Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Внутриклеточные протеиназы в патогенезе и прогнозе злокачественных новообразований

На правах рукописи

СПИРИНА ЛЮДМИЛА ВИКТОРОВНА

ВНУТРИКЛЕТОЧНЫЕ ПРОТЕИНАЗЫ В ПАТОГЕНЕЗЕ И ПРОГНОЗЕ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ НОВООБРАЗОВАНИЙ

14. 01.12 — онкология 14. 03. 03 — патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

О 5 СЕН 2013

005532780

Томск -2013

005532780

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор,

академик РАМН

Чойнзонов Евгений Лхамацыренович

доктор медицинских наук, профессор Кондакова Ирина Викторовна

Официальные оппоненты: Кологривова Елена Николаевна

доктор медицинских наук, профессор кафедры иммунологии и аллергологии, ГБОУ ВПО СибГМУ Минздрава РФ

Агафонов Владимир Иванович

доктор медицинских наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории патологической физиологии, ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН

Завьялов Александр Александрович

доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник торакоабдоминального отделения, ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН

Ведущая организация: ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук, Москва.

Защита состоится « »_2013 г. в_часов на заседании

диссертационного совета Д.001.032.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт онкологии» СО РАМН (634050, г. Томск, пер. Кооперативный, 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН.

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор

Фролова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальпость темы. Онкологические заболевания являются важной медико-социальной проблемой современной России. В настоящее время отмечен неуклонный рост заболеваемости данной патологией среди лиц трудоспособного возраста, приводящий к ранней инвалидизации и увеличению уровня смертности среди них. Достаточно высокий удельный вес в общей структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями населения России занимают плоскоклеточные опухоли головы и шеи (4,4%), рак тела матки (3,8%), почки (3,6), мочевого пузыря (2,7%). Злокачественные новообразования тела матки (7,1%) занимают второе место в структуре онкологической патологии женских репродуктивных органов, уступая лишь опухолям молочной железы [Чиссов В.И., 2012].

Рост заболеваемости злокачественными новообразованиями, преобладание распространенных форм данной патологии ставит перед фундаментальной онкологией новые задачи по поиску оптимальных маркеров опухолевого роста, прогрессирования заболевания, а также значимых прогностических показателей. Одним из перспективных подходов является изучение систем внутриклеточного протеолиза [Yamasaki L. et al, 2004; Lah Т.Т. et al, 2006]. Существуют данные, которые показывают, что протеолиз обеспечивает такие важные процессы, определяющие опухолевый рост как пролиферативная активность, апоптоз, регуляция неоангиогенеза, функционирование иммунной системы и индукция лекарственной резистентности [Lah Т.Т. et al, 2006; Dahlmann В., 2007; Sharova N„ 2011].

Основными компонентами внутриклеточного протеолиза являются протеасомная и кальпаиновая системы [Немова Н.Н, 2010; Шарова Н.П., 2011; Frisan Т., 1998; Almond J.B., 2002; Arlt А., 2009]. Нарушение в функционировании протеасомного комплекса имеет большое значение в развитии онкологических заболеваний различных локализаций, в частности, толстой кишки, легких, молочной железы и др. [Erlanson М., 2001; Hayashi Н., 2001; Li J.Q., 2001; Barnes С. J., 2005; Ducoux-Petit М et al., 2008; Pan J„ 2010]. Однако эти факты, в основном, носят экспериментальный характер и получены на культурах клеток. В экспериментальных условиях показана апоптотическая гибель раковых клеток эндометрия при применении ингибитора протеасом -бортезомиба [Dolcet X., 2006]. Изучение тканей опухолей показало, что прогрессирование злокачественных новообразований почки и мочевого пузыря тесно связано с изменением состояния протеасом и уровня убиквитинированных белков [Dahlmann В., 2007]. Активность протеасом в

ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи, ее связь с клинико-морфологическими параметрами заболевания не изучена.

Системы внутриклеточного протеолиза находятся в тесной связи друг с другом. Предполагается, что кальпаины способствуют изменению структуры белков, что делает их восприимчивыми для дальнейшего протеасомного расщепления [Jang J.S., 1999]. Выявлена заместительная роль кальпаинов в процессах протеолиза белков в клетке в отсутствии необходимого количества протеасом, а также при угнетении их ферментативной активности [Smith I.J., 2007; Sorimashi, 2011]. Разрушение и модификация белков при помощи внутриклеточных протеиназ имеет огромное значение в жизнедеятельности клетки. Их субстратами выступают многие регуляторные белки, среди которых наиболее важны транскрипционные и ростовые факторы, их рецепторы и белки сигнальных систем.

В настоящее время, несмотря на изучение роли внутриклеточных систем протеолиза в развитии патологических состояний, отсутствуют данные об их особенностях при развитии злокачественных новообразований различного происхождения. Имеются единичные сведения о связи ростовых и транскрипционных факторов с внутриклеточным протеолизом [Su Y., 2006; An J., 2007]. В целом, аспект протеолитической регуляции экспрессии ростовых и транскрипционных факторов, которые определяют возникновение и прогрессирование злокачественных опухолей, не исследован. Учитывая важную роль внутриклеточных протеолитических систем и регулируемых ими ростовых и транскрипционных факторов в патогенезе рака, важным практическим приложением работы является разработка новых молекулярных маркеров прогноза течения онкологических заболеваний.

Цель исследования. Изучение роли внутриклеточных протеиназ в патогенезе злокачественных новообразований почки, мочевого пузыря, эндометрия и плоскоклеточных карцином головы и шеи с определением их прогностической значимости.

Задами исследования:

1. Изучить химотрипсинподобную активность протеасом, их субъединичный состав и активность кальпаинов в опухолевой ткани больных раком почки, мочевого пузыря, эндометрия, плоскоклеточными карциномами головы и шеи, сопоставить изучаемые показатели с соответствующими значениями неизмененных тканей.

2. Изучить экспрессию транскрипционных факторов ЫР-кВ (р50 и рб5), ЮТ- 1а и содержания ростового фактора УЕОР в тканях опухолей почки, мочевого пузыря, эндометрия и плоскоклеточных карцином головы и шеи.

3. Определить экспрессию инсулиноподобных факторов роста (ИФР-1, ИФР-П), их связывающих белков и металлопротеиназы РАРР-А в ткани рака эндометрия.

4. Изучить взаимосвязи активности внутриклеточных протеиназ с экспрессией ростовых и транскрипционных факторов в тканях злокачественных новообразований для выяснения патогенетических механизмов опухолевой прогрессии.

5. Оценить взаимосвязь изучаемых молекулярных показателей с клинико-морфологическими параметрами заболевания у больных злокачественными новообразованиями.

6. Оценить прогностическую значимость компонентов внутриклеточных протеолитических систем у изучаемого контингента больных.

7. Разработать математические модели прогноза риска развития гематогенных метастазов у больных раком почки и лимфогенных метастазов у больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи.

Научпая новизна

Впервые исследована химотрипсинподобная активность протеасом, их субъединичный состав, а также активность кальпаинов в опухолевой ткани больных раком почки, мочевого пузыря, эндометрия и плоскоклеточным раком головы и шеи. Выявлено тканеспецифичное изменение активности, субъединичного состава протеасом и активности кальпаинов в опухолях различных локализаций, а именно, повышение активности протеасом и кальпаинов в опухолях мочевого пузыря, в плоскоклеточных карциномах головы и шеи по сравнению с окружающей условно нормальной тканью, повышение активности протеасом в тканях рака эндометрия и снижение этих показателей в ткани рака почки. Изменения активности протеасом связаны с изменением экспрессии субъединиц протеасом.

Получены принципиально новые сведения о зависимости изучаемых показателей от клинико-морфологических параметров заболевания. Показано, что развитие гематогенных метастазов у больных раком почки связано со снижением активности протеасом и возрастанием активности кальпаинов в первичной опухоли, что сопровождается увеличением содержания ядерных факторов ОТ-кВ р65, 1ПР-1 и ростового фактора УЕСтР. У больных раком

мочевого пузыря увеличение глубины инвазии опухоли приводит к повышению активности 26S протеасом, кальпаинов, а также к снижению экспрессии транскрипционного фактора NF-кВ р50. По мере увеличения стадии рака эндометрия наблюдалось повышение активности 20S протеасом и кальпаинов. Рецепторный статус опухоли эндометрия ассоциирован с активностью протеасом, а также с экспрессией транскрипционного фактора NF-кВ р50. У больных ПКГШ с увеличением стадии заболевания наблюдается повышение активности протеасом и кальпаинов, которое сопровождается изменением содержания транскрипционного фактора NF-кВ р50.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты расширяют представления о роли протеасомной и кальпаиновой систем в патогенезе злокачественных новообразований почки, мочевого пузыря, эндометрия и плоскоклеточных карцином головы и шеи. Показано, что в исследованных опухолевых тканях активность протеасом и кальпаинов коррелирует с экспрессией транскрипционных факторов NF-кВ и RTF-1, что подтверждает возможность регуляции этих биологически важных молекул системами внутриклеточного протеолиза. В опухолях эндометрия другим важным протеолитическим регулятором содержания факторов роста ИФР-1, VEGF и ядерного фактора I [IF-1 является металлопротеиназа РАРР-А.

Выявлена прогностическая значимость определения активности протеасом для оценки безметастатической и общей выживаемости больных раком почки, а также общей выживаемости больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи. Безметастатическая выживаемость больных опухолями головы и шеи ассоциирована с экспрессией транскрипционных факторов NF-кВ р65, NF-кВ р50 и HIF-lcx. На основании полученных данных методом многомерной статистики построена модель прогнозирования развития гематогенных метастазов рака почки и лимфогенных метастазов плоскоклеточных карцином головы и шеи.

Положения, выносимые на защиту

1. Химотрипсинподобная активность протеасом и активность кальпаинов в опухолях мочевого пузыря и плоскоклеточных раков головы и шеи значительно превышает соответствующий показатель в условно нормальной нетрансформированной окружающей опухоль ткани, для пациенток с опухолями эндометрия характерно увеличение только активности протеасом. У больных раком почки активность внутриклеточных протеиназ

снижена. Повышение активности протеасом тесно связано с их субъединичным составом, а именно, с увеличением содержания иммунных и 20S активированных форм.

2. Об участии протеасом и кальпаинов в регуляции транскрипционных и ростовых факторов свидетельствуют взаимосвязи между активностью протеасом, их пулов, активностью кальпаинов и экспрессией транскрипционных факторов NF-кВ, HIF-Ia и ростового фактора VEGF у больных раком почки, мочевого пузыря и с ростовым фактором ИФР-I у пациенток с опухолями эндометрия. Кроме того, в опухолях эндометрия показана ассоциация между экспрессией ■ металлопротеиназы РАРР-А и содержанием HIF-la и ИФР-1.

