Автореферат и диссертация по медицине (14.00.39) на тему:Клиническое значение антител к нуклеосомам и белкам теплового шока при системной красной волчанке

На правах рукописи

КОТОВСКАЯ Мария Андреевна

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АНТИТЕЛ К НУКЛЕОСОМАМ И БЕЛКАМ ТЕПЛОВОГО ШОКА ПРИ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКЕ

14.00.39 - Ревматология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□ОЗОб150Т

Москва - 2007

003061507

Работа выполнена в Государственном Учреждении Институте ревматологии Российской академии медицинских наук

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

АНАНЬЕВА Лидия Петровна

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита состоится 21 сентября 2007 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.018 01 при Государственном учреждении Институте ревматологии Российской академии медицинских наук (115522, Москва, Каширское шоссе, 34А)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Института ревматологии Российской академии медицинских наук (115522, Москва, Каширское шоссе, 34А)

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН НАСОНОВ Евгений Львович

доктор медицинских наук, профессор БАРАНОВ Андрей Анатольевич

Автореферат разослан

2007года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

ДЫДЫКИНА И.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы

Системная красная волчанка (СКВ) - системное аутоиммунное заболевание неизвестной этиологии, патогенетически связанное с такими нарушениями иммунорегуляции, которые являются причиной гиперпродукции широкого спектра органонеспецифических аутоан-тител к различным компонентам ядра и иммунных комплексов, вызывающих иммуновоспалительное повреждение тканей и нарушения функций внутренних органов (Насонова В А., Насонов Е.Л.,2003)

Основным компонентом лабораторной диагностики СКВ является выявление аутоантител к клеточным антигенам, преимущественно к ядерным, таких как антитела к гистонам (anti-HST), односпи-ральной и двухспиральной ДНК Антитела к двухспиральной ДНК (дсДНК) в настоящее время являются наиболее распространенным диагностическим маркерам СКВ Однако они выявляются, не более чем в 50 % случаев, а уровень антител к дсДНК не всегда коррелирует с активностью заболевания (Simon J. и соавт., 2004) Другой, широко известный маркер СКВ - антинуклеарные антитела (АНФ), имеют достаточно низкий уровень специфичности в связи с высокой частотой выявления АНФ не только при СКВ, но и при других аутоиммунных заболеваниях (Cairns А.Р и соавт,, 2003)

В широком спектре антиядерных антител, выявляемых при СКВ, особое внимание уделяется антителам к нуклеосомам. Нуклеосома состоит из двойной спирали ДНК, обмотанной вокруг специфического комплекса из восьми нуклеосомных гистонов (гистонового окта-мера). Нуклеосома представляет собой дисковидную частицу с диаметром около 11 нм, содержащую по две копии каждого из нуклеосомных гистонов (Н2А, Н2В, НЗ, Н4) (Foumel S. и соавт., 2002).

По данным Amoura Z и соавт, 2000, нуклеосомы играют роль превалирующих патогенетических антигенов у больных СКВ, а появление антител к нуклеосомам ассоциируется с органньми поражениями (Simon и соавт, 2004) Важно отметить, что у пациентов с СКВ при скрининговом исследование было отмечена корреляционная связь между уровнем антител к нуклеосомам и поражением почек и центральной нервной системы (Wilhams R и соавт , 2001) Более того, антитела к нуклеосомам, так же как и аутореактивные Т - хелпе-

ры, специфичные к нуклеосомам были определены в сыворотоках больных СКВ (Chabre и соавт , 1995, Lu L., 1999). На биологических моделях СКВ было показано, что антитела к нуклеосомам выявляются до развития заблевания Однако до настоящего времени вопрос о специфичности антител к нуклеосомам при СКВ остается дискуссионным (Rumore А и соавт., 1990) До настоящего времени нет убедительных данных о преимуществах этого теста перед выявлением дсДНК (Mm D J , 2002).

В процессе разработки новых тестов, которые давали бы представление о характере нарушения гуморального иммунитета при СКВ, обратила на себя внимание группа сравнительно недавно открытых внутриклеточных белков, получивших название "белки теплового шока" (БТШ (Hsp)) или "стрессовые белки" Эти белки недостаточно изучены, но уже имеющиеся данные свидетельствуют о том, что они высоко консервативны в процессе филогенеза (Lindqulst S., 1986), необычно полифункциональны и играют важную роль во многих внутриклеточных иммунобиохимических процессах как в экстремальных, так и в нормальных условиях (Polla В S , 1988).

Таким образом, поиск новых диагностических маркеров является актуальным направлением в исследованиях, посвященных системной красной волчанке

Цель исследования

Изучить клиническое значение антител к нуклеосомам и белкам теплового шока при системной красной волчанке больных

Задачи исследования

1 Определить частоту повышения антител к нуклеосомам в сыворотках больных СКВ и их связь с клинико - лабораторными проявлениями СКВ

2 Проанализировать связь уровня антител к нуклеосомам с антителами к дсДНК

3 Выявить уровень и частоту повышения антител к связанным гис-тонам в сыворотках больных СКВ, их связь с клинико-лабораторными параметрами СКВ

4 Исследовать уровень и частоту повышения антител к белкам теплового шока в сыворотках больных СКВ

Научная новизна

Впервые в настоящей работе на большом клиническом материале проведено одновременное исследование сывороточных концентраций антител к нуклеосомам, компонентам нуклеосом - гистонам и белкам теплового шока у больных СКВ, и проведено их сопоставление с клинико - лабораторными проявлениями и активностью этого заболевания

Выявлена связь антител к нуклеосомам у больных СКВ с поражением почек, центральной нервной системы и активностью заболевания

Впервые проведен детальный анализ клинических проявлений СКВ в зависимости от степени повышения уровня антител к гистонам Выявлена связь антител к гистонам Н2А и Н2В с поражением почек и центральной нервной системы у больных СКВ.

