Автореферат и диссертация по медицине (14.00.29) на тему:Клинические особенности и диагностика острой реакции "трансплантат против хозяина"

На правах рукописи

Анухина Маргарита Владимировна

Клинические особенности и диагностика острой реакции «трансплантат против хозяина»

14.00.29 -гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 2005

Работа выполнена в Государственном учреждении -Гематологическом научном Центре Российской Академии Медицинских наук

Научные руководители: Доктор медицинских наук, профессор Л.С.Любимова Доктор медицинских наук, профессор Г.И. Козинец

Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Л.Г. Ковалева Доктор медицинских наук, профессор С.А. Луговская

Ведущая организация:

Московский областной научно-исследовательский клинический институт имени М.Ф. Владимирского

Защита диссертации состоится Ь » 2005 года в_часов на

заседании диссертационного совета Д 001.042.01 в Гематологическом научном центре Российской Академии Медицинских наук (125167, Москва, Новозыковский проезд, дом 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра Российской Академии Медицинских наук

Автореферат разослан « » 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Е.Е. Зыбунова

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы: Аллогенная трансплантация костного мозга (аллоТКМ) широко применяется в практике лечения гемобластозов с середины 80-х годов. Согласно имеющимся публикациям, 5-летняя безрецидивная выживаемость достигается в среднем у 50-60% больных, которым ТКМ произведена при остром лейкозе (ОЛ) в фазе I полной ремиссии, а при хроническом миелолейкозе (ХМЛ) в хронической фазе. Из пациентов с ОЛ и ХМЛ, которым аллогенная трансплантация костного мозга произведена на более поздних стадиях заболевания, в число долгожителей попадает лишь 10-20% больных. Таким образом, после аллогенной ТКМ выздоравливает, примерно, 50-60% больных в фазе I ремиссии ОЛ и каждый пятый больной с ОЛ из тех, кто вообще не имеет шансов на длительную выживаемость при стандартной химиотерапии. Аллогенная ТКМ остается до сих пор единственным методом терапии, способным излечить больных ХМЛ.

Одной из основных причин смерти больных в раннем посттрансплантационном периоде является острая реакция «трансплантат против хозяина» (острая РТПХ). По имеющимся данным развитие острой РТПХ отмечается у 50-80% реципиентов аллогенного костного мозга и в 1520% случаев приобретает крайне тяжелое течение с летальным исходом.

Наша клиника располагает наблюдениями за больными с острой РТПХ, однако в отечественной литературе приведены немногочисленные сведения, касающиеся, в основном, частоты развития острой РТПХ и смертельных исходов от этого осложнения, недостаточно освещены сроки возникновения острой РТПХ, особенности клинического течения, динамика гематологических показателей, не проведен анализ факторов риска ее развития. Поэтому многосторонний комплексный анализ материалов, накопленных в клинике в процессе ведения больных с острой РТПХ, представляется важным.

Одной из основных задач остается поиск новых методов ранней диагностики и профилактики острой РТПХ, так как применяемые методы не

привели к значительному снижению ее частоты или степени тяжести. Существующие подходы к диагностике острой РТПХ являются достаточно ограниченными и базируются, прежде всего, на характерной клинической картине заболевания. Результаты основного лабораторного метода диагностики - гистологического исследования биопсийного материала пораженных органов не всегда бывают информативными и, обычно, становятся известными, когда болезнь уже приняла развернутый характер. Очевидно, что ранняя диагностика острой РТПХ может оказать значительное влияние на успех терапии. Поэтому разработка новых методов диагностики, которые могут способствовать своевременной постановке диагноза, особенно, в случае отсутствия ярких и очевидных клинических симптомов, является чрезвычайно актуальной.

В связи с этим были предприняты исследования нуклеолярного аппарата лимфоцитов у реципиентов костного мозга. Основанием для их проведения послужили результаты работ, выполненных в лаборатории гемоцитологии ГНЦ РАМН у больных с гемобластозами, а также публикации зарубежных авторов, посвященые изучению нуклеологенеза при лейкозах. В частности, было отмечено, что морфология ядрышек лимфоцитов и нуклеолярный коэффициент могут изменяться под влиянием интенсивных воздействий, таких как химиотерапия или облучение /Pioton D. 1986, Погорелов В.М. 1992/. В литературе имеются единичные работы, авторы которых нашли изменения ультраструктур клеток периферической крови и слизистой тонкого кишечника у реципиентов костного мозга с хронической РТПХ /Wesierska-Gadek J, 1992, Forbes G,1996 /. Публикаций, касающихся исследования нуклеолярного аппарата лимфоцитов периферической крови у больных после аллоТКМ, нам не встретилось. Так как известно, что лимфоциты принимают активное участие в механизме развития острой РТПХ /Ferrara J, 1996/, возникло предположение, что изучение морфологических особенностей ядрышек лимфоцитов после трансплантации аллогенного костного мозга позволит выявить особенности, характерные для самых

ранних сроков развития острой РТПХ, когда клинические проявления этого осложнения еще отсутствуют.

Что же касается профилактики острой реакции «трансплантат против хозяина», то привлекли внимание сообщения отдельных авторов /Chao NJ, 2000, Ruutu T, 2000/ об использовании преднизолона дополнительно к стандартной профилактике циклоспорином А (ЦСА) и метотрексатом (МТК). Поскольку работы, анализирующие значение дополнительной профилактики острой РТПХ преднизолоном являются немногочисленными и противоречивыми, особое внимание было уделено оценке ее эффективности у больных острыми лейкозами и хроническим миелолейкозом. Анализ клинических особенностей острой РТПХ, исследования, направленные на совершенствование подходов к ранней диагностике и профилактике этого тяжелого осложнения аллогенной ТКМ, определяют актуальность данной работы.

Цель работы - охарактеризовать клинико-лабораторные проявления острой РТПХ и установить морфологические особенности нуклеолярного аппарата лимфоцитов у реципиентов костного мозга.

Задачи исследования:

1. Определить сроки развития, клинические проявления острой РТПХ и факторы риска ее развития.

2. Оценить динамику восстановления числа лейкоцитов и тромбоцитов у больных с острой РТПХ.

3. Определить эффективность дополнительной профилактики острой РТПХ преднизолоном.

4. Установить морфологические особенности нуклеолярного аппарата лимфоцитов у реципиентов аллогенного костного мозга.

5. Определить значение изменений нуклеолярного аппарата лимфоцитов для раннего распознавания острой РТПХ.

Научная новизна работы

Работа посвящена вопросам клиники, диагностики и профилактики острой РТПХ. Наряду с анализом клинического материала, позволившего установить частоту, сроки развития острой РТПХ, факторы риска ее развития, изучено состояние нуклеолярного аппарата лимфоцитов с целью определения его значения в диагностике острой реакции «трансплантат против хозяина». Подобная методика у больных после аллогенной ТКМ до сих пор не использовалась. Также на собственном материале впервые проведена оценка эффективности дополнительного использования преднизолона в профилактике острой РТПХ у больных ОЛ и ХМЛ.

Научно-практическая ценность работы

На основе созданной базы данных, включившей 45 реципиентов аллогенного костного мозга, наблюдавшихся в клинике в течение последних 4 лет, охарактеризованы клинико-лабораторные проявления острой РТПХ. Выявлено, что острая РТПХ реже развивалась у больных с ОЛ (44%), чем при ХМЛ (67%), причем при ХМЛ преобладали более тяжелые ее формы (II-IV степени тяжести).

Установлено, что факторами риска, имеющими наибольшее значение в развитии острой РТПХ, являются более быстрый темп приживления трансплантированных донорских клеток и содержание в костномозговой взвести миелокариоцитов в количестве более 3,0 х 108/кг массы тела больного. Помимо диагноза ХМЛ, к неблагоприятным факторам отнесены также II - III категория риска больных и возраст больного и донора старше 40 лет, поскольку они имели место более чем у половины больных с острой РТПХ. Показано, что тяжелые формы острой РТПХ наблюдались, преимущественно, у больных, имеющих не менее 3 неблагоприятных факторов. Полученные данные позволили выделить группу больных, имеющих высокий риск развития острой РТПХ, что важно учитывать при

отборе больных для аллоТКМ и определении тактики их ведения в посттрансплантационном периоде.

Опыт применения дополнительной профилактики острой РТПХ преднизолоном показал ее эффективность. Установлено, что преднизолон способствует снижению частоты острой РТПХ и наиболее тяжелых ее форм, особенно, у больных ХМЛ, что позволяет рекомендовать его назначение у больных с этим заболеванием.

Динамическое изучение нуклеолярного аппарата лимфоцитов у реципиентов костного мозга показало, что после аллогенной ТКМ наблюдаются значительные изменения морфологии ядрышек лимфоцитов, особенно, под влиянием кондиционирования и в период, совпадающий с началом приживления донорских клеток.

Установленные отличия в морфологии лимфоцитов и показателях нуклеолярного коэффициента (НК) у больных с острой РТПХ по сравнению с пациентами, без этого осложнения способствовали выявлению пациентов, у которых вероятность развития острой РТПХ является высокой. Это имеет большое значение для раннего распознавания острой РТПХ и своевременного начала терапии.

Проведенные исследования позволили получить информацию фундаментального характера, свидетельствующую о значительных функциональных изменениях в нуклеолярном аппарате лимфоцитов реципиентов костного мозга. Результаты этих исследований способствуют углублению наших знаний об изменениях на клеточном уровне, происходящих в посттрансплантационном периоде.

Положения, выносимые на защиту

1. Острая РТПХ у больных с ХМЛ развивается чаще и в более ранние сроки, чем у больных с ОЛ.

2. При ХМЛ частота развития острой РТПХ ГГ-ГУ степени тяжести выше, чем у пациентов с ОЛ.

