Автореферат и диссертация по медицине (14.01.01) на тему:Клинические и молекулярно-биологические особенности ассоциированных гиперпластических процессов матки

на правах рукописи

СМИРНОВА Марина Юрьевна

КЛИНИЧЕСКИЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ АССОЦИИРОВАННЫХ ГИПЕРПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ МАТКИ

14.01.01 - акушерство и гинекология

14.03.02 - патологическая анатомия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

005008Ь^

1 2 ЯНБ 2012

Санкт-Петербург - 2011

005008532

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный университет»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор

Ниаури Дари ко Александровна Кветной Игорь Моисеевич

Новиков Борис Николаевич Аничков Николай Мильевич

Ведущая организация: ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ

Защита диссертации состоится «-¿-^7» с/)^^^^1 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 001.021.01 при Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН (199034, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН.

Автореферат разослан « »^¿^¿-й 201^г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

доктор медицинских наук Кузьминых Татьяна Ульяновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время отмечается возросший интерес исследователей к проблемам гиперпластических процессов органов репродуктивной системы женщины, что связано с большой распространённостью этих заболеваний в структуре гинекологической патологии, в том числе при их сочетании (Сидорова И.С. и соавт., 2007; Унанян A.JL, 2007; Станоевич И.В., 2009; Bergeron С. et al., 2006; Kitawaki J., 2006; Vercellini P. et al, 2006; Blake R.E., 2007; Reed S.D. et al., 2009).

Традиционно ассоциированные гиперпластические процессы матки (миома матки, аденомиоз, гиперплазия и полипы эндометрия) считаются показанием к радикальному хирургическому вмешательству (Зайцева Е.Г. и соавт., 2007). Однако такой подход противоречит принципам современной репродуктивной хирургии, приоритетами которой являются органосохраняющие операции, что особенно важно при необходимости сохранить способность к реализации репродуктивной функции (Стрижаков А.Н. и соавт., 2003; Тихомиров А.Л., 2007). В то же время вопрос прогнозирования риска развития сочетанных и рецидивов имеющихся гиперпластических процессов после оперативного лечения остаётся открытым.

Активно изучается роль половых стероидных гормонов и их рецепторов, а также факторов, регулирующих пролиферацию (сосудистый эндотелиальный фактор роста, инсулиноподобные факторы роста, трансформирующий фактор роста ß, Ki-67 и др.) и апоптоз (bcl-2, Fas/FasL и др.) в патогенезе отдельных гиперпластических процессов матки (Бурлев В .А., 2006; Brosens I., Pinn V.W., 2005; Blake R.E., 2007; Fleischer R. et al., 2008; Hermon T.L. et al., 2008; Okolo S., 2008; Epplein M. et al., 2009; Dai H. et al., 2010; Amalinei C., 2011). Появляются фундаментальные работы, посвящённые молекулярно-биологическим характеристикам миомы матки, аденомиоза, их сочетаний между собой и с онкологической патологией (Сидорова И.С. и соавт., 2002, 2006, 2007; Гуриев Т.Д., 2005;

ПечениковаВ.А., 2005, 2011; Мунтян А.Б. и соавт., 2007; Т. Магио й а1., 2004; КоБЫуашаМ. е! а1., 2004; Капд 8. е1 а1., 2009). Однако имеющиеся данные с трудом поддаются сопоставлению, поскольку получены на различном клиническом материале, охватывают разные аспекты влияния регуляторов пролиферации и апоптоза, и не позволяют уточнить механизмы возникновения и развития ассоциированных гиперпластических процессов (Сидорова И.С. и соавт., 2006). Следует также учитывать, что обычно применяемый для оценки экспрессии различных молекулярно-биологических маркеров в тканях иммуногистохимический метод отличается субъективностью полуколичественной оценки результатов реакции (Снигур Г.Л., 2008). Проведение репрезентативных сравнимых молекулярно-биологических исследований ассоциированных гиперпластических процессов матки диктует необходимость разработки стандартной методики количественного иммуногистохимического анализа экспрессии сигнальных молекул в миометрии и эндометрии.

