Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клиническое значение характеристики костного мозга больных плоскоклеточным раком головы и шеи

На правах рукописи

ТИМОНИНА ЕЛЕНА ГЕННАДЬЕВНА

Клиническое значение характеристики костного мозга больных плоскоклеточным

раком головы и шеи.

14.00.14 - онкология

Автореферат диссертации на соискание ученей степени кандидата медицинских наук

Москва 2009

003481808

Москва 2009

Работа выполнена на кафедре онкологии ГОУ ДПО Российской Медицинской Академии Последипломного Образования Росздрава, на базе хирургического отделения опухолей верхних дыхательно-пищеварительных путей, лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ КО Российского Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохпна РАМН

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор С.О.Подвязников

доктор медицинских наук, профессор Н.Н.Тупицын

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор З.Г. Кадагидзе

доктор медицинских наук, профессор С.Б. Петерсон

Ведущее учреждение: ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова Росздрава

Защита диссертации состоит 2009 года в _ часов на заседании

диссертационного совета (Д.001.017.02) Российского Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина РАМН (115478, Москва, Каширское шоссе, 24)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Онкологического Научного Центра им. H.H. Блохина РАМН

Автореферат разослан

У 2009года

Ученый секретарь диссертационного совета jlß^^^^t/') А Барсуков

Общая характеристика работы.

Актуальность темы

Злокачественные опухоли головы и шеи составляют до 5% всех новообразований (Пачес А.И., 1999). Среди злокачественных опухолей головы и шеи с гистологическим вариантом плоскоклеточного рака число больных достигает 90%. По данным ВОЗ ежегодно выявляется 551000 больных с первичным раком головы и шеи, при этом 217000 - погибают в первый год наблюдения. Несмотря на современные методы диагностики, в России до 60% больных с этой локализацией поступают в специализированные лечебные учреждения с местно-распространенным процессом (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2008). За последние 10 лет отмечаются успехи современных методов лечения плоскоклеточного рака головы и шеи (ПРГШ), однако отдаленные результаты остаются не удовлетворительными.

Развитие рецидива болезни, регионарных метастазов и в отдельных случаях отдаленных метастазов подтолкнуло клиницистов к изучению факторов прогноза при ПРГШ, в частности таких как: пол и возраст больных, локализации и распространенности опухолевого процесса, формы роста опухоли и др. (Матякин Е.Г., 1988; Нуммаев Г.М. 1988; Kademani D., 2005). В последующие годы вышел ряд научных работ, посвященных определению морфологических и биологических характеристик опухолевого процесса, определению популяционного состава и кинетических характеристик опухолевых клеток методом проточной ДНК-цитометрии, позволяющих характеризовать биологические свойства опухолей (Уваров A.A., 1997; Худират С.А. 1998; Ахундов A.A., 2000). Ведущими факторами прогноза остается распространенность опухолевого процесса: размер опухоли, наличие метастазов рака в регионарные лимфатические узлы, а также локализация опухолевого процесса орофарингеальной области и степень дифференцировки клеток плоскоклеточного рака,

Ряд исследований, проведенных в некоторых научных центрах (Partrige М. et al., 2003; Colnot D.R. et al., 2004), показали, что более достоверная информация о распространенности опухолевого процесса может быть получена при исследовании костного мозга больных ПРГШ.

Роль костного мозга, как возможной мишени гематогенного метастазирования,

доказана при многих опухолях эпителиальной природы. Наиболее детально изучено

поражение костного мозга при раке молочной железы в 47 - 62, 5% случаев (Mansi J.L.

et al., 1991; Harbeck N. et al., 1994; Крохина O.B., 2003; Wiedswang G. et al., 2003). В

публикациях описаны случаи костномозговых микрометастазов при раке

3

предстательной железы (до 54% - 85% случаев), немелкоклеточном раке легкого (32% - 40%), раке почки (28% - 40%), колоректальном раке (8% - 13%), (Pantel К. et al., 1995; Pantel К. et al., 1996; Soeth E. et al., 1996; Weitz Ju. et al., 1999; Buchner A. et al., 2006; Hofmann T. et al., 2007).

Микрометастазирование в костный мозг при ПРГШ не изучалось. И только в 1999 году была опубликована научная работа Brakenhoff et al., в которой отмечено, что наличие небольших опухолевых кластеров или единичных опухолевых клеток в костном мозге больных различными эпителиальными опухолями можно установить методами цитохимии и молекулярной биологии, а именно, полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Кроме того, наиболее часто используются тканеспецифичные маркерные антигены, такие как цитокератины. Специфичным для выявления метастатических клеток ПРГШ является экспрессия гена Е48 на уровне мРНК в ОТ-ПЦР, которая позволяет обнаруживать метастатические клетки в костном мозге и периферической крови больных ПРГШ с высокой чувствительностью и специфичностью 1 опухолевая клетка среди 10 миллионов миелокариоцнтов.

В дальнейшем присутствие микрометастазов в костном мозге, в плане вероятного фактора прогноза ПРГШ, было продемонстрировано Colnot D.R. et al. (2004). Авторами показана экспрессия гена Е48 клетками костномозгового пунктата в 40% случаев у больных ПРГШ. Отмечено, что обнаружение мРНК-транскриптов гена Е48 в костном мозге больных ПРГШ сопряжено с неблагоприятным прогнозом. Так же показано, что выживаемость больных ПРГШ с поражением не менее двух метастатических лимфатических узлов достоверно снижается при наличии микрометастазов в костном мозге (р=0,02). Эти данные указывают на возможность более точного стадирования опухолевого процесса, более точную объективную оценку групп больных, нуждающихся в проведении дополнительных лечебных мероприятий.

Специфика роста гистогенетически различных опухолей приводит к разнообразным клиническим проявлениям в организме в целом, в том числе в системе кроветворения. Следует отметить, что гемопоэз больных ПРГШ ранее детально не изучался, тем более в группах больных с присутствием опухолевых клеток в костном мозге.

Все вышеизложенное послужило основанием для проведения настоящего исследования костномозгового пунктата в плане выявления микрометастазов в костном

мозге с целью уточнения истинной распространенности опухолевого процесса, а также оценки показателей гемопоэза у больных ПРГШ.

Цель исследования

Выявить особенности гемопоэза в зависимости от клинических, морфологических параметров опухоли и наличия костномозговых микрометастазов у больных ПРГШ.

Задачи исследования

1. Оценить показатели кроветворения у больных плоскоклеточным раком головы и шеи.

2. Изучить клинико-гематологические особенности у больных ПРГШ.

3. Определить значимость методов диагностики в выявлении микрометастазов в костный мозг у больных ПРГШ.

4. Выявить частоту поражения костного мозга микрометастазами ПРГШ на уровне экспрессии мРНК Е48.

5. Оценить показатели миелограмм у больных ПРГШ при наличии положительного сигнала Е48.

6. Изучить особенности клинического течения ПРГШ в группах больных с наличием и отсутствием микрометастазов в костном мозге.

Научная новизна

Впервые в России выявлены изменения клеточного состава костного мозга больных ПРГШ, которые заключаются в увеличении относительного содержания сегментоядерных нейтрофилов, снижениии уровней молодых форм гранулоцитарного ряда (промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов) без изменения индекса созревания нейтрофилов и процента клеток гранулоцитарного ростка. Для низкодифференцированного плоскоклеточного рака характерной является гипоклеточность костного мозга.

Установлено, что достоверное повышение лейко-эритробластического соотношения в костном мозге больных ПРГШ обусловлено редукцией эритроидного ряда. Впервые показано, что индекс созревания эритроидных клеток повышен за счет увеличения процента оксифильных нормобластов в костном мозге больных с местнораспространенным плоскоклеточным раком головы и шеи.

Впервые в России отработан высокочувствительный метод детекции мРНК специфического белка плоскоклеточного рака Е48, с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, Саузерн-блотингом и последующим иммуноферментным или иммунофлуоресцентным проявлением. Этот метод позволяет вьивить микрометастазы в костном мозге 35% больных ПРГШ.

У больных с выявленными микрометастазами в костном мозге определено достоверное снижение пропорции полихроматофильных нормобластов и достоверное повышение уровня клеток гранулоцитарного ряда при нормальных показателях лимфоцитов и других клеточных элементов миелограмм. Установлено, что при наличии поражения регионарных лимфатических узлов достоверно чаще выявляются микрометастазы в костном мозге больных ПРГШ и наблюдалось прогрессирование опухоли в сроки до 9 мес.

Практическая значимость

Молекулярный метод ОТ-ПЦР с иммуноферментным или иммунофлуоресцентным проявлением, отработанный в настоящем исследовании, позволяет выявить микрометастазы в костном мозге 35% больных ПРГШ, что свидетельствует о гематогенном метастазировании опухолевых клеток и позволяет судить об истинном распространении опухоли, а также вьивить группу больных с неблагоприятным течением болезни. В работе оценена реакция кроветворной системы больных ПРГШ на опухолевый рост, в том числе в группе больных с выявленными микрометастазами. Полученные результаты исследования могут явится дополнительным фактором прогноза ПРГШ при определении группы больных с повышенным риском прогрессирования опухолевого процесса и позволят провести отбор больных для проведения дополнительных методов противоопухолевого лечения.