3. Среди факторов, ассоциирующихся с высоким риском развития острой РТПХ, наиболее важными являются более быстрое приживление донорских клеток и количество миелокариоцитов в трансплантате > 3 х 10 8/кг.

4. Включение преднизолона в схему стандартной профилактики острой РТПХ циклоспорином А и метотрексатом способствует снижению частоты развития острой РТПХ и степени ее тяжести, особенно при ХМЛ.

5. После аллогенной трансплантации костного мозга имеют место значительные изменения в нуклеолярном аппарате лимфоцитов.

6. Отличительные особенности морфологии ядрышек лимфоцитов и динамики нуклеолярного коэффициента у больных с острой РТПХ могут иметь значение для выявления больных с высоким риском развития этого осложнения.

Апробация работы состоялась на заседании Проблемной комиссии Гематологического научного центра РАМН «Гемобластозы и депрессии кроветворения». Основные положения работы доложены на межлабораторном семинаре ГНЦ РАМН (2003 год), на курсах повышения квалификации врачей по специальности «Основы клинической трансфузиологии» (2004 год), на Российско-Норвежской конференции по гематологии (Санкт-Петербург, сентябрь 2003г). По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 100 страницах,

состоит из введения, обзора литературы, методической главы, 2 глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы, включающего 214 работ, в том числе 10 отечественных авторов. В работе содержится 17 таблиц, 6 рисунков.

Диссертация выполнена в отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга (научн. руков. член-корр. РАМН проф. В.Г.

Савченко) и лаборатории гемоцитологии ГНЦ РАМН (зав. проф. Г.И. Козинец).

Соавторами работ, опубликованных по теме диссертации являются сотрудники ГНЦ РАМН Л.П. Порешина, О.А.Дягилева, В.Г. Савченко, Л.П. Менделеева, Л.А. Кузьмина, Е.О. Грибанова, И.А. Демидова, А.В. Мисюрин, О.А. Виноградова, Е.В. Домрачева, P.M. Кутьина, А.П. Шпакова, А.А. Матвеенко, Н.Н. Калинин, Э.Г. Гемджян

Содержание работы

Общая характеристика больных

В настоящей работе использованы материалы наблюдений за 51 больным, которые находились на лечении в отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга ГНЦ РАМН с 1999 по 2003 гг.

Работа состоит из двух разделов - клинического и лабораторного. Согласно поставленным задачам в первом разделе представлен клинический материал на основе созданной базы данных. Он включил 45 реципиентов аллогенного костного мозга. Другая часть работы посвящена изучению состояния нуклеолярного аппарата лимфоцитов у 25 пациентов, из которых 19 произведена трансплантация аллогенного костного мозга и 6-аутологичного (группа сравнения).

Среди 45 больных, которым была произведена трансплантация аллогенного костного мозга, было 22 мужчин и 23 женщины. Медиана возраста составила 30 лет (от 15 до 51). У 23 больных диагностирован острый лейкоз, у 4 миелодиспластический синдром (МДС), у 18 ХМЛ. Больные с острыми лейкозами и МДС были, в основном, из группы высокого риска (23), 4 пациентов - стандартного. Большинство больных с ХМЛ (12 из 18) отнесены к категории промежуточного или высокого риска. У 25 из 45 пациентов давность диагностики заболевания к моменту ТКМ не превышала 12 месяцев. Следует отметить, что 74% (20 из 27) больных с острыми лейкозами к моменту ТКМ были в фазе I ремиссии, а 89% (12 из 18) больных

ХМЛ - в хронической фазе заболевания. Донорами для больных во всех случаях были ИЬА - идентичные сиблинги, ареактивные в реакции смешанной культуры лимфоцитов.

В качестве кондиционирования перед ТКМ использовались два режима: миелоаблативный и немиелоаблативный. Первый включал в себя бусульфан (БУ) в общей дозе 16 мг/кг массы тела и циклофосфан (ЦФ) в общей дозе 120 мг/кг массы тела. Программа немиелоаблативного кондиционирования применена 7 пациентам и в 3 случаях включала ЦФ, БУ, и флюдарабин, еще у 3 больных - антитимоцитарный иммуноглобулин (АТГ) 10 мг/кг - 4 дня, бусульфан 4 мг/кг- 2 дня и флюдарабин 30 мг/м2 - 6 дней, а у 1 больного - БУ, АТГ и цитозар 2 мг/м2 в сутки в течение 5 дней. Для предупреждения развития РТПХ всем больным применяли циклоспорин А (3 мг/кг с -1 дня) и метотрексат (15 мг/м2 в +1 день и 10 мг/м2 - в +3, +6, +11 дни). Дополнительная профилактика острой РТПХ преднизолоном применена 19 больным.

Второй раздел работы посвящен изучению морфологических особенностей нуклеолярного аппарата лимфоцитов периферической крови реципиентов аллогенного костного мозга. Исследования нуклеолярного аппарата проведены у 19 больных.

Среди больных преобладали женщины - 12 человек. Медиана возраста составила 26 лет (от 15 до 30 лет). Большинство больных были с ОЛ -14, у 3 диагностирован ХМЛ и у 2-МДС. Из 16 пациентов с ОЛ и МДС 13 (81%) были отнесены к группе высокого риска. Из 3 больных с ХМЛ 2 были из категории промежуточного риска и 1 больная - низкого риска Трансплантация костного мозга выполнена 9 больным (47%) в сроки до 12 месяцев с момента диагностики заболевания, 6 из 19 (32%) до двух лет с момента диагностики. Лишь у 4 больных давность диагностики до ТКМ превышала 24 мес. Все больные ОЛ и 1 пациент с МДС до начала кондиционирования были в фазе ремиссии заболевания: 10 в I и 5 во II ремиссии. У 1 больного с МДС к началу кондиционирования ремиссии

заболевания получено не было. Все больные с хроническим миелолейкозом были в хронической фазе заболевания. В качестве кондиционирования использовались два режима: миелоаблативный - 14 пациентам, а немиелоаблативный - 5. Для предупреждения развития РТПХ у всех больных после трансплантации с миелоаблативным кондиционированием применяли циклоспорин А, метотрексат, преднизолон.

Группу сравнения составили реципиенты аутологичного костного мозга (аутоТКМ). Эта группа состояла из 6 человек, 5 мужчин и 1 женщины, медиана возраста составила 28,5 лет, 5 пациентов страдали миелоидными вариантами острого лейкоза и 1 острым лимфобластным лейкозом. Все больные были отнесены к группе высокого риска. Трансплантация костного мозга была выполнена, в основном, на протяжении первых 2 лет с момента диагностики заболевания, причем 3 пациентов находились в фазе I ремиссии и также 3 - во II ремиссии острого лейкоза. Во всех случаях для кондиционирования использовалась программа БУ+ЦФ. Больным, которым применялась аутоТКМ, профилактика РТПХ не проводилась. Методы исследования

Нуклеолярный аппарат лимфоцитов периферической крови реципиентов костного мозга исследовали до начала кондиционирования, в день трансплантации (0 день) и в течение первого месяца после трансплантации (на 7, 14, 18, 28, 35 дни). Состояние нуклеолярного аппарата оценивали по количеству лимфоцитов с различной формой ядрышек, а также по значению нуклеолярного коэффициента. Предполагалось установить значение этого метода для ранней диагностики РТПХ.

У здоровых людей основная масса лимфоцитов (93+1,8%) характеризуется распределением РНК по периферии ядрышек, что обусловливает их кольцевидную форму. Небольшая часть лимфоцитов содержит ядрышки с равномерным распределением базофильной РНК-содержащей субстанции по всему ядрышку (гомогенные нуклеолы).

Имеются также лимфоциты, содержащие ядрышки с точечной локализацией базофильного вещества (4+0,7%).

Среднее число ядрышек на один лимфоцит (нуклеолярный коэффициент) составляет 1,00-1,25 (Быкова И.А., Козинец Г.И., Терентьева Э.И., 1976). Такое состояние нуклеолярного аппарата соответствует тому, что лимфоциты периферической крови находятся вне пролиферативного цикла в стадии Go (Smetana К. 1970; Undriz 1972).

Для выявления ядрышек в лимфоцитах использовали цитохимическую реакцию для выявления РНК по методу Smetana К. в модификации Быковой И.А. (Г.И. Козинец, И.А. Быкова. Методические рекомендации, 1979). Поскольку в первые недели после ТКМ у реципиентов сохранялась глубокая лейкоцитопения, мазки периферической крови приготавливали из лейкоконцентратов. После высушивания на воздухе их фиксировали метанолом в течение 5-10 минут, затем на 30 минут опускали в 0,25% раствор метиленового синего, разведенного I:I фосфатным буфером Мс Hwain при рН= 5. Состав буфера описан Э.Пирс в 1966 (Г.И. Козинец, И.А. Быкова. Методические рекомендации, 1979). После этого мазки трижды ополаскивали в течение 1 минуты в заново приготовленном буферном растворе Mc Hwain с тем же значением рН. Перед каждым окрашиванием правильность приготовления и сохранность буферных растворов контролировали электрическим рН-метром. Для просмотра мазков использовали световой микроскоп (объектив 100, окуляр 12,5). При микроскопическом анализе препаратов подсчитывали число лимфоцитов с различной морфологией нуклеол - кольцевидными, гомогенными, точечными. Нуклеолярный коэффициент (НК) подсчитывали в 100 лимфоцитах периферической крови. В ряде случаев, в период глубокой аплазии кроветворения, для подсчета 100 клеток просматривали 2-3 препарата.