3. Активность протеасом ассоциируется с безрецидивной выживаемостью больных раком мочевого пузыря, безметастатической выживаемостью больных раком почки, а также с общей выживаемостью пациентов с опухолями почки и плоскоклеточными карциномами головы и шеи. Возникновение локорегионарных рецидивов при раке эндометрия зависит от субъединичного состава протеасом. Экспрессия транскрипционных факторов NF-кВ р65, NF-кВ р50 и HIF-la связана с прогнозом рецидивирования рака мочевого пузыря и безметастатической выживаемостью больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены и обсуждены на Российских научно-практических конференциях с международным участием, г. Барнаул, 2007-2009; конференции молодых специалистов - онкологов Уральского федерального округа, г. Челябинск: 2008г.; III-VIII конференциях молодых ученых им. Академика РАМН Н.В. Васильева г. Томск, 2008-2013; III Конгрессе с международным участием «Опухоли головы и шеи», г. Сочи, 2009 г; Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития», г. Томск, 2009г.; Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, г. Казань 2009 г.; VI съезде онкологов и радиологов стран СНГ, г. Душанбе, 2010 г.; V Российском симпозиуме «Белки и пептиды», г. Петрозаводск, 2011 г.; 8-й конференции по фундаментальной онкологии, ФГБУ НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова Минздравсоцразвития России, г. Санкт-Петербург, 2012г.; 11-й Всероссийской конференции молодых ученых, г. Москва, 2011г.; 17th International meeting of

the European society of gynaecological oncology (ESGO) Milan, Italy, 2011 г.; Седьмом съезде онкологов и радиологов стран СНГ, г. Астана, 2012 г.;

Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 08-04-00616, а также Федеральной целевой программой «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы» (Государственный контракт №П320). По итогам исследования оформлено 1 ноу-хау «Новая мишень таргетной терапии злокачественных новообразований различных локализаций» (ноу-хау №2 от 01.10.2012).

Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 45 печатных работах, в том числе 22 статьи в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования используются в обучении студентов и клинических ординаторов при изучении вопросов, посвященных патогенетическим аспектам, диагностике и лечения онкологических заболеваний различных локализаций на кафедре онкологии ГБОУ «Сибирский государственный медицинский университет» Минздрава РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 287 страницах и иллюстрирована 24 рисунками и 93 таблицами. Библиография включает 344 литературных источника, из которых 23 отечественных и 321 иностранный.

Личный вклад автора. Анализ данных литературы по теме диссертации, планирование исследования, определение цели, задач, выбор методов исследования, его проведение, статистический анализ результатов и написание диссертации выполнены лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с поставленной целью и задачами было проведено комплексное исследование 266 больных, обратившихся на консультативный прием и находившихся на стационарном лечении в клиниках ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН с 2006 по 2012 год. В исследование вошли 4 группы больных: 1 группа - 65 больных светлоклеточным почечноклеточным раком, 2 группа - 54 пациента с раком мочевого пузыря, 3 группа - 81 больная раком эндометрия, 4 группа - 66 больных плоскоклеточными карциномами области головы и шеи. Дизайн исследования представлен на рисунке 1.

Стадии заболевания уточнялись по данным клинического и полного инструментального обследования в соответствии с международной классификацией TNM (2009) и FIGO (2009) для рака эндометрия. Подробная характеристика больных приведена в таблице 1.

Рисунок 1 - Дизайн исследования

Диагностика и лечение больных соответствовали рекомендуемым алгоритмам объемов диагностики и лечения злокачественных новообразований,

утвержденным министерством здравоохранения и социального развития РФ. Проведение данной работы одобрено этическим комитетом ФГБУ «НИИ онкологии» СО РАМН.

Таблица 1 - Клинико-морфологическая характеристика больных, включенных в исследование

Параметры Локализации

Рак почки РМП Рак эндометрия ПКП11

количество 65 54 81 66

средний возраст 58,0±1,4 лет 61,5±1,4 лет 56,2±1,1 лет 57,1±1,7 лет

пол мужчины - 38 человек, женщины - 27 мужчины -45 человек, женщины - 9 мужчины - 55 человек, женщины - 11 человек

стадия T1.3N0.1M0-48 пациентов, ЪЛЧо-М- 17 ТгИоМо-26 пациентов, ТОоМо - 28 1а - 58 больных, 1Ъ-10,И стадию - 13 Тг-зИоМо - 36 человек, Т2-зМ|МО-20, Тз-зИзМо- 10

гистологическая форма светлоклеточ-ный почечно-клеточный рак переходно-клеточный рак эндометриоид-ный рак плоскоклеточный рак

степень дифференци- ровки высоко дифференцированный рак - 21 пациент, умеренно - 25, низко - 8 высоко дифференцированный рак -15 больных, умеренно -51, низко - 15 высоко дифференцированный рак -15 больных, умеренно - 42, низко - 9

наличие метаболического синдрома метаболический синдром - 49 пациенток, нет-32

рецепторный статус ЕЯ позитивные -23, ЕЯ негативные - 4. РЯ позитивные -25, РЯ негативные - 2

Всем больным раком почки в зависимости от размера опухоли было проведено хирургическое лечение, включающее в себя радикальную нефрэктомию или частичную резекцию почки.

Лечение больных РМП включало в себя проведение 2 курсов системной полихимиотерапии в неоадъювантном режиме по стандартной схеме МУАС. В последующем этим пациентам выполнялась трансуретральная резекция

опухоли мочевого пузыря и еще 2 курса адъювантной химиотерапии по вышеуказанной схеме.

У больных РЭ на первом этапе выполнялось оперативное вмешательство в различных объемах, а в последующем проводилась лучевая терапия.

Все пациенты ПКГШ получали комбинированное лечение, включающее неоадъювантную химиолучевую терапию и последующее хирургическое иссечение опухоли. При наличии регионарных метастазов выполняли фасциально-футлярное иссечение шейной клетчатки, операцию Крайла.

Материалом исследования явились образцы опухолевой и гистологически неизмененной ткани, находящиеся на расстоянии не менее 2 см от границы опухолей, которые были получены при выполнении радикального оперативного вмешательства. Весь материал подвергался морфологическому исследованию и был гистологически верифицирован. Образцы тканей замораживались и хранились при -80°С.

Согласно поставленным задачам исследования была исследована активность протеасом и их пулов в тканях флуорометрическим методом по гидролизу олигопептида N-Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-Amido-4-MethyIcoumarin (Sigma, США) и при наличии специфического ингибитора протеасом MG132 (Sigma, США) [Ben-Shahar. S., 1999].

Фракционирование протеасом осуществлялось методом высаливания [Абрамова Е.Б., 2004]. Активность кальпаинов определяли в гомогенатах тканей по гидролизу флуорогенного олигопептида N-Succinyl-Leu-Leu-Val-Tyr-7-Amido-4-Methylcoumarin с помощью специфического ингибитора N-ацетил-Leu-Leu-норлейцинал (Sigma, США) [Sandmann S., 2002].

Экспрессию а1а2аЗа5аба7, LMP7, LMP2, PA28ß (Santa Cruz, США) и Rpt6 (Biomol International, Enzo Life Science, Великобритания) субъединиц протеасом исследовали с помощью метода Вестерн блоттинг с последующей обработкой хемилюминесцентной системой детекции белков. Плотность полос была определена с помощью стандартной компьютерной программы «Image J». Результаты были стандартизированы по содержанию актина в пробе и выражали в процентах от содержания субъединиц протеасом в неизмененной ткани, где за 100% брали содержание субъединиц протеасом в неизмененной ткани.

Уровень продукции транскрипционных факторов HIF-la, NF-кВ (р50 и р65 форм) (Caymanchem, США), ростовых факторов ИФР-I, ИФР-И, их связывающих белков IGFBP3, IGFBP-4, ростового фактора VEGF и металлопротеиназы РАРР-А (R&D Systems, DSL, США) определяли с

использованием наборов для твердофазного ИФА на ИФА-анализаторе «Anthos 2020». Статистическую обработку результатов проводили с применением пакета статистических программ Statistica 6.0, SPSS 19.0. Результаты представлены как М - как медиана с интерквартильным размахом (25-й и 75-й процентили). Значимость различий исследовали с помощью критерия Манна-Уитни, при количестве сравниваемых групп более чем две - с помощью многомерного непараметрического дисперсионного анализа, рангового теста Краскела-Уоллиса и медианного теста. Корреляционный анализ был проведен с использованием непараметрического критерия Спирмена. Прогностическая значимость признаков в отношении общей, безрецидивной и безметастатической выживаемости оценивалась с использованием программы Survival Analysis Statistica 6.0. кривые кумулятивной выживаемости строились по методу Каплан-Майера. Значимость различий в выживаемости между группами оценивалась по критерию Гехана-Вилкоксона и log-рангового критерия. При построении математических моделей для прогнозирования развития гематогенных и лимфогенных метастазов использовался дискриминантный анализ [Боровиков В.П., 2001; Реброва О.Ю., 2002].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Роль внутриклеточных протеиназ в развитии и прогнозе рака почки.

Результаты проведенного исследования показали, что тотальная активность протеасом в опухоли почки уменьшалась в 3,4 раза, активность 26S и 20S протеасом - в 2,6 раза и 2,7 раза, соответственно по сравнению с неизмененной тканью (таблица 2). Известно, что интенсивный протеолиз в ткани почки существует в физиологических условиях и связан с процессами деградации альбумина в проксимальных канальцах почки [Gidehithlu К.Р., 2004]. При этом в исследованиях Macconi D. et al (2009) показано, что альбумин предварительно подвергается процессингу в протеасомах [Macconi D. et al, 2009]. При опухолевой трансформации происходит нарушение нормальной почечной функции, что ведет к значительному снижению протеасомной активности. Второй причиной этого эффекта при светлоклеточном раке почки, связанном с синдромом фон Хиппель-Линдау, является, вероятно, дефект ЕЗ лигазы, который способствует снижению активности протеасом в опухоли и связан с накоплением транскрипционного фактора HIF-1.

Сниженная активность протеасом и изменение их субстратной специфичности при раке почки было связано с наличием модифицированных форм протеасом (рисунок 2). Количество тотального пула протеасом в ткани

опухоли было увеличено, о чем свидетельствует повышение экспрессии а1а2ссЗа5а6а7 субъединиц на 28% по сравнению с неизмененной тканью. Однако экспрессия иммунных субъединиц протеасом ЬМР2 и РА28Р в их составе была низкой. Разница между уровнями продукции данных субъединиц в опухоли и прилежащей к ней нетрансформированной ткани составляли 30%, соответственно, в обоих случаях. Вероятно, активность пула 208-протеасом была снижена вследствие уменьшения содержания РА28 активаторного комплекса, о чем свидетельствует низкая экспрессия частицы РА28р.