Апробация работы состоялась 3 июля 2009 года на совместной научной конференции с участием кафедры онкологии ГОУ ДПО РМАПО, кафедры онкологии ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова, кафедры онкологии ФУВ РГМУ, кафедры челюстно-лицевой хирургии МГМСУ, хирургического отделения опухолей верхних дыхательно-пищеварительных путей, хирургического отделения черепно-челюстно лицевой области, лабораторий иммунологии гемопоэза, клинической иммунологии опухолей, клинико-диагностической лаборатории централизованного клинико-лабораторного отдела НИИ КО РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ. Материалы диссертационной работы доложены на II Российском симпозиуме «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека» (Москва, 21-22 января 2009г.) и VI международной конференции «Иммунология гемопоэза» (Москва, 7 - 8 июня 2009г.).

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 157 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Иллюстрирована 29 таблицами, 11 рисунками, 7 диаграммами. Указатель литературы содержит 179 источников, из которых 25 отечественных и 154 зарубежных.

Материалы и методы

Общая характеристика больных и методов исследования

Материалом для настоящего исследования послужил аспират костного мозга 41 больного плоскоклеточным раком головы и шеи. Исследуемую группу составили первичные пациенты II - IV стадий заболевания. Больные проходили обследование и лечение в хирургическом отделении опухолей верхних дыхательно-пищеварительных путей Российского онкологического научного центра им. H.H. Блохина РАМН и в радиологическом отделении ГКБ № 33 им. А. А. Остроумова за период 2007-2008 года.

Больным проведены стандартные общеклинические и лабораторные исследования систем и органов. По результатам обследования отдаленных метастатических изменений выявлено не было ни у одного больного.

Среди пациентов были преимущественно мужчины - 38 человек (92,6%), женщин - 3 (7,3%). Возраст больных варьировал от 33 до 75 лет, средний возраст составил - 54,4 года.

По локализации неопластического процесса, в анализируемой группе, рак языка определялся у 17 больных (41,5%); ротоглотки - у 9 (22%); слизистой оболочки дна полости рта - у 8 (19,5%); гортаноглотки - у 7 (17%). Объем опухоли и степень распространенности процесса колебались значительно. Наиболее часто определялась IV стадия заболевания у 19 (46,3%) человек (табл. 1).

Таблица 1.

Частота распределения больных по стадии локализации опухолевого процесса.

Стадия ^Локализация TNM Слизистая оболочка полости рта Гортано-глотка Ротоглотка Язык Всего (%)

II T2NOMO 1 1 2 5 9 (22%)

III TI.2NIMo — 2 — ■ 2 4 (9,8%)

T3N0M0 1 — 1 1 3 (7,3%)

T3N1M0 1 — 1 4 6 (14,6%)

IVA T1.3N2M0 — 2 1 3 6(14,6%)

T4aNoMo 2 — — — 2 (4,9%)

T4aN|.2Mo 1 — 4 2 7 (17,0%)

IVB Тлюбая^зМо 2 2 — — 4 (9,8%)

Всего (%) 8(19,5%) 7(17,0%) 9 (22,0%) 17(41,5%) 41 (100,0%)

При гистологическом исследовании биоптатов опухоли во всех случаях рака орофарингеальной области определен плоскоклеточный рак с разной степенью дифференцировки опухолевых клеток (табл. 2).

Таблица 2.

Степень дифференцировки плоскоклеточного рака.

Степень дифференцировки Стадия опухолевого процесса Всего (%)

II III IVa IVb

высоко- дифференцированный 2 8 7 — 18(43,9%)

умеренно- дифференцированный 7 5 4 2 17(41,5%)

низко- дифференцированный — — 4 2 6 (14,6%)

Всего (%) 9 (22%) 13(31,7%) 15(36,6%) 4 (9,8%) 41 (100%)

Всем больным ПРГШ, вошедшим в наше исследование, перед проведением специального лечения, применяемого в клинике ОВДПП РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН с учетом локализации и распространенности опухолевого процесса,

выполнялась пункционная биопсия костного мозга в области задней верхней ости подвздошной кости.

Специальное лечение включало различное сочетание методов воздействие на опухоль. На первом этапе проводилась полихимиотерапия (ПХТ) в неоадьювантном режиме и после проведения 2 курсов ПХТ оценивалась степень регрессии опухоли и в зависимости от полученного эффекта, далее выполнялось хирургическое вмешательство, либо лучевая терапия, либо их комбинация (табл. 3).

Таблица 3.

Методы лечения ПРГШ.

Локализация Объем проведенного лечения Всего (%)

комплекс- химио- оператив- отказ от

ное лучевое ное лечения

Язык 4 13 — — 17(41,4%)

Гортаноглотка 1 5 — 1 7(17,1%)

Ротоглотка 2 8 — — 10 (24,4%)

Слизистая 2 4 1 — 7 (17,1%)

оболочка

полости рта

Всего (%) 9 (22,0%) 30 (73,2%) 1 (2,4%) 1 (2,4%) 41 (100,0%)

У 73,2% больных проведено химиолучевое лечение, 22% больных - комплексное лечение (2 курса неоадыовантной полихимиотерапии по схеме РИ: 5-фторурацил -500мг/м2, в/в струйно, в 1-й, 2-й ,3-й дни, Цисплатин - 100мг/м2 4-й день, в/в капельно на фоне аитиэметиков, премидикации и водной нагрузки. Второй курс полихимиотерапии проводился через 21 день) с последующим подведением лучевой терапии на первичный очаг и зоны регионарных лимфатических узлов шеи (РОД - 2Гр, СОД - 44—50Гр) и хирургическим вмешательством. В группу исследования были включены двое больных, которым проведено комплексное лечение с включением Таксанов по схеме: Таксотер 75мг/м2 в 1-й день, Цисплатин 75мг/м2 1-й день и 5-фторурацил 750мг/м2 каждые 24 часа, непрерывная внутривенная 120 часовая инфузия. С дальнейшим проведением 5 циклов сочетанного химиолучевого лечения. Одному больному раком слизистой оболочки полости рта (Т4И2М0) была выполнена радикальная операция на первом этапе лечения, учитывая выраженный болевой синдром и угрозу распада опухоли. Одному больному был проведен один курс полихимиотерапии - от дальнейшего лечения больной отказался.

В нашей работе период наблюдения за больными составил от 3 до 9 месяцев (2007-2008 г.г.). Из 41 больного, получившего лечение, прогрессирование опухолевого

9

процесса было отмечено у 12 больных (29,3%). У двух больных (4,9%) при IV стадии рака орофарингеальной области прогрессирование опухолевого процесса привело к летальному исходу через 7-8 месяцев динамического наблюдения. 28 больных (68,3%) живы без прогрессирования опухолевого процесса в сроки наблюдения до 9 месяцев (диаграмма 1).

Диаграмма 1.

Прослеженность больных после проведенного лечения.

12% 3% П=41

« жив, п=28 рецидив, п=5 * летальный исход, п=2

■ продолженный рост, п=5 3 отказ от лечения, п=1

Забор аспирата костного мозга из верхней задней ости подвздошной кости (spina iliaca posterior superior) выполнялся по общепринятой методике иглой «Jamshidi». При морфологическом исследовании пунктатов особое внимание обращали на качество забора костного мозга, стараясь брать не более 0,5 мл. Полученный материал помещался в вакутейнер с консервантом (1-1,5мг КгЭДТА), тщательно перемешивался, маркировался и направлялся в лабораторию иммунологии гемопоэза РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН.

Микроскопическое исследование выполнялось двумя экспертами-гемоцитологами, просматривались 6 препаратов костного мозга по следующим параметрам:

- поиск метастатических клеток в 6 препаратах костного мозга;

- подсчет и описание миелограммы.

Для оценки костномозгового кроветворения после подсчета костномозговых элементов производился расчет индексов миелограммы:

- индекс созревания эритрокариоцитов (ИСЭ);

- индекс созревания нейтрофилов (ИСН);

- лейкоэритробластическое соотношение (Л/Э).

В качестве норм показателей аспиратов костного мозга и периферической крови использовались. данные Соколова В. В. и Грибовой И. А. (1972), эти расчетные показатели соответствуют М±1,5а и включает до 80 - 90% нормальных наблюдений. В качестве норм расчетных индексов красной крови: показателя среднего объема эритроцита в фентолитрах (MCV), показателя среднего содержания гемоглобина в эритроците в пикограммах (МСН), показателя концентрации гемоглобина в эритроците в г/л (МСНС) - данные Кузнецова Ю.В. (2003).

Молекулярный анализ аспирата проводился методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией. Исследовали мРНК от 4 до 54 млн. миелокариоцитов.

Ведение культур эукариотических клеток.

Клеточные линии RPMI 8226, А431 культивировали во флаконах (25см и 75см2) в COi-инкубаторе при 37°С и 5% СО2. Для ведения этих культур клеток использовали культуральную среду RPMI 1640 или DMEM с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки и антибиотика. Рассевали клетки каждые 3-4 дня.

Техника проведения полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).

Выделение ДНК. К клеточной суспензии добавляли 0,1 % SDS по объёму и проводили разрушение мембран клеток троекратным замораживанием/ размораживанием. Далее добавляли равный объём фенола, встряхивали содержимое пробирки на «Вортексе» и откручивали при 13400 об./мин. на центрифуге в течение 10 мин. Затем отбирали из пробирки верхнюю фазу и переносили её в пробирку с равным объёмом смеси фенол / хлороформ / изоамиловый спирт (25:24:1), интенсивно встряхивали и центрифугировали при 13400 об./мин. в течение 10 мин. Отбирали верхнюю фазу, добавляли к ней равный объём хлороформа и снова центрифугировали при 13400 об./мин. 10 мин. Далее отбирали верхнюю фазу, переносили её в новую пробирку и добавляли 10% по объёму ЗМ ацетата натрия (рН 5,0) и равный объём изопропилового спирта. После этого пробирку ставили на ночь в морозильную камеру на -20°С, далее откручивали на центрифуге при 13400 об./мин. 10 мин. Осадок высушивали и ресуспендировали деионизованной водой.