Впервые отмечена ассоциация уровня антител к пептиду убик-витина 42-76 с активностью СКВ

Практическая значимость

1 Определение антител к нуклеосомам имеет диагностическое значение при СКВ

2 Определение уровня антител к нуклеосомам целесообразно для определения активности СКВ

3. У больных СКВ с поражением почек целесообразно определение антител к нуклеосомам для оценки активности почечного процесса

Положения, выносимые на защиту

1. При СКВ с высокой частотой выявляются антитела к нуклеосомам

2 Одновременное определение антител к нуклеосомам и к дсДНК позволяет повысить чувствительность и специфичность лабораторной диагностики СКВ

3 У больных СКВ уровень антител к нуклесомам достоверно связан с клиническими и лабораторными параметрами, характеризующими активность заболевания

4. Повышение уровня антител к нуклеосомам у больных СКВ ассоциируется с поражением почек, ЦНС и активностью заболевания

Внедрение в практику

Основные результаты работы используются в клинике ГУ Института ревматологии РАМН

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы 1 статья, 3 тезиса.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 6-ой Европейской конференции по СКВ (Лондон, 2005), на заседании ревматологической секции Московского научного терапевтического общества (Москва, 2006) Первичная экспертиза диссертации проведена на заседании Ученого Совета ГУ Института ревматологии РАМН 19 июня 2007 года.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 94 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и указателя лите-

ратуры, содержащего 7 отечественных и 123 зарубежных источников Диссертация проиллюстрирована 24 таблицами и 21 рисунком

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы исследования

Работа проводилась в рамках совместного научного исследования «Роль антител к нуклесомам при СКВ» между ГУ Институт ревматологии РАМН и Институтом молекулярной и клеточной биологии (Франция)

В основу работы положены результаты клинико - иммунологического обследования 85 больных с системной красной волчанкой, находившихся на стационарном лечении в клинике ГУ Институт ревматологии РАМН, а так же 85 пациентов с СКВ, проходивших обследование в клинике University of New Mexico School of Medicine, Albuquerque (США) за период с 2002 по 2004 год Все больные имели достоверный диагноз СКВ. Достоверность диагноза подтверждалась наличием не менее 4-х критериев Американской Коллегии Ревматологов (1997 г), поражение центральной нервной системы при СКВ диагностировалось согласно классификации Американской Коллегии Ревматологов (1999 г) (Hochberg М.С, 1997, ACR, 1999) В группу сравнения были включены пациенты с ревматоидным полиартритом (РА) (п=36) и болезнью Шегрена (БШ) (п=31). Группа контроля состояла из 45 здоровых доноров, сопоставимых по полу и возрасту

Группа больных СКВ состояла из 19 (11,1%) мужчин и 151(88,9%) женщины в возрасте от 14 до 81 года. Средний возраст больных на момент включения в исследование равнялся 34,6+13,8 лет (m±SD) Основную часть обследованных больных - 61,1 % - представляли пациенты в возрасте от 21 до 40 лет На время обследования 26 больных (15,2%) были моложе 20 лет и 17 больных (10%) - старше 50 лет Продолжительность заболевания варьировала от 1 месяца до 17 лет, составляя в среднем 86 + 59,9 месяца

Частота клинических и лабораторных проявлений СКВ у больных на момент обследования представлена в таблицах 1, 2

Таблица 1

ПРОЯВЛЕНИЯ " > > • ПАЦИЕНТЫ •

* ' ».о" ,> ' * 4 (%) . '

ЭРИТЕМАТОЗНЫЕ ПОРАЖЕНИЯ КОЖИ 50 29,4

ПОРАЖЕНИЕ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛОЧЕК (язвенный стоматит) 36 21,1

АРТРИТ/ АРТРАЛГИИ 56 32,9

ПОЛИСЕРОЗИТ (перикардит и/или плеврит) 28 16,4

НЕФРИТ 51 30

- из них с нефротиче-ским синдромом 10 5,8

ПОРАЖЕНИЕ ЦНС 36 21,1

Анемия (гемоглобин < 100 г/л) 14 8,2

Лейкопения <2,7х109/Л < 3,4 х109/л 14 15 8,2 8,8

Тромбоцитопения <100 х 109/л 8 4,7

АНФ 68 40

За весь период болезни в обследованной группе с наибольшей частотой встречались такие клинические проявления СКВ, как поражение кожи (29,4%), артриты (32,9%), нефрит (30%), поражение ЦНС (21,1%) Поражения ЦНС проявлялось органическими поражениями, мигненозными головными болями и интеллектуально-мнестическими нарушениями и их сочетанием. Среди лабораторных нарушений с одинаковой частотой выявлялась анемия и лейкопения (8,2% и 8,2% соответственно) Антинуклеарный фактор в диагностических титрах регистрировался у 40% больных

Характер течения и активность СКВ по классификации В.А Насоновой (1972), а так же по SLEDAI (SLE Activity Index) (Gladman D D и соавт., 2002) представлена в таблице 2

Степень активности и характер течения СКВ

Таблица 2

- • Параметр количество '» i %з * ' '

SLED AI, баллы Mean 10,7 (SD 8 9)

Активность СКВ

I 67 39,4

II 77 45,2

III 26 15,2

Характер течения

Острый 28 16,4

Подострый 39 22,9

Хронический 103 60,5

Большинство больных СКВ имели хронический характер течения заболевания (60,5%) и минимальная (I) степень активности (42%)

При включении в исследование больным проводилось полное клиническое, лабораторное обследование по единому протоколу

Рентгенография грудной клетки выполнялась в рентгенологическом отделении ГУ Институт ревматологии (заведующая отделением - И.А.Удельнова)

Электрокардиографическое, эхокардиографическое и ультразвуковое исследование печени, селезенки, почек (при необходимости и других внутренних органов) проводилась в лаборатории функциональной диагностики (руководитель - профессор Э.С Мач)

Исследование гематологических, биохимических показателей крови и анализов мочи проводилось унифицированным методом в биохимической лаборатории (заведующая лабораторией -к б н Л.Н.Кашникова).