Дополнительно для оценки метаболизма в лимфоцитах больных с острой РТПХ исследовали полисахариды в те же сроки, в которые изучали состояние нуклеолярного аппарата лимфоцитов реципиентов костного мозга. В период глубокой аплазии кроветворения, из периферической крови готовили лейкоконцентрат, для подсчета 100 клеток просматривали 2-3 препарата. Для выявления полисахаридов применяли PAS - реакцию. После 10 минутной фиксации в парах формалина, сухие мазки помещали на 5 минут в 0,5% раствор йодной кислоты. После повторного промывания в дистиллированной воде, мазки опускали на 30 минут в раствор Шиффа, приготовленного путем растворения 1 гр. основного фуксина в 200 мл кипящей дистиллированной воды, кипячения в течение 1 сек. с последующим фильтрованием. После охлаждения до 50° добавляли 20 мл I H HCL, 1 гр. мета-бисульфита натрия и 0,5 таблетки активированного угля. Готовый раствор оставляли в темноте на 24 часа, после чего реактив становился прозрачным. После промывания мазков в мета - бисульфитном растворе (Г.И. Козинец, С.М. Дульцина .Методические рекомендации, 1977). ядра контрастировали 2 % метиленовым зеленым. Этот раздел работы выполняли совместно с к.м.н. О.А Дягилевой (лаб. гемоцитологии ГНЦ РАМН, зав. лаб. д.м.н. проф. Г.И. Козинец).

Анализ гемограмм и миелограмм осуществляли совместно с сотрудниками клинико-диагностической лаборатории (зав.- Л.Ю.Тихонова) ГНЦ РАМН (дир.- академик Воробьев А.И.), гистологические исследования трепанобиоптатов выполняли сотрудники патологоанатомического отделения (зав. - член-корр. АМН РФ Г.А. Франк).

Иммунологическое типирование пар донор-реципиент проводили совместно с к.б.н. P.M. Кутьиной, изучение приживления трансплантата - с д.б.н. Л.П. Порешиной в лаборатории иммуногематологии (зав. к.м.н. Л.Л. Головкина), реакцию смешанной культуры лимфоцитов выполняли с к.м.н. А.П. Шпаковой (лаб. клинической иммунологии, зав. -д.м.н. проф. Т.И. Булычева) ГНЦ РАМН.

При статистическом анализе данных применялись методы дисперсионного, корреляционного и факторного анализов с использованием статистического пакета "Статистика" 5.0 при участии с. н. с. Э. Г. Гемджяна (лаборатория биостатистики ГНЦ РАМН; зав. лаб. к. ф-м. н. С.М. Куликов).

Результаты исследований Анализ клинического материала на основе созданной базы данных.

Острая РТПХ развилась у 24 из 45 больных после трансплантации аллогенного костного мозга (53%), частота этого осложнения у больных ХМЛ оказалась большей, чем у больных с острыми лейкозами и составила 67% и 44% соответственно. Острую РТПХ диагностировали в среднем на +35+4,4 день, у больных ХМЛ раньше - на +28+3,5 день, чем у пациентов с острыми лейкозами - на +42+6,9 день (р=0,05).

В таблице 1 представлено распределение больных в зависимости от степени тяжести острой РТПХ. Острая РТПХ ЬП степени тяжести развилась у 62,5% больных, Ш-ГУ степени - в 37,5% случаев. Отмечено, что у больных ХМЛ тяжелых форм РТПХ было больше, чем у больных острыми лейкозами.

Таблица 1.

Распределение больных с РТПХ по степени тяжести

Степень тяжести Всего случаев (%) Всего РТПХ Ш-1У степени тяжести из общего числа больных (%)

ОЛ (п=27) ХМЛ (п=18)

1-Й 62,5 15 28

III -IV 37,5

Анализ клинических проявлений острой РТПХ (таблица 2) показал, что поражение кожи наблюдалось практически у всех пациентов (у 22 больных -91,5%). Диагноз подтвержден во всех случаях гистологическим исследованием биоптата кожи. На втором месте по частоте был кишечник, поражение которого наблюдалось у 9 пациентов (37,5%). В 16% случаев отмечено вовлечение печени. Изолированное поражение кожи диагностировано более чем у половины больных - в 14 случаях (58,3%), а изолированное поражение кишечника, в частности, его верхних отделов, отмечено лишь у 1 больного (4%). Наиболее тяжелыми были случаи сочетанного поражения органов, чаще - кожи и кишечника.

Таблица 2.

Поражение органов при острой РТПХ

Органы-мишени Число больных %

Кожа 22 91,5

Печень 4 16,5

Кишечник 9 37,5

Изолированное поражение:

Кожа 14 58,3

Кишечник 1 4,2

Кожа + кишечник 5 20,8

Кожа + печень 1 4,2

Кожа + печень + кишечник 2 8,3

Печень + кишечник 1 4,2

Анализ факторов риска развития острой РТПХ.

Анализ прогностически неблагоприятных факторов развития РТПХ показал, что помимо диагноза ХМЛ, к таким факторам могут быть отнесены высокая категория риска больных и возраст больного и донора старше 40 лет, поскольку они имели место более чем у половины больных с острой РТПХ. Несовместимость донора и реципиента по полу, по АВО антигенам, а также

ТКМ от донора женщины встречались у больных с РТПХ и без этого осложнения с одинаковой частотой.

При ретроспективном анализе динамики эритроцитарного химеризма выяснилось, что у больных с острой РТПХ содержание донорских эритроцитов на +30 и на +60 дни было выше, чем у больных без острой РТПХ. На + 60 день разница была статистически значимой (рисунок 1).

Рисунок 1. Количество донорских эритроцитов у больных с РТПХ и без

РТПХ.

Изучение сроков восстановления лейкоцитов и тромбоцитов после ТКМ показало, что у больных с острой РТПХ лейкоциты и тромбоциты восстанавливались быстрее; более раннее восстановление количества тромбоцитов свыше 50,0 х 109/л подтверждено статистически (таблица 3).

Эти данные свидетельствуют о том, что у больных с более быстрым восстановлением кроветворения существует большая вероятность развития РТПХ.

Таблица 3.

Сроки восстановления лейкоцитов и тромбоцитов у больных с/без острой РТПХ (М+т)

Больные Лейкоциты (х 109/л) Тромбоциты (х 10*/л)

>0,5 >1,0 >50,0 > 100,0

С РТПХ (п=24) 14±0,69 18±0,85 19±1,24 38±5,29

Без РТПХ (п=21) 16±0,92 20±0,87 24±1,77 р < 0,05 45±532

Для более точной оценки влияния изученных факторов, был проведен статистический анализ данных методами дисперсионного, корреляционного и факторного анализов (с использованием статистического пакета программ «Статистика 5.0.»). За факт принимали наличие острой РТПХ и определяли взаимосвязь между развитием острой РТПХ и такими факторами как: возраст больного старше >35 лет, давность диагностики заболевания свыше 12 мес., высокая группа риска, несовместимость пар по полу и АВО-антигенам, возраст донора старше 40 лет, ТКМ от донора-женщины, количество миелокариоцитов во взвеси > или < 3,0 х108/кг, содержание донорских эритроцитов в крови реципиента на +30 и +60 дни. Кроме того, в анализ были включены данные о сроках восстановления тромбоцитов и повышения количества лейкоцитов до 0,5 х 109/л (раньше или позже +15 дня), отражающие темп приживления трансплантата.

Обнаружена зависимость между количеством циркулирующих в крови реципиента донорских клеток на +60 день и развитием острой РТПХ (г = 0,4; р =0,05), а также количеством миелокариоцитов в костномозговой взвеси более 3,0 х 108/кг массы тела больного и развитием РТПХ (г = 0,3 ; р=0,05).

Таким образом, на основании проведенного анализа, помимо диагноза ХМЛ к наиболее значимым факторам риска развития РТПХ можно отнести:

1.более быстрый темп приживления трансплантата по данным исследования эритроцитарного химеризма (р=0,05);

2. количество миелокариоцитов в костномозговой взвеси > 3,0 х 108/кг

массы тела больного (р=0,05) При оценке числа неблагоприятных факторов у больных с острой РТПХ выяснилось, что у большинства больных с ХМЛ, и с ОЛ имелось сочетание 3 и более неблагоприятных факторов. Эти данные свидетельствуют о том, что вероятность развития РТПХ больше при сочетании неблагоприятных факторов (таблица 4).

Таблица 4.

Количество неблагоприятных факторов у больных с острой РТПХ ГГ-ГУ степени тяжести (число случаев в %)

Больные с острой РТПХ 1-2 неблагоприятных фактора 3-6 неблагоприятных факторов

ХМЛ п=12 22 78

ОЛ п=12 29 74

Анализ эффективности дополнительной профилактики острой РТПХ

преднизолоном.

Специальный раздел исследований был посвящен изучению эффективности применения преднизолона дополнительно к стандартной профилактике острой РТПХ циклоспорином А и метотрексатом. Препарат применяли по следующей схеме (К|шШ ^ 2000):

Дни приема + 14 - +20 +21 - +34

+35-+48 + 49- +69 + 70- +89

+ 90- +99 +100- +110 На +111 день препарат отменяли

Показано, что использование преднизолона способствовало уменьшению общего числа случаев острой РТПХ и частоты РТПХ ГГГ-ГУ степени тяжести, которая наблюдалась при применении преднизолона в 3 раза реже (таблица 5).

Таблица 5.

Частота острой РТПХ у больных с и без дополнительной профилактики

преднизолоном

Доза в мг/кг массы тела 0,5 1

0,5 0,25 0,12

0,12 через день 0,6 через день

Группы больных Число случаев острой РТПХ (%) РТПХ 1-Н степени тяжести (%) РТПХ Ш-1У степени тяжести (%)

С преднизолоном п=19 47 37 10

Без преднизолона п=26 58 27 31

Среди больных с острой РТПХ, получавших преднизолон, по сравнению с пациентами, которым преднизолон не применяли, также отмечено уменьшение частоты развития наиболее тяжелых форм этого осложнения (таблица 6).