Выделение РНК. К клеточной суспензии добавляли гуанидин-тиоционатный

буфер (4М гуанидин тиоцианат, 25 юМ натрия цитрат рН 7,0, 0.5% натрия N-

лауроилсаркозилат, 0,1% p-меркаптоэтанол), держали 10 мин. при комнатной

11

температуре, далее добавляли 10% по объёму ЗМ ацетата натрия (pH 5,0), интенсивно перемешивали содержимое пробирки, добавляли равный объём фенола, 5 мин. держали при комнатной температуре, добавляли смесь хлороформа с изоамиловым спиртом (24:1), интенсивно перемешивали и центрифугировали при 13400 об./мин. в течение 10 мин. Далее отбирали верхнюю фазу, переносили её в новую пробирку, повторяли экстракцию с фенолом и хлороформом. После этого отбирали водную фазу, добавляли 2,5 объёма этилового спирта и ставили на ночь в морозильную камеру на -20°С. Далее откручивали от спирта на центрифуге при 13400 об./мин. в течение 10 мин, осадок высушивали и ресуспендировали деионизованной водой.

Обратная транскрипция. Реакцию проводили стандартно в объеме 40 мкл. К 20 мкл РНК добавляли 2 мкл политимидинового олигонуклеотида (18 звеньев). После этого ставили пробирку в термостат на +70°С на 5 мин. Далее добавляли 8мкл 5 х буфера для обратной транскрипции, 4 мкл смеси дезоксирибонуклеотидов, 4 мкл ингибитора рибонуклеазы и ставили пробирку в термостат на +37*С на 5 мин. После добавляли 2 мкл фермента MMulV обратной транскриптазы и ставили пробирку в термостат на +42"С на 1 час. Фермент инактивировали 10 мин. при +70°С.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась на амплификаторе «Терцик» (Россия). В случае каждой пары праймеров использовалась индивидуальная программа. Для амплификации кДНК Е48 использовали следующие пары праймеров: Е-48 forward: 5 '-СAGACGACATCAGAGATGAGGACAGC-3',

Е48 reverse: 5'-GGGCAGACCACAGAATGCTTGC-3\ Условия амплификации: денатурация 90°С 1 мин., отжиг праймеров 65°С, элонгация 72°С 1 мин. Цикл повторяли 40 раз. Продукт амплификации равнялся 130 пар оснований (п.о.). Контроль качества мРНК оценивали по амплификации м-РНК ß-глобина. Использовали праймеры:

ß-globin forward: 5'-CTGGGCAGGCTGCTGGTG-3', ß-globin reverse: 5'-GCTTGTCACAGTGCAGCTC-3' (продукт амплификации равнялся 210 п.о.) Условия амплификации: денатурация 94°С 45 сек., отжиг праймеров 60'С, элонгация 72"С 30 сек. Цикл повторяли 30 раз.

Амплификация геномной ДНК Е48 осуществляли с теми же праймерами, что и амплификация мРНК Е48, денатурация при 94°С. Продукт амплификации - 908 п.о.

ПЦР с включением 32Р. Полимеразная цепная реакция проводилась на амплификаторе «Терцик» (Россия). Для амплификации использовали следующие пары праймеров:

E-48 forward: 5 '-CAGACGACATCAGAGATGAGGACAGC-3 ',

E-48 reverse: 5 '-GGGCAGACC ACAGAATGCTTGC-3 '. Продукт амплификации равнялся 130 п.о. Реакцию проводили в объеме 50 мкл. К 20 мкл кДНК добавляли 5 мкл 10*буфера для полимеразной цепной реакции, 5 мкл MgCh, 1 мкл. Смеси dNTP (1 мкл dATP + 1 мкл dTTP + 1 мкл dGTP + 1мкл 32P-dCTP + б мкл Н20), 16 мкл Н20, 2 мкл праймеров Е48, 1 мкл TAG-полимеразы.

ПЦР с включение,м BrdUTP проводилась на амплификаторе «Терцик» (Россия). Для амплификации использовали следующие пары праймеров: E-48 forward: 5 '-CAGACGACАТСAGAGATGAGGACAGC-3',

E-48 reverse: 5 '-GGGCAGACCACAGAATGCTTGC-S '. Продукт амплификации равнялся 130 п.о. Реакцию проводили в объеме 50 мкл. К 20 мкл кДНК добавили 5 мкл 10*буфера для полимеразной цепной реакции, 5 мкл MgCh, 1 мкл смеси dNTP (1 мкл dATP + 1мкл dCTP + 1мкл DGTP + 1 мкл BrdUTP + 6 мкл Н20), 16 мкл Н20, 2 мкл праймеров Е48,1 мкл TAG-полимеразы.

Электрофорез. Для разделения ПЦР-продукта амплифицированных фрагментов использовали 1,5% легкоплавкую агарозу на ТВЕ-буфере с добавлением Ethidium bromide (Helicon, Россия) или SYRB Green (Roche, Германия). Проводили в электрофоретической камере Helicon (Россия) в течении 25-30 минут. Гель документировали на видеосистеме GI-2.

Саузерн-блоттинг. Проводили электрофоретический перенос на Criterion Blotter (Bio Rad) 15 минут при 30V. Мембрану предварительно инкубировали в ТВЕ-буфере 5 минут.

УФ-фиксация. Фиксация мембраны проводилась в камере УФ-облучения CL-1000 Ultraviolet Crosslinker ( БиоХимМак,Россия) в течение 10 минут, режим 2000-4000.

Иммуноферментное окрашивание мембран Hybond N+ Саузерн-блоттинга. Мембрану инкубируем 5 мин. в 0,1 Трис-NaCl, рН 7,5; 15 мин. - в блокирующем буфере (0,1 Трис-NaCl, рН 7,5 + 5% обезжиренного сухого молока); 45 мин. - с anti-BrdU (в разведении 1/1000 в блокирующем буфере) при 37°С; 3 отмывки по 5 минут в Трис-NaCl.

Инкубация с- анти-мышиными антителами, меченными пероксидазой хрена (разведение 1/2000 в блокирующем буфере), 30 минут при 37°С. 3 отмывки по 5 минут в Трис-NaCl. Добавляем ECL на мембрану Amersham Hybond-N+ 1 минута. Экспонируем мембрану с пленкой Amersham Hyperfilm 1 сутки. Проявляем в темной комнате: проявитель - 5 минут, фиксаж - 5 минут, промываем водой и высушиваем.

Иммунофлуоресцентное окрашивание. Мембрану предварительно инкубируем в 0,7 М NaOH 10 минут. Инкубируем 5 мин. в 0,1 Трис-NaCl, рН 7,5; 15 мин. - в блокирующем буфере (0,1 Трис-NaCl, рН 7,5 + 5% обезжиренного сухого молока); 45мин. - с anti Brdu (в разведении 1/1000 в блокирующем буфере) при 37°С; 3 отмывки по 5 минут в Трис-NaCl; инкубация с анти- BRDU-FITC 30 минут при 37°С; 3 отмывки по 5 минут в Трис-NaCl. Сканирование мембраны осуществлено на приборе Typhoon 9410 (ГУ НИИ биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича).

Статистический анализ данных.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась методом математического анализа данных с использованием пакета компьютерных программ EXEL и SPSS.10 for Windows с использованием методической литературы (Рябова

0.10..2003; Наследов А.Д., 2007): корреляционный анализ с использованием ранговых корреляций; сравнение средних значений двух выборок и t-критерий для независимых выборок с оценкой по уровню значимости; подсчет распределения частот по категориям с непрерывными и дискретными переменными; применение критерия Somers'a для качественных переменных.

Результаты исследования и обсуждение.

1. Возможности использования иепадноактнвных методов молекулярной диагностики метастатического поражения костного мозга при ПРГШ.

При морфологическом исследовании образцов костного мозга 41 больного

ПРГШ (по 6 мазков в каждом случае) метастатических клеток выявлено не было.

Нами проведено молекулярное исследование костного мозга у 41 больного

ПРГШ различных стадий заболевания. РНК выделяли из 4,4 - 54 миллионов

миелокариоцитов. Всем больным определена экспрессия гена Е48 в стандартной ОТ-

ПЦР с использованием для выявления продукта ПЦР красителя этидиума бромида,

внесенного в агарозный гель при разделении продуктов ПЦР. Ни в одном из изученных

образцов костного мозга экспрессии гена Е48 на уровне мРНК не обнаружено.

С целью определения чувствительности обнаружения продукта ПЦР РНК

выделяли из 100000 клеток линии А431, которая постоянно экспрессирует белок Е48.

Выделенную общую РНК разводили в 10, 100, 1000, 10000 и 100000 раз, проводили

обратную транскрипцию, затем ПЦР. Этидиум бромид выявлял продукт ПЦР,

соответствующий мРНК Е48, выделенной из 100 клетЬк линии А431. Подобная

14

чувствительность обнаружения продукта ПЦР не является достаточной для выявления микрометастазов ПРГШ в костном мозге больных.