Описаны некоторые клинические и анамнестические особенности сочетанных гиперпластических заболеваний матки (Макаркина Л.Г, 2005; Гусаева Х.З., 2009; Ккачуа!« I. й а!., 2001). При этом отсутствуют исследования, посвященные закономерностям последовательного и взаимообусловленного возникновения миомы матки, аденомиоза и гиперпластических процессов эндометрия. Таким образом, представляется актуальным поиск клинико-анамнестических особенностей и молекулярно-биологических характеристик тканей матки, позволяющих прогнозировать выявление ассоциированных синхронных или развитие метахронных гиперпластических процессов.

Целью настоящей работы явилось изучение клинических особенностей течения заболеваний и молекулярно-биологических характеристик миометрия и эндометрия у больных с ассоциированными гиперпластическими процессами матки.

Задачи исследования

1. Выявить клинико-анамнестические особенности больных с ассоциированными гиперпластическими процессами матки (миома матки, аденомиоз, гиперпластические процессы эндометрия).

2. Выявить клинико-анамнестические особенности больных с синхронным и метахронным развитием ассоциированных гиперпластических процессов матки (миома матки, аденомиоз, гиперпластические процессы эндометрия).

3. Разработать стандартную методику количественного иммуногистохимического анализа экспрессии цитоплазматических и ядерных маркеров с помощью доступных программ анализа изображений.

4. Провести сравнительный анализ экспрессии рецепторов половых гормонов, факторов роста, регуляторов пролиферации и апоптоза в эндометрии при ассоциированных гиперпластических процессах матки и при изолированной гиперплазии эндометрия.

5. Провести сравнительный анализ экспрессии рецепторов половых гормонов, факторов роста, регуляторов пролиферации и апоптоза в лейомиоме при ассоциированных гиперпластических процессах матки и при изолированной миоме матки.

6. Провести сравнительный анализ экспрессии рецепторов половых гормонов, факторов роста, регуляторов пролиферации и апоптоза в интактном миометрии при ассоциированных гиперпластических процессах матки и при изолированной миоме матки.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Впервые проведена комплексная клиническая, морфологическая и молекулярно-биологическая оценка ассоциированных гиперпластических процессов матки при синхронном и метахронном развитии. Впервые определена последовательность развития ассоциированных гиперпластических заболеваний матки.

Впервые осуществлено сравнение вариантов количественного анализа результатов иммуногистохимической реакции (ручным способом и с помощью программы компьютерной обработки изображения).

Изучено соотношение между экспрессией рецепторов эстрогенов и прогестерона, маркера пролиферации Кл-67, факторов роста (сосудистого эндотелиального фактора роста, трансформирующего фактора роста |3), регуляторов апоптоза (Раэ/ТазЬ) в эндо- и миометрии при ассоциированных гиперпластических процессах по сравнению с изолированными гиперпластическими процессами матки.

Впервые получены данные о состоянии интактного миометрия у больных с ассоциированными гиперпластическими процессами матки.

Практическая значимость работы

Выявленные особенности ассоциированных гиперпластических процессов эндо- и миометрия позволяют оптимизировать тактику ведения больных с миомой матки с учётом риска развития метахронных гиперпластических процессов.

Разработанная методика количественной оценки результатов иммуногистохимической реакции может быть рекомендована для применения в научных и практических целях.

Выявленные молекулярно-биологические особенности взаимного влияния гиперпластических процессов матки позволяют расширить показания к проведению иммуноморфологического исследования биопсийного и операционного материала при органосохраняющих операциях на матке.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Ассоциированные гиперпластические процессы наиболее часто встречаются у больных старше 45 лет. Основными жалобами больных с ассоциированными гиперпластическими процессами матки являются нарушения менструального цикла (в 53,2±4,5 % случаев), болевой синдром (в 29,8±4,1 % случаев). Бессимптомное течение наблюдается в 6,5±2,2 %

случаев. Метахронное развитие ассоциированных гиперпластических процессов матки наблюдается чаще, чем синхронное (66,1 ±4,3 % и 33,9±4,3 %, соответственно). В 93,9±2,6 % первым заболеванием выявляется миома матки.

2. На основании сравнительного анализа вариантов количественной оценки результатов иммуногистохимического исследования разработана методика определения распространённости и интенсивности экспрессии изучаемых сигнальных молекул, оптимальная для сокращения сроков проведения анализа серии однотипных препаратов.