20

Таблица 6.

Частота острой РТПХ ГГ-ГУ степени тяжести среди больных с этим осложнением, получавших и не получавших преднизолон

Группы больных с острой РТПХ Н-1У степени тяжести Частота развития (%)

с преднизолоном без преднизолона 18 82 р< 0,05

При анализе случаев РТПХ 11-1У степени тяжести у больных с ХМЛ и ОЛ в отдельности получены аналогичные данные. Дополнительная профилактика острой РТПХ преднизолоном привела к уменьшению частоты острой РТПХ 11-1У степени тяжести как у больных с ХМЛ, так и с ОЛ. Так, у больных ХМЛ при применении преднизолона она составила 33%, а у пациентов, не получавших препарат, 67%. Среди пациентов с ОЛ, получавших преднизолон, тяжелых форм острой РТПХ не было. В то же время все 5 больных с острыми лейкозами, у которых наблюдали РТПХ П-ГУ степени тяжести, преднизолон не получали.

Изучение морфологических особенностей нуклеолярного аппарата лимфоцитов реципиентов аллогенного костного мозга.

В этом разделе работы предполагали определить значение изменений нуклеолярного аппарата лимфоцитов для раннего распознавания РТПХ. Известно, что нуклеолы могут изменяться в процессе клеточной пролиферации, дифференцировки, созревания клетки (ОИкоиёо М. 1998, 8ше1апа К. 2002), а также, как уже указывалось выше, - под влиянием различных интенсивных воздействий. Судить об активации лимфоцитов

можно по возрастанию доли гомогенных нуклеол и по увеличению НК за счет гомогенных нуклеол.

Исследование нуклеолярного аппарата проведены у 19 реципиентов аллогенного костного мозга, у 8 из которых наблюдалась острая РТПХ в сроки от +31 до +59 дня у 7 больных и на + 95 день - у 1 пациента (в среднем на +48 день). Группу сравнения составили 6 реципиентов аутологичного костного мозга. Всего исследовано 400 препаратов периферической крови, продолжительность исследований - до 35 дня после ТКМ.

Определение нуклеолярного коэффициента.

Динамика НК у реципиентов аллогенного костного мозга представлена на рис. 2.

НК

1,95 1,90 1,85 1,80 1,75 1,70 1,65 1,60 1,55 1,50 1,45

Рисунок 2. Динамика изменений нуклеолярного коэффициента.

До начала кондиционирования НК в среднем превышал верхнюю границу нормы, установленную при исследовании здоровых доноров, и составлял В 0 день отмечено повышение НК (р=0,05), вероятнее

всего, за счет влияния режима кондиционирования. После трансплантации, в +7 день, выявлено незначительное снижение НК с дальнейшим его повышением в сроки с +14 по +28 дни (р<0,05), когда кроветворение восстанавливается вследствие приживления трансплантата.

Для того чтобы установить, связаны ли изменения НК с развитием острой РТПХ, были проанализированы результаты определения НК у больных с и без острой РТПХ (рисунок 3)

Оказалось, что значения НК у больных с острой РТПХ во все сроки исследования превышали НК у больных без РТПХ. Статистически значимые различия отмечены в 0 день (1,9+0,3 и 1,6+ 0,4, р < 0,01) и на + 28 день (1,95+0,1 и 1,64+0,1, р=0,01). Изменения в 0 день в обеих группах можно объяснить влиянием мощного цитостатического воздействия химиопрепаратов на клетки. Однако обратил на себя внимание тот факт, что в группе больных, у которых впоследствии развилась РТПХ, повышение НК было статистически значимым в отличие от пациентов без РТПХ. Можно предположить, что у пациентов с РТПХ кондиционирование оказало более значительное повреждающее действие на клетки, что сыграло определенную роль в развитии этого осложнения.

НК

2,2 и

2,1

1.5 -

1.4 ^-----------

доткм 0 +7 +14 +18 +28 +35

Дни после ТКМ

Рисунок 3. Динамика изменений НК у больных с острой РТПХ ( верхняя линия) и без острой РТПХ ( нижняя линия)

Эти наблюдения нуждаются в дальнейшем подтверждении, однако, не исключено, что выраженное увеличение НК в 0 день может иметь значение в прогнозировании развития острой РТПХ. Высказанное предположение основано на том, что кондиционирование рассматривается в качестве первого этапа в развитии острой РТПХ /Thornhill M, 1991; James L. ,1999/.

На +28 день у больных с острой РТПХ НК был также достоверно повышен по сравнению с исходным значением. Можно предположить, что статистически достоверное превышение значений НК в +28 день у больных с острой РТПХ объясняется именно наличием этого осложнения.

Результаты определения НК, выполненные в группе сравнения (таблица 7), показали, что также как и в группе пациентов с аллоТКМ, НК у больных, которым была произведена аутоТКМ, был исходно повышен по сравнению с НК у здоровых доноров и составил В 0 день отмечено

увеличение НК (р >0,05), все дальнейшие колебания показателя оказались также статистически недостоверными.

Таблица 7.

Динамика НК у больных после аутологичной ТКМ

Показатель До ТКМ Одень +7 +14 +18 +28

НК 1,8±0,15 1,93±0,03 1,85±0,08 2,03±0,08 1,88±0,08 1,95±0,15

Для того чтобы установить, за счет каких нуклеол у больных после алло ТКМ увеличивается НК, предпринято изучение морфологии ядрышек лимфоцитов.

Изменения морфологии нуклеол лимфоцитов.

При световой микроскопии нуклеолы обнаруживали во всех лимфоцитах. Они располагались в центре ядра или слегка эксцентрично.

Результаты подсчета лимфоцитов с кольцевидными, гомогенными и точечными нуклеолами в посттрансплантационном периоде представлены в таблице 8.

До кондиционирования соотношение лимфоцитов с кольцевидными и гомогенными нуклеолами не отличалось от показателей у здоровых лиц (за нормальное принимали соответственно). Доля лимфоцитов с

точечными нуклеолами была по сравнению с нормой несколько

увеличена - до

Таблица 8.

Морфология нуклеол лимфоцитов у больных после аллоТКМ (п=19)

Сроки исследования (дни) Среднее содержание лимфоцитов с различными нуклеолами (%)

кольцевидными гомогенными точечными

До кондиционирования 92,0+0,56 2,63+0,3 5,37+0,44

0 (день ТКМ) 83,37+0,87 7,26+0,68 9,37+0,99

+ 7 86,58+1,12 5,0+0,68 8,42+0,56

+ 14 89,26+0,56 3,84+0,31 6,89+0,68

+18 91,47+0,56 3,16+0,44 5,37+0,37

+28 90,79+0,50 3,32+0,5 5,89+0,5

+35 92,46+0,66 2,08+0,33 5,46+0,66

Установлено, что в день трансплантации, после кондиционирования, количество лимфоцитов с кольцевидными ядрышками достоверно уменьшалось, а число клеток с гомогенными и, особенно точечными нуклеолами, достоверно возрастало (р<0,05). Изменения морфологии нуклеол, выявленные в 0 день, можно объяснить влиянием мощного

цитостатического воздействия на ядрышки лимфоцитов, часть из которых гибнет. Об этом свидетельствует и преобладание содержания в лимфоцитах точечных ядрышек, что наблюдается при феномене ядрышковой сегрегации (Погорелов В.М., 1992г). Уже на +18 день статистически значимого отличия количества лимфоцитов с гомогенными и кольцевидными нуклеолами от исходных показателей не было. Содержание лимфоцитов с точечными нуклеолами приблизилось к исходному значению раньше, к +14 дню. Обратил на себя внимание тот факт, что на +28 день содержание клеток с гомогенными нуклеолами вновь повысилось до и превысило

исходные значения (р=0,075).

Для того чтобы уточнить, может ли увеличение содержания лимфоцитов с гомогенными нуклеолами в +28 день коррелировать с развитием острой РТПХ, нами изучена морфология ядрышек лимфоцитов у больных с и без острой РТПХ. Как уже указывалось ранее, при этом предполагалось установить значение выявленных изменений для раннего распознавания острой РТПХ.

Изменения морфологии ядрышек лимфоцитов у больных с и без

острой РТПХ

Распределение лимфоцитов по морфологии ядрышек в двух группах больных - с и без острой РТПХ представлено в таблице 9. В составе нуклеол до кондиционирования у больных с острой РТПХ и без этого осложнения заметных отличий не наблюдалось. После ТКМ динамика изменений лимфоцитов с кольцевидными и точечными нуклеолами у больных с РТПХ и без РТПХ также не имела заметных различий. В обеих группах, в 0 день, количество лимфоцитов с кольцевидными ядрышками достоверно уменьшалось, а содержание лимфоцитов с гомогенными и, особенно, точечными возрастало. К +14 дню в обеих группах больных содержание

лимфоцитов с кольцевидными, гомогенными и точечными нуклеолами достоверно не отличалось от исходных величин; не было разницы и в морфологии лимфоцитов у больных с и без РТПХ.

Таблица 9.