Мы заменили ДНК-связывающий краситель этидиум бромид на более чувствительный - SYBR Green I. При проведении экспериментов на клеточной линии А431, SYBR Green I позволяет выявлять продукт амплифицированного мРНК Е48, выделенную из 10 клеток. Однако, в этом случае, окрашивание амплифицированной кДНК в 130 п.о. является крайне слабым и не всегда воспроизводимьм. При внесении 30 мкл продукта ПЦР в агарозный гель экспрессия мРНК Е48 выявляется в 10 клетках линии А431, однако этой чувствительности также не достаточно для выявления микрометастазов. Необходимый порог чувствительности должен соответствовать мРНК одной клетки линии А431 (рис. 1).

Рисунок 1.

Сравнение чувствительности Этидиум-бромидч и SYBR Green I (титрование мРНК линии А431).

SYBR Green I Этидиум бромид

Пояснение к рисунку 1. Справа-налево: маркер мол. массы, далее последовательно продукты ПЦР, соответствующие мРНК линии А431, выделенной из 100000, 10000, 1000, 100, 10 и 1 клетки. Этидиум бромид выявляет мРНК из 100 клеток, SYBR Green I - м РНК из 10 клеток (слабая полоса). Продукт ПЦР соответствует 130 п.о. Первая полоса - несвязавшиеся праймеры, интенсивность этой полосы возрастает при уменьшении количества специфического продукта ПЦР.

Для повышения чувствительности обнаружения экспрессии Е48 нами предпринята попытка повышения чувствительности обнаружения продукта ОТ-ПЦР за счет использования радиоизотопной метки (радиоактивно меченые нуклеотиды по 32Р). При замене холодного dCTP (дезоксицитидинтрифосфата) на радиоактивно меченый

Р-ёСТР на этапе ПЦР нуклеотид включался в ДНК, что было установлено как радиохроматографией, так и последующей радиоавтографией (рис. 2).

Рисунок 2.

Сканирование и радиоавтография агарозного геля с 32Р-(1СТР, включенным в кДНК Е48 (130 п.о.) линии А431

Л / \

7

А.

Б.

А. Сканер для радиохроматографии

Б. Радиоавтография

ЬВ2722-2 (ВЕКТНОЬО, Германия) с проточным детектором ЬВ6280 и системой обработки данных (интегратором) НР3396А.

Определение порога чувствительности радиоактивного мечения проводили на линии А431. РНК, выделенную из 100000 клеток А431, последовательно разводили и проводили обратную транскрипцию. Радиоактивно меченый нуклеотид (32Р-аСТР) добавляли на этапе ПЦР-амплификации кДНК, полностью замещая им холодный дезоксицитидинтрифосфат. Последующий электрофорез в агарозном геле проводили по стандартной методике. Мы использовали электрофоретический Саузерн-блоттинг (рис. 3), который позволяет проводить реакцию в более короткое время и избежать диффузии снижающей чувствительность метода. Это особенно ценно при определении мРНК единичных опухолевых клеток. Эффективность электрофоретического переноса продуктов ПЦР из агарозного геля на мембрану НуЬопс! N4- показана на рисунке 3.

Рисунок 3.

Эффективность переноса амплифицированной кДНК Е48 (130 и.о.) методом Саузерн-блоттинга из агарозного геля на мембрану после электрофоретического разделения продуктов ПЦР.

А.вимшииа Б.

Пояснения к рисунку 3: А - агарозный гель после разделения продуктов ПЦР. Б -мембрана НуЬош! Ы+ после переноса на нее продуктов ПЦР с геля А. На первой (правой дорожке маркеры мол. массы), вторая дорожка пустая, третья дорожка -продукт амплификации кДНК Е48, по молекулярной массе соответствует 130 п.о. Рисунок демонстрирует высокую эффективность электрофоретического переноса на мембрану.

Использование радиоактивной метки и электрофоретического Саузерн-блотинг повышает чувствительность обнаружения до 1 клетки А431. Это видно как на примере гена, так и кДНК Е48 (рис.4).

Рисунок 4.

Сравнение чувствительности выявления мРНК Е48 радиоактивным методом и в обычной ПЦР.

Пояснение к рисунку 4. На рисунках А. и Б. первая дорожка (правая) соответствует маркеру, вторая - геномной ДНК Е48 (908 п.о.), третья - кДНК Е48 (130 п.о.). А. - радиоактивное проявление мембраны. Б. - мембрана после электрофоретического переноса продуктов ПЦР из агарозного геля (окрашивание этидиумом бромидом). На рис. А. первая дорожка не видна, т.к. маркеры не являются радиомечеными. Рисунок Б. демонстрирует значительное усиление сигнала после радиоавтографии.

Однако использование радиактивной метки имеет ряд ограничений: радиоактивность, изотоп короткоживущий - период полураспада 32Р - 2 недели, что требует регулярных поставок, а это невозможно планировать с учетом поступления больных.

Все это сделало необходимым поиск более чувствительных нерадиоактивных методов. Для этого потребовалось придание ДНК иммуногенпости. В качестве иммуногена использовали BrdUTP (бромдезоксиуридин-трифосфата) При оценки эффективности включения в продукт ПЦР видно его включение в продукты с различной молекулярной массой: 130 п.о. - кДНК Е48, 210 п.о - кДНК бета глобина (стандартно используемая для оценки качества РНК), 908 п.о. - ДНК гена Е48 с интроном (рис. 5).

Рисунок 5.

Включение BrdUTP (вместо dTTP) в продукт ПЦР. III. II. I.

I. 908 п.о. - ген Е48

II. 210 п.о. - бета-глобин

III. 130 п.о. - кДНК Е48

Таким образом, использование ВгёиТР на этапе ПЦР позволяет эффективно выявлять ПЦР-продукты с различной молекулярной массой - 130 п.о., 210 п.о., 908 п.о. Однако в этих экспериментах не исключена возможность включения нуклеотидов (ёТТР), использовавшихся на этапе обратной транскрипции, синтеза кДНК Е48.

Прямое подтверждение включения ВгсШТР и иммуногенности продукта ПЦР может быть получено только иммунологически.

Поскольку любое иммунопроявление требует многократных отмывок от несвязавшихся антител, то необходима дополнительная фиксация ДНК к мембране, что в нашем случае было осуществлено с помощью ультрафиолета (рис. 6).

Рисунок 6.

Фиксация ДНК с включенным ВпШТР ультрафиолетовым облучением.

Мембрана после Фиксация УФ

блоттинга (фрагмент мембраны, увеличение)

После отмывок и нанесения флуоресцирующих антител к BrdU проводилось сканирование мембраны на приборе Typhoon 9440 (лазер 488нм, детектировали излучение 532 нм) в ГУ НИИ биомедицинской химии имени В.Н.Ореховича РАМН (рис. 7).

Рисунок 7.

Иммунолюминисцентное проявление BRDU, включенного в кДНК Е48.

Сканирование мембраны (Typhoon 9410).

Пояснения к рисунку 7. А. — мембрана после электрофоретического иммуноблоттинга: справа-налево - маркер молекулярной массы, геномная ДНК Е48

(908 п.о.), кДНК Е48 (130 п.о.), этидиум бромид. Б. - фрагмент мембраны с полосой кДНК Е48 после окрашивания FITC-мечеными антителами к BRDU, отмывок и проявления на приборе Typhoon 9440.

Таким образом, продукт ПЦР с включенным BRDU выявляется с помощью флуоресцирующих антител прямым конъюгатом анти-BRDU-FITC (BD, USA), (рис.7).

По данным литературы флуоресцентное окрашивание уступает иммуноферментному по чувствительности в несколько раз. Это хорошо известно как из иммуногистохимического опыта окрашивания тканей, так и из использования иммуноферментного окрашивания продуктов ПЦР с хемилюминисцентной детекцией сигнала. По данным литературы (Dakhama А., 1996) чувствительность иммуноферментного метода соответствует чувствительности метода детекции мРНК с радиоактивной гибридизацией (32P-dCTP). По этим причинам мы оценили возможность использования непрямого иммуноферментного метода для выявления BRDU-меченой кДНК Е48. В качестве субстрата в этих случаях стандартно используется ECL.

Проведение исследований на модельной системе - линии клеток А431 - с использованием разведений РНК и добавления различных количеств клеток к нормальному костному мозгу позволило установить, что данным методом возможно обнаруживать 1 клетку А431 среди 10 млн миелокариоцитов костного мозга. В 11 контрольных образцах костного мозга (здоровые лица больные гемобластозами) сигнал Е48 не обнаружено (исследовали от 5x106 - 3x107 миелокариоцитов).

Рисунок S.

Высокая чувствительность хемилюминесцентного проявления (линия А431).

Этидиум бромид ECL, проявка

после отмывок (А) на мембране (Б)

Пояснения к рисунку 8. А. - нейлоновая мембрана Hybond N+ после непрямого иммуноферментного окрашивания и отмывок перенесенной Саузерн-блоттингом амплифицированной кДНК Е48, ДНК-окрашивание этидиумом бромидом. Б. -фотопленка после хемилюминисцентного проявления связавшихся с ДНК антител, меченых пероксидазой хрена. Видно значительное усиление сигнала.

Иммуноферментное проявление ВгсШТР, включенного в продукт ОТ-ПЦР, после Саузерн-блоггинга с использованием в качестве субстрата ЕСЬ значительно повышает чувствительность обнаружения метастатических клеток ПРГШ в костном мозге, позволяет выделять мРНК из 1 клетки.