Таблица 2 - Тотальная химотрипсинподобная активность протеасом, активность 268, 20Б пулов протеасом и активность кальпаинов в опухолях, Ме (ОгСЬ)_

Локализация Активность протеасом, -103 Ед/мг белка Активность кальпаинов, •103 Ед/мг белка

Тотальная химотрипсинподобная активность протеасом Активность 265 пула Активность 20S пула

РП неизмененная ткань 126,6 (63,8-187,0) 32,3 (17,6-87,0) 81,5 (46,0-154,8) 49,1 (31,3-78,7)

опухолевая ткань 36,9 (22,0-99,4)* 12,2 (7,3-25,8)* 29,8 (16,7-65,9)* 37,5 (18,6-74,0)*

РМП неизмененная ткань 40,0 (21,0-60,0) 6,6 (3,7-10,8) 30,0 (17,2-50,1) 21,7 (8,5-24,0)

опухолевая ткань 50,0 (38,2-80,0) 16,7 (11,9-26,3)* 45,0 (24,2-60,5) 34,0 (21,5-51,9)*

РЭ неизмененная ткань 43,8 (23,9-82,1) 18,3 (7,4-37,0) 50,0 (22,5-79,2) 78,9 (4,6-121,0)

опухолевая ткань 105,0 (56,7-172,6)* 33,3 (22,4-56,8)* 68,8 (49,1-145,0)* 112,0 (41,7-232,0)

пкгш неизмененная ткань 26,7 (16,0-55,9) 9,5 (5,0-20,0) 36,0 (16,0-65,0) 42,3 (31,8-100,0)

опухолевая ткань 59,9 (37,7-120,0)* 20,0 (13,9-38,3)* 45,0 (33,9-90,1)* 125,7 (67,0-256,0)*

Примечание:

* - значимость различий по сравнению с неизмененной тканью, р<0,05.

Другими сопряженными с протеасомами ферментами внутриклеточного протеолиза являются кальпаины. При раке почки обнаружено снижение активности ферментов в опухоли в 1,3 раза по сравнению с неизмененной тканью, что составляло 37,5 -103 Ед/мг белка (таблица 2). Низкая активность

протеасом в опухоли коррелировала со сниженной активностью кальпаинов, что подтверждено также данными непараметрического корреляционного анализа.

<Иак щт- Ф> 'т' Э-агап 42кДа А ! 2 3 4

__«и» _ ШРТЗОкДа

Р.рс6 45 кДа

140 130 Б 120 110 100

80 70 60 50 40

Рисунок 2 - Экспрессия субъединиц протеасом в опухолевой и неизмененной ткани при раке почки: А - Вестерн блоттинг субъединиц протеасом в опухолевой и неизмененной тканях; Б - Содержание субъединиц протеасом в опухолевой ткани в процентном отношении к содержанию субъединиц протеасом в неизмененной ткани

Примечание: 1, 3 - в опухолевой ткани; 2, 4 - в неизмененной ткани; *- значимость различий по сравнению с неизмененной тканью р<0,05.

Следует отметить, что прогрессировать заболевания и развитие гематогенных метастазов сопровождалось еще более значительными изменениями активности внутриклеточных протеиназ. В метастазирующих опухолях почки происходило снижение активности протеасом, сопровождаемое повышением активности кальпаинов. В группе больных со стадией T2.4N0.1M1 наблюдалось снижение тотальной активности протеасом в 1,3 раза и повышение активности кальпаинов в 1,3 раза по сравнению с группой больных

1

а1»2аДа4а5а6а7 11УП»71 ШЙ ■ 1)16

А

TuNo-iMo. Известно, что кальиаины осуществляют лимитированный протеолиз специфических субстратов. В отсутствии протеасом они являются ответственными за частичный протеолиз белков и пептидов. Так, возможными их субстратами в ткани опухоли могут быть ингибитор транскрипционного фактора NF-kB - 1кВ, а также ядерный фактор HIF-1. Неполный протеолиз этих транскрипционных факторов может быть причиной их накопления в опухолевых клетках, что, в свою очередь, приводит к развитию гематогенных метастазов [Zhou А., 2006; Li С., 2010].

В представленном исследовании показано, что разнонаправленное изменение активности внутриклеточных протеиназ при метастазировании РП происходило на фоне увеличения уровня транскрипционных факторов HIF-la, NF-кВ р65 и ростового фактора VEGF (таблица 3). В проведенном исследовании отмечен значительный рост продукции ядерного фактора NF-kB р65 в 3,2 раза, коэффициента NF-kB р65/ р50 в 5 раз, транскрипционного фактора HIF-la и ростового фактора VEGF в 1,9 и 2,8 раза, соответственно, у больных с отдаленными метастазами заболевания по сравнению с локализованной формой.

Таким образом, в ткани светлоклеточного рака почки установлена низкая химотрипсинподобная активность протеасом и кальпаинов по сравнению с неизмененной тканью. Развитие гематогенных метастазов сопровождается дальнейшим снижением активности протеасом и увеличением активности кальпаинов, что не может в полной мере обеспечить эффективный протеолиз и приводит к нарушению деградации транскрипционного фактора HIF-la (г= -0,36; р=0,04) и увеличению продукции ростового фактора VEGF. Вероятно, увеличение экспрессии транскрипционного фактора NF-кВ р65 в метастазирующей светлоклеточной карциноме способствует росту продукции ядерного фактора HIF-la (г=0,9; р=0,001) и дальнейшему прогрессированию заболевания. Наши результаты совпадают с данными на культуре почечноклеточного рака, в которых обнаружено влияние фактора транскрипции NF-kB на фактор HIF-1 [van Uden P., 2010].

Изучение прогностической значимости показателей внутриклеточного протеолиза и экспрессии транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF при раке почки позволило выявить комплекс показателей связанных с безметастатической и общей выживаемостью больных. Снижение активности 26S и 20S протеасом ниже их пороговых значений, менее 12,2 и 29,8-1000 Ед/мг белка, соответственно, ассоциируется с лучшей безметастатической выживаемостью больных. Увеличение общей выживаемости больных РП

наблюдается на фоне снижения тотальной активности протеасом и 20S пула протеасом ниже 36,9 и 29,8-1000 Ед/мг белка, соответственно.

Таблица 3 - Зависимость экспрессии транскрипционных факторов ОТ-кВ р65, ОТ-кВ р50, ЮТ-! и ростового фактора УЕОР в опухоли от клинико-

Локализация Содержание NF-кВ p65, УЕ /мг белка в лунке тотальная Содержание NF-кВ р50, УЕ/мг белка в лунке Коэффициент NF-KB р65/ р50 Экспрессия HIF-lct, УЕ/ мг белка в лунке Содержание VEGF, пг/мг бежа

РП T1.3NO-1M0 5,0 (2,0-7,9) 6,4 (3,3-10,0) 0,6 (0,3-2,0) 4,2 (2,2-7,8) 71,5 (38,3-139,7)

T2^NO.IMI 11,3 (6.8-15,7)* 6,2 (4,4-9,7) 3,0 (1,6-3,0)* 7,9 (6,2-8,5)* 205,4 (131,7 -261,5)*

РМП T;N0M0 13,9 (8,3-21,4) 14,4 (8.5-29,0) 1,0 (0,64-1,3) 8,6 (4,1-14,8) 78,7 (50,5-131,6)

T3N0M0 7,2 (5.6-17,7) 8,9 (4,5-13.6)** 1,5 (0,7-3,0) 25,1 (3,6-41,4)** 146,2 (81,5201,7)**

РЭ la 14,1 (8,4-19,8) 16,6 (7,1-26,4) 0,7 (0,5-2,1) 7,8 (5,6-10,0) 102,0 (68,6-130,9)

Ib 11,0 (7,8-19,2) 6,8 (5,9-7,8) 1,3 (1,15-1,4) 11,9 (7,819,2)*** 164,6 (162,8329,9)***

II 11,7 (4,6-13,2) 4,0 (2,7 -12,5)*** 1,6 (0,92,4)*** 4,0 (3,7- 8,4) 176,2 (51,2236,8)***

пкгш T2-3N0M0 9,2 (5,9-14,4) 6,6 (2,2 - 17,0) 1,6 (0,7- 3,3) 7,8 (4,6-21,1) 71,1 (48,2- 87,7)

T2-3N1M0 12,5 (10,7- 16,7) 19,7(11,8-30,8)* 0,6 (0,5- 0,8) 10,9 (10,8- 16,7) 92,1 (84,5- 98,7)

T2-3N2M0 8,7 (7,0- 19,4) 5,2 (2,8 - 7,8f 2,5 (1,73,2)** 9,0 (6,5- 14,6) 74,5 (65,2- 88,8)

Примечание:

*- значимость различий по сравнению с группой больных со стадией T1.3N0.1M0; р<0,05; ** - значимость различий по сравнению с группой больных с размером опухоли Т21\тоМо, р<0,05; *** - значимость различий по сравнению с сравнению с группой больных со стадией 1а, (р<0,05); # - значимость различий по сравнению с сравнению с группой Т2-з^М0, р<0,05); ## - значимость различий по сравнению с сравнению с группой Тг-з^Мо, (р<0,05).

Результатом проведенного дискриминантного анализа явилось создание модели прогнозирования развития гематогенных метастазов при РП, в которую включены важные транскрипционные и ростовые факторы. В результате дискриминантные функции имели следующий вид:

У1 = -3,2+0,026-Х1+0,03-Х2-0,02-ХЗ+0,34-Х4+0,3-Х5;

У2= -33,3-0,01 -X1 +0,11-Х2-1,2-ХЗ+1,57-Х4+1,8 -Х5;

где XI - тотальная активность протеасом -10"3 Ед/мг белка; Х2 - содержание УЕСР, пг/мг белка; ХЗ - экспрессия НИМ, УЕ/мг белка в лунке; Х4 -экспрессия ОТ-кВ р50, УЕ/мг белка в лунке; Х5 - коэффициент ОТ-кВ р65/50.

У1 характеризует низкую вероятность развития гематогенных метастазов, У2 - высокую вероятность. Если значение функции У1 > У2, то прогнозируют высокую вероятность развития гематогенных метастазов у больных раком почки.

Чувствительность и специфичность модели составляли 96% и 70%, соответственно. Предлагаемая модель с высокой диагностической эффективностью позволяет предсказать вероятность появления гематогенных метастазов у больных раком почки после проведенного хирургического вмешательства, что позволяет определить оптимальные сроки динамического наблюдения и в случае прогрессирования заболевания принять своевременные лечебные меры.

Роль внутриклеточных протеиназ в развитии и прогнозе рака мочевого пузыря. В ткани РМП химотрипсинподобная активность 26Б протеасом была выше в 2,5 раза по сравнению с таковой в гистологически неизмененной ткани (см. таблицу 2). Рост активности данного пула протеасом сочетался со снижением содержания тотального пула протеасом на 29,5% и увеличением экспрессии Яр(б субъединиц на 58,8% по сравнению с неизмененной тканью (рисунок 3). Вероятно, увеличение активности протеасом в тканях РМП по сравнению с неизмененными тканями связано с повышением содержания 26Б пула протеасом рйе У. й а!., 2010].

В опухоли мочевого пузыря активность кальпаинов была равна 34,0 (21,551,9) -10' Ед/мг белка, что также превышало соответствующий показатель в неизмененной ткани мочевого пузыря. Возможно, увеличение активности 265 протеасом и кальпаинов в ткани опухоли является свидетельством их совместного участия в патогенезе переходноклеточного рака мочевого пузыря.