Иммунологическое обследование больных выполнялось в лаборатории клинической иммунологии (руководитель - профессор А И Сперанский), а так же на базе Института молекулярной и клеточной биологии (директор - С Мюллер) (Франция)

Антинуклеарный фактор (АНФ) определяли методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием срезов печени крыс

Антитела к нуклеосомам определяли иммуноферментным методом (ИФМ) с использованием коммерческих наборов (Quanta lite, США), согласно инструкции фирмы производителя Верхняя граница нормальной концентрации составляла 25 ЕД/мл (Mean + 3SD), что соответствует рекомендациям фирмы производителя, полученным при исследовании 300 сывороток здоровых доноров, а так калибро-

вочная кривая сверена с собственными данными, которые были получены при исследовании 45 сывороток здоровых доноров Калибровочная кривая зависимости оптической плотности стандарта от концентрации антинуклеосомальных антител в представлена на рисунке 1.

Антинуклеосомагъные антитела ЕД/мл

Рисунок 1 Калибровочная кривая зависимости оптической плотности стандарта от концентрации антинуклеосомальных антител

Антитела к двухспиральной ДНК определяли ИФМ с использованием коммерческих наборов (Quanta lite, США), согласно инструкции фирмы производителя. Верхняя граница нормальной концентрации (Cut off) составляла 20 ЕД/мл (Mean + 3SD), что соответствует рекомендации фирмы производителя, полученным при исследовании 150 сывороток здоровых доноров Калибровочная кривая концентрации антинуклеосомальных антител сверена с данными, которые были получены при исследовании 45 сывороток здоровых доноров в данном исследовании Калибровочная кривая зависимости оптической плотности стандарта от концентрации антител дсДНК представлена на рисунке 2.

/ 1

1

/

✓ {

J

/

О 20 40 60 во

Антитела дсДНК ЕД/мл

коммерческий набор

еобствамыа рвууг^таты_

Рисунок 2 Калибровочная кривая зависимости оптической плотности стандарта от концентрации антител к дсДНК

Антитела к гистонам Н2А, Н2В, НЗ, Н4 определяли ИФМ. Пептиды к гистонам Н2А, Н2В, НЗ, Н4 были синтезированы и очищены в Институте молекулярной и клеточной биологии Верхняя граница нормальной концентрации была определена по уровню Mean + 3SD, полученному при исследовании 60 здоровых доноров. Cut off определялся в единицах оптической плотности (ед.ОП) и составлял 0,20 ед ОП, 0,20 ед.ОП, 0,46 ед ОП и 0,5 ед.ОП соответственно.

Антитела к белкам теплового шока (Hsp 60, Hsp 70, Hsp 90) определяли ИФМ с использованием коммерческих материалов (Stressgen bioreagents corp, USA) Рекомбинантный человеческий Hsp 60 (концентрация протеина 0,85 мг/мл), рекомбинантный человеческий Hsp 70 (концентрация протеина 1,25 мг/мл), рекомбинантный человеческий Hsp 90 (концентрация протеина 1,05 мг/мл). Верхняя граница нормальной концентрации была определена по уровню Mean + 3SD и составляла 0,20 ед ОП, 0,20 ед ОП и 0,20 ед ОП соответственно

Антитела к белкам теплового шока (Убиквитину, пептиду уби-квитина 22-45 цистеин и пепетиду убиквитина 42-76) определяли ИФМ. Пептиды к убиквитину, пептиду убиквитина 22-45 цистеин и пептиду 42-76 были синтезированы и очищены в Институте молекулярной и клеточной биологии. Верхняя граница нормальной концентрации была определена по уровню Cut off (Mean + 3SD) и составляла 0,21 ед.ОП, 0,20 едОП и 0,23 ед.ОП соответственно Чувствительность и специфичность определения аутоантител в диагностике СКВ рассчитывали согласно рекомендациям Е.С (Vamvakas Е.С , 1998).

Статистический анализ проводился по программе на Statistica 7.0 (Statsoft, США). Применялись методы описательной статистики, непараметрические методы Значения уровней антител представлены в виде среднего ± стандартное отклонение. Разница концентраций между двумя сравниваемыми группами оценивалась с помощью непараметрического теста Манна-Уитни, при сравнении более двух групп наличие достоверности различий оценивалось по критерию Краскела - Уоллиса Выполнялся расчет описательных статистик, для оценки взаимосвязи двух признаков применялся непараметрический корреляционный анализ по методу Спирмена, результаты которого представлены коофицентом корреляции г и точным значение р.

Результаты исследования Антитела к нуклеосомам в исследуемых группах больных

Определение антител к нуклеосомам было проведено у 237 исследуемых больных (170 СКВ, 36 РА, 31 БШ) и 45 доноров группы контроля. В сыворотках доноров уровень антител к нуклеосомам варьировал от 0,26 ЕД/мл до 22,5 ЕД/мл, составляя в среднем 8,3 + 5,2 ЕД/мл. В сыворотках больных РА уровень антител к нуклеосомам определялся в диапазоне от 0,14 до 54,5 ЕД/мл, составляя в среднем 10,9 + 13,7 ЕД/мл, а в группе с БШ от 0,16 до 52,5 ЕД/мл средний уровень составлял 15,7 ± 11,5 ЕД/мл. Содержание антител к нуклеосомам у больных СКВ варьировало от 0,45 до 221,6 ЕД/мл, а их средние показатели 74,5 ± 62,9 ЕД/мл Увеличение уровня антител к нуклеосомам > 25 ЕД/мл отмечено у 112 пациентов СКВ (65,8%), 1 пациента с РА (2,8%), а у 5 пациентов с БШ (16,1%). Уровень антител к нуклеосомам достоверно превышали показатели контрольной группы и групп больных РА и первичным БШ (р<0,05)(рисунок 3).