Таким образом, нами разработан высокочувствительный нерадиоактивный метод детекции экспрессии мРНК Е48, включающий 16 этапов. Разумеется, данный метод является многоэтапным и достаточно трудоемким:

1. Выделение общей РНК

2. Проведение обратной транскрипции

3. Проведение ПЦР с включением ВпШТР вместо сЛТР

4. Разделение продуктов ПЦР электрофорезом в агарозном геле

5. Электрофоретический Саузерн-блотгинг, перенос продуктов ПЦР на нейлоновую мембрану

6. Высушивание мембраны

7. Фиксация ДНК к мембране ультрафиолетовым облучением

8. Блокирование неспецифического связывания антител

9. Обработка мембраны антителами к ВШЗЫ

10. Отмывки от несвязавшихся антител

11. Нанесение вторичных антител, меченных пероксидазой хрена

12. Отмывки от несвязавшихся антител

13. Нанесение субстрата ЕСЬ

14. Помещение мембраны в тонкую пленку (избежать контакт влажной мембраны с фотопленкой)

15. Экспозиция с выокочувствительной фотопленкой в специальных кассетах

16. Проявка фотопленки.

Подводя итог этому разделу работы, можно отметить, что нами оценен ряд методов, позволяющих повысить чувствительность обнаружения амплифицированной кДНК Е48. Наиболее приемлемыми с точки зрения возможности обнаружения одной метастатической клетки ПРГЩ среди 10 млн миелокариоцитов явились радиоактивный метод и иммуноферментный метод с усилением хемшпоминисцентного сигнала (ЕСЬ).

С использованием высокочувствительных методов исследование проведено у 19 больных ПРГЩ (0,44 - 5,4 х Ю7 миелокариоцитов). В 2 случаях из 19 было отмечено низкое качество РНК (не было сигнала мРНК р-глобина). Из 17 оставшихся пациентов

у 6 (35,3%) выявлен продукт экспрессии Е48, 130 пар оснований (в позитивных случаях изучено 1,1 -2,7 х 107 миелокариоцитов).

2. Характеристика гемопоэза при ПРГШ.

Возникновение опухоли и её дальнейшее развитие приводит к разнообразным клиническим проявлениям в организме в целом. Сложный комплекс биологически активных веществ, продуцируемых опухолью, оказывает влияние на системы и органы человека, в том числе на гемопоэз.

Анализ 41 аспирата костного мозга показал, что миелограммы больных независимо от числа миелокариоцитов характеризуется уменьшением содержания молодых форм и увеличением - зрелых элементов нейтрофильного ряда (в сравнении с нормой), без изменения индекса созревания нейтрофилов и процента клеток гранулоцитарного ростка (диаграмма 2).

■ nvyivid i iur\aja i cjich duiripaid

нормальная клеточность аспирата s¡ сниженная клеточность аспирата

Число моноцитов и лимфоцитов было достоверно выше нормы у больных с нормальной и сниженной клеточностью, р=0,05 (диаграмма 3).

Диаграмма 2.

Изменение клеточного состава гранулоцитарного ростка.

Диаграмма 3.

Уровень содержания моноцитов и лимфоцитов в костном мозге больных ПРГШ.

Лимфоциты Моноциты

нормальная клеточность аспирата

норма показателей аспирата

клеточность аспирата

При сравнении с нормой показателей клеток эритроидного ростка было выявлено снижение базофильных и полихроматофильных нормобластов с одновременным повышенным содержанием оксифильных форм (р=0,05), что привело к увеличению индекса созревания эритроидных клеток. При этом сумма клеток эритроидного ряда не выходила за пределы нормальных значений (диаграмма 4).

Диаграмма 4.

Редукция клеток эритроидного ряда.

В группе больных с поражением костного мозга (МТС+) отмечено достоверно повышение суммарного количества клеток гранулоцитарного ростка до 72% в сравнении с пациентами без микрометастазов в костном мозге (МТС-) за счет всех (зрелых и незрелых) морфологически распознаваемых форм (диаграмма 5).

Диаграмма 5.

Суммарное количество клеток гранулоцитарного ряда в двух группах больных ПРГШ.

Р=0,03

| я 75 ■ „--г*-----~ 72,3

1а ш ° 70 | ------ Ш 67<6

1 ° 1е 1 65 У 616^

0 5 ° ? 1 2 з-1 60 } |Щ

1 » 5 а > 1- и 55 я МТС + «вадЗДа ш _______;; ■— / / а МТС- норма' """.................

Учитывая данные изменения, закономерным является снижение показателя индекса созревания нейтрофилов (среднее значение нормы - 0,6). В каждой группе отмечено снижение индекса созревания нейтрофилов до 0,4 (р=0,76).

Уровень лимфоцитов у больных с микрометастазами не отличался от нормы, что отличает этих пациентов от общей группы больных плоскоклеточным раком и косвенно свидетельствует об отсутствии разбавления периферической кровью (диаграмма 6).

Диаграмма 6.

Частота повышения уровня лимфоцитов в костном мозге двух групп больных

ПРГШ.

Суммарное количество клеток эритроидного ростка в костном мозге двух группах (МТС+ и МТС-) достоверно не различалось, различия касались изолированно только полихроматофильных нормобластов (4,6±1,2 и 8,0±1,2 соответственно, р=0,02).

При выявлении микрометастазов процентное содержание этих клеток было достоверно снижено и не было ни одного случая, где бы эти клетки были в нормальных пределах (диаграмма 7).

Диаграмма 7.

Частота снижения уровня полихроматофильных нормобластов в костном мозге двух групп больных ПРГШ.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о существовании отличий в показателях костномозгового кроветворения у больных ПРГШ в сравнении с нормой.

3. Взаимосвязь показателей гемопозза с клиническими и морфологическими характеристиками опухоли.

Особенностей костномозгового кроветворения в зависимости от пола и возраста больных не выявлено.

Нами установлено, что локализация опухолевого процесса имела ограниченную связь с показателями миелограмм. При раке ротоглотки отмечено снижение уровня миелоцитов (р=0,03) и повышенное содержание лимфоцитов (р=0,04). Следует отметить, что при проведении молекулярного исследования костного мозга, наибольшую группу представляли больные раком языка. Нами оценены две группы, включающие поражение языка (п=8) и все остальные локализации - ротоглотка (п=2), гортаноглотка (п=2), слизистая оболочка полости рта (п=5), (табл. 3).

Таблица 3.

Выявление микрометастазов в зависимости от локализации опухолевого

процесса.

Микрометастазы Локализация опухолевого процесса Хи- квадрат Р

рак языка все остальные

присутствие 4 (50,0%)* 2 (22,0%)* 1,431 0,232

отсутствие 4 (50,0%)* 7 (78,0%)*

'Процент в столбце.

Наиболее часто микрометастазы в костном мозге выявляются при раке языка (в 2,5 раза чаще, чем при других локализациях), однако, в нашем исследовании мы не получили корреляции между наличием микрометастазов в костном мозге и локализацией опухолевого процесса (р=0,232).

В зависимости от размера первичной опухоли было выявлено нарушение дифференцировки эритрокариоцитов без изменения их процентного содержания (21,8±2,9%) в миелограмме при размере опухоли Т4 и изолированное повышение оксифильных нормобластов (11,5%), р<0,05 в этой группе, что достоверно отличается

от содержания этих элементов в нормальном костном мозге и у больных с размером опухоли Т2 и ТЗ (диаграмма 8).

Диаграмма 8.

Влияние размера первичной опухоли на эритроидный росток.

Объем первичной опухоли не имел статистической взаимосвязи с наличием микрометастазов ПРГШ в костном мозге (табл. 4).

Таблица 4.

Первичный объем опухоли и поражение костного мозга.

Размер первичной опухоли Наличие микрометастазов Хи- квадрат Р

присутствие отсутствие

Т2 3 (42,9%) 4(57,1%) 1,466 0,481

ТЗ 1 (16,7%) 5 (83,2%)

Т4 2 (50%) 2 (50%)

Обращает на себя внимание тот факт, что микрометастазы в костном мозге могут обнаруживаться даже при опухолях небольшого размера (Т2).

Нами оценены аспираты костного мозга больных с поражением регионарных лимфатических узлов и без такового. Существенных различий в показателях клеточного состава костного мозга выявлено не было (р>0,05). Различия определялись только в количестве миелокариоцитов (24,3x109/л и 48,1х109/л, соответственно, р=0,01). В зависимости от размера и количества пораженных лимфатических узлов отмечено

27

снижение уровня миелокариоцитов при N0 (24,3±3,7х109/л против N1 - 46,5±8,3 и N2 -47,6±15,6, соответственно, р<0,05), (табл. 5).

Таблица 5.

Клеточность костного мозга в зависимости от статуса лимфатических узлов

(N0 и N1).

Клеточность костного мозга Регионарные метастазы Хи- квадрат Р

N0 N1

Сниженная 9(64,3%) 1(9,1%) 7,819 0,005

Нормальная 5(35,7%) 10(90,9%)

При сравнении двух групп больных с поражением лимфатических узлов (III и IV стадии) с положительным сигналом Е48 в костном мозге и при отсутствии мРНК Е48 поражение регионарных лимфатических узлов (N1 - N3) наблюдалось чаще в группе больных с присутствием микрометастазов в костном мозге, р=0,046 (табл. 6).

Таблица 6.

Поражение регионарных лимфатических узлов (N1 -N3) и микрометастазы в

костном мозге.