Экспрессия транскрипционных и ростовых факторов в ткани РМП также была связана с течением заболевания. Отмечено, что увеличение глубины инвазии опухоли сочеталось со снижением уровня ядерного фактора НР-кВ р50. Данный показатель у больных с Т3М0Мо стадией заболевания уменьшался в 1,9 раза по сравнению с больными с Т^Т^оМо стадией (см. таблицу 3).

Прогрессирование заболевания сопровождалось также активацией процесса ангиогенеза. В группе больных со стадией заболевания Т^0М0 экспрессия транскрипционного фактора ШР-1 а и ростового фактора УЕОР в опухоли увеличивались в 2,9 и 1,8 раза, соответственно, по сравнению с больными со стадией Т^оМо.

p-actin 42кДа aia2a3oDofcf.7 29 кДа

LMP730 к Да ШИ 20«Д»

PA2SP ISfaa P-psé 45 кДа

200 Б 180 160 140 120 % 100 80 60 40 20 0

Рисунок 3 - Экспрессия субъединиц протеасом в опухолевой и неизмененной ткани при РМП: А - Вестерн блоттинг субъединиц протеасом в опухолевой и неизмененной тканях при раке мочевого пузыря; Б - Содержание субъединиц протеасом в опухолевой ткани рака мочевого пузыря в процентном отношении к содержанию субъединиц протеасом в неизмененной ткани Примечание: 1, 3 - в опухолевой ткани; 2, 4 - в неизмененной ткани; * - значимость различий по сравнению с неизмененной тканью р<0,05.

Гистологическая организация опухоли играет важную роль в патогенезе рака. Известно, что в низкоорганизованные опухоли обладают более агрессивным течением. Снижение степени дифференцировки опухоли мочевого пузыря приводило к росту активности 26,S протеасом, кальпаинов. Активность 26S протеасом и кальпаинов в низко дифференцированных опухолях повышалась в 1,3 и 2 раза, соответственно по сравнению с умеренно дифференцированными.

*

,—,

а1а !a3a5í 6а7 LMP7 LMP2 PA28b Rpt6

Учитывая важную роль внутриклеточных протеиназ в регуляции экспрессии транскрипционных факторов, было проведено их исследование в связи с активностью протеасом и кальпаинов. При уменьшении степени гистологической организации опухоли происходило увеличение экспрессии транскрипционных факторов NF-кВ р65, NF-кВ р50, HIF-la и содержания ростового фактора VEGF. В низко дифференцированных опухолях содержание фактора NF-кВ р65 увеличивалось в 4 раза по сравнению с высоко дифференцированными опухолями. Подобные изменения были выявлены для ядерного фактора NF-кВ р50, уровень которого повышался при увеличении степени гистологической организации опухоли в 2,0 раза по сравнению с высоко дифференцированными раками. Вероятно, агрессивное течение низко дифференцированных опухолей связано с большей интенсивностью патологических процессов, приводящих к росту пролиферативного потенциала опухолевых клеток, и к быстрой активации ангиогенеза.

Изучение связи содержания транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF с активностью внутриклеточных протеиназ показало, что протеолиз при РМП, связанный с увеличением активности пула 26S протеасом, 20S протеасом и тотальной активности протеасом, осуществляет контроль ангиогенеза, что происходит за счет их участия в разрушении транскрипционного фактора HIF-1, ростового фактора VEGF. В исследованиях Zhou А. (2006) выявлено также участие кальпаинов в деградации HIF-1 [Zhou А., 2006]. Результаты представленного исследования подтверждают роль кальпаинов в развитии РМП, которые регулируют содержание ядерного фактора NF-KBp50, что в свою очередь оказывает влияние на уровень HIF-la и VEGF. В ранее проведенных экспериментальных исследованиях [Kassis J., 2002] показана роль данных протеиназ в регуляции подвижности опухолевых клеток мочевого пузыря. Установлено, что кальпаины способствуют активации транскрипционного фактора NF-кВ р50, а учитывая влияние последнего на продукцию транскрипционного фактора HIF-1 [van Uden P. 2010], можно утверждать, что они косвенно стимулируют ангиогенез в опухоли. Таким образом, инвазивный рост опухоли, увеличение пролиферативного потенциала раковых клеток и формирование новых кровеносных сосудов регулируются внутриклеточными протеиназами и являются молекулярной основой процесса рецидивирования РМП.

Рак мочевого пузыря представлен довольно разнородной группой больных, среди которых встречаются лица с повышенным риском повторного рецидивирования. Эта закономерность выдвигает на первый план углубленное

изучение механизмов развития заболевания и поиска информативных маркеров рецидивирования. К числу потенциальных маркеров, связанных с появлением рецидивов РМП, по данным ряда авторов, относят наличие микросателлитных последовательностей ДНК, мутаций проонкогенов, онкосупрессоров, регуляторов клеточного цикла, рост содержания ангиогенных факторов [Goddard J.C., 2003; Garcia-Closas М., 2007; Inoue К., 2002] и молекул адгезии [Goldberg A.L., 2007]. Однако эти результаты носят противоречивый характер и их значимость в прогнозе течения РМП неоднозначна.

Участие внутриклеточных протеиназ в патогенезе РМП, их связь уровнем экспрессии транскрипционных и ростовых факторов определяет значение изучаемых показателей в оценке безрецидивной выживаемости больных (рисунок 4, 5).

Активность 26S протеасом

-более 18"1ООО

Ед/мг белка

■ менее 18'1000

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 Ед,мг 6елка Срок наблюдения в месяцах

Рисунок 4 — Безрецидивная выживаемость больных РМП в зависимости от порогового уровня 26S протеасом в ткани опухоли, равного 18,0-1000 Ед/мг

Активность 268 протеасом менее 18-1000 Ед/мг белка и уровень коэффициента 1ЧБ-кВ р65/р50 менее 1,0 в ткани опухоли ухудшали безрецидивную выживаемость. Выявленный факт подтверждает показанную связь увеличения глубины инвазии опухоли со снижением экспрессии транскрипционного фактора №-кВ р50 на фоне роста содержания ядерного фактора Н1Р-1 и ростового фактора УЕОР. При этом стоит отметить отсутствие

связи изучаемых протеиназ с инвазивным ростом опухоли мочевого пузыря. Однако, учитывая роль протеасом в процессах активации транскрипционного фактора №-кВ и в деградации транскрипционного фактора НИМ, роль внутриклеточного протеолиза в процессе онкогенеза довольно значительна.

20 40 60

срок наблюдения в месяцах

Коэффициент NF-кВ рб5/50

NF-kB более 1.0 NF-kB менее1,0

Рисунок 5 - Безрецидивная выживаемость больных РМП в зависимости от порогового уровня коэффициента NF-кВ р65/р50, равного 1,0

Роль внутриклеточных протеиназ в развитии и прогнозе рака эндометрия. Химотрипсинподобная активность тотального пула протеасом, активность 26S протеасом и 20S протеасом в опухоли эндометрия были увеличены в 2,4; 1,8 и 1,4 раза, соответственно, по сравнению с неизмененной тканью (см. таблицу 2).

Изменение тотальной химотрипсинподобной активности протеасом, их пулов 26S и 20S при РЭ связано с увеличением экспрессии иммунных субъединиц LMP7 и LMP2 на 42,4% и 29,3%, соответственно, на фоне снижения экспрессии ala2a3a5a6a7 субъединиц протеасом в ткани опухоли на 29,3% по сравнению с такими же показателями в нормальной ткани (рисунок 6). Вероятно, изменение субъединичного состава протеасом приводит к увеличению их активности. Связь активности протеасом с формированием модифицированных форм ферментов и наличием в их составе иммунных субъединиц представлена в экспериментальных работах Almond J.В. (2002) и Arlt А. (2009). При РЭ была выявлена ассоциация экспрессии LMP2 субъединицы протеасом и тотальной активности протеасом.

Р-асм 42ь:Да а1а2аЗа5аба? 25 кДа

LMP7 30 к Да LMP2 20кДа

РА28э:«кД»

Rpí5 45 к Да

200 180

140 120 %100 80 60 40 20 0

Рисунок б — Экспрессия субъединиц протеасом в опухолевой и неизмененной ткани при РЭ: А — Вестерн блоттинг субъединиц протеасом в опухолевой и неизмененной тканях; Б - Содержание субъединиц протеасом в опухолевой ткани в процентном отношении к содержанию субъединиц протеасом в неизмененной ткани

Примечание: 1, 3 - в опухолевой ткани; 2, 4 - в неизмененной ткани; *-значимость различий по сравнению с неизмененной тканью р<0,05.

Увеличение содержания РА28р субъединиц протеасом на 18,5 % в опухоли эндометрия по сравнению с ^трансформированной тканью, вероятно, свидетельствует о повышении содержания всего активаторного комплекса РА28 и является причиной высокой активности 20S пула протеасом [Emmerich N.P.N., 2000]. Протеолиз, осуществляемый данным пулом протеасом, происходит без участия АТФ, является частичным и затрагивает короткоживущие и аномальные белки [Emmerich N.P.N., 2000]. Его значение возрастает в условиях патологии и при усилении процесса внутриклеточного протеолиза.

1а!аЗа5,6а7 LMP7 LMP2_РА28Ь_Rpt6

При изучении связи изучаемых показателей с клшшко-морфологическими параметрами заболевания выявлено, что увеличение стадии заболевания способствовало росту активности пула 20S протеасом при повышении экспрессии LMP2 и РА28 субъединиц протеасом. Также активность внутриклеточных кальций зависимых ферментов увеличивалась в 1,8 раза в группе больных со II стадией по сравнению с больными с 1а стадией.

Одной из важных функций внутриклеточных протеиназ является регуляция экспрессии транскрипционных факторов, в частности NF-кВ, HIF-1. В опухоли эндометрия отмечено преобладание неактивных форм ядерного фактора, о чем свидетельствует коэффициент NF-кВ р65/р50 менее 1,0. Прогреесирование заболевания, увеличение стадии процесса приводило к снижению экспрессии транскрипционного фактора NF-кВ р50. Продукция транскрипционного фактора уменьшалась в 4,5 раза у больных со II стадией заболевания по сравнению с 1а стадией.

Также увеличение стадии заболевания сопровождалось значимыми изменениями экспрессии транскрипционного фактора HIF-1 и ростом уровня ростового фактора VEGF. У больных с lb стадией заболевания экспрессия HIF-1а увеличивалась в 1,5 раза по сравнению с группой больных с 1а стадией (см. таблицу 3). У больных со II стадией заболевания экспрессия HIF-la снижалась в 1,9 раза, а уровень продукции VEGF в этом случае повышался в 1,7 раза по сравнению с больными с 1а стадией. Данная закономерность, вероятно, может быть объяснена влиянием транскрипционного фактора NF-кВ на активацию процесса транскрипции VEGF без участия HIF-la [Shibata А., 2002].