240 220 200 1S0 160 140 120 100 80 во

40

20 О 20

л=170 п=36 п=31 п=45

Рисунок 3 Уровень антинуклеосомальных антител у больных СКВ, РА, БШ и доноров

Больные СКВ в зависимости от результатов определения уровня антител к нуклеосомам были разделены на две подгруппы- с повышенным уровнем антител к нуклеосомам (>25 ЕД/мл) п = 112 и с нормальным уровнем (<25 ЕД/мл) п=58 (таблица 3).

Таблица 3

Частота основных клинических проявлений СКВ в зависимости от уровня _______ __антител к нуклеосомам

ПРОЯВЛЕНИЯ , " Антитела к нуклеосомам >25'ЕД/мл 1 ' Антитела ч ■кнуклеосомам Г „<25ЕД/Ш1, • у "4 1 1

. п=П2 5 ъ " п =5$ • . £ ""> ■ •

ЭРИТЕМАТОЗНЫЕ ПОРАЖЕНИЯ КО- 21 (18,7%) 29 (50%) нд

ЖИ

ПОРАЖЕНИЕ СЛИЗИСТЫХ ОБОЛО- 17 (15,2%) 19 (32,7%) н д

ЧЕК (язвенный стоматит)

АРТРИТ/ АРТРАЛ-ГИИ 38 (34%) 18(31%) Н.Д

ПОЛИСЕРОЗИТ 21 (18,7%) 7 (12%) 0,028

НЕФРИТ 46 (41%) 15 (25,8%) 0,0034

- из них с нефроти- 8 (7,1%) 2 (3,4%) 0,05

ческим синдромом

ПОРАЖЕНИЕ ЦНС 27 (24,1%) 9 (15,5%) 0,021

Анемия нд

(гемоглобин <100 г/л) 7 (6,25%) 7 (12%)

Лейкопения

<2,7х 10% <3,4х109/л 6 (5,3%) 8 (7,1%) 8 (13,8%) 7(12%) н.д Н.Д

Тромбоцитопения <100х109/л 5 (4,5%) 3 (5,2%) НД

АНФ 54 (48,2%) 14 (24,1%) 0,001

БЬЕОАГ, баллы 11,1 4Д 0,002

Активность СКВ

I II III 44 (39,3%) 49 (43,7%) 19 (17%) 23 (39,6%) 28 (48,3%) 7 (12%) н.д нд 0,05

Характер течения Острая Подострая Хроническая 21 (18,7%) 26 (23,2%) 65 (58%) 7 (12%) 13 (22,4%) 45 (77,6%) 0,048 н д нд

Статистически значимые различия между двумя группами больных были отмечены в первую очередь в отношении поражения почек, центральной нервной системы, полисерозита (р<0,05). Так же выявлены достоверные различия в активности СКВ: у больных с повышенным уровнем антител к нуклеосомам по сравнению с нормальным уровнем чаще регистрировалась III степень активности заболевания и реже I и II степени Такое соотношение сохранялось и балльной оценке активности заболевания с использованием индекса оценки активности SLEDAI (р<0,05).

Согласно литературным данным антитела к нуклеосомам превосходят по диагностической значимости антитела к дсДНК [Haddouk S и соавт, 2004, Decker Р, 2006] В нашем исследовании выявлена прямая корреляция выявления повышенного уровня антител к нуклеосомам и антител к дсДНК (г=0,70, р<0,0001) При анализе чувствительности и специфичности метода определения антител к нуклеосомам и к дсДНК было установлено, что при одновременном определении антител к нуклеосомам и дсДНК уровни чувствительности и специфичности наиболее высоки (таблица 4)

Таблица 4

Чувствительность и специфичность антител к нуклеосомам и к дсДНК при ____________СКВ, % _________

Показатель • VI . * i . - ' ... . Чувствительность * ~ Специфичность * *'

Антитела к нуклеосомам IgG 67,5% 92,5%

Антитела к дсДНК IgG 71,2% 91,7%

Антитела к нуклеосомам IgG и антитела к дсДНК IgG 86% 98,8%

Имеются данные о повышении уровня антител к нуклеосомам у больных СКВ и о тесной ассоциации их концентрации с активностью воспалительного процесса при СКВ. Оийеггег-АсИапгеп О А и соавт. (2006) выявил достоверную корреляцию активности заболевания и уровня антител к нуклеосомам, в то время как антитела к дс ДНК не отражали такой зависимости, а в другом исследовании уровень концентрации антител к нуклеосомам коррелировал и такими показате-

лями активности СКВ, как антитела к дс ДНК (Saisoong S и соавт., 2006) В проведенном нами исследовании, повешенный уровень как антител к нуклеосомам, так и антител к дсДНК кррелировал с активностью заболевания. При статистическом анализе выявлена прямая корреляция частоты выявления повышенного уровня антител к нуклеосомам и антител к дсДНК и индекса SLED AI (r=0,35, р<0,01 и г=0,31, р<0,01 соответственно)

При проведении сравнительной характеристике пациентов СКВ с положительным уровнем антител к нуклеосомам (>25 ЕД/мл) и антител к дсДНК (>20 ЕД/мл) статистически значимые различия между группами больных выявлены не были. В обеих группах были отмечены поражения почек, центральной нервной системы и полисерозита (р<0,05).