Микрометастазы Поражение регионарных лимфатических узлов Хи- квадрат Р

нет есть

КМ + 0(0%) 4(100%) 2,0 0,046

КМ- 3 (37,5%) 5 (62,5%)

Стадия опухолевого процесса в большей степени определяет прогноз течения заболевания, так как включает совокупность двух критериев: локальное распространение и поражение зон регионарного метастазирования. При сопоставлении показателей миелограмм при разных стадиях (II, III, IV, а также IVa - IVb) опухолевого процесса статистически достоверных различий получено не было. Также нами не установлено взаимосвязи микрометастатического поражения костного мозга со стадией заболевания ПРГШ (р=0,78).

Степень диффереттровки опухолевых клеток плоскоклеточного рака имеет достоверную взаимосвязь с особенностями костномозгового кроветворения у больных ПРГШ. Так, для низкодифференцированного рака оказалось характерным резкое снижение клеточности костного мозга (14,5х103/мкл, р=0,091) и изолированное

снижение уровня метамиелоцитов (5,3%, р=0,049) в сравнении с умеренно дифференцированным раком (диаграмма 9).

Диагралша 9.

Влияние степени дифференцировки первичной опухоли на показатели аспирата костного мозга.

45,1

I 1

шмиелокариоциты

умеренная

степень дифференцировки опухолевых клеток низкая

Нами был проведен анализ миелограмм больных в зависимости от дальнейшего течения опухолевого процесса после проведенного лечения.

Таким образом, прогрессирование опухолевого процесса отмечено у 12 больных. Сравнение миелограмм в двух группах больных (с прогрессированием опухоли, п=12 и без такового, п=28) выявило изменения в отдельных показателях аспиратов. В группе больных с прогрессированием опухолевого процесса определялось снижение клеточности костного мозга практически в 2 раза в сравнении с группой больных без прогрессирования (27,1±5,2 и 46,0±8,5, соответственно), однако статистически достоверных различий по группам не получено, р=0,17. Кроме того, уровень молодых клеток гранулоцитарного ростка -промиелоцитов у больных с прогрессированием опухоли был снижен и составил 0,017±0,01, в то время как без прогрессирования - 0,3±0,06, р=0,016.

Молекулярный анализ аспиратов костного мозга показал, что в группе с положительным сигналом Е48 частота прогрессирования болезни составила 50%, в то время как без поражения костного мозга прогрессирование опухолевого процесса наблюдалось в 9,1%, р=0,057 (табл. 8).

Таблица 8.

Взаимосвязь прогрессирования опухолевого процесса с присутствием микрометастазов в костном мозге больных.

Микрометастазы Прогрессирование опухолевого процесса Хи- квадрат Р

нет есть

КМ- 10(90,9%) 1 (9,1%) 3,61 0,057

КМ + 3 (50%) 3 (50%)

Подводя итог вышеизложенному, изменения, в миелограммах больных ПРГШ могут свидетельствовать о своего рода реакции костного мозга на опухолевый рост, что согласуется с современным представлениям о влиянии опухолевых клеток на костномозговое кроветворение. В случаях с выявленными микрометастазами эти изменения носят более очерченный характер и заключаются в увеличении суммарного содержания клеток гранулоцитарного ростка и снижении полихроматофильных нормобластов при нормальном уровне лимфоцитов и ряда других клеток костного мозга. Патогенетической причиной этих изменений, возможно, является продукция опухолевыми клетками комплекса биологически активных веществ, которые влияют на костномозговое кроветворение. Кроме того, эти изменения возможно расценить, как проявление местного иммунного ответа на присутствие чужеродного компонента в костном мозге больных ПРГШ.

Выводы

1. Особенности кроветворения у больных плоско клеточным раком головы и шеи обусловлены клиническими, морфологическими параметрами и наличием единичных опухолевых клеток (микрометастазов) в костном мозге вне зависимости от его клеточности.

2. Клеточный состав костного мозга больных ПРГШ отличается от нормы увеличением относительного содержания сегментоядерных нейтрофилов (27,4±1,9 и 17,8±0,65, р<0,05), снижением уровней молодых элементов гранулоцитарного ряда (промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов) без изменения индекса созревания нейтрофилов и процента клеток гранулоцитарного ростка в миелограмме.

3. У больных ПРГШ отмечается достоверная редукция эритроидного ростка костного мозга в сравнении с нормой (16,7±1,5% и 21,1±0,73%, р<0,05 ), что ведет к достоверному повышению лейко-эритробластического соотношения (7,2±1,5 и 3,25±0,16, р<0,05). Характерным является увеличение индекса созревания эритроидных клеток (0,95±0,02 и 0,78±0,01, р<0,05) на фоне снижения базофильных и полихроматофильных нормобластов и относительного повышения оксифильных форм.

4. У больных местнораспространенным плоскоклеточным раком головы и шеи (Т4) выявленные изменения характеризуются нарушением дифференцировки эритрокариоцитов без изменения их процентного содержания в миелограмме (в среднем 21,8±2,9%). Наблюдается изолированное повышение оксифильных нормобластов (в среднем 11,5±1,5%), что достоверно отличается от содержания этих элементов в нормальном костном мозге и в костном мозге больных с размером опухоли Т2 и ТЗ (р<0,05).

5. Степень дифференцировки опухолевых клеток имеет достоверную взаимосвязь с особенностями костномозгового кроветворения у больных плоскоклеточным раком головы и шеи. В особую группу выделяется низкодифференцированный рак, именно для этой формы заболевания характерно резкое снижение клеточности костного мозга (в среднем до 14,5х109 миелокариоцитов/л) с изолированным достоверным уменьшением процентного содержания метамиелоцитов в сравнении с умеренно дифференцированным ПРГШ (5,3±1,3% и 8,6±0,8%, р=0,049).

6. Метастатические клетки ПРГШ не выявляются в пунктатах костного мозга морфологическими методами и использованием полимеразной цепной реакции с

обратной транскрипцией (экспрессия мРНК специфического белка плоскоклеточного рака головы и шеи Е48).

7. Повышение чувствительности метода детекции мРНК Е48 введением радиоактивно меченых нуклеотидов или включением BrdUTP с последующим иммуноферментным окрашиванием после Саузерн-блоттинга и хемилюминисцентным проявлением позволяет выявить микрометастазы ПРГШ в костном мозге у 35,3% больных.

8. Больные с выявленными микрометастазами в костном мозге имеют ряд особенностей гемопоэза в сравнении с остальными пациентами: достоверное повышение содержания клеток гранулоцитарного ряда (72,3% и 61,6%, р=0,03) при отсутствии лимфоцитоза в костном мозге (р=0,05), достоверное снижение у всех больных уровня полихроматофильных нормобластов (4,6% и 8,4%, р=0,02).

9. Обнаружение микрометастазов в костном мозге больных ПРГШ ассоциируется с большей частотой поражения регионарных лимфатических узлов при III и IV стадиях заболевания (100% и 62,5%, р=0,046) и более частым прогрессированием болезни в сроки до 9 мес. (50% и 9,1%, р=0,057).

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Тимонина Е.Г., Френкель М.А., Колбацкая О.П., Подвязников С.О. Характеристика гемопоэза у больных плоскоклеточным раком головы и шеи. // 2009г.

— Вестник РОНЦ им. H.H. Блохина. — Том 20, №3. — с. 32—35.

2. Тимонина Е.Г., Подвязников С.О., Чегринец О. А., Колбацкая О. П., Спиридонова В. А., Жарова 3. Д., Трещалина Е. М., Григорьева Е. Ю., Тупицын Н. Н. Молекулярная диагностика костномозговых микрометастазов плоскоклеточного рака головы и шеи. // Материалы II Российского симпозиума «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека». — Москва. — 22-23 января 2009г.

— с.ЗО.

3. Тимонина Е.Г., Подвязников С.О., Чегринец О. А., Колбацкая О. П., Спиридонова В. А., Жарова 3. Д., Трещалина Е. М., Григорьева Е. Ю., Тупицын Н. П. Молекулярная диагностика костномозговых мнкрометастазов плоскоклеточного рака головы и шеи. // Вестник РОНЦ им. H.H. Блохина. — 2009г. — том 20, №1. — стр.104.

4. Тимонина Е.Г., Подвязников С.О., Чегринец О. А., Френкель М.А., Колбацкая О. П., Тупицын H.H. Особенности гемопоэза у больных плоскоклеточным раком головы и шеи (ПРГШ) при наличии костномозговых микрометастазов. // Онкохирургия. — 2009г. — Том1, №2. — стр.92. —Материалы III международного конгресса «Опухоли головы и шеи». — Сочи. — 3-4 мая 2009г.

5. Тимонина Е.Г., Тупицын H.H., Подвязников С.О. Результаты молекулярного исследования костного мозга больных плоскоклеточным раком головы и шеи (ПРГ111). // Вестник РОНЦ им. H.H. Блохина. — 2009г. — том 20, приложение 1. — Материалы Евразийского конгресс «Опухоли головы и шеи». — Минск. — 16-18 июля 2009г.

Подписано в печать 24.09.09 Формат 60x84/16. Бумага офсетная.

_Заказ № 713 Тираж 100 экз. _

Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Злокачественные опухоли головы и шеи составляют до 5% всех новообразований [19]. Среди злокачественных опухолей головы и шеи с гистологическим вариантом плоскоклеточного рака число больных достигает до 90%. По данным ВОЗ ежегодно выявляется 551000 больных с первичным раком головы и шеи, при этом 217000 - погибают в первый год наблюдения. Несмотря на современные методы диагностики, в России до 60% больных с этой локализацией поступают в специализированные лечебные учреждения с местно-распространенным процессом [7]. За последние 10 лет отмечаются успехи современных методов лечения плоскоклеточного рака головы и шеи (ПРГТИ), однако, отдаленные результаты остаются неудовлетворительными.

