подгруппах с низкими уровнями данных маркеров. Однако, учитывая относительно низкую долю больных с I и IV стадиями в общей группе, влияние этого фактора не следует преувеличивать. Это предположение подтверждается и при проведении многофакторного анализа с помощью регрессионной модели Кокса, который свидетельствует о том, что уровень PAI-1 выше верхнего квартиля является более значимым фактором прогноза, чем наличие отдаленных метастазов, степень поражения лимфатических узлов и стадия заболевания в целом (р =0,048).

Таким образом, исследование общей продолжительности жизни свидетельствует о том, что высокий уровень (более 1,61 нг/мг белка) ингибитора PAI-1 в опухолевой ткани больных раком желудка является неблагоприятным прогностическим фактором и коррелирует с низкой выживаемостью данных пациентов (р=0,004). В тоже время низкое содержание PAI-1 в опухоли (меньшее или равное 1,61 нг/мг белка) у больных раком желудка может служить благоприятным прогностическим фактором, так как коррелирует с лучшей выживаемостью у данных пациентов. То же самое относится и к активатору плазминогена урокиназного типа. Высокие показатели его концетрации в опухолевой ткани (более 0,37 нг/мг белка) коррелируют с худшей продолжительностью жизни больных раком желудка, и наоборот, низкое содержание иРА в опухоли (меньшее или равное 0,37 нг/мг белка) свидетельствует о лучшей выживаемости данных пациентов (р=0,03). Следовательно, высокий уровень PAI-1 и иРА в опухолевой ткани больных раком желудка может расцениваться как неблагоприятный прогностический фактор.

Выявленные закономерности могут иметь как теоретическое, так и практическое значение. С одной стороны, они подтверждают тот факт, что усиление активации плазминогена по урокиназному типу, сопровождающееся усилением защиты опухолевых клеток от саморазрушения (за счет увеличения уровня PAI-1), является достаточно универсальным признаком малигнизации. С другой стороны, повышенная экспрессия иРА в опухоли желудка по сравнению с окружающей неизмененной тканью делает этот фермент перспективной избирательной мишенью для антиметастатической противоопухолевой терапии рака желудка - заболевания с достаточно низкой чувствительностью к стандартным видам химиотерапии.