3. Сравнительная оценка экспрессии рецепторов эстрогенов и прогестерона, маркера пролиферации Ki-67, факторов роста, регуляторов апоптоза Fas/FasL в миометрии и эндометрии у больных с ассоциированными и изолированными гиперпластическими процессами матки позволяет выявить следующие особенности: у больных с ассоциированными гиперпластическими процессами матки в гиперплазированном эндометрии в железах отмечается снижение экспрессии рецепторов прогестерона и повышение экспрессии белка Fas; как в лейомиоме матки, так и в интактном миометрии экспрессия изучаемых сигнальных молекул при ассоциированных заболеваниях сравнима с таковой при изолированной миоме матки, при этом имеется тенденция к меньшей экспрессии регуляторов апоптоза Fas и FasL.

Апробация и внедрение результатов работы в практику. Материалы диссертации представлены на XX Симпозиуме «Современная химическая физика», Туапсе, 2008; на IV научно-практической геронтологической конференции с международным участием, посвященной памяти Э.С. Пушковой, Санкт-Петербург, 2008; на научно-практической конференции кафедры акушерства и гинекологии им. А.Я. Крассовского ВМедА, Санкт-Петербург, 2009; на XII и XIII Всероссийских медико-биологических научных конференциях молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина», Санкт-Петербург, 2009, 2010; на VI и VII конференциях с международным участием «Молекулярная

медицина и биобезопасность», Москва, 2009, 2010; на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов», Санкт-Петербург, 2010; на научной конференции молодых учёных и специалистов «Репродуктивная медицина: взгляд молодых», Санкт-Петербург, 2010; на Всероссийском форуме «Пироговская хирургическая неделя», Санкт-Петербург, 2010.

Результаты исследования внедрены в практическую работу клиники акушерства и гинекологии СПбГМУ им.И.П.Павлова, отделения гинекологии №1 Городской Александровской больницы, гинекологического отделения Городской Мариинской больницы, отдела патоморфологии НИИАГ им. Д.О. Огга СЗО РАМН, используются в учебном процессе кафедры акушерства, гинекологии и репродуктологии СПбГУ. По теме диссертации опубликовано 18 научных работ, в том числе 4 - в рецензируемых научных журналах и изданиях.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 161 странице печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 44 таблицами и 12 рисунками. Библиографический указатель включает 163 источника, из них 91 отечественный и 72 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

В основу работы положены результаты обследования 272 больных (средний возраст 42,4±9,4 года) с гиперпластическими процессами матки -миомой матки (ММ), аденомиозом (AM) и гиперпластическими процессами эндометрия (ГПЭ) изолированно или в различных сочетаниях. Больные проходили лечение в гинекологическом отделении с операционным блоком

НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (руководитель - д.м.н. Беженарь В.Ф.), в отделении гинекологии №2 Городской Александровской больницы (заведующий - д.м.н. Комличенко Э.В.), в гинекологическом отделении городской больницы № 33 (заведующий - Тарасов С.А.). Основную группу составили 124 женщины. Критерием включения служило наличие 2 и более гиперпластических процессов матки. Критериями исключения явились: злокачественные опухоли, гормональная терапия в последние 6 месяцев до обследования, острые воспалительные заболевания матки и придатков в период обследования, беременность и лактация. Группу сравнения составили 148 больных с изолированными заболеваниями (ММ - 90 больных, AM - 21 больная, ГПЭ - 37 больных), выделенных согласно аналогичным критериям исключения.

Применяли клинико-анамнестический, клинико-лабораторный методы, эхографическое исследование органов малого таза, эндоскопическое обследование (лапароскопия и гистероскопия), оперативное лечение (по показаниям), гистологическое и иммуногистохимическое исследование операционного материала.

Патоморфологическое исследование выполнено в 42 клинических наблюдениях, из них 24 больные основной группы, 10 больных с изолированной ММ и 8 больных с изолированной ГПЭ. Исследование проведено в патологоанатомическом отделении НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН (руководитель — з.д.н. РФ, д.м.н., проф. Кветной И.М.).