Развитие локорегионарных метастазов, рецидива болезни и в отдельных случаях отдаленных метастазов подтолкнуло клиницистов к изучению факторов прогноза при ПРГШ, в частности таких как: пол и возраст больных, локализации и распространенности опухолевого процесса, формы роста опухоли [13, 17, 91]. В последующие годы вышел ряд научных работ, посвященных определению морфологических и биологических характеристик опухолевого процесса, определению популяционного состава и кинетических характеристик опухолевых клеток методом проточной ДНК-цитометрии, позволяющих характеризовать биологические свойства опухолей [1, 23, 24]. Однако мнения авторов далеко не однозначны. Ведущими факторами прогноза остается распространенность опухолевого процесса: размер опухоли, наличие метастазов рака в регионарные лимфатические узлы, а также локализация опухоли орофарингеальной области и степень дифференцировки клеток плоскоклеточного рака.

Ряд исследований, проведенных в некоторых исследовательских центрах [48, 130], показали, что более достоверная информация о распространенности опухолевого процесса может быть получена при исследовании костного мозга.

Роль костного мозга, как возможной мишени гематогенного метастазирования, доказана при многих опухолях эпителиальной природы. Наиболее детально изучено поражение костного мозга при раке молочной железы, до 47 - 62, 5% случаев [9, 81, 104, 175]. В публикациях описаны случаи костномозговых микрометастазов при раке предстательной железы (54% - 85% случаев), немелкоклеточном раке легкого (32% - 40%), раке почки (28% - 40%), колоректальном раке (8% - 13%) [40, 83, 119, 123, 158, 174].

Микрометастазирование в костный мозг при ПРГШ не изучалось. И только в 1999 году была опубликована научная работа Brakenhoff et al. [35], в которой отмечено, что наличие небольших опухолевых кластеров или единичных опухолевых клеток в костном мозге больных различными эпителиальными опухолями можно установить методами цитохимии и молекулярной биологии, а именно, полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Кроме того, наиболее часто используются тканеспецифичные маркерные антигены, такие как цитокератины. Специфичным для выявления метастатических клеток ПРГШ является экспрессия гена Е48 на уровне мРНК в ОТ-ПЦР, которая позволяет обнаруживать метастатические клетки в костном мозге и периферической крови больных ПРГШ с высокой чувствительностью и специфичностью 1 опухолевая клетка среди 10 миллионов миелокариоцитов.

В* дальнейшем присутствие микрометастазов в костном мозге, в плане вероятного фактора прогноза ПРГШ, было продемонстрировано Colnot D.R. et al. (2004) [48]. Авторами показана экспрессия гена Е48 клетками костномозгового пунктата в 40% случаев у больных ПРГШ. Отмечено, что обнаружение мРНК-транскриптов гена Е48 в костном мозге больных ПРГШ сопряжено с неблагоприятным- прогнозом. Так же показано, что выживаемость больных ПРГШ с поражением не менее двух метастатических лимфатических узлов достоверно снижается при наличии микрометастазов в 5 костном мозге (р=0,02). Эти данные указывают на возможность более точного стадирования опухолевого процесса, более точную объективную оценку групп больных, нуждающихся в проведении дополнительных лечебных мероприятий.

Наличие небольших опухолевых кластеров или единичных опухолевых клеток в костном мозге больных различными эпителиальными опухолями устанавливается методами цитохимии и молекулярной биологии, а именно, полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Кроме того, наиболее часто используются тканеспецифичные маркерные антигены, такие как цитокератины.

Специфика опухолевого роста гистогенетически различных опухолей приводит к разнообразным клиническим проявлениям в организме в целом, том числе в системе кроветворения. Следует отметить, что гемопоэз больных ПРГШ ранее детально не изучался, тем более в группах больных с присутствием опухолевых клеток в костном мозге.

Все вышеизложенное послужило основанием' для проведения исследования костного мозга в плане вероятного выявления микрометастазов в костный мозг и оценки показателей гемопоэза у больных ПРГШ с целью уточнения истинной распространенности опухолевого процесса.

Цель исследования^

Выявить особенности гемопоэза в зависимости от клинических, морфологических параметров опухоли и наличия костномозговых микрометастазов у больных ПРГШ.

Задачи исследования^

1. Оценить показатели кроветворения у больных плоскоклеточным! раком головы и,шеи.

2. Изучить клинико-гематологические особенности у больных ПРГШ.

3. Определить значимость методов диагностики в выявлении микрометастазов в костный мозг у больных ПРГШ.

4. Выявить частоту поражения костного мозга микрометастазами ПРГШ на уровне экспрессии мРНК Е48.

5. Оценить показатели миелограмм у больных ПРГШ при наличии положительного сигнала Е48.

6. Изучить особенности клинического течения ПРГШ в группах больных с наличием и отсутствием микрометастазов в костном мозге.

Научная новизна

Впервые в России выявлены изменения клеточного состава костного мозга больных ПРГШ, которые заключаются в увеличении относительного содержания сегментоядерных нейтрофилов (27,4±1,9 и 17,8 ± 0,65, р<0,05), снижении уровней молодых форм гранулоцитарного ряда (промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов) без изменения индекса созревания нейтрофилов и процента клеток гранулоцитарного ростка. Для низкодифференцированного ПРГШ характерной является гипоклеточность костного мозга (в среднем 14,5 х 109/л).

Установлено, что достоверное повышение лейко-эритробластического соотношения (7,2 ± 1,5 и 3,25 ± 0,16, р<0,05) в костном мозге больных ПРГШ обусловлено редукцией эритроидного ряда в сравнении с нормой (16,7 ±

1,5% и 21,1 ± 0,73%, р<0,05 ). Впервые показано, что индекс созревания эритроидных клеток повышен (0,95 ± 0,02 и 0,78 ± 0,01, р<0,05) за счет увеличения процента оксифильных нормобластов в костном мозге больных с местнораспространенным ПРГШ.

Впервые в России отработан высокочувствительный метод детекции мРНК специфического белка плоскоклеточного рака Е48, с использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией, Саузерн7 блотингом и последующим иммуноферментным или иммунофлуоресцентным проявлением. Этот метод позволяет выявить микрометастазы в костном мозге 35% больных ПРГШ.

У больных с выявленными микрометастазами в костном мозге определено достоверное снижение пропорции полихроматофильных нормобластов (4,6% и 8,4%, р=0,02) и достоверное повышение уровня клеток гранулоцитарного ряда (72,3% и 61,6%, р=0,03) при нормальных показателях лимфоцитов и других клеточных элементов миелограмм (р=0,05).

Установлено, что при наличии поражения регионарных лимфатических узлов достоверно чаще выявляются микрометастазы в костном мозге больных ПРГШ и наблюдалось прогрессирование опухоли в сроки до 9 мес.

Практическая значимость

Молекулярный метод ОТ-ПЦР с иммуноферментным или иммунофлуоресцентным проявлением, отработанный в настоящем исследовании, позволяет выявить микрометастазы в костном мозге 35% больных ПРГШ, что свидетельствует о гематогенном метастазировании опухолевых клеток и позволяет судить об истинном распространении опухоли, а также выявить группу больных с неблагоприятным течением болезни. В работе оценена реакция кроветворной системы больных ПРГШ на опухолевый рост, в том числе в группе больных с выявленными микрометастазами. Полученные результаты исследования могут явится дополнительным фактором прогноза ПРГШ при определении группы больных с повышенным риском прогрессирования опухолевого процесса и позволят провести отбор больных для проведения дополнительных методов противоопухолевого лечения.

выводы

1. Особенности кроветворения у больных плоскоклеточным раком головы и шеи обусловлены клиническими, морфологическими параметрами и наличием единичных опухолевых клеток (микрометастазов) в костном мозге вне зависимости от его клеточности.

2. Клеточный состав костного мозга больных ПРПП отличается от нормы увеличением относительного содержания сегментоядерных нейтрофилов (27,4±1,9 и 17,8±0,65, р<0,05), снижением уровней молодых элементов гранулоцитарного ряда (промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов) без изменения индекса созревания нейтрофилов и процента клеток гранулоцитарного ростка в миелограмме.

3. У больных ПРГШ отмечается достоверная редукция эритроидного ростка костного мозга в сравнении с нормой (16,7±1,5% и 21,1±0,73%, р<0,05 ), что ведет к достоверному повышению лейко-эритробластического соотношения (7,2±1,5 и 3,25±0,16, р<0,05). Характерным является увеличение индекса созревания эритроидных клеток (0,95±0,02 и 0,78±0,01, р<0,05) на фоне снижения базофильных и полихроматофильных нормобластов и относительного повышения оксифильных форм.

4. У больных местнораспространенным плоскоклеточным раком головы и шеи (Т4) выявленные изменения характеризуются нарушением дифференцировки эритрокариоцитов без изменения их процентного содержания в миелограмме (в среднем 21,8±2,9%). Наблюдается изолированное повышение оксифильных нормобластов (в среднем 11,5±1,5%), что достоверно отличается от содержания этих элементов в нормальном костном мозге и в костном мозге больных с размером опухоли Т2 и ТЗ (р<0,05).

5. Степень дифференцировки опухолевых клеток имеет достоверную взаимосвязь с особенностями костномозгового кроветворения у больных плоскоклеточным раком головы и шеи. В особую группу выделяется низкодифференцированный рак, именно для этой формы заболевания характерно резкое снижение клеточности костного мозга ( в среднем до 14,5x109 миелокариоцитов/л) с изолированным достоверным уменьшением процентного содержания метамиелоцитов в сравнении с умеренно дифференцированным ПРГШ (5,3+1,3% и 8,6+0,8%, р=0,049).