Достоверные различия в активности СКВ- у больных в обеих группах как с повышенным уровнем антител к нуклеосомам так и с повышенным уровнем к дсДНК по сравнению с нормальным уровнем чаще регистрировалась III степень активности заболевания и реже I и II степени. Такое соотношение сохранялось и балльной оценке активности заболевания с использованием индекса оценки активности SLEDAI (р<0,05)

Одним из наиболее часто встречающихся проявлений СКВ в обследованной группе было поражение почек У больных с нефритом концентрация антител к нуклеосомам была достоверно выше, чем у больных без поражения почек (р = 0,0023). Детальный анализ продемонстрировал, что максимальные уровни (достоверные) антинуклео-сомальных антител определялись у больных с нефритом с нефроти-ческим синдромом (НС) при сравнении с больными с нефритом без НС и больными без поражения почек (р<0,05) (рисунок 5)

Рисунок 5. Концентрация антител к нуклеосомам у больных с поражением почек и с различной патологией почек.

(1)-без нефрита, (2)- нефрит, (3)-нефритс нефротическим синдромом.

В нашем исследовании уровень антител к нуклеосомам был достоверно выше в группе с поражением ЦНС (р=0,001). При этом концентрация антител к нуклеосомам была достоверно выше, чем уров-нень антител к дсДНК (р=0,0034).

Антитела к пистонам в исследуемых группах

ГГо данным литературы антитела к гистонам бнаружевы при СКВ в 30 - 70% случаев при РА в 5-50%, склеродермии в 5-45%, еш-лимиозите/дерматомиозите в 20% случаев (5ЬоепГе1с1 У. И соавт., 2006). Уровени антител к гистонам Н2А и Н2В достоверно превышали показатели контрольной группы и ирупп больных РА и БШ (р<0,0 5). С одержан не антител к гистону Н2А у больных СКВ варьировало от 0,11 до 0,345 ЕД о.п., а их средние показатели 0,176 + 0, ¡34 ЕД о.п. Увеличение уровня антител к гистону Н2А > 0,20 ЕД о.п. отмечено у 74 пациентов СКВ (43,5%). 1 пациентов с РА (0,5%), а у 5 пациентов с БШ (2,9%). Содержание антител к гистону Н2В у больных СКВ варьировало от 0,16 до 0,415 ЕД о.п., а их средние показатели 0,212 + 0,174 ЕД о.п. Увеличение уровня антител к гистону Н2В > 0,20 ЕД о.л. отмечено у 85 пациентов СКВ (50%), у ни одного из пациентов с РА (0%), а у 3 пациентов с БШ (1,7%). Уровни антител к

гистонам НЗ и Н4 не превышали показатели контрольной группы и групп больных РА и БШ (р>0,05).

Статистически значимые различия повышенного уровня антител к гистонам Н2А и Н2В по сравнению с нормальным уровнем были отмечены в отношении поражения почек и центральной нервной системы, и активности заболевания (р<0,05).

Таким образом, определение гистонов Н2А и Н2В имеет достоверное значение при поражении у больных СКВ почечной ткани и ЦНС, а так же при оценке активности заболевания, что подтверждает гипотезу (Burlingame R W. и соавт , 1994) о раннем распознавании эпитопов нативного хроматина при поражении почечной ткани и вероятно ЦНС.

Антитела к белкам теплового шока в исследуемых группах

В современной литературе имеются лишь единичные публикации о роли и значимости антител к белкам теплового шока при аутоиммунных заболеваниях При сравнении уровня антител к БТШ 90, 70 и 60 при различных аутоиммунных заболеваниях, значимое повышение было определено лишь в группе смешанных заболеваний соединительной ткани (Horvath L И соавт., 2001). У больных СКВ уровень антител к убиквитину и его пептидам определяется в 80 % случаев, а при иных аутоиммунных заболеваниях антитела к «малым» БТШ описаны менее в 15% случаев (Muller S и соавт ,1988) В нашем исследовании средние уровни антител к высокомолекулярным БТШ статистически не отличались от уровней в группе доноров Однако средний уровень антител к низкомолекулярному белку убиквитину был достоверно выше при СКВ, РА и БШ по сравнению с группой доноров. При этом статистически значимых различий между группами выявлено не было Антитела же к пептидам убиквитина с аминокислотной последовательностью 22-45 цистеин и 42-76 достоверно превышали показатели контрольной группы и групп больных РА и БШ (р=0,023 и 0,04 соответственно) (табл 5)

Таблица 5

Средний уровень концентрации антител к БТШ у больных СКВ и доноров

Показатель (п=170) ЕДо.п. Меап + вВ/ -- ЕД £>.п. ВШ ' , < (п~31) Меап+50, ЕДол. , Доноры *■> "<№=45)7 ,% Меаа %'Ш», '' - ЕДо.п., *

Антитела к БТШ 90 0,24 + 0,19 0,21 + 0,23 0,20 ±0,18 0,06 ±0,02

Антитела к БТШ 70 0,20 + 0,10 0,24 ± 0,2 0,20 ±0,13 0,08 ± 0,04

Антитела к БТШ 60 0,16 + 0,16 0,26 ± 0,22 0,19 ±0,14 0,12 ± 0,04

Антитела к убиквитину 0,38 + 0,59* 0,34 + 0,26* 0,3 ±0,21* 0,060 ± 0,02

Антитела к пептид убиквитина 22-45 цис-теин 0,34+0,40" 0,17 + 0,14 0,21 ±0,21 0,07 ± 0,02

Антитела к пептид убиквитина 42-76 0,37 + 0,30" 0,26 + 0,23 0,21 ±0,21 0,07 ± 0,04

Примечание. * - р<0,05 по сравнению с группой доноров, ** - р<0,05 по сравнению с группами РА, первичным СШ и группой доноров

Наиболее тесные ассоциации были выявлены между антителами к пептиду убиквитина 42-76 и активностью заболевания (г=0,41, р=0,006) (рисунок 6).