Образцы тканей эндометрия, лейомиомы, макроскопически неизменённого миометрия объёмом около 1 см3 фиксировали в 10% нейтральном забуференном формалине (pH 7,2), обезвоживали с помощью автоматической станции Leica TP 1020 и заливали в парафин согласно стандартной гистологической схеме. Для обзорной окраски использовали гематоксилин и эозин. Иммуногистохимическим (ИГХ) методом в указанных тканях выявляли экспрессию рецепторов эстрогенов (ER) и прогестерона (PR), маркера пролиферации Ki-67, сосудистого эндотелиального фактора

роста (СЭФР), трансформирующего фактора роста-ß (ТФР-В) и факторов апоптоза Fas и FasL. Для стандартизации условий реакцию проводили на тканевых матрицах (мануальный способ сборки). Микротомия производилась с помощью санного микротома (толщина срезов 5-7 мкм). Срезы ткани помещали на предметные стекла, покрытые пленкой из поли-L-лизина (Sigma).

Постановку ИГХ реакции осуществляли по стандартному протоколу с использованием моноклональных мышиных антител к ER, PR, Ki-67 («Dako», Дания), СЭФР, ТФР-В, Fas и FasL («Novocastra», Великобритания) и системы визуализации Dako Cytomation LSAB2 System-HRP («Dako», Дания), состоящей из биотинилированных козьих антикроличьих и антимышиных антител, стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена и 3,3'-диаминобензидина. Перед постановкой реакции проводили демаскировку антигена (высокотемпературной обработкой ткани) в 0,01 М цитратном буфере (pH 6,0). Использовались позитивные и негативные контроли.

Получали микрофотографии образцов ткани на увеличении 200 с помощью микроскопа Nikon Eclipse Е400 и цифровой камеры Nikon DXM1200 (фотосъёмку производили после настройки освещения по Келлеру, с полным закрытием апертурной диафрагмы, при поднятом конденсоре). Дальнейшее количественное исследование проводили с помощью программы компьютерного анализа изображений «Морфология 5.0» (ВидеоТест, Россия). Распространённость экспрессии изучаемых маркеров оценивали по показателю относительной площади кадра (отношение площади, занятой иммунопозитивными структурами, к общей площади кадра, %); интенсивность экспрессии - по показателю оптической плотности (А), рассчитываемому по формуле A=-ln(I/I0), где I - интенсивность светового потока, прошедшего через слой светопоглощающего вещества в области локализации иммунопозитивных структур; 10 - интенсивность падающего светового потока (интенсивность светового потока, прошедшего через иммунонегативные участки цитоплазмы).

Статистическую обработку данных проводили с использованием методов описательной статистики. Для оценки межгрупповых различий применяли t-критерий Стьюдента, критерий Манна-Уитни, ранговый дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса и медианный тест. При сравнении частотных величин использовали х2-критерий и двухсторонний точный критерий Фишера. Зависимость между количественными признаками оценивали с помощью рангового коэффициента корреляции Спирмена. Критическое значение уровня статистической значимости при проверке нулевой гипотезы принимали равным 0,05. Статистическая обработка выполнялась с использованием программы Statistica for Windows, 6.0.

Результаты исследования Клиническая характеристика обследованных больных В структуре ассоциированных гиперпластических процессов у обследованных больных ММ была выявлена у 118 из 124 больных (95,2±1,9%), AM - у 63 больной (50,8±4,5 %), ГПЭ - у 88 больных (71,0±4Д %). Самым частым вариантом сочетаний было сочетание ММ и ГПЭ (выявлено у 61 больной; 49%) (рис. 1).

17%

29%

□ сочетание ММ и AM Я сочетание ММ и ГПЭ В сочетание MM, AM и ГПЭ 0 сочетание AM и ГПЭ

49%

Рис. 1. Частота сочетаний гиперпластических процессов матки в основной группе.

Ассоциированные гиперпластические процессы, в отличие от изолированных, встречались в основном у женщин старшего возраста: старше 45 лет были 53,2 % больных основной группы и только 22,3 % больных с изолированными заболеваниями, р<0,0001. Впервые клинические проявления гиперпластических процессов матки у больных с

ассоциированными заболеваниями начали проявляться позже, чем у больных с изолированными заболеваниями (40,8±0,9 и 37,4±0,8 лет, соответственно, р<0,05). Клинически ассоциированные гиперпластические процессы матки характеризовались нарушениями менструального цикла (53,2±4,5 % случаев), болевым синдромом (29,8±4,1 %), а в 6,5±2,2 % случаев протекали бессимптомно.