6. Метастатические клетки ПРГШ не выявляются в пунктатах костного мозга морфологическими методами и использованием полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (экспрессия мРНК специфического белка плоскоклеточного рака головы и шеи Е48).

7. Повышение чувствительности метода детекции мРНК Е48 введением радиоактивно меченых нуклеотидов или включением BrdUTP с последующим иммуноферментным окрашиванием после Саузерн-блоттинга и хемилюминисцентным проявлением позволяет выявить микрометастазы ПРГШ в костном мозге у 35,3% больных.

8. Больные с выявленными микрометастазами в костном мозге имеют ряд особенностей гемопоэза в сравнении с остальными пациентами: достоверное повышение содержания клеток гранулоцитарного ряда (72,3% и 61,6%, р=0,03) при отсутствии лимфоцитоза в костном мозге (р=0,05), достоверное снижение у всех больных уровня полихроматофильных нормобластов (4,6% и 8,4%, р=0,02).

9. Обнаружение микрометастазов в костном мозге больных ПРГШ ассоциируется с большей частотой поражения регионарных лимфатических узлов при III и IV стадиях заболевания (100% и 62,5%, р=0,046) и более частым прогрессированием болезни в сроки до 9 мес. (50% и 9,1%, р=0,057).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Распространение опухолевых клеток по костному мозгу предполагает гематогенную диссеминацию опухоли, и в дальнейшем приводит к прогрессированию заболевания.

Применение новых методов диагностики в изучении распространения опухолевого процесса по организму, является одним из важных направлений в онкологии.

Выявление метастатических клеток плоскоклеточного рака головы и шеи в костном мозге представляет определенные трудности. Как показали наши исследования морфологический (цитологический) метод на материале аспирационной биопсии не является адекватным методом диагностики костномозговых метастазов ПРГШ. Это обусловлено тем, что количество метастатических клеток в пунктатах костного мозга больных ПРГШ чрезвычайно мало, порядка одной клетки среди 10 миллионов о миелокариоцитов, при средней клеточности костного мозга 100x10 /мкл, что соответствует 100 мкл нормоклеточного костного мозга. Следует отметить, что в молекулярных исследованиях предпочтение отдается количеству исследуемых миелокариоцитов. Именно такой порог чувствительности (1 клетка на 10 млн миелокариоцитов) позволяет обнаруживать поражение костного мозга при ПРГШ примерно в 35-40% случаев, и только при достижении такой чувствительности исследование костного мозга имеет клиническое значение [48].

До сих пор, подобные работы проводились только за рубежом. В России это первое исследование возможного гематогенного распространения опухолевых клеток при ПРГШ. Нами на базе НИИ Клинической онкологии РОНЦ им. Блохина РАМН, проведено молекулярное исследование костного мозга у 41 больного ПРГШ различных стадий. РНК выделяли из 4,4 - 54 миллионов миелокариоцитов.

Всем больным определена экспрессия гена Е48 в ОТ-ПЦР. Ни в одном из изученных образцов костного мозга стандартной ОТ-ПЦР (окраска продукта этидиумом бромидом) не выявлено микрометастазов.

Нами оценен ряд методов, позволяющих повысить чувствительность обнаружения амплифицированной кДНК Е48, и разработан молекулярно-биологический метод обнаружения одной метастатической клетки ПРГШ среди Юмлн миелокариоцитов. Такими методами явились радиоактивный метод и иммуноферментный метод с усилением хемилюминисцентного сигнала (ECL). Однако эти методы многоэтапны и достаточно трудоемки, но обладают высокой чувствительностью.

По мнению многих авторов [48, 130], прогрессирование опухолевого процесса у больных с выявленными микрометастазами в костном мозге, связано с гематогенным распространением опухолевых клеток, ассоциированного с поражением регионарных лимфатических узлов, что зачастую приводит к формированию отдаленных метастазов [28, 55, 97, 101]. Возникновение отдаленных метастазов крайне не предсказуемо и может привести к неминуемой гибели больного в короткий период времени после проведенного лечения. В нашем исследовании отдаленные метастазы ни у одного больного не определялись. Однако в группе больных с положительным сигналом Е48 прогрессирование опухолевого процесса наблюдалось в 50% случаев, в то время как в группе без присутствия микрометастатических клеток - у 9% больных (р=0,057).

Существует мнение, что предполагаемые опухолевые микродиссеминаты, могут находиться в покоящемся «дремлющем» состояние («dormant cells», фаза GO клеточного цикла) и длительное время не вызывать какой либо иммунной реакции окружающих тканей [120, 121,

125, 138, 139]. Присутствие микрометастазов в костном мозге возможно выявить при отсутствии метастатического поражения регионарных лимфатических узлов, что было продемонстрировано в нашем

135 исследовании. При II стадии опухолевого процесса микрометастазы в костном мозге определялись в 33%случаев. Интересно, что за период наблюдения за этими больными (до 9 мес.) ни у одного из них не было отмечено прогрессирования опухолевого процесса.

Мы не установили взаимосвязи между микрометастатическим поражением костного мозга и локализацией опухолевого процесса (р=0,232), стадией заболевания (р=0,78), наличием конгломератов лимфатических узлов (р=0,317), однако при III и IV стадиях ПРГШ поражение регионарных лимфатических узлов наблюдалось достоверно чаще (р=0,046).

Проведенное нами исследование показало не только распространение опухолевых клеток гематогенным путем, но и выявило характерные изменения в миелограммах больных ПРГШ, что не исключает реакцию костного мозга на их присутствие и реакцию системы кроветворения на опухолевый рост в целом.

Исследование костномозгового пунктата всей группы больных ПРГШ выявило изменения в отдельных показателях: гранулоцитарного ряда — увеличение относительного содержания сегментоядерных нейтрофилов (р<0,05), снижение уровня молодых форм гранулоцитарного ростка (промиелоцитов, миелоцитов, метамиелоцитов) без изменения индекса созревания нейтрофилов и их процентного содержания;

- эритроидного ряда — снижение суммы эритрокоариоцитов в сравнении с нормальным средним значением (р<0,05 ) и повышение индекса созревания эритроидных клеток (р<0,05) за счет снижения базофильных и полихроматофильных нормобластов и относительном повышении оксифильных форм; достоверное увеличение индекса созревания эритроидных клеток (р<0,05) в костном мозге больных ПРГШ за счет редукции эритроидного ростка.

Кроме вышеперечисленных изменений, нами были выявлены отклонения от нормальных значений в отдельных показателях миелограммы в зависимости от клинико-морфологических характеристик опухолевого процесса:

- уровень оксифильных нормобластов был статистически достоверно выше в группе больных при Т4, чем при Т2 (р=0,037) и ТЗ (р=0,009), что привело к увеличению суммы клеток эритроидного ряда по сравнению с ТЗ (р=0,028), при этом индекс созревания эритроидных клеток достоверно по группам не различался; при N1 достоверно реже отмечалось снижение клеточности костного мозга (р=0,013) и более низкое содержание отдельных элементов красного ряда (р=0,04);

- при низкодифференцированном плоскоклеточном раке характерным оказалось снижение уровня миелокариоцитов (р=0,091) и снижение уровня метамиелоцитов (р=0,049).

- при раке ротоглотки отмечено снижение уровня миелоцитов (р=0,03) и повышением уровня лимфоцитов (р=0,04), в остальных показателях миелограммы, в зависимости от локализации опухолевого процесса статистически достоверных различий получено не было; отмечено более низкое содержание промиелоцитов в группе больных у которых в дальнейшем выявлено прогрессирование опухолевого процесса после проведенного лечения (р=0,016).

Таким образом, для больных первичным плоскоклеточным раком головы и шеи характерны определенные изменения в показателях миелограмм, не исключающие реакцию отдельных ростков кроветворения на опухолевый рост в целом.

Полученные нами результаты в группе больных с положительным сигналом Е48 дают возможность предположить, что косвенными признаками присутствия микрометастатических клеток в костном мозге, могут быть следующие критерии: снижение процентного содержания полихроматофильных нормобластов (р=0,02); повышение суммарного количества клеток гранулоцитарного ростка (р=0,03).

Таким образом, уникальность обнаруженных нами изменений в костном мозге больных ПРГШ, может свидетельствовать о своего рода реакции костного мозга на опухолевый рост, что не противоречит современным представлениям о влиянии опухолевых клеток на костномозговое кроветворение. В случаях с выявленными микрометастазами, эти изменения носят более очерченный характер и заключаются в увеличении суммарного содержания клеток гранулоцитарного ростка и снижении полихроматофильных нормобластов при нормальном уровне лимфоцитов и ряда других клеток костного мозга.

Патогенетической причиной этих изменений, возможно, является продукция опухолевыми клетками комплекса биологически активных веществ, которые реагируют с иммунной системой пациента, стимулируя макрофагальный росток гемопоэза. В активированных макрофагах повышается продукция ряда цитокинов (интерферона-у, интерлейкина -1, фактора некроза опухоли), что приводит к дисбалансу в системе кроветворения [141].

Кроме того, эти изменения возможно расценить, как проявление местного иммунного ответа на присутствие чужеродного компонента в костном мозге больных ПРГШ.

Мы надеемся, что наша работа положила начало более углубленному изучению проблемы плоскоклеточного рака головы и шеи и в дальнейшем,

138 работы по изучению клинического течения этой группы больных будут продолжаться.