з

К 0670 с

г

Рисунок 6 Ранговая корреляция Спирмена между уровнем пептида убиквитина 42-76 и активностью СКВ по БЬЕОА!

Таким образом, повышенный уровень антител к пептиду убик-витина 42-76 ассоциируется с активностью заболевания.

Связь между антителами к нуклеосомам, дсДНК, гистонам и белкам теплового шока с клинико-лабораторными параметрами

Установлены тесные корреляционные взаимосвязи между антителами к нуклеосомам, дсДНК, гистонами Н2А и Н2В, а так же убик-витином и его пептидами 22-45 цистеин и 42-76 (р<0,05) Выявлена положительная корреляция между повышенным уровнем антител к гистонам Н2А и Н2В и антителами к белкам теплового шока - пептидами убиквитина 22-45 цистеин и 42-76(р<0,05)

Больные с одновременным определением нескольких типов ау-тоантител были разделены на 2 подгруппы в зависимости от типов, определяемых антител, у 17 больных (10%) одновременно определялись антитела к нуклеосомам, дсДНК, гистонам Н2А и Н2В, убикви-тину и его пептидам (22-45 цистеин и 42-76) (группа 1), и у 35 (20,5%) одновременно определялись антитела к гистонам Н2А и Н2В и к пептидам убиквитина 22-45 цистеин и 42-76 (группа 2). Лабора-торно-клиническая характеристика больных обеих групп представлена в таблице 6

Таблица 6

Клинико-лабораторные показатели у больных с различными аутоантителами

при СКВ _

Параметр Группа I - , п=10 V*' , Грухцга2 * ' , '' ; ' №=35 -' »

ВОЗРАСТ, лет 41,7(11,3) 32,4 (6,3)

ДЛИТЕЛЬНОСТЬ БОЛЕЗНИ, мес. 67,2 ± 45,8 74,7 + 55,1

ЭРИТЕМАТОЗНЫЕ ПОРАЖЕНИЯ КОЖИ 3 (30%) 8 (22,8%)

НЕФРИТ 7 (70%) 6(17,1%)*

ПОРАЖЕНИЕ ЦНС 1 (10%) 1 (2,8%)

АРТРИТ/АРТРАЛГИИ 5 (50%) 10 (28,5%)

ПОЛИСЕРОЗИТ 2 (20%) 1 (2,8%)

Анемия (гемоглобин <100 г/л) 3 (30%) 3 (8,5%)

Лейкопения < 3,4 х Ю9/л 4 (40%) 5 (14,2%)

Тромбоцитопения <100 х 109/л 3 (30%) 2 (5,7%)

БЬЕЭА!, баллы 6,5 (4,2) 7,2 (5,6)

Примечание * - достоверность различий между группами (р<0,05)

Обращает на себя внимание, что в обеих группах длительность заболевания не превышала 10 лет, во второй группе пациенты были моложе Статистические достоверные различия между группами наблюдались только в отношении развития нефрита (р<0,05).

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что антитела к нуклеосомам, гистонам Н2А и Н2В и низкомолекулярным белкам теплового шока при системной красной волчанке являются новыми высокочувствительными диагностическими маркерами, которые дают возможность мониторирования прогрессирующих поражений жизненно важных органов и систем, предопределяющих прогноз больных СКВ

ВЫВОДЫ

1. У пациентов СКВ частота обнаружения и средний уровень антител к нуклеосомам, гистонам Н2А и Н2В, низкомолекулярным белкам

теплового шока - пептиду 22-45 цистеин и 42-76 был достоверно выше, чем в контрольной группе (здоровые доноры), и у пациентов

РА и БШ (р<0,05) При этом в сыворотке крови больных СКВ по-

ложительный уровень антител к нуклеосомам был выявлен в 65,8% случаев, антител к гистонам Н2А и Н2В в 43,5% и 50% случаев соответственно, антител к пептиду убиквитина 22-45 цистеин и пеп-

тиду убиквитина 42-76 в 21,7% и 24,1% случаев соответственно.

2 У пациентов СКВ отмечена положительная корреляция уровня ан-

тител к нуклеосомам и антител к дсДНК (г=0,70, р<0,0001). Чувст-

вительность и специфичность антител к нуклеосомам и антител к

дсДНК была сходной (67,5% , 92,5% и 71,2% и 91,7% соответст-

венно) Определение антител к нуклеосомам наряду с антителами к дсДНК улучшает чувствительность и специфичность диагностики СКВ (86% и 98,8% соответственно).

3 У пациентов СКВ с волчаночным нефритом средний уровень антител к нуклеосомам был выше, чем у больных без поражения почек (74,5 ±41,2 ЕД/мл и 46,4 ± 26,9 ЕД/мл, соответственно, р<0,05). У пациентов с нефритом с нефротическим синдромом было отмечено наиболее существенное увеличение концентрации антител к нуклеосомам (89,6 + 62,9 ЕД/мл, р<0,05), чем у пациентов без нефро-тического синдрома (52,3 + 23,9 ЕД/мл, р<0,05).