Характер менструальной функции не имел достоверных различий при ассоциированных и при изолированных гиперпластических процессах. Возраст менархе составил 13,3±0,1 лет и 13,0±0Д лет, соответственно. Более чем в половине случаев как в основной группе, так и в группе сравнения, сохранялся регулярный менструальный цикл (63,8±4,5 % и 63,2±4,1 %, соответственно). Продолжительность менструального цикла у больных с регулярным циклом составила в сравниваемых группах 28,0±0,2 дней и 27,9±0,2 дней, соответственно; длительность менструального кровотечения -5,3±0,2 и 4,8±0,1 дней, соответственно. При этом более чем у 40% больных основной группы отмечались гиперменорея или меноррагия. Ациклические кровотечения выявлены у каждой пятой больной (как в основной группе, так и в группе сравнения). Большинство обследованных женщин имели в анамнезе беременности. В основной группе число больных, имевших в анамнезе беременности, в том числе закончившиеся родами и искусственными абортами, было достоверно больше. Число искусственных абортов преобладало над числом родов.

По характеру перенесённых и сопутствующих гинекологических заболеваний сравниваемые группы достоверно не различались между собой (табл. 1).

В ряде случаев изучаемые гиперпластические процессы матки являлись рецидивами после проведённого оперативного лечения. Так, рецидивы ГПЭ отмечены у 12 больных основной группы (70,6± 11,1 % от числа больных, имевших в прошлом ГПЭ), и у 3 больных с изолированными заболеваниями (33,3±15,7%) (р<0,05). Рецидивы ММ

отмечены в основной группе у 5 из 6 больных, перенесших ранее операции по поводу ММ, при изолированной ММ - в 6 из 7 случаев.

Таблица 1

Сопутствующие гинекологические заболевания у обследованных больных _

~ Клиническая группа Сопутствующая патология " —_____ Ассоциированные гиперпластические процессы (п=124) Изолированные гиперпластические процессы (п=148)

Абс. % Абс. %

Наружный генитальный эндометриоз 25 20,2±3,6 35 23,6±3,5

Опухоли яичников 12 9,7±2,7 20 13,5±2,8

Опухолевидные процессы яичников 28 22,6±3,8 21 14,2±2,9

Хронический сальпингоофорит 35 28,2±4,0 26 17,6±3,1

Заболевания шейки матки 66 53,2±4,5 65 43,9±4,1

Среди перенесённых и сопутствующих экстрагенитальных заболеваний в обеих группах преобладали заболевания сердечно-сосудистой системы, заболевания эндокринной системы и патология обмена веществ.

Значительная часть показаний к оперативному вмешательству была связана с различными проявлениями ММ - 69 из 117 больных (59,0%). Среди других показаний отмечались различные виды маточных кровотечений, планирование беременности. Характер патологических процессов в органах репродуктивной системы определил достоверно более частое выполнение операций по сочетанным показаниям, а также большую частоту радикальных операций в основной группе.

Как при ассоциированных заболеваниях, так и при изолированной ММ преобладали интрамуральное, субсерозно-интрамуральное и субсерозное расположение узлов. В каждом пятом случае имела место множественная ММ. Самой частой гистологической особенностью узлов лейомиомы был фиброз узлов (26,3±4,1 % случаев в основной группе и 17,8±4 % при изолированной ММ).

Большинство случаев ГПЭ составляли простая или сложная гиперплазия эндометрия (ГЭ) без атипии: 48 случаев (75,0±5,4 %) в основной группе и 23 случая (95,8±4,1 %) при изолированных ГПЭ, р<0,05. В основной группе в каждом пятом случае выявлена базальная гиперплазия эндометрия и отмечено 3 случая ГЭ с атипией. Полипы эндометрия выявлены у 26 больных

основной группы и у 15 больных с изолированными ГПЭ и в основном были представлены железистым и железисто-фиброзным вариантами (за исключением 1 случая аденоматозного полипа в основной группе).

Синхронное и метахронное развитие ассоциированных

гиперпластических процессов матки

При анализе анамнеза заболеваний установлено, что ассоциированные гиперпластические заболевания могли развиваться как синхронно (42 из 124 больных, 33,9±4,3 %), так и метахронно (82 больных, 66,1±4,3 %). При этом частота синхронного или метахронного варианта развития достоверно не зависела ни от вариантов сочетаний заболеваний, ни от возраста больных.