Важным аспектом онкогенеза на фоне гормонально-метаболических нарушений является активирующее влияние лептина, гормона жировой ткани, на продукцию транскрипционных факторов NF-кВ, HIF-1 и, как следствие, на содержание VEGF [Gonzalez-Perez RR, 2010]. Однако в представленном исследовании показано, что развитие гормонально-метаболических нарушений происходило при снижении экспрессии VEGF в опухоли в 1,7 раза по сравнению с больными без метаболического синдрома. Вероятно, влияние лептина на ткани опухоли на уровне организма не ограничивается его прямым действием на содержание транскрипционных факторов, но и опосредуется другими причинами, в частности, вовлечением в процесс регуляции эстрогенов. В экспериментальных условиях показано, что при развитии метаболического синдрома эстрогены способствует снижению уровня экспрессии HIF-1 и содержания VEGF в тканях [Xu J. et al., 2012]. Данный факт находит свое

подтверждение в связи с наличием влияния ЕЯ профиля опухоли на продукцию фактора роста УЕОР, что представлено нами далее.

Важным для развития РЭ молекулярно-генетическим параметром является рецепторньш статус опухоли, который оказывает значительное влияние на развитие заболевания, связан с ее чувствительностью к лекарственной терапии. Выявлено увеличение активности 268 протеасом в ткани ЕЙ. позитивных опухолей эндометрия в 1,9 раза по сравнению с ЕЙ негативными (таблица 4).

Таблица 4 - Зависимость активности протеасом в ткани рака эндометрия от рецепторного статуса опухоли, Ме (С^-ОЬ)

Химотрипсинподобная активность протеасом в опухолевой ткани, 10*3 Ед/мг белка

тотальная 26S протеасомы 20S протеасомы

ER статус ER негативные 149,1 (86,1-350,0) 14,0 (10,6-70,1) 78,3 (41,6-252,1)

ER позитивные 79,8 (42,2-161,6) 27,7 (22,8-42,9)* 66,5 (52,5-150,6)

PR статус PR негативные 86,1 (46,6-125,6) 14,0(13,0-15,1) 63,3 (26,6-100,0)

PR позитивные 100,0 (48,4-172,6) 27,7 (22,7-44,0) 66,5 (55,0-176,1)

Примечание:

* - значимость различий по сравнению с ER негативными опухолями, р<0,05.

Рост активности 26S протеасом в случае ER позитивных опухолей свидетельствует об активации данных рецепторов за счет протеолиза ER протеина [Fan М. et al., 2004]. Изменение активности протеасом происходило за счет формирования их модифицированных форм. Так, в ER позитивных опухолях наблюдалось увеличение содержания LMP2 субъединиц протеасом на 19,8% и снижение продукции Rpt6 субъединиц на 83,7% по сравнению с ER негативным раком.

Уровень продукции транскрипционных факторов и ростового фактора VEGF в гормонозависимых опухолях, связанный с пролиферативной активностью опухоли, особенностями ее роста и развития, также может быть гормон-индуцибельным. Стоит отметить участие ядерного фактора NF-кВ в формировании чувствительности опухоли и ее микроокружения к гормонам [Ryu К., 2011]. В ER и PR позитивных опухолях наблюдалось уменьшение продукции ядерного фактора NF-icBp50: содержание данного показателя

снижалось в 1,5 раза по сравнению с ER и PR негативными опухолями (таблица 5).

Полученные результаты согласуются с данными Gionet N. (2009) и Shapochka D.O. (2012), которые показывают, что в ER позитивных [Gionet N., 2009] и PR позитивных [Shapochka D.O., 2012] опухолях молочной железы наблюдается низкий уровень и активность ядерного фактора NF-кВ, что играет важную роль в онкогенезе и формировании чувствительности к гормонотерапии [Keklikoglou I., 2012].

Таблица 5 - Зависимость экспрессии транскрипционных факторов №-кВ р65 и ОТ-кВ р50, Н1Р-1а и ростового фактора УЕОБ в ткани РЭ от рецепторного статуса опухоли, Ме (ОгСЬ)_____

Содержание NF-кВ р65, УЕ /мг белка в лунке тотальная Содержание NF-кВ р50, УЕ /мг белка в лунке Коэффициент NF-kB р65/р50 Содержание HIF-la УЕ' мг белка в лунке Содержание, VEGF, пг/'мг белка

ER статус ER негативные 14,3 (8,4-53,9) 10,1 (6,4-91,1) 0,8 (0,62-1,9) 8,1 (6,25-47,3) 161,5 (96,6-298,0)

ER позитивные 14,1 (8,6-19,2) 6,8 (3,0-17,4)* 1,7 (0,9-3,4)* 8,6 (5,6-11,9) 117,9 (82,2-128,6)*

PR статус PR негативные 8,4 (5,2-11,7) 10,1 (7,113,2) 0,8 (0,7-0,9) 6,5 (4,7-8,4) 11,2 (46,3-176,2)

PR позитивные 15,2 (10,8-19,2) 6,8 (4,0-17,4)** 1,7(0,9-3,1)** 8,6 (5,9-11,9) 118,9 (98,7-143,0)

Примечание: * - значимость различий по сравнению с ER негативными опухолями, р<005; ** - значимость различий по сравнению с PR негативными опухолями, р<005.

Содержание ростового фактора УЕОР также зависело от наличия рецепторов ЕК. В группе больных с ER позитивными опухолями содержание УЕОР было снижено в 1,4 раза по сравнению с больными с ER негативным РЭ и происходило на фоне одинаковых показателей экспрессии НИМ в обоих видах опухоли. Отмеченная связь наличия ER рецепторов в опухоли с содержанием ростового фактора УЕОР, обусловлена влиянием транскриптов ER на уровень продукции ростового фактора [Кос1ип 8., 2006], что, вероятно, способствует прогрессии опухолевого роста.

В ткани больных РЭ были определены уровни инсулиноподобных факторов роста (ИФР-1, ИФР-П), их связывающих белков ЮРВР-З и ЮРВР-4, а

также металлопротеиназы РАРР-А (таблица 6). В дальнейшем, их значения были использованы при проведении корреляционного анализа для выявления взаимосвязей между содержанием изучаемых транскрипционных факторов, ростового фактора VEGF, а также инсулиноподобных факторов, их связывающих белков и металлопротеиназы РАРР-А.

Таблица б - Содержание инсулиноподобных факторов роста, связывающих их белков и РАРР-А в ткани рака эндометрия, Ме (Qi-Qr.)_

Показатели

ИФР-1, ИФР-П, IGFBP-3, IGFBP-4, РАРР-А,

нг/мг белка нг/мг белка нг/мг белка нг/мг белка нг/мг белка

РЭ,п=30 0,19 4,97 4,04 0,64 5,15

(0,06-0,45) (3,66-6.76) (3,05-1,02) (0.28-0,83) (1,25-11,3)

Изучение возможного участия протеасом, их пулов 26S и 20S в регуляции экспрессии транскрипционных факторов и VEGF показало, что экспрессия HIF-! и ИФР-1 при РЭ находится под контролем протеасом. Кроме того выявлено, что содержание ИФР-1 является NF-кВ-зависимым, что объясняется взаимодействиями по типу обратной связи, так и непосредственным участием ядерного фактора в регуляции транскрипции ИФР-1. Для металлопротеиназы РАРР-А показан ангиогенный эффект, который опосредуется как через HIF-1, так и сам ростовой фактор VEGF. Вероятно, процесс формирования новых сосудов при раке эндометрия опосредуется через HIF-зависимые факторы, на которые оказывает значительное влияние система ИФР и регулирующая ее состояние металлопротеиназа РАРР-А. Система ИФР в ткани РЭ обладает комплексными эффектами, что способствует росту пролиферативного потенциала опухоли и прогрессированию заболевания.

Лучшая безрецидивная выживаемость больных наблюдалась при снижении экспрессии PA28ß субъединицы протеасом менее порогового уровня, равного 118,5% (рисунок 7). Среди возможных механизмов этого явления имеет значение связь нарастания тяжести патологических изменений с активностью 20S протеасом, также продемонстрированную в представленном исследовании. Известно, что РА28 активаторный комплекс входит в состав 20S протеасомы, роль которых возрастает в патологических условиях.

Таким образом, при снижении пула 20S протеасом, который осуществляет протеолиз аномальных и короткоживущих белков, вероятно, происходит изменение состояния внутриклеточного протеолиза, что, в конечном итоге, приводит к улучшению прогноза заболевания.

Экспрессия РА28|}

10 16 20 25 30 Срок наблюдения в месяцах

более 118,5 менее 118.5

Рисунок 7 - Безрецидивная выживаемость больных РЭ в зависимости от порогового уровня экспрессии РА28Р, равной 118,5%

Роль внутриклеточных протеиназ в развитии и прогнозе ПКГШ. В ткани плоскоклеточных карцином происходило увеличение тотальной химотрипсинподобной активности протеасом, а также пулов 268 и 208 протеасом в 2,8; 1,8 и 1,4 раза, соответственно, по сравнению с гистологически неизмененной тканью (см. таблицу 2).

Высокая активность изучаемых протеасом и их пулов в опухоли связана с повышением экспрессии иммунных субъединиц ГМР7, ЬМР2 на 60, 47%, соответственно, активаторной субъединицы РА28 (3 на 22% и регуляторной субъединицы - Яр1б на 51% по сравнению с неизмененной тканью (рисунок 8). При этом тотальный пул протеасом в ПКГШ снижен, так как выявлено уменьшение уровня экспрессии а1«2аЗа5а6а7 субъединиц протеасом в опухоли на 27,2% по сравнению с показателем в нетрансформированной ткани. Высокая интенсивность процессов протеолиза в протеасомах в ткани ПКГШ сочеталась также с повышением активности кальпаинов. В опухоли активность кальпаинов составила 125,7 (67,0-256,0) -103 Ед/мг белка, что увеличено в 2,У раза по сравнению с гистологически неизменной тканью. Кальций зависимые ферменты совместно с протеасомами обеспечивают деградацию белков, а также играют важную роль в регуляции процессов подвижности опухолевых клеток.

а1 а2аЗ&5 29 кДа

á liffí 30 к Да

200 180 Б 160 140 120 % 100 80 60 40 20 0

Рисунок 8 - Экспрессия субъединиц протеасом в опухолевой и неизмененной ткани при ПКГШ: А - Вестерн блоттинг субъединиц протеасом в опухолевой и неизмененной тканях; Б - Содержание субъединиц протеасом в опухолевой ткани в процентном отношении к содержанию субъединиц протеасом в неизмененной ткани

Примечание: 1, 3 - в опухолевой ткани; 2, 4 - в неизмененной ткани; * - значимость различий по сравнению с неизмененной тканью р<0,05.

Изучение связи систем внутриклеточного протеолиза с клинико-морфологическими показателями выявило увеличение тотальной активности протеасом при увеличении критерия Т у больных ПКГШ. Тотальная активность протеасом увеличивалась в 2 раза у больных со стадией T3N0.2M0 по сравнению с больными со стадией T2NoM0. А активность кальпаинов была выше в 1,5 раза по сравнению с больными со стадией T2NoM0.