Изменения морфологии нуклеол лимфоцитов у больных с и без острой

РТПХ

Среднее содержание лимфоцитов с различными нуклеолами (%)

Сроки исследования (дни) Больные с РТПХ (п=8) Больные без РТПХ (п=11)

К Г т К Г т

До кондиционирования 91,63+0,88 3,25+0,7 5,13±0,51 92,27+0,76 2,18+0,57 5,55±0,67

0 ( день ТКМ) 83,63+1,26 7,38+1,01 9,0+0,51 83,18+1,05 7,18+1,05 9,64+1,52

+ 7 86,0+1,89 5,38+1,14 8,63+1,01 87,0+1,52 4,73+1,05 8,27+0,86

+ 14 90,38+0,88 3,5+0,51 6,13±1,14 88,45+0,86 4,09+0,48 7,45±1,05

+18 91,88+1,01 3,50+0,63 4,63±0,63 91,18+0,67 2,91+0,67 5,91±0,57

+28 90,75+0,51 4,5+1,01 4,75±0,76 90,82+0,76 2,45+0,38 6,73±0,76

+35 91,0+1,02 2,67+0,68 6,33+1,71 92,9+0,82 i ,9+0,41 5,2±0,82

К - лимфоциты с кольцевидными нуклеолами Г- -«-«-«-« с гомогенными нуклеолами Т- -«-«-«-« с точечными нуклеолами

Отличия были выявлены позже, они коснулись лишь изменения содержания лимфоцитов с гомогенными нуклеолами. При сравнительном анализе кривых, отражающих динамику распределения лимфоцитов с гомогенными нуклеолами у больных обеих групп оказалось, что до + 28 дня кривые были идентичными. На + 28 день у больных с острой РТПХ количество лимфоцитов с гомогенными нуклеолами достоверно увеличивалось (р=0,03), что могло быть расценено как активация

лимфоцитов вследствие развития острой реакции «трансплантат против хозяина». Динамика лимфоцитов с гомогенными нуклеолами представлена

на рисунке 4.

%

9

1 -I-.-,-----,-,-г-

До 0 + 7 +14+18+28+35

ткм

Дни после ТКМ

Рисунок 4. Изменение содержания лимфоцитов с гомогенными нуклеолами у больных с острой РТПХ (1) и без РТПХ (2)

Если увеличение содержания лимфоцитов с гомогенными нуклеолами происходит за счет активации лимфоцитов, то по числу клеток с этим типом ядрышек можно судить об усилении обменных процессов в лимфоцитах и начале активного синтеза р-РНК, т.е. об активации белкового синтеза. Известно, что при активации лимфоцитов происходит потребление мукополисахаридов, что может быть выявлено с помощью цитохимической реакции (PAS реакции). Для того чтобы установить, наблюдались ли изменения в метаболизме лимфоцитов после аллогенной ТКМ, нами были предприняты цитохимические исследования мазков периферической крови.

Исследование мукополисахаридов в лимфоцитах больных с острой РТПХ (PAS реакция).

Предполагалось установить, ассоциировались ли выявленные у больных с острой РТПХ признаки активации лимфоцитов с повышенным потреблением клетками мукополисахаридов.

Цитохимические исследования мазков периферической крови были выполнены у 11 реципиентов аллогенного костного мозга, у 8 из которых наблюдалась острая РТПХ.

Показано, что к +28 дню, т.е. в период, совпадающий со сроками увеличения лимфоцитов с гомогенными нуклеолами, содержание полисахаридов уменьшалось, что указывает на активацию лимфоцитов, предшествующую развитию острой РТПХ.

На рисунке 7, схематично представлена динамика содержания лимфоцитов с гомогенными нуклеолами у больных с РТПХ и без РТПХ в сравнении с результатами PAS - реакции.

Таким образом, у реципиентов аллогенного костного мозга установлены значительные изменения нуклеолярного коэффициента и морфологии нуклеол лимфоцитов под влиянием предтрансплантационного кондиционирования. У больных с острой РТПХ в сравнении с пациентами без РТПХ выявлены достоверные отличия - повышение НК на +28 день, увеличение количества лимфоцитов с гомогенными нуклеолами одновременно с уменьшением содержания в клетках мукополисахаридов. Эти изменения можно трактовать как ранние проявления острой РТПХ, клинические признаки которой наблюдали в большинстве случаев с+32 дня.

Проведенные исследования позволили охарактеризовать клинические особенности острой РТПХ, факторы риска ее развития, показать уменьшение частоты и степени тяжести РТПХ при использовании преднизолона, выявить изменения в нуклеолярном аппарате лимфоцитов, которые можно использовать для ранней диагностики этого осложнения.

Рисунок 7. Динамика лимфоцитов с гомогенными нуклеолами у больных с и без РТПХ и PAS- положительных лимфоцитов.

ВЫВОДЫ

1. Острая реакция «трансплантат против хозяина» у больных хроническим миелолейкозом развивается чаще, чем у больных острыми лейкозами и в более ранние сроки; при этом преобладают наиболее тяжелые ее формы.

2. В 91,5 % случаев острой реакции «трансплантат против хозяина» имеет место поражение кожи, в 37,5% - кишечника и 16,5% - печени; сочетанное поражение органов составляет 37%.

3. К факторам повышенного риска развития острой реакции «трансплантат против хозяина» относятся более быстрый темп приживления донорских клеток, количество в костномозговой взвеси миелокариоцитов более 3,0 х 108/кг, а также категория высокого риска при хроническом миелолейкозе, возраст больного и донора старше 40 лет.

4. Установлено влияние сочетания неблагоприятных факторов на развитие острой реакции «трансплантат против хозяина»; у 74-78% больных с острой реакцией «трансплантат против хозяина» отмечено 3-6 неблагоприятных факторов.

5. Применение преднизолона в схеме стандартной профилактики острой реакции «трансплантат против хозяина» способствует снижению частоты развития этого осложнения, и особенно П-ХУ степени тяжести.

6. У реципиентов аллогенного костного мозга выявлено увеличение нуклеолярного коэффициента и содержания лимфоцитов с гомогенными и точечными нуклеолами в 0 день, что можно связать с воздействием режима кондиционирования.

7. У больных с острой реакцией «трансплантат против хозяина» в сравнении с пациентами без этого осложнения выявлены повышение нуклеолярного коэффициента на +28 день, увеличение количества

лимфоцитов с гомогенными нуклеолами одновременно с уменьшением в клетках мукополисахаридов, что позволяет использовать эти данные для ранней диагностики острой реакции «трансплантат против хозяина».

Список опубликованных работ по теме диссертации

1). Анухина М.В., Любимова Л.С., Дягилева О.А., Козинец Г.И. Возможные диагностические подходы оценки реакции «трансплантат против хозяина». Клиническая лабораторная диагностика 2002, 10, стр.13.

2). Анухина М.В, Любимова Л.С. Применение преднизолона в профилактике острой РТПХ., Тезисы. «Русско-Норвежская конференция по гематологии», г. Санкт-Петербург, сентябрь 2003г, стр.4-7.

3). Анухина М.В., Любимова Л.С, Козинец Г.И., Порешина Л.П.. Возможные подходы к диагностике реакции «трансплантат против хозяина». Проблемы гематологии и переливания крови 2003,2, стр.32-33.

4). Анухина М. В., Любимова Л.С, Дягилева О.А., Козинец Г.И. Морфологические особенности нуклеолярного аппарата лимфоцитов в доклиническом периоде острой реакции «трансплантат против хозяина». Проблемы гематологии и переливания крови 2004, 2, стр.32-33.

5). Любимова Л.С, Савченко В.Г., Менделеева Л.П., Кузьмина Л.А., Анухина М.В., Грибанова Е.О., Демидова И.А., Мисюрин А.В., Виноградова О.А., Домрачева Е.В., Порешина Л.П., Кутьина P.M., Шпакова А.П., Матвеенко А.А., Калинин Н.Н., Гемджян Э.Г. Трансплантация аллогенного костного мозга при хроническом миелолейкозе. Терапевтический архив 2004, 7, стр. 18-24.

6). Анухина М.В., Любимова Л.С. Роль преднизолона в профилактике острой реакции «трансплантат против хозяина» после аллогенной трансплантации костного мозга больным гемобластозами. Проблемы гематологии и переливания крови 2004,4,стр 19-23.

Отпечатано в ООО«Аведа» 117342, Москва, ул. Введенского, д.8, тел. 332-50-94.

Подписано в печать 31.03.2005 г. Формат 60x90/16. Тираж 100 экз. 1.0 п.л. Бумага New SvetoCopy.

270

11 АПР 2005 • - - v

Актуальность проблемы

Аллогенная трансплантация костного мозга (аллоТКМ) широко применяется в практике лечения гемобластозов с середины 80-х годов. Согласно имеющимся публикациям, 5-летняя безрецидивная выживаемость достигается в среднем у 5060% больных, которым ТКМ произведена при остром лейкозе (OJI) в фазе I полной ремиссии, а при хроническом миелолейкозе (XMJI) в хронической фазе. Из пациентов с OJT и XMJT, которым аллогенная трансплантация костного мозга произведена на более поздних этапах заболевания, в число долгожителей попадает лишь 10 - 20% больных (2, 6, 26, 65). Таким образом, после аллогенной ТКМ выздоравливает, примерно, 50 - 60% больных в фазе I ремиссии OJT и каждый пятый больной с OJI из тех, кто вообще не имеет шансов на длительную выживаемость при стандартной химиотерапии. Аллогенная ТКМ остается до сих пор единственным методом терапии, способным излечить больных XMJI.

Несмотря на значительные успехи, достигнутые в области трансплантации костного мозга, проблема ранней летальности реципиентов остается актуальной. Одной из основных причин смерти больных в раннем посттрансплантационном периоде является острая реакция «трансплантат против хозяина» (острая РТПХ). По имеющимся данным развитие острой РТПХ отмечается у 50 - 80% реципиентов аллогенного костного мозга и в 15 - 20% случаев, приобретает крайне тяжелое течение с летальным исходом.

Острая РТПХ была описана еще в середине 60-х годов прошлого века, однако многие аспекты этой проблемы остаются недостаточно изученными и до сих пор привлекают внимание клиницистов и исследователей во всем мире.

Наша клиника располагает наблюдениями за больными с острой РТПХ, однако в отечественной литературе приведены лишь немногочисленные сведения, касающиеся, в основном, частоты развития острой РТПХ и смертельных исходов от этого осложнения. Практически не освещены детально сроки возникновения острой РТПХ, особенности клинического течения, динамика гематологических показателей, не проведен анализ факторов, ассоциирующихся с ее развитием. Поэтому многосторонний комплексный анализ материалов, накопленных в клинике в процессе ведения больных с острой РТПХ представляется особенно важным.