Возраст дебюта гиперпластических процессов при синхронном развитии заболеваний (43,8± 1,6 года) был достоверно больше, чем при метахронном (39,4±1,0 года), р<0,05. Выявлена умеренная отрицательная корреляционная связь (11= -0,59) между возрастом дебюта первого гиперпластического процесса и промежутком между первым и последующими заболеваниями.

Больные с синхронным и метахронным развитием гиперпластических процессов на момент обследования имели однотипные клинические проявления и сравнимую сопутствующую гинекологическую и соматическую патологию.

В подавляющем большинстве случаев (93,9±2,6 %) комплекс метахронных заболеваний начинал развиваться с ММ. При этом группы больных с разными последующими заболеваниями (АМ, ГПЭ или АМ и ГПЭ) были сравнимы по возрасту дебюта ММ и по промежутку между ММ и последующими заболеваниями. Выявлено также, что возраст дебюта ММ достоверно не различался при сравнении больных с метахронным развитием ассоциированных гиперпластических процессов матки, начавшихся с ММ, и больных с изолированной ММ (38,7±1,0 и 37,5±1,0 года, соответственно).

Разработка метода количественной оценки результатов иммуногистохимического исследования экспрессии сигнальных молекул в миометрии и эндометрии

Проведено сравнение полуколичественной оценки результатов иммуногистохимической реакции «ручным» способом и при помощи программы компьютерного анализа изображений. Оценивали воспроизводимость результатов и затрачиваемое на анализ время.

Для ядерных маркеров сопоставляли следующие варианты оценки распространённости экспрессии: при анализе с помощью программы - доля иммунопозитивных ядер (%), относительная площадь иммунопозитивных ядер (%), относительная площадь кадра (%); при ручном подсчёте - доля иммунопозитивных ядер (%). Установлено, что при полуавтоматическом анализе распространённости экспрессии наблюдается выигрыш по времени в три и более раз. Самым быстрым вариантом является расчёт относительной площади кадра, занимаемой иммунопозитивными структурами (65,0±11,2с по сравнению с 1232,7±85,8 с при ручном подсчёте). Однако воспроизводимость результатов при таком варианте расчёта была хуже, чем при других.

Показано, что расчёт относительной площади кадра может быть применён для быстрого анализа серии однотипных препаратов. В иных случаях следует применять показатель доли иммунопозитивных ядер, как наиболее близкий к традиционно определяемому. Для цитоплазматических же маркеров относительная площадь кадра, занятая имунопозитивными структурами, является единственной объективной величиной распространённости экспрессии. Интенсивность экспрессии изучаемых маркеров оценивали по показателю оптической плотности. Проанализированы значения оптической плотности при длинах волн 630, 550 и 450 нм. Оказалось, что наилучшим образом различаются иммунопозитивные и иммунонегативные структуры, а также иммунопозитивные структуры разной интенсивности окраски при

использовании оптической плотности при длине волны 450 нм, что соответствует синему цвету.

Молекулярно-биологические особенности тканей матки при ассоциированных гиперпластических процессах Проведено сопоставление гистологических и иммуноморфологических характеристик эндометрия у больных при сочетании ГПЭ с ММ (7 больных, 36-57 лет) и у больных с изолированными ГПЭ (8 больных, 26-54 лет). Все больные находились в старшем репродуктивном или пременопаузальном возрасте.

В группе больных с ГПЭ в сочетании с ММ гиперпластические процессы эндометрия соответствовали в 3 случаях простой гиперплазии без атипии, в 2 - базальной гиперплазии, в 1 случае выявлена простая атипическая гиперплазия и в 1 - атипическая базальная ГЭ. Выраженность пролиферативной активности была преимущественно слабой и умеренной, кистозной трансформации желёз эндометрия не отмечалось. Изолированные ГПЭ были представлены в 4 случаях простой гиперплазией без атипии, в 2 -сочетанием железистого полипа и простой гиперплазии без атипии, в 1 случае - железистым полипом эндометрия. Пролиферативная активность варьировала от умеренной до выраженной. В 5 случаях наблюдалась кистозная трансформация желёз слабой и умеренной выраженности.