4 Уровень антител к нуклеосомам у больных СКВ с поражением ЦНС был выше по сравнению с таковыми у больных без поражения ЦНС (88,1 ± 51,6 ЕД/мл и 56,4 ± 48,7 ЕД/мл соответственно, р=0,001)

5 Выявлена связь уровня антител к нуклеосомам с активностью СКВ по SLEDAI (г=0,35, р<0,01) Средние уровни антител к нуклеосомам у больных со второй и третьей степенями активности СКВ были достоверно выше по сравнению с таковыми у больных с первой степенью активности заболевания (р<0,05)

6 Отмечена связь сывороточного уровня антител к гистонам Н2А и Н2В с поражением почек и ЦНС при СКВ (р<0,05) и активностью заболевания по SLEDAI (г=0,38, р=0,0016 и г=0,42, р=0,0012 соответственно)

7. Установлена взаимосвязь уровня пептида убиквитина 42-76 с активностью заболевания по SLEDAI (г=0,41, р=0,006)

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1 Определение антител к нуклеосомам имеет диагностическое значение при СКВ

2 Определение уровня антител к нуклеосомам целесообразно для определения активности СКВ

3 У больных СКВ с поражением почек целесообразно определение антител к нуклеосомам для оценки активности почечного процесса

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Диагностическое значение антинуклеосомальных антител при системной красной волчанке / Котовская М.А., Насонов Е.Л. // Научно-практическая ревматология. - 2006 - № 4. - С 80-86

2. Kotovskaya М.А., Soloviev S К. Intravenous therapy of methylpredmsolone and cyclophosphamide m the treatment of early SLE. Lupus 2005,14(3),S73 English

3. Клинические, лабораторные и демографические особенности у больных с ранней не леченной системной красной волчанкой / Котовская М.А., Никишина Н Ю , Соловьев С К., Насонов ЕЛ// Научно-практическая конференция «IV Съезд ревматологов Рос-сии»-Тезисы. - Научно-практическая ревматология - 2005 -

№3(приложение) - С 67.

4. Факторы риска и клиническая характеристика пациентов с «ранней» СКВ / Котовская М.А., Никишина Н Ю, Соловьев С К, Насонов Е Л. // Научно-практическая конференция «V Северозападная конференция по ревматологии»' Сборник тезисов. - 2005 -С.60.

Котовская Мария Александровна

КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ АНТИТЕЛ К НУКЛЕОСОМАМ И БЕЛКАМ ТЕПЛОВОГО ШОКА ПРИ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКЕ

Автореферат диссертации на соискание ученой

степени кандидата медицинских наук

ЛИЦЕНЗИЯ ПД 00608

Формат 60x84/16. 1,38 уел п.л Бумага офсетная 80 гр. Тираж 100 экз. Заказ 109

Отпечатано с готовых о/м в типографии ООО «Медина-Принт» ул. Новослободская д. 14/19 стр. 5 тел./факс: 787-62-21

Актуальность проблемы

Системная красная волчанка (СКВ) - системное аутоиммунное заболевание неизвестной этиологии, патогенетически связанное с такими нарушениями иммунорегуляции, которые являются причиной гиперпродукции широкого спектра органонеспецифических аутоантител к различным компонентам ядра и иммунных комплексов, вызывающих иммуновоспалительное повреждение тканей и нарушения функций внутренних органов (Насонова В.А., Насонов ЕЛ,2003).

Основным компонентом лабораторной диагностики СКВ является выявление аутоантител к клеточным антигенам, преимущественно к ядерным, таких как антитела к гистонам (anti-HST), односпиральной и двухспиральной ДНК. Антитела к двухспиральной ДНК (дсДНК) в настоящее время являются наиболее распространенным диагностическим маркерам СКВ, однако по некоторым данным они выявляются не более чем в 50 % случаев, а уровень антител к дсДНК не всегда коррелирует с активностью (Simon et al., 2004). Другой, широко известный маркер СКВ - антинуклеарные антитела (АНФ), имеют достаточно низкий уровень специфичности, в связи с высокой частотой выявления АНФ не только при СКВ, но и при других аутоиммунных заболеваниях.

В достаточно широком спектре антиядерных антител, выявляемых при СКВ, особое внимание уделяется антителам к нуклеосомам. Нуклеосома состоит из двойной спирали ДНК, обмотанной вокруг специфического комплекса из восьми нуклеосомных гистонов (гистонового октамера). Нуклеосома представляет собой дисковидную частицу с диаметром около 11 нм, содержащую по две копии каждого из нуклеосомных гистонов (Н2А, Н2В, НЗ, Н4).

По данным Amoura Z et al. 2000, нуклеосомы играют роль превалирующих патогенетических антигенов у больных СКВ, а появление антител к нук-леосомам ассоциируется с органными поражениями (Simon et al., 2004). Более того, антитела к нуклеосомам, так же как и аутореактивные Т - хелперы, специфичные к нуклеосомам были определены в сыворотках больных СКВ (Chabre et al., 1995, Lu L., 1999). У пациентов с СКВ при скрининговом исследование была отмечена корреляционная связь между уровнем антител к нуклеосомам и поражением почек и центральной нервной системы (Williams et al., 2001). На биологических моделях СКВ было показано, что антитела к нуклеосомам выявляются до развития заболевания, однако до настоящего времени остается дискуссионным вопрос о специфичности этих аутоантител при СКВ (Rumore et al., 1990). Нет убедительных данных о преимуществах этого теста перед выявлением антител к дсДНК (Simon et al., 2004).

При поиске новых тестов, которые давали бы представление о состоянии иммунокомпетентных клеток крови при СКВ, обратила на себя внимание группа сравнительно недавно открытых внутриклеточных белков, получивших название "белки теплового шока" (БТШ или Hsp) или "стрессовые белки". Эти белки недостаточно изучены, но уже имеющиеся данные говорят, что они высоко консервативны в процессе филогенеза (Lindqulst S., 1986), необычно полифункциональны - играют важную роль во многих внутриклеточных иммуно-биохимических процессах как в экстремальных, так и в нормальных условиях (Polla B.S., 1988), что позволяет предположить об участии белков теплового шока в формировании патобиохимических внутриклеточных связей.