Одной из основных задач остается поиск новых методов ранней диагностики и профилактики острой РТПХ, так как существующие методы не привели к значительному снижению ее частоты или степени тяжести. Существующие подходы к диагностике острой РТПХ являются достаточно ограниченными и базируются, прежде всего, на характерной клинической картине заболевания. Результаты основного лабораторного метода диагностики - гистологического исследования биопсийного материала пораженных органов (кожи, печени, кишечника), не всегда бывают информативными и обычно известны, когда болезнь приняла развернутый характер. Очевидно, что ранняя диагностика острой РТПХ может оказать значительное влияние на успех терапии. Поэтому разработка новых методов диагностики, которые могут способствовать своевременной постановке диагноза, особенно в случае отсутствия ярких и очевидных клинических симптомов, является чрезвычайно актуальной.

В связи с этим были предприняты исследования состояния нуклеолярного аппарата лимфоцитов у реципиентов костного мозга. Обоснованием для их проведения послужили результаты работ, выполненных в лаборатории гемоцитологии ГНЦ РАМН у больных с хроническим миелолейкозом, острыми лейкозами в процессе проведения цитостатической терапии и после достижения ремиссии (1, 10), а также публикации зарубежных авторов, которые посвящены изучению нуклеологенеза при гемобластозах (16, 156). Они показали, что при различных гемобластозах нуклеолярный аппарат различных клеток претерпевает значительные изменения. Были отмечены морфологические особенности ядрышек, изменения нуклеолярного коэффициента в момент диагностики лейкоза, после достижения ремиссии (5), а также при прогрессировании заболевания. В ряде работ показано, что нуклеолярный аппарат лимфоцитов также подвергается значительным изменениям под влиянием интенсивных воздействий (7), таких как химиотерапия, ионизирующее облучение (8). В литературе нам встретились немногочисленные публикации, касающиеся изучения ультраструктур клеток периферической крови, слизистой тонкого кишечника у реципиентов костного мозга с хронической РТПХ (61,101). Публикаций, касающихся исследований лимфоцитов периферической крови у реципиентов после аллоТКМ нам не встретилось. В то же время известно, что лимфоциты принимают активное участие в механизме развития острой РТПХ (57). В связи с этим возникло предположение, что изучение морфологических особенностей ядрышек лимфоцитов может выявить особенности, характерные для самого раннего (доклинического) периода развития острой РТПХ.

Что же касается профилактики острой реакции «трансплантат против хозяина», то привлекли внимание сообщения отдельных авторов (34, 35, 164) об использовании других препаратов, в частности, преднизолона, дополнительно к стандартной профилактике циклоспорином А (ЦСА) и метотрексатом (МТК). Поскольку работы, анализирующие значение дополнительной профилактики острой РТПХ преднизолоном являются немногочисленными и противоречивыми, особое внимание было уделено оценке ее эффективности у больных острыми лейкозами и хроническим миелолейкозом. Актуальность этого раздела исследований определяется необходимостью совершенствования методов профилактики острой РТПХ.

Цель работы - охарактеризовать клинико-лабораторные проявления острой РТПХ и установить морфологические особенности нуклеолярного аппарата лимфоцитов у реципиентов костного мозга.

Задачи исследования:

1. Определить сроки развития, клинические проявления острой РТПХ и факторы, риска ее развития.

2. Оценить динамику восстановления числа лейкоцитов и тромбоцитов у больных с острой РТПХ.

3. Определить эффективность дополнительной профилактики острой РТПХ преднизолоном.

4. Установить морфологические особенности нуклеолярного аппарата лимфоцитов у реципиентов аллогенного костного мозга.

5. Определить значение изменений нуклеолярного аппарата лимфоцитов для раннего распознавания острой РТПХ.

Научная новизна работы

Работа посвящена вопросам клиники, диагностики и профилактики острой РТПХ. Наряду с анализом клинического материала, позволившего установить частоту, сроки развития острой РТПХ, факторы, риска ее развития, изучено состояние нуклеолярного аппарата лимфоцитов с целью определения его значения в диагностике острой реакции «трансплантат против хозяина». Подобные методики при динамическом обследовании больных после аллогенной ТКМ до сих пор не использовались. Также на собственном материале впервые проведена оценка эффективности дополнительного использования преднизолона в профилактике острой РТПХ у больных OJI и XMJL

Научно-практическая ценность работы

На основе созданной базы данных, включившей 45 реципиентов костного мозга, наблюдавшихся в клинике в течение последних 4 лет, охарактеризованы клинико-лабораторные проявления острой РТПХ.

Выявлено, что острая РТПХ реже развивалась у больных с OJI (44%), чем при XMJI (67%), причем при XMJI преобладали более тяжелые ее формы (II-IV степени тяжести).

Установлено, что факторами риска, имеющими наибольшее значение в развитии острой РТПХ являются более быстрый темп приживления трансплантированных донорских клеток и содержание в костномозговой взвести миелокариоцитов в количестве более 3,0 х 108/кг массы тела больного, возраст больного и донора > 40 лет.

Установлено, что тяжелые формы острой РТПХ наблюдаются, преимущественно, у больных, имеющих не менее 3 неблагоприятных факторов. Отмечено также, что при XMJI острая РТПХ развивалась в 2 раза чаще у больных II-III категории риска. Полученные данные позволяют выделить группу больных, имеющих высокий риск развития острой РТПХ, что следует учитывать при отборе больных и в посттрансплантационном периоде.

Опыт применения дополнительной профилактики острой РТПХ преднизолоном показал ее эффективность. Установлено, что преднизолон способствовал снижению частоты острой РТПХ и наиболее тяжелых ее форм, особенно, у больных XMJI, что позволяет рекомендовать назначение преднизолона пациентам XMJI. Поскольку установлено, что частота развития и степень тяжести острой РТПХ у больных OJI ниже, а риск развития посттрансплантационных рецидивов высок, вопрос о целесообразности применения более интенсивной профилактики острой РТПХ у этой группы больных подлежит дальнейшему обсуждению.

Динамическое изучение нуклеолярного аппарата лимфоцитов периферической крови у реципиентов костного мозга показало, что после аллогенной ТКМ имеют место значительные изменения в морфологии ядрышек лимфоцитов.

Установлено, что наиболее существенные изменения происходят под влиянием кондиционирования и в период, совпадающий с началом приживления донорских клеток. Важными представляются выявленные отличия в морфологии нуклеол лимфоцитов и показателях нуклеолярного коэффициента (НК) у больных с острой РТПХ по сравнению с пациентами без этого осложнения. Это способствовало выявлению пациентов, у которых вероятность развития острой РТПХ является высокой и своевременному началу терапии.

Проведенные исследования позволили получить информацию фундаментального характера, о функциональных изменениях в нуклеолярном аппарате лимфоцитов реципиентов костного мозга, способствуют углублению наших знаний не только о клинических особенностях острой РТПХ, но и изменениях Hai клеточном уровне, происходящих в постгрансплантационном периоде. Этот раздел исследований также имеет значение для практики, так как дает дополнительные возможности для раннего распознавания острой РТПХ и своевременного начала терапии.

Положения, выносимые на защиту

1. Острая РТПХ у больных с XMJI развивается чаще и в более ранние сроки, чем у больных с ОД.

2. При XMJI частота развития острой РТПХ II-IV степени тяжести выше, чем у пациентов с ОД.

3. Из числа факторов, ассоциирующихся с высоким риском развития острой РТПХ, наиболее важными являются более быстрое приживление донорских клеток и количество миелокариоцитов в трансплантате >3х108/кг.

4. Включение преднизолона в схему стандартной профилактики острой РТПХ циклоспорином А и метотрексатом способствует снижению частоты развития острой РТПХ и степени ее тяжести, особенно при XMJ1.

5. После аллогенной трансплантации костного мозга имеют место значительные изменения в нуклеолярном аппарате лимфоцитов.

6. Отличительные особенности морфологии ядрышек лимфоцитов и динамики нуклеолярного коэффициента у больных с острой РТПХ могут иметь значение для выявления больных с высоким риском развития этого осложнения.

Апробация работы.

Основные положения работы доложены на межлабораторном семинаре ГНЦ РАМН (2003 год), на курсах повышения квалификации врачей по специальности «Основы клинической трансфузиологии» (2004 год) и опубликованы в сборнике трудов Российско-Норвежской конференции по гематологии. Санкт-Петербург, сентябрь 2003 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 104 стр. состоит из введения, обзора литературы, методической главы, глав собственных исследований, заключения, выводов, указателя литературы. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 6 рисунками. Диссертация выполнена в отделении химиотерапии гемобластозов и трансплантации костного мозга (руководитель, член-корр. РАМН, проф. В.Г. Савченко) и лаборатории гемоцитологии ГНЦ РАМН (руководитель - проф. Г.И. Козинец) с участием д.м.н. В.М. Погорелова, к.м.н. О.А. Дягилевой, д.м.н. Т.Г. Сарычевой, к.б.н. P.M. Кутьиной, д.б.н. А.П. Порешиной (лаб. иммуногематологии зав. - к.м.н. Л.Л. Головкина), к.м.н. А.П. Шпаковой (лаб. клинической иммунологии, зав. - проф. Т.И.Булычева), сотрудников клинико-диагностической лаб. (зав -Л.Ю. Тихонова).

Выводы

1. Острая реакция «трансплантат против хозяина» у больных хроническим миелолейкозом развивается чаще, чем у больных острыми лейкозами и в более ранние сроки; при этом преобладают наиболее тяжелые ее формы.