При ИГХ исследовании у больных с ассоциированными гиперпластическими процессами наблюдали достоверно меньшую относительную площадь экспрессии PR в железах (14,6±4,6 и 35,1±3,3 %, соответственно, р<0,01) и меньшую относительную площадь экспрессии маркера пролиферации Ki-67 в строме эндометрия (2,0±1,0 и 7,0±1,6%, соответственно, р<0,05), чем у больных с изолированными заболеваниями. Экспрессия факторов пролиферации достоверно не различалась (табл. 2). Отмечена более высокая экспрессия факторов системы апоптоза как в строме, так и в железах эндометрия больных с ассоциированными

гиперпластическими процессами, но достоверными различия были только для экспрессии Fas в железах (17,2±3,7 и 2,5±1,1 %, соответственно, р<0,05).

Таблица 2

Экспрессия изучаемых сигнальных молекул в эндометрии

..... ——Клиническая группа Показатель"""— экспрессии сигнальный— молекул ' —___ Сочетание ММ и ГПЭ (п=7) М±т Изолированные ГПЭ (п=8) М±ш

HR э ж площ, % 23,6±tí,8 29,4±4,8

ER э ж опт плотн, ед. 0,82±0,16 0,87±0,14

fcR э с площ, % 8,6±3,í 12,7±4,9

BR э с опт плотн, ед 0,52±0,2 0,68±0,11

PR э ж площ, % 14 ,б±4,б * 35,1±3,3

PR э ж опт плотн, ед. 0,68±0,08 0,72±0,13

PR э с площ, % 9,3±2,7 13,7±3,1

PR э с опт плотн., ед. 0,55±0,05 0,72±0,09

Ki-67 э ж площ, % 9,4±2,8 16,2±4,2

Ki-67 э ж опт плотн., ед. Ó,97±0,13 0,S8±d, 15

Ki-67 э с площ, % 2,0±1,0 ** 7,Ш,6

Ki-67 э с опт плотн, ед. 0,82±0,15 0,68±0,09

ТФР-В э ж площ, % 17,2±5,0 13,7±9,2

ТФР-В э ж опт плотн, ед. 0,41 ±0,06 0,49±0,14

ТФР-В э с площ, % 7,8±3,1 7,5±6,3

ТФР-В э с опт плотн, ед. 0,27±0,03 0,39±0,11

СЭФР э ж площ, % 13,9±5,7 20,4±5,3

СЭФР э ж опт плотн, ед. 0,31 ±0,07 0,3±0,04

СЭФР э с площ, % 8,5±4,б 14,1±2,7

СЭФР э с опт плотн, ед. 0,28±0,05 0,35±0,0б

Fas э ж площ., % 17,2±3,7 ** 2,5±1,1

Fas э ж опт плотн, ед. 0,36±0,08 0,34±0,05

Fas э с площ, % 9,5±4,7 1,5±0,8

Fas э с опт плотн, ед. 0,26±0,04 0,29±0,08

FasL э ж площ, % 9,8±3,9 1,4±1,3

FasL эж опт плотн, ед. 0,35±0,09 0,25±0,03

FasL эс площ, % 2,3±1,4 0,3±0,2

FasL э с опт плотн, ед. 0,28±0,08 0,39±0,07

Примечание 1: «э ж» - экспрессия в железах эндометрия, «э с» - экспрессия о строме эндометрия, «ллощ» - относительная площадь экспрессии, «опт плотн» - оптическая плотность. Примечание 2: * - р<0,01, ** - р<0,05 по сравнению с группой больных с изолированными заболеваниями.

Исследовано 28 образцов ткани лейомиомы матки, полученных при операциях у больных с сочетанием ММ и АМ (5 человек), с сочетанием ММ, АМ и ГПЭ (3 человека), с сочетанием ММ и ГПЭ (12 человек), с изолированной ММ (8 человек). Возраст больных с ассоциированными заболеваниями составил 36-53 года, с изолированной ММ - 32-50 лет.

Молекулярно-биологический профиль лейомиомы матки не зависел от наличия или отсутствия ассоциированных заболеваний. По количественным показателям экспрессии рецепторов половых стероидов и маркера пролиферации Кл-67 не было вьивлено достоверных различий между

группой больных с ассоциированными заболеваниями и с изолированной ММ (табл. 3).