Таким образом, совершенствование диагностики заболевания является на сегодняшний день наиболее актуальным направлением в исследованиях, посвященных СКВ.

Цель работы

Изучить клиническое значение антител к нуклеосомам и белкам теплового шока при системной красной волчанке.

Задачи

1. Определить частоту повышения антител к нуклеосомам в сыворотках больных СКВ и их связь с клинико - лабораторными проявлениями СКВ.

2. Проанализировать связь уровня антител к нуклеосомам с антителами к дсДНК.

3. Выявить уровень и частоту повышения антител к связанным гистонам в сыворотках больных СКВ, их связь с клинико-лабораторными параметрами СКВ.

4. Исследовать уровень и частоту повышения антител к белкам теплового шока в сыворотках больных СКВ.

Научная новизна

Впервые в настоящей работе на большом клиническом материале проведено одновременное исследование сывороточных концентраций антител к нуклеосомам, компонентам нуклеосом - гистонам и белкам теплового шока у больных СКВ, и проведено их сопоставление с клинико — лабораторными проявлениями и активностью этого заболевания.

Выявлена связь антител к нуклеосомам у больных СКВ с поражением почек, центральной нервной системы и активностью заболевания.

Впервые проведен детальный анализ клинических проявлений СКВ в зависимости от степени повышения уровня антител к гистонам. Выявлена связь антител к гистонам Н2А и Н2В с поражением почек и центральной нервной системы у больных СКВ.

Впервые отмечена ассоциация уровня антител к пептиду убиквитина 4276 с активностью СКВ. !

Практическая значимость

1. Определение антител к нуклеосомам имеет диагностическое значение при СКВ

2. Определение уровня антител к нуклеосомам целесообразно для определения активности СКВ

3. У больных СКВ с поражением почек целесообразно определение антител к нуклеосомам для оценки активности почечного процесса

Положения, выносимые на защиту

1. При СКВ с высокой частотой выявляются антитела к нуклеосомам.

2. Одновременное определение антител к нуклеосомам и к дсДНК позволяет повысить чувствительность и специфичность лабораторной диагностики СКВ.

3. У больных СКВ уровень антител к нуклесомам достоверно связан с клиническими и лабораторными параметрами, характеризующими активность заболевания.

4. Повышение уровня антител к нуклеосомам у больных СКВ ассоциируется с поражением почек, ЦНС и активностью заболевания.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 работы: 3 - в отечественной печати, 1 -в зарубежной.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на: •S Lupus meeting, London, UK, 2005;

S Заседание ревматологической секции Московского научного терапевтического общества, Москва, 2006;

Первичная экспертиза проведена на заседании Ученого совета ГУ Институт ревматологии РАМН.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 93 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы, содержащего 7 отечественных и 123 зарубежных источников. Диссертация проиллюстрирована 24 таблицами и 21 рисунком.

ВЫВОДЫ

1. У пациентов СКВ частота обнаружения и средний уровень антител к нуклеосомам, гистонам Н2А и Н2В, низкомолекулярным белкам теплового шока — пептиду 22-45 цистеин и 42-76 был достоверно выше, чем в контрольной группе (здоровые доноры), и у пациентов РА и БШ (р<0,05). При этом в сыворотке крови больных СКВ положительный уровень антител к нуклеосомам был выявлен в 65,8% случаев, антител к гистонам Н2А и Н2В в 43,5% и 50% случаев соответственно, антител к пептиду убиквитина 22-45 цистеин и пептиду убиквитина 42-76 в 21,7% и 24,1% случаев соответственно.

2. У пациентов СКВ отмечена положительная корреляция уровня антител к нуклеосомам и антител к дсДНК (г=0,70, р<0,0001). Чувствительность и специфичность антител к нуклеосомам и антител к дсДНК была сходной (67,5% , 92,5% и 71,2% и 91,7% соответственно). Определение антител к нуклеосомам наряду с антителами к дсДНК улучшает чувствительность и специфичность диагностики СКВ (86% и 98,8% соответственно).

3. У пациентов СКВ с волчаночным нефритом средний уровень антител к нуклеосомам был выше, чем у больных без поражения почек (74,5 + 41,2 ЕД/мл и 46,4 + 26,9 ЕД/мл, соответственно, р<0,05). У пациентов с нефритом с нефротическим синдромом было отмечено наиболее существенное увеличение концентрации антител к нуклеосомам (89,6 + 62,9 ЕД/мл, р<0,05), чем у пациентов без нефротического синдрома (52,3 + 23,9 ЕД/мл, р<0,05).

4. Уровень антител к нуклеосомам у больных СКВ с поражением ЦНС был выше по сравнению с таковыми у больных без поражения ЦНС (88,1 +51,6 ЕД/мл и 56,4 + 48,7 ЕД/мл соответственно, р=0,001).

5. Выявлена связь уровня антител к нуклеосомам с активностью СКВ по SLEDAI (г=0,35, р<0,01). Средние уровни антител к нуклеосомам у больных со второй и третьей степенями активности СКВ были достоверно выше по сравнению с таковыми у больных с первой степенью активности заболевания (р<0,05).

6. Отмечена связь сывороточного уровня антител к гистонам Н2А и Н2В с поражением почек и ЦНС при СКВ (р<0,05) и активностью заболевания по SLEDAI (г=0,38, р=0,0016 и г=0,42, р=0,0012 соответственно).

7. Установлена взаимосвязь уровня пептида убиквитина 42-76 с активностью заболевания по SLEDAI (г=0,41, р=0,006).

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Определение антител к нуклеосомам служит дополнительным диагностическим тестом при СКВ, позволяет уточнить активность процесса и наличие органной патологии (нефрита и поражения ЦНС).