2. В 91,5% случаев острой реакции «трансплантат против хозяина» имеет место поражение кожи, в 37,5% - кишечника и 16,5% - печени; сочетанное поражение органов составляет 37%.

3. К факторам повышенного риска развития острой реакции «трансплантат против хозяина» относятся более быстрый темп приживления донорских клеток, количество в костномозговой взвеси миелокариоцитов более 3,0 х 108/кг, а также категория высокого риска при хроническом миелолейкозе, возраст больного и донора старше 40 лет.

4. Установлено влияние сочетания неблагоприятных факторов на развитие острой реакции «трансплантат против хозяина»; у 74-78% больных с острой реакцией «трансплантат против хозяина» отмечено 3-6 неблагоприятных факторов.

5. Применение преднизолона в схеме стандартной профилактики острой реакции «трансплантат против хозяина» способствует снижению частоты развития этого осложнения, и особенно II-IV степени тяжести.

6. У реципиентов аллогенного костного мозга выявлено увеличение нуклеолярного коэффициента и содержания лимфоцитов с гомогенными и точечными нуклеолами в 0 день, что можно связать с воздействием режима кондиционир ов ания.

7. У больных с острой реакцией «трансплантат против хозяина» в сравнении с пациентами без этого осложнения выявлены повышение нуклеолярного коэффициента на +28 день, увеличение количества лимфоцитов с гомогенными нуклеолами одновременно с уменьшением в клетках мукополисахаридов, что позволяет использовать эти данные для ранней диагностики острой реакции «трансплантат против хозяина».

Заключение

Настоящая работа проводилась с целью определения особенностей течения и критериев диагностики острой реакции «трансплантат против хозяина». Особенно интересным нам представлялось сделать акцент на ранней диагностике этого осложнения.

Поскольку наша клиника располагает значительным числом наблюдений за больными с острой РТПХ, мы провели анализ неблагоприятных факторов, ассоциирующихся с высоким риском развития этого осложнения, используя материалы, накопленные в клинике. Результаты этого анализа предполагалось применять для определения критериев риска развития РТПХ и прогнозирования развития этого осложнения.

Кроме того, были определены особенности клинического течения острой РТПХ, проанализирован собственный опыт применения дополнительной профилактики реакции «трансплантат против хозяина» преднизолоном.

В результате многофакторного анализа результатов обследования 45 реципиентов аллогенного костного мозга, наблюдавшихся в клинике в течение последних 5 лет, были установлены частота и сроки возникновения острой РТПХ, и факторы, ассоциирующиеся с повышенным риском ее развития.

Так, из 45 больных, включенных в анализ, острая реакция «трансплантат против хозяина» развилась у 24 больных (53%). Оказалось, что в этой группе было примерно одинаковое число больных с ХМЛ и ОЛ, включая МДС, и почти все больные были отнесены к высокой категории риска. При анализе больных с острой РТПХ выяснилось, что после миелоаблативного кондиционирования она развивается чаще у больных с ХМЛ (67%) по сравнению с пациентами с ОЛ (44%). Также отмечено, что острая РТПХ наблюдалась, за исключением 1 случая, у всех пациентов после немиелоаблативного кондиционирования.

При анализе сроков развития и клинических проявлений острой РТПХ, нами установлено, что у наших больных острая РТПХ развивалась в среднем на +35 день, причем у больных с ХМЛ она развивалась значительно раньше - на +28 день, чем у больных с ОЛ - на + 42 день.

Наиболее часто диагностировалась РТПХ I-II степени тяжести как в группе больных с XMJI, так и в группе с OJI, причем число тяжелых форм острой реакции «трансплантат против хозяина» из общего числа больных в каждой нозологической группе было почти вдвое большим среди больных с XMJI. РТПХ III-IV степени тяжести наблюдалась у двух больных с XMJI, один случай со смертельным исходом. В другом случае было отмечено присоединение хронической РТПХ, осложненной тяжелыми инфекционными осложнениями, от которых больная погибла через 7 месяцев после ТКМ.

Анализ клинических проявлений острой реакции «трансплантат против хозяина» показал, что практически у всех больных наблюдалось поражение кожи (91,5%). На втором месте по частоте поражения оказался кишечник (37,5%), реже отмечалось поражение печени (16,5%). Изолированное поражение одного органа наблюдалось у 15 больных: у 14 больных (58%) - изолированное поражение кожи, и у 1 (4%)-кишечника. Наиболее тяжелыми были случаи сочетанного поражения органов: кожи и печени (у 1), кожи и кишечника (у 5 больных), печени и кишечника (у 1) и кожи, печени и кишечника - у 2 пациентов.

Одной из задач исследования было установить факторы, ассоциирующиеся с развитием острой РТПХ, и выявить критерии риска развития этого осложнения. Для оценки факторов, которые могли коррелировать с развитием острой РТПХ, была создана база данных. Прежде всего, мы попытались охарактеризовать в больных, у которых была диагностирована острая РТПХ. При этом мы ориентировались на те факторы, которые по данным литературы относят к числу неблагоприятных (возраст старше 40 лет, давность диагностики заболевания более 12 мес., наличие донора женщины и т.д.). Кроме указанных, мы ввели и такие показатели, как категория риска больных, скорость приживления трансплантата по данным исследования эритроцитарного химеризма и сроков восстановления показателей периферической крови, а таюке содержание в костномозговой взвеси миелокариоцитов в количестве менее и более 3,0 х 108/кг массы тела больного. По полу, возрасту, давности диагностики заболевания группы не имели заметных различий.

Было выявлено, что существенное неблагоприятное влияние на развитие острой РТПХ оказали темп приживления трансплантированных донорских клеток по данным эритроцитарного химеризма. Так, у больных с острой РТПХ число донорских клеток на +30 и +60 дни после аллоТКМ превышало таковое у больных без РТПХ, причем на +60 день - статистически достоверно. Иными словами, у больных с острой РТПХ темп приживления трансплантированных клеток был более быстрым. К неблагоприятным факторам, способствующим развитию РТПХ, по нашим данным, можно отнести также содержание в костномозговой взвеси Q более 3,0 хЮ /кг массы тела больного миелокариоцитов, а также принадлежность больных к высокой категории риска, возраст больного и донора старше 40 лет.

Для таких факторов как наличие донора- женщины, совместимость пар по полу, по АВО -антигенам заметной роли в развитии острой РТПХ не установлено, так как эти показатели практически не отличались у больных с и без острой реакции «трансплантат против хозяина».

Для более углубленной оценки значения указанных выше показателей, на основе созданной базы данных, были дополнительно проведены также статистические исследования с помощью дисперсионного, корреляционного и факторного анализов (с использованием статистического пакета программ «Статистика 5.0.»). В результате этого исследования была подтверждена зависимость между количеством донорских клеток в крови реципиента на + 60 день и развитием острой реакции «трансплантат против хозяина» и числом о миелокариоцитов в костномозговой взвеси более 3,0 хЮ /кг массы тела больного. Также выявлена определенная взаимосвязь между развитием острой РТПХ и несовместимостью больного и донора по антигенам системы АВО. В группе больных с OJI этими методами была обнаружена корреляция между развитием острой РТПХ и более быстрым достижением уровня лейкоцитов > 0,5x109/ л. Несмотря на немногочисленное число наблюдений, этот анализ позволил выделить те факторы, которые с большей степенью вероятности могут влиять на развитие острой РТПХ.

Результаты проведенного анализа степени тяжести острой реакции «трансплантат против хозяина» у больных с XMJI и OJI позволил установить, что при ХМЛ было в 3 раза больше случаев острой РТПХ II-III степени тяжести, чем III; также при ХМЛ в сравнении с больными с ОЛ было больше тяжелых форм (75 и 58% соответственно). Обратил на себя внимание факт, что у больных с II-IV степенью тяжести острой РТПХ развилась впоследствии экстенсивная хроническая РТПХ, причем в большем числе случаев при ХМЛ (67%), чем при ОЛ (43%).

На наш взгляд, представляло интерес установить взаимосвязь между развитием острой РТПХ и количеством неблагоприятных факторов. Оказалось, что у подавляющего числа больных с острой РТПХ II-III степени тяжести при обеих нозологиях имели место 3 и более неблагоприятных фактора. У больных с немиелоаблативным кондиционированием, за исключением одного, было 4-6 неблагоприятных фактора, степень тяжести РТПХ была не менее II.

Представлялось интересным определить, какие из неблагоприятных факторов имели большее значение для развития острой реакции «трансплантат против хозяина» и отмечались у наших больных чаще. Для этого сравнили частоту встречаемости неблагоприятных факторов у больных с и без РТПХ. Было выявлено, что в группе больных с РТПХ было больше пациентов в возрасте старше 40 лет, имеющих донора старше 40 лет. Несмотря на то, что подавляющее число наших больных принадлежало к группе высокого риска, среди больных с острой РТПХ их оказалось больше, чем среди пациентов без РТПХ, причем за счет больных с ХМЛ.

Таким образом, при анализе факторов риска развития острой РТПХ, было показано, что имеют значение: скорость приживления трансплантата, о чем свидетельствовали достоверно более высокое среднее содержание донорских клеток в крови реципиента на +60 день, более быстрое повышение числа лейкоцитов до 0,5x109/л при ОЛ и достоверно более быстрое восстановление числа тромбоцитов до 50,0x10% (у больных с острой РТПХ к +19 дню, а у больных без острой РТПХ - на 5 дней позже); о содержание миелокариоцитов в костномозговой взвеси более 3,0 х10 /кг массы тела больного; отмечена неблагоприятная роль исходного статуса больных (группа высокого риска), особенно, при ХМЛ. Другие из выделенных нами факторов (возраст больного и донора старше 40 лет, несовместимость пар по антигенам системы АВО), могут, видимо, также влиять на развитие РТПХ. При этом показано, что имеет значение также число неблагоприятных факторов у каждого отдельного пациента.