Поражение регионарных лимфоузлов у больных ПКГШ сопровождалось также усилением процессов внутриклеточного протеолиза, осуществляемого

ala !аЗа5 6а7 LMP7_LMP2_РА28Ь_Rpl6

иротеасомами и кальпаинами. В ткани ПКГШ у больных со стадией IYiN:M0 тотальная активность протеасом была увеличена в 1,8 и 2,4 раза, соответственно, по сравнению с больными со стадиями T2.:,N0M0 и T1.3N1M0. В ткани пациентов, имеющих Тг-з^Мо и T2.3N1M0 стадии заболевания, выявлено повышение активности кальпаинов в 1,2 и 1,7 раза, соответственно, по сравнению с больными со стадией 'IVjNqMo.

Рост активности протеасом, сочетающийся с поражением регионарных лимфоузлов, связан с изменением субъединичного состава протеасом. В местастазирующей опухоли выявлена низкая экспрессия LMP2 субъединицы протеасом, которая снижалась на 33,0 и 44,4%, соответственно, в ткани опухоли со стадией T2.3N2 по сравнению с больными со стадиями T;.3NoM0 и Tjoi^Mo.

Развитие и прогрессирование ПКГШ сопровождается изменениями экспрессии транскрипционных и ростовых факторов [Liang X., 2008]. Выявлено, что экспрессия NF-кВ зависела от наличия метастазов в регионарных лимфоузлах, причем эта зависимость носила сложный волнообразный характер (см. таблицу 3). Экспрессия ядерного фактора NF-kB р50 у больных со стадией T2.3N1M0 увеличивалась в 2,9 раз по сравнению с больными со стадией T:.-,N0M,). Дальнейшее увеличение количества пораженных лимфоузлов сопровождалось снижением экспрессии NF-кВ р50 в 3,7 раза по сравнению с больными со стадией Tj.jlN^Mo. В представленном исследовании показано колебание содержания транскрипционного фактора NF-кВ р50, которое было ассоциировано с лимфогенным распространением опухоли и с активностью протеасом. Поражение регионарных лимфоузлов приводило к росту активности протеасом и увеличению экспрессии транскрипционного фактора NF-кВ. Известно, что протеасомы способствуют появлению активных форм транскрипционного фактора NF-кВ, что связано с посттрансляционной модификацией полипептида р105 - предшественника NF-KBp50 [Moorthy А.К., 2008; JuvekarA., 2010].

Экспрессия транскрипционного фактора HIF-1 и фактора роста VEGF в ткани ПКГШ не была связана с клинико-морфологическими параметрами заболевания. Известно, что деградация транскрипционного фактора HIF-1 происходит в протеасомах [Klatte Т., 2007]. В представленном исследовании была показана связь между содержанием транскрипционного фактора NF-кВ и уровнем продукции фактора HIF-1, что, возможно, обеспечивает косвенное участие NF-кВ р50 в регуляции уровня ростового фактора VEGF и процесса неоангиогенеза в ткани ПКГШ. С другой стороны, известно, что транскрипционный фактор NF-кВ может активировать транскрипцию HIF-la и

за счет этого влиять на процесс образования новых сосудов [van Uden А., 2008; Goerlach А., 2008].

Резюмируя выше изложенное, участие внутриклеточных протеиназ в регуляции ими транскрипционных и ростовых факторов показано на всех стадиях опухолевого роста ПКГШ, приобретая большую значимость при развитии лимфогенного метастазирования.

Важным результатом проведенного исследования является подтверждение связи выживаемости больных с активностью внутриклеточных протеиназ и экспрессией транскрипционных факторов. Безметастатическая выживаемость больных с ПКГШ увеличивалась при уровнях экспрессии транскрипционных факторов NF-кВ р65, NF-кВ р50, HIF-1 менее 9,6; 7,8 и 9 УЕ/мг белка в лунке, соответственно. Общая выживаемость больных ПКГШ зависела от совокупности показателей активности протеасом: тотальной активности и активности 26S пула. Общая выживаемость больных значимо выше у больных ПКГШ с уровнями тотальной активности протеасом более 59,9-103 Ед/мг белка и активностью 26S протеасом более 20-10'' Ед/мг белка.

На основании данных дискриминантного анализа была рассчитана модель прогнозирования развития лимфогенных метастазов ПКГШ. В нее были включены такие важные показатели как степень дифференцировки опухоли, тотальная активность протеасом, активность 20S протеасом и, регулируемыми данными протеиназами, экспрессия транскрипционных факторов HIF-1 и NF-кВр50. В результате дискриминантные функции имели следующий вид:

Y1 = -39,5+28,6-Xl-0,05-X2+0,09-X3+l,4-X4-0,87-X5;

Y2= -23,6+20,1 -X1 -0,0003-X2+0,04-X3+0,84-X4-0,38 -Х5; где XI - степень дифференцировки (1-низко дифференцированная опухоль, 2 -умеренно дифференцированная, 3 - высоко дифференцированная;); Х2 -тотальная активность протеасом -10"5 Ед/мг белка; ХЗ - активность 20S протеасом -10"3 Ед/мг белка; Х4 - экспрессия HIF-1, УЕ/мг белка в лунке; Х5 -экспрессия NF-кВ р50, УЕ/мг белка в лунке;

Y1 характеризует низкую вероятность развития лимфогенных метастазов; Y2 - высокую вероятность. Если Y1>Y2, то прогнозируют высокую вероятность развития лимфогенных метастазов заболевания. Данная модель прогнозирования развития лимфогенных метастазов ПКГШ с большой диагностической эффективностью позволяет предсказать вероятность появления лимфогенных метастазов заболевания, что дает возможность скорректировать тактику лечения пациентов. Выделение группы больных, характеризующихся высокой вероятностью в отношении возникновения

лимфогенного метастазирования, позволяет определить оптимальные сроки динамического наблюдения и в случае прогрессирования заболевания принять своевременные лечебные меры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог проведенному изучению роли систем внутриклеточного протеолиза в патогенезе злокачественных новообразований, можно заключить, что развитие РП, РЭ, РМП, ПКГШ тесно связано с функционированием протеасом и кальпаинов. Это обусловлено протеолитической регуляцией транскрипционных факторов ИР-кВ, НИМ и ростовых факторов УЕОБ и ИФР, которые регулируют пролиферацию, апоптоз, миграцию и другие основные клеточные функции. Выявленные закономерности позволяют предложить комплексную схему, характеризующую вероятное участие протеолитических систем, ростовых и транскрипционных факторов в развитии опухолей (рисунок 9). Прогрессирование РМП и РЭ проходило, главным образом по пути развития локорегионарных рецидивов, с появлением которых была связана, главным образом, химотрипсинподобная активность пулов протеасом, а при РМП - и содержание ОТ-кВ р65. Развитие метастазов является более сложным и многоэтапным процессом, видимо, поэтому оно сопряжено с вовлечением большего количества регуляторных молекул. Так, лимфогенное метастазирование ПКГШ зависит от тотальной активности протеасом и содержания транскрипционных факторов ОТ-кВ р50 и Н1Р-1. Отдаленное метастазирование рака почки связано с тотальной активностью протеасом, содержанием транскрипционных факторов ОТ-кВ р50, Н1Р-1 и ростового фактора УЕОР. Представленная схема отражает возможность использования исследованных молекулярных показателей для прогноза злокачественных новообразований.

Обобщая представленные в работе данные, можно заключить, что системы внутриклеточного протеолиза играют важную роль в патогенезе злокачественных карцином головы и шеи, эндометрия, почки, мочевого пузыря, обуславливая их инвазивный рост и метастазирование. Кроме того установлено, что уровни показателей протеасомной системы и содержание транскрипционных факторов являются дополнительными факторами прогноза общей выживаемости, рецидивирования и метастазирования злокачественных новообразований. Разработаны математические модели индивидуальной оценки прогноза гематогенного метастазирования рака почки и лимфогенного метастазирования ПКГШ, что позволяет проведение дополнительной системной терапии опухолей этих локализаций.

Рисунок 9- Схема вероятного метастазирования и рецидивирования злокачественных новообразований в зависимости

от показателей внутриклеточного протеолиза, содержания транскрипционных факторов и VEGF Примечание: ПКГШ - плоскоклеточные карциномы головы и шеи, РМП - рак мочевого пузыря, РП - рак почки, РЭ -рак эндометрия, HIF-1 (hypoxia inducible transcription factor) - ядерный фактор, активируемый гипоксией, NF-кВ (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells) - ядерный фактор NF-кВ, VEGF (vascular endothelial growth factor) -сосудистый эндотелиальный факгор роста

выводы

1.У больных злокачественными новообразованиями отмечаются разнонаправленные сдвиги в химотрипсинподобной активности протеасом, связанные с их субъединичным составом. Выявлено повышение активности протеасом у больных раком эндометрия и плоскоклеточными карциномами головы и шеи, тогда как у больных раком почки отмечается снижение их активности. В то же время у больных раком мочевого пузыря наблюдается увеличение активности 268 пула протеасом по сравнению с условно нормальной окружающей тканью.

2. Выявлены органоспецифические изменения активности кальпаинов в опухолевой ткани больных злокачественными новообразованиями по сравнению с условно нормальной окружающей тканью. У больных раком мочевого пузыря и плоскоклеточными карциномами головы и шеи наблюдается повышение активности кальпаинов, в то время как у больных раком почки активность кальпаинов снижена.

3. Развитие гематогенных метастазов рака почки сопровождается снижением активности протеасом в ткани первичной опухоли, увеличением активности кальпаинов и содержания транскрипционных факторов ОТ-кВ р65, Н1Р-1сх и ростового фактора УЕСтР. В ткани рака почки активность 268 пула протеасом коррелирует с содержанием транскрипционного фактора Н1Р- 1а (р=0,04), а активность 208 пула с экспрессией ОТ-кВ р50 (р=0,02).

4. Увеличение глубины инвазии опухоли мочевого пузыря происходит на фоне снижения экспрессии ОТ-кВ р50 и повышения экспрессии транскрипционного фактора Н1Р-1 и ростового фактора УКОР. В опухолевой ткани больных раком мочевого пузыря выявлена прямая зависимость между экспрессией транскрипционного фактора №-кВ р50 и активностью кальпаинов (р=0,04).

5. По мере увеличения стадии рака эндометрия наблюдается повышение активности кальпаинов, 208 протеасом, содержания ЬМР2 и РА28Р субъединиц протеасом, снижение экспрессии транскрипционного фактора ОТ-кВ р50, а также повышение содержания транскрипционного фактора Н1Р-1а и ростового фактора УЕОР. Наблюдается связь активности 268 протеасом, содержания ядерного фактора ОТ-кВ р50 и ростового фактора УЕОБ с ЕЯ статусом и экспрессии транскрипционного фактора ЫР-кВ р50 с 1'11 статусом рака эндометрия.

6. У больных раком эндометрия выявлены регрессионные зависимости экспрессии ядерных факторов КБ-кВ р50 и ИР-кВ р65 от активности 20.8

пула протеасом (р=0,0019; р=0,043); экспрессии транскрипционного фактора HIF-la от тотальной активности протеасом (р=0,0019) и экспрессии металл опротеиназы РАРР-А (р=0,01); установлена ассоциация между содержанием ростового фактора ИФР-I и активностью 26S (р=0,01) и 20S (р=0,01) пулов протеасом.