Острая РТПХ является частым осложнением после аллогенной ТКМ. Проводимая пациентам профилактика циклоспорином А в сочетании с метотрексатом, является недостаточной. Некоторые исследователи попытались усилить иммуносупрессию, в частности, добавлением преднизолона к общепринятой схеме. Так как работы, анализирующие значение дополнительной профилактики острой РТПХ преднизолоном являются единичными и противоречивыми, мы применили преднизолон 19 пациентам и проанализировали наши данные.

Результаты, полученные при анализе частоты развития острой реакции «трансплантат против хозяина» у больных, получавших и не получавших преднизолон, показали, что у больных без дополнительной профилактики острой РТПХ преднизолоном число случаев этого осложнения было большим, превалировали более тяжелые формы. Так у пациентов, не получавших преднизолон, число случаев острой РТПХ II-III степени тяжести в 3 раза превышало таковое у больных, получавших преднизолон (31% и 10% соответственно). Мы обратили внимание на то, что профилактика преднизолоном способствовала также уменьшению числа случаев экстенсивных форм хронической РТПХ. Кроме того, мы отметили, что дополнительная профилактика преднизолоном способствовала уменьшению частоты развития хронической РТПХ у больных, получавших преднизолон (55%); в отсутствии профилактики преднизолоном хроническая РТПХ развилась у 80% больных.

Был также проведен анализ степени тяжести острой РТПХ в зависимости от применения преднизолона. Оказалось, что у 9 пациентов, получавших профилактику преднизолоном, превалируют более легкие формы, т.е. РТПХ I-II степени тяжести (54% случаев против 46% у пациентов, не получавших преднизолон -15 человек). Соответственно острая РТПХ III- IV степени тяжести развилась всего у 2 (18%) больных, получавших преднизолон, и у 82% (9 больных из 19) пациентов без дополнительной профилактики.

Таким образом, было показано, что дополнительная профилактика преднизолоном способствует уменьшению частоты развития острой реакции трансплантат против хозяина». Но основной эффект преднизолона, на наш взгляд, заключается в значительном снижении числа случаев тяжелых форм острой РТПХ (III, IV степени тяжести).

Приведенные данные были получены при совместном анализе обеих групп больных - с XMJI и OJI. Мы провели также сравнительный анализ частоты развития и тяжести острой РТПХ отдельно у больных с XMJI и OJI, получавших и не получавших преднизолон. Оказалось, что применение преднизолона способствовало уменьшению частоты развития острой РТПХ в обеих группах, и в значительной степени снижению развития более тяжелых форм острой реакции «трансплантат против хозяина», особенно у пациентов с OJI.

Таким образом, первый опыт применения дополнительной профилактики острой РТПХ преднизолоном позволил сделать вывод о том, что преднизолон способствует снижению частоты развития острой РТПХ и, что особенно важно, тяжелых ее форм.

Вторая часть работы была посвящена изучению нуклеолярного аппарата лимфоцитов периферической крови реципиентов аллогенного костного мозга. В задачи исследования входило выявление морфофункциональной активности ядрышек лимфоцитов для оценки возможного доклинического определения проявлений острой реакции «трансплантат против хозяина».

В это исследование включено 19 реципиентов аллогенного и 6 -аутологичного костного мозга.

Было выявлено увеличение НК после кондиционирования в 0 день и период начала приживления трансплантата - +14 - +35 дни. Установлено, что эти сроки соответствуют появлению донорских эритроцитов и в этот период времени также наблюдалось возрастание лейкоцитов периферической крови, свидетельствующее о реконституции миелоидного кроветворения.

Для того чтобы установить, связаны ли изменения НК с развитием острой РТПХ, были проанализированы изменения НК у больных с и без острой РТПХ. Из 19 реципиентов аллогенного костного мозга острая реакция «трансплантат против хозяина» развилась у 8 пациентов, у 7 - в сроки от +31 до +59 дня, у 1 на +95 день (в среднем на +48 день). Группу без острой РТПХ составили 11 пациентов. При анализе изменения НК в этих двух группах больных во все сроки наблюдения были выявлены более высокие показатели у больных с острой РТПХ по сравнению с больными без этого осложнения, а в 0 и +28 дни различие оказалось статистически значимым. Кроме того, на + 28 день у больных с острой РТПХ НК был достоверно повышен также по сравнению с исходным значением.

Для того чтобы установить, за счет каких нуклеол у исследуемых больных увеличивается НК, были изучены изменения морфологии ядрышек лимфоцитов. До кондиционирования преобладали лимфоциты с кольцевидными нуклеолами 92+0,56%, гомогенные составляли 2,63+0,37%, а точечные 5,37+0,44%, что наблюдается у здоровых лиц.

Установлено, что в общей группе реципиентов аллогенного костного мозга, в день трансплантации, после кондиционирования, количество лимфоцитов с кольцевидными ядрышками достоверно уменьшалось до 83,37+0,87% (р <0,05), число клеток с гомогенными и точечными нуклеолами достоверно возрастало до 7,26+0,68% и 9,37+0,99% (р <0,05) соответственно. Содержание лимфоцитов с точечными нуклеолами приблизилось к исходному значению к +14 дню, а к +18 не было статистически значимого отличия количества лимфоцитов с гомогенными и кольцевидными нуклеолами от исходных показателей. Обратил на себя внимание тот факт, что на +28 день содержание лимфоцитов с гомогенными нуклеолами вновь повысилось и превосходило исходные значения (р <0,075).

Изменения морфологии нуклеол, выявленные в 0 день, были связаны с мощным цитостатическим воздействием на лимфоциты, часть из которых гибнет. Об этом свидетельствует и преобладание лимфоцитов с точечными ядрышками, что наблюдается при феноменене ядрышковой сегрегации.

Увеличение лимфоцитов с гомогенными нуклеолами в +28 день, указывало на их активацию. Для того чтобы уточнить, коррелирует ли увеличение лимфоцитов с гомогенными нуклеолами с острой реакцией «трансплантат против хозяина», нами изучено изменение морфологии ядрышек лимфоцитов у больных с и без острой РТПХ. Учитывая, что самые ранние проявления этого осложнения в исследуемой группе пациентов наблюдались в +31 день, предполагалось установить значение выявленных изменений для раннего распознавания острой РТПХ.

Оказалось, что в составе нуклеол до кондиционирования у больных с острой РТПХ и без нее, заметных отличий не было. Сравнительный анализ морфологии ядрышек лимфоцитов у больных с и без РТПХ также не выявил существенных отличий в первые 2 недели. Так обеих группах больных до трансплантации преобладали лимфоциты с кольцевидными нуклеолами. Распределение лимфоцитов с различной морфологией ядрышка соответствовало нормальному. В О день, так же в обеих группах больных, количество лимфоцитов с кольцевидными нуклеолами достоверно уменьшалось, а содержание лимфоцитов с гомогенными и особенно с точечными нуклеолами возрастало. К +14 дню в исследуемых группах больных содержание лимфоцитов с кольцевидными, гомогенными и точечными нуклеолами достоверно не отличались от исходных величин.

Однако после +14 дня, в динамике распределения лимфоцитов с гомогенными нуклеолами у больных с острой реакцией «трансплантат против хозяина» и без этого осложнения были выявлены статистически значимые отличия. Так у больных без острой РТПХ наблюдалось неуклонное уменьшение лимфоцитов с гомогенными нуклеолами до +35 дня. В группе больных с РТПХ было обнаружено достоверное увеличение лимфоцитов с гомогенными нуклеолами по сравнению с аналогичным показателем в группе больных без острой РТПХ (р <0,03). Отмеченные у больных с острой РТПХ колебания содержания лимфоцитов с гомогенными нуклеолами, возможно обусловлены этой реакцией.

Увеличение лимфоцитов с гомогенными нуклеолами указывает на усиление обменных процессов в лимфоцитах и начале активного синтеза р-РНК, т.е. об активации белкового синтеза. Расход большого количества энергетических запасов отражается в повышенном потреблении полисахаридов. Чтобы установить, наблюдаются ли изменения в метаболизме лимфоцитов после аллоТКМ, были предприняты цитохимические исследования мазков периферической крови. Наибольший интерес представляло установить, соответствовали ли выявленные у больных с острой РТПХ признаки активации лимфоцитов с повышенным потреблением клетками полисахаридов.

Было выявлено, в первые 18 дней после ТКМ, когда начиналось восстановление кроветворения, вследствие приживления трансплантированных клеток, число PAS - положительных клеток достоверно увеличилось (р =0,02). К

28 дню число PAS - положительных лимфоцитов снизилось. Вероятно, что накопленный к +18 дню энергетический потенциал, далее к +28 дню расходовался в период, совпадающий со сроками увеличения лимфоцитов с гомогенными нуклеолами. Можно предположить, что в этот период, расходуя полисахариды, лимфоциты из фазы Go переходили в Gi фазу, в нуклеолах начинался усиленный синтез р-РНК и белка. Это приводило к гомогенизации нуклеол. Обнаруженные нами изменения в нуклеолярном аппарате лимфоцитов являются отражением тех процессов, которые имеют место в период, когда еще нет явных клинических проявлений острой реакции «трансплантат против хозяина».

Следует отметить, что связать указанные изменения в нуклеолярном аппарате лимфоцитов однозначно с острой РТПХ трудно, поскольку в раннем постгрансплантационном периоде на ядрышковой аппарат лимфоцитов может влиять множество факторов: режим кондиционирования, иммуносупрессивная терапия (циклоспорин А, преднизолон, селсепт), инфекционные осложнения. Поэтому настоящая работа может рассматриваться в качестве начального этапа исследований, выявивших изменения в нуклеолярном аппарате лимфоцитов реципиентов аллогенного костного мозга.