7. В опухолевой ткани больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи с увеличением стадии опухоли происходит повышение тотальной активности протеасом, снижение экспрессии LMP2 субъединицы протеасом и изменение экспрессии транскрипционного фактора NF-KBp50. В ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи выявлены регрессионные зависимости экспрессии ядерного фактора NF-кВ р65 от тотальной активности протеасом (р=0,0009) и активности 20S пула протеасом (р=0,037) и экспрессии NF-кВ р50 от активности 20S пула протеасом (р=0,047).

8. Безметастатическая выживаемость больных раком почки выше при активности 26S и 20S пулов протеасом в опухоли менее 12,2-103 и 29,8-Ю3 Ед/мг белка, соответственно. Безрецидивная выживаемость лучше у больных раком мочевого пузыря при активности 26S пула протеасом в опухоли более 18- 10J Ед/мг белка, а у больных раком эндометрия она связана со снижением экспрессии PA28J3 субъединицы протеасом менее 118,5%. Общая выживаемость больных раком почки выше при регистрации тотальной активности протеасом и активности 20S пула протеасом в опухоли ниже 36,9-103 и 29,8-10' Ед/мг белка, соответственно, в то время как у больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи общая выживаемость выше при значениях тотальной активности протеасом и активности 26S пула протеасом более 59,9-103 и 20-103 Ед/мг белка, соответственно.

9. Содержание ростовых и транскрипционных факторов в тканях злокачественных новообразований влияет на выживаемость больных: безрецидивная выживаемость больных РМП увеличивается при коэффициенте NF-кВ р65/р50 в опухоли более 1,0; безметастатическая выживаемость у больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи улучшается при уровнях экспрессии в опухоли транскрипционных факторов NF-кВ р65, NF-кВ р50, HIF-la менее 9,6; 7,8 и 9 УЕ/мг белка в лунке, соответственно.

10. Создана модель прогнозирования развития гематогенных метастазов у больных раком почки, чувствительность и специфичность которой составляет 96% и 70%, соответственно. Для плоскоклеточных карцином головы и шеи рассчитана модель прогнозирования развития лимфогенных

метастазов. Чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели составила, соответственно, 96% и 90%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Применение модели прогнозирования развития гематогенных метастазов при раке почки позволит отработать оптимальную тактику ведения больных с данной онкопатологией. Дискриминантные функции имеют следующий вид: Y1 характеризует низкую вероятность в отношении развития гематогенных метастазов; Y2 — высокую вероятность в отношении развития гематогенных метастазов.

Y1 = -3,2+0,026-Х1+0,03-Х2-0,02-Х3+0,34-Х4+0,3-Х5;

Y2= -33,3-0,01 -Х1+0,11-Х2-1,2-ХЗ+1,57 X4+1,8 -Х5;

где XI - тотальная активность протеасом • 10° Ед/мг белка;

Х2 - Содержание VEGF, пг/мг белка;

ХЗ - Экспрессия HIF-1, УЕ/мг белка в лунке;

Х4 - Экспрессия NF-кВ р50, УЕ/мг белка в лунке;

Х5 - Коэффициент NF-кВ р65/50.

Чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели составляет, соответственно, 96% и 70%, диагностическая точность -88,9%.

Если Y1>Y2, то прогнозируют высокую вероятность развития гематогенных метастазов у больных раком почки

2. Рассчитана модель прогнозирования развития лимфогенных метастазов для ПКГШ, что в свою очередь влияет на объем и дальнейшую тактику лечения. В результате дискриминантные функции имеют следующий вид: Y1 характеризует низкую вероятность в отношении развития лимфогенных метастазов; Y2 - высокую вероятность в отношении развития лимфогенных метастазов.

Yl = -39,5+28,6-Xl-0,05-X2+0,09-X3+l,4-X4-0,87-X5;

Y2=-23,6+20,l-Xl-0,0003-X2+0,04-X3+0,84-X4-0,38 Х5;

где XI - степень дифференцировки (1 - низко дифференцированная

опухоль, 2 - умеренно дифференцированная, 3 - высоко

дифференцированная);

Х2 - тотальная активность протеасом • 10""' Ед/мг белка; ХЗ - активность 20S протеасом -10"3 Ед/мг белка; Х4 - Экспрессия HIF-1, УЕ/мг белка в лунке; Х5 - Экспрессия NF-кВ р50, УЕ/мг белка в лунке.

Чувствительность и специфичность полученной дискриминантной модели

составила, соответственно, 96% и 90%, диагностическая точность - 93%.

Если Y1>Y2, то прогнозируют высокую вероятность развития лимфогенных

метастазов у больных плоскоклеточными карциномами головы и шеи.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Спирина Л.В. Металлопротеиназы как регуляторы пеоангиогенеза в злокачественных новообразованиях [текст] / И.В. Кондакова, Е.В. Клншо, Г.В. Какурина, Д.А. Шишкин // Сибирский онкологический журнал. - 2007. - №1(21). - С. 67-71.

2. Спирина Л.В. Убиквитинзависимая и кальпаиновая протеолитические системы в развитии злокачественных новообразований [текст] / Кондакова И.В. // Профилактика и лечение злокачественных новообразований в современных условиях: материалы Российской научно-практической конференции с международным участием. 3-4 июля 2007 г. / ред. А.Ф. Лазарев. - С. 355-356.

3. Спирина Л.В. Убиквитинзависимая протеолитическая система при раке почки [текст] / И.В. Кондакова, Е.А. Усынин // ЛЕЧЕНИЕ РАКА В XXI ВЕКЕ: Сборник научных работ молодых специалистов-онкологов Уральского федерального округа. - Выпуск третий. - Челябинск: Иероглиф, 2008. - С. 77-78 / под редакцией А. В. Важенина.

4. Спирина Л.В. Содержание сосудистого эндотелиального фактора роста и ангиостатина в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи [текст] / Е.В. Клишо, И.В. Кондакова, Д.А. Шишкин, Е.Л Чойнзонов // Совершенствование онкологической помощи в современных условиях: материалы Российской научно-практической конференции с международным участием. 24-25 июня 2008 г. / ред. А.Ф. Лазарев. - С. 149.

5. Спирина Л.В. Регуляция ангиогенеза протеасомной системой при раке почки и мочевого пузыря [текст] / И.В. Кондакова, Е.А. Усынин, С.И. Винтизенко // Совершенствование онкологической помощи в современных условиях: материалы Российской научно-практической конференции с международным участием. 24-25 июня 2008 г. / ред. А. Ф.Лазарев. - С. 239-240.

6. Спирина Л.В. Регуляция ангиогенеза при злокачественных новообразованиях почки и мочевого пузыря [текст] / И.В. Кондакова, Е.А. Усынин, С.И. Винтизенко // Сибирский онкологический журнал. -2008. - № 4(28). - С. 65-70.

7. Спирина, Л.В. Роль внутриклеточного специфического протеолиза и онкогенезе [текст] / И.В. Кондакова // Вопросы онкологии. - 2008. - Т. 54. - С. 690-694.

8. Спирина Л.В. Иисулииоиодобные факторы роста и активность протеасом в опухолях эндометрия [текст] / Н.В. Бочкарева, И.В. Кондакова, Л.А. Коломиец, А.Л. Чернышева, Л.В. Спирина, С.Л. Стуканов, Т.В. Тропина, О.Н. Асадчикова // Сибирский онкологический журнал. - 2008. - № 5(29). - С. 31-36.

9. Спирина Л.В. Активность протеасом и их пулов в ткани рака эндометрия [текст] / А.Л. Чернышова // Материалы IV конференции молодых ученых им. Академика РАМН Н.В. Васильева 24 апреля 2008 г. Томск, Сибирский онкологический журнал приложение № 1 2009 г. - С. 187.

Ю.Спирина Л.В. Активность протеасом и их состав при злокачественных новообразованиях головы и шеи [текст] / И.В. Кондакова, Е.Л. Чойнзонов, С.Ю. Чижевская, М.Р. Мухамедов, Н.П. Шарова // Материалы III Конгресса с международным участием «Опухоли головы и шеи» 5-6 мая г. Сочи, Онкохирургия. - № 2. - 2009. - С. 91.

П.Спирина Л.В. Значение протеасом в развитии плоскоклеточных карцином головы и шеи [текст] / Е.В. Клишо, И.В. Кондакова, Е.Л. Чойнзонов, С.Ю. Чижевская, Д.А. Шишкин // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Проблемы современной онкологии», 9-10 июня 2009 г., г. Барнаул. - под ред. д.м.н., профессора Лазарева А.Ф. - 2009. - С. 272 - 273.

12.Спирина Л.В. Связь интра- и экстраклеточного протеолиза в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи [текст] / Е.В. Клишо, И.В. Кондакова, О.В. Савенкова, М.Р. Мухамедов, Н.П. Шарова // материалы Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития» 10-11 сентября 2009. г. Томск. - С.183-184.

13. Спирина Л.В. Протеасомы при раке почки и мочевого пузыря [текст] / И.В. Кондакова, Е.А. Усынин, С.И Винтизенко // Пути повышения эффективности онкологической службы Российской Федерации : материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, 24-26 июня 2009 г. - Казань : ИГМА-пресс. - 2009. - С. 198-200.

14.Спирина Л.В. Активность протеасом в тканях злокачественных опухолей различных локализаций [текст] / И.В. Кондакова,

Е.А. Усынин, Л.А. Коломиец, Е.Л. Чойнзонов, М.Р. Мухамедов, А.Л. Чернышева, Н.П. Шарова // Сибирский онкологический журнал.

- 2009. - № 5. - С. 49-52.

15.Спирина Л.В. Активность и субъединичный состав в плоскоклеточных карциномах головы и шеи [текст] / И.В. Кондакова, ЕЛ. Чойнзонов, Н.П. Шарова, С.Ю. Чижевская, Д.А. Шишкин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149. - С. 89-90.

16.Спирина Л.В. Активность протеасом и содержание ростовых факторов при раке почки, мочевого пузыря и эндометрия [текст] / И.В. Кондакова, Е.А. Усынин, Л.А., С.И. Винтизеико, Н.В. Бочкарева // Российский онкологический журнал. - 2010. - № 1. - С. 23 - 25.

17.Спирина Л.В. Активность протеасом и их субъединичный состав при раке почки и мочевого пузыря [текст] / И.В. Кондакова, Е.А. Усыпин, Н.П. Шарова // Онкоурология. - 2010. - № 3. - С. 12-15.

18.Спирина Л.В. Активность и субъединичный состав протеасом в опухолях головы и шеи [текст] / И.В. Кондакова, Е.Л. Чойнзонов, С.Ю. Чижевская, М.Р. Мухамедов, Н.П. Шарова // Вопросы онкологии. - 2010. - Приложение.

- С. 28.

19. Спирина Л.В. Миграция клеток и онкогеиез [текст] / И.В. Кондакова // Российский онкологический журнал. - 2010. - № 3. - С. 49-53.

20.Спирина Л.В. Активность протеасом в злокачественных карциномах головы и шеи: связь с клинико-морфологическими факторами [текст] / И.В. Кондакова, Е.Л. Чойнзонов, Н.П. Шарова, Д.А. Шишкин, С.Ю. Чижевская // Молекулярная медицина. - 2010. - № 5. - С. 18-20.

21. Спирина Л.В. Связь активности протеасом и их субъединичного состава при раке почки и мочевого пузыря с клинико-морфологическими параметрами заболевания [текст] / Е.А. Усынин // Материалы V конференции молодых ученых им. Академика РАМН Н.В. Васильева 23 апреля 2010 г. Томск, Сибирский онкологический журнал приложение № 1. - 2010. - С. 98-99.

22.Спирина Л.В. Субъединичный состав протасом в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи [текст] / И.В. Кондакова, Е.Л. Чойнзонов, С.Ю. Чижевская, Д.А. Шишкин, Н.П. Шарова // Материалы VI съезда онкологов и радиологов стран СНГ, 1-4 октября 2010 года, Душанбе. - С. 41.

23.Спирина Л.В. Активность протесом и их субъединичный состав при гиперпластических процессах и раке эндометрия [текст] / И.В. Кондакова, Л.А. Коломиец, А.Л. Чернышова, О.Н. Асадчикова, Н.П. Шарова //

Материалы VI съезда онкологов и радиологов стран СНГ, 1-4 октября 2010 года, Душанбе. - С. 42.

24.Спирина JI.B. Активность и субъединичный состав протеасом в опухолях женской репродуктивной системы [текст] / И.В. Кондакова, JI.B. Спирина, Е.Е. Шашова, В.Д. Коваль. JI.A. Коломиец, Е.М. Слонимская,

A.JI. Чернышова, Н.П. Шарова // Вопросы онкологии. - 2011. - № 2. - С. 39.

25.Спирина JI.B. Активность протеасом и их субъединичный состав при злокачественных новообразованиях различных локализаций [текст] // Сборник научных трудов. - 11 марта 2011 года. - Санкт-Петербург. -С. 52-56.

26.Спирина JI.B. Активность и субъединичный состав протеасом в гиперплазированном и неоплазированном эндометрии [текст] / В.Д. Коваль, JI.B. Спирина, О.В. Замкова // Сибирский онкологический журнал. - 2011. -Приложение. - С. 62.

27.Spirina L. Role of proteasome system in regulation of insuline-like growth factors and NF-kappaB in endometrial cancer [текст] / L. Spirina, N. Bochkareva, I Kondakova, L. Kolomiets, A. Chemyshova // The 17th International meeting of the European society of gynaecological oncology (ESGO)/ Milan, Italy, September 11-14. - Электрон, дан. - 2011. - 1 электр. опт. диск (CD-ROM)

28.Спирина JI.B. Внутриклеточные и внеклеточные протеиназы при метастазировании злокачественных новообразований [текст] / И.В. Кондакова, Е.В. Клишо, JI.B. Спирина, Г.В. Какурина, Е.В. Малахова, О.В. Савенкова, Д.А. Шишкин, E.JI. Чойнзонов, Н.П. Шарова // Тезисы докладов V Российский симпозиум «Белки и пептиды», Петрозаводск, 8-12 августа, 2011 года. - С. 125.

29.Спирина Л.В. Активность протеасом и их субъединичный состав при гиперпластических процессах и раке эндометрия [текст] / И.В. Кондакова, JI.A. Коломиец, АЛ. Чернышова, Н.П. Шарова,

B.Д. Коваль // Опухоли женской репродуктивной системы. - 2011. - JV» 4. - С. 64-67.

30. Спирина Л.В. Активность протеасом в опухолях женской репродуктивной системы [текст] / И.В. Кондакова, Е.Е. Шашова, Л.В. Спирина, В.Д. Коваль, Л.А. Коломиец, АЛ. Чернышова, Е.М. Слонимская// Биоорганическая химия. - 2012. - JV» 1. - С. 106-110.

31.Спирина Л.В. Регуляция инсулиноподобных факторов роста и NF-kappaB протеасомнон системой при раке эндометрия [текст] / Н.В. Бочкарева, И.В. Кондакова, Л.А. Коломиец, Е.Е. Шашова,

B.Д. Коваль, А.Л. Чернышова, О.Н. Асадчнкова // Молекулярная биология. - 2012. - Т. 46. - № 3. - С. 453-460.

32.Спирина, Л.В. Активность протеасом и пх субъединичиый состав в ткани рака эндометрия: связь с клинико-морфологическими параметрами [тек'ст] / И.В. Кондакова, В.Д. Коваль, JI.A. Коломиец, AJI. Чернышова, ЕЛ. Чойнзонов, Н.П. Шарова // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - № 4. - С. 491-494.

33.Спирина Л.В. Протеолитичеекая регуляция экспрессии ростовых факторов и HIF-1 при раке эндометрия [текст] / Н.В. Юнусова, И.В. Кондакова, Л.А. Коломиец, В.Д. Коваль, А.Л. Чернышова,

0.В. Шпилева // Сибирский онкологический журнал. - 2012. - № 2. -

C. 45-51.

34.Spirina, L.V. Association of growth factors, HIF-l and NF-кВ expression with proteasomes in endometrial cancer [текст] / N.V. Yunusova,

1.V. Kondakova, L.A. Kolomiets, V.D. Koval, A.L. Chernyshova, O.V. Shpileva // Mol. Biol. Rep. - 2012 - Vol. 39(9). - P. 8655-8662.

35.Спирина Л.В. Роль убиквитип-протеасомной системы в развитии рака эндометрия [текст] / В.Д. Коваль, И.В. Кондакова, Л.В. Спирииа // Вопросы онкологии. - 2012. - № 4. - С. 473-480.

36.Спирина Л.В.. Регуляция экспрессии транскрипционных факторов и фактора роста эндотелия сосудов протеасомной системой при метастазировании рака почки [текст] / И.В. Кондакова, Е.А. Усынин, З.А Юрмазов // Вестник РОНЦ им. H.H. Блохина РАМН. - Т. 23. - № 1. -С. 27-32.

37.Спирина, Л.В. Связь активности протеасом с экспрессией транскрипционных факторов NF-кВ, PIF и сосудистого эндотелиального фактора роста в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи [текст] / И.В. Кондакова, Е.Л. Чойнзонов, С.Ю. Чижевская, Д.А. Шишкин // Петровские чтения-2012: тезисы 8-й конференции по фундаментальной онкологии / ФГБУ НИИ онкологии им. H. Н. Петрова Минздравсоцразвития России (20 апреля 2012 г.). - СПб., 2012. - С. 138-139.

38.Спирина Л.В. Внутриклеточные протеиназы в новообразованиях эндометрия и регуляция ими белков, ассоциированных с клеточной подвижностью [текст] / В.Д. Коваль, Л.В. Спирина, О.В. Шпилева // Сибирский онкологический журнал: научно-практическое издание. - 2012. -Прил. №1. - С. 81-82. - Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии: седьмая региональная конференция молодых

ученых-онкологов, посвященная памяти академика РАМН Н. В. Васильева.

39.Спирина JI.B. Активность протеасом и кальпаинов в ткани плоскоклеточных карцином головы и шеи [текст] / С.Ю. Чижевская, Д.А. Шишкин // Сибирский онкологический журнал : научно-практическое издание. - 2012. - N Прил.№1. - С. 152-153. - Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии: седьмая региональная конференция молодых ученых-онкологов, посвященная памяти академика РАМН Н. В. Васильева.

40.Спирина J1.B. Активность и субъединичный состав протеасом в доброкачественных и злокачественных новообразованиях эндометрия [текст] / В.Д. Коваль, И.В. Кондакова, J1.B. Спирина, О.В. Замкова // Онкохирургия. - 2011. - Том 3, N 4. - С. 80-81. - Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии: материалы 11 Всероссийской конференции молодых ученых.

41.Спирина Л.В. Активность протеасом и кальпаинов при новообразованиях эндометрия [текст] / В.Д. Коваль, Л.В. Спирина, И.В. Кондакова, Л.А. Коломиец, О.В. Шпилева // Молекулярная медицина. - 2012. - № 4. - С. 45-48.

42.Спирина Л.В. Роль внутриклеточных протеиназ в регуляции экспрессии транскрипционных факторов HIF-1, NF-kB и фактора роста сосудов при лимфогеино.м метастазировании плоскоклеточных карцином головы и шеи [текст] / Е.Л. Чойнзонов, Л.В. Спирина, И.В. Кондакова, С.Ю. Чижевская, Д.А. Шишкин, Д.Е. Кульбакин // Бюллетень СО РАМН. - 2012. - № 6. - С. 15-21.

43.Спирина Л.В. Связь экспрессии металлопротеиназы РАРР-А с экспрессией ростовых и транскрипционных факторов при раке эндометрия [текст] / Н.В. Юнусова, Л.В. Спирина, И.В. Кондакова, Л.А. Коломиец, А.Л. Чернышева, В.Д. Коваль, В.В. Недосеков, О.В. Савенкова // Известия РАН. Серия биологическая. - 2013. - № 3. -

C. 284-291.

44.Spirina, L.V. // Expression of vascular endothelial growth factor and transcription factors HIF-1, NF-kB expression in squamous cell carcinoma of head and neck; association with proteasome and calpain activities [текст] / I.V. Kondakova, E.L. Choynzonov, S.Y. Chigevskaya, D.A. Shishkin,

D.Y. Kulbakin // J. Cancer Res. Clin. Oncol. - 2012 - V. 139. - P. 625-633.

45.Спирина Л.В. Определение онкологического риска у больных с

гиперпластическими процессами эндометрия на основе показателей

внутриклеточного протеолиза [текст] / Коваль, В.Д., JI.B. Спирина, Ю.М. Былина // Сибирский онкологический журнал: научно-практическое издание. - 2013. - Прил. №1. - С. 52-53.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ИФР (insulin-like growth factor, IGF) - инсулиноподобный фактор роста; ОГШ - опухоли головы и шеи;

ПКГШ - плоскоклеточные карциномы головы и шеи; РМП - рак мочевого пузыря; РП - рак почки; РЭ - рак эндометрия;

bFGF (basic fibroblasts growth factor) - основной фактор роста фибробластов; EGFR (epithelial growth factor receptor) - рецептор эпидермального фактора роста;

ER -рецепторы эстрогенов;

IGFBP (insulin-like growth factor binding protein) - белки, связывающие

инсулиноподобные факторы роста HIF-l (hypoxia inducible transcription factor family) - ядерный фактор,

активируемый гипоксией NF-кВ (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated В cells) - ядерный фактор NF-кВ

PAPP-A (pregnancy-associated plasma protein) - белок, ассоциированный

с беременностью PR -рецепторы прогестеронов;

TGF (transforming growth factor) - трансформирующий фактора роста VEGF (vascular endothelial growth factor) - сосудистый эндотелиальный фактор роста

VHL (von Hippel-Lindau) - белок фон Хиппель-Линдау

Тираж 100 экз. Заказ 758. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники. 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел. 533018.