Таблица 3

Экспрессия изучаемых сигнальных молекул в лейомиоме

Клиническая группа Показатель —____ экспрессии сигнальных молекул Ассоциированные заболевания (п=20) М±т Изолированная ММ (п=8) М±т

ER площ, % 2.8±0,8 3,0±2,0

ЕЯ опт плотн,ед. 0,35±0,05 0,31±0

PR площ,% 1Ó,3±1,4 6,7±¿,Ó

PR опт плотн.ед. 0,78±0,08 0,73±0,10

Ki-67 площ,% 0,05±0,03 0,1 ±0,1

Ki-67 опт плотн, ед. 0,52±0,05 Ö,56±Ö,Öl

ТФР-В площ, % 7,5±1,5 10,6±4,9

ТФР-В опт плотн, ед. 0,33±0,03 0,27±0,03

СЭФР площ, % 1.1±Ö,7 0,6±0,5

СЭФР опт плотн., ед. 0,35±0,05 0,26±0,04

Fas площ, % 4,3±1,2 5,8±3,1

Fas опт плотн., ед. 0,20±0,02 О,19±0,02

FasL площ, % 3,0±1,4 7,4±3,7

FasL опт плотн., ед. 0,22±0,02 Ú,23±0,0é

Примечание: «площ» - относительная площадь экспрессии, «опт плотн» - оптическая плотность.

Экспрессия факторов пролиферации и неоангиогенеза также достоверно не различалась в сравниваемых группах. При этом отмечено, что случай растущей лейомиомы характеризовался самой большой среди исследованных образцов экспрессией СЭФР (относительная площадь экспрессии 14,2 %), весьма высокой экспрессией ТФР-В (23,3 %), а также Fas (21,9 %) и FasL (24 %). В целом при ассоциированных заболеваниях имелась тенденция к меньшей экспрессии Fas и его лиганда в лейомиоме (различия статистически не достоверны).

Исследован 21 образец макроскопически интактного миометрия у больных с сочетанием ММ и АМ (3 женщины), с сочетанием ММ, АМ и ГПЭ (2 женщины), с сочетанием ММ и ГПЭ (10 женщин) и с изолированной ММ (6 женщин). Возраст больных с ассоциированными заболеваниями составил 36-57 лет, с изолированной ММ - 45-50 лет. Всем больным выполнены радикальные операции (надвлагалищная ампутация или экстирпация матки). При микроскопическом исследовании в 2 случаях у больных с сочетанием ММ и ГПЭ и в 2 случаях при изолированной ММ выявлены признаки отёка миометрия.

Средние уровни экспрессии рецепторов половых стероидов и Ю-67 в миометрии достоверно не различались при ассоциированных заболеваниях и при изолированной миоме матки (табл. 4).

Таблица 4

Экспрессия изучаемых сигнальных молекул в интактном миометрии

Клиническая группа Показатель^—^^ экспрессии сигнальныХ~-^_^ молекул Ассоциированные заболевания (п=15) М±т Изолированная ММ (п=6) М±т

ER площ, % 3,8±1,2 0,3±0,1

ER опт плотн,ед. 0,32±0,04 0,49±0,13

PR площ,% 6,3±1,2 4,7±0,78

PR опт плотн,ед. 0,67±0,06 0,68±0,08

Ki-67 площ,% 0,17±0,09 0,2±0,1

Ki-67 опт плотн, ед. 0,65±0,09 0,68±0,10

ТФР-В площ, % 5,9±1,9 9,3±5,8

ТФР-В опт плотн, ед. 0,27±0,02 0,26±0,04

СЭФР площ, % 1,1 ±0,4 1,8±0,8

СЭФР опт плотн., ед. 0,32±0,03 0,29±0,04

Fas площ, % 1,7±0,9 7,2±4,7

Fas опт плотн., ед. 0,23±0,03 0,23±0,03 '

FasL площ, % 2,2±1,2 6,1±2,5

FasL опт плотн., ед. 0,16±0,02 0,22±0,03

Примечание: «площ» - относительная площадь экспрессии, «опт плотн» - оптическая плотность.

Однако в подгруппе больных с сочетанием ММ и АМ (3 больных) отмечено отсутствие экспрессии Ki-67, в то время как при изолированной ММ (6 больных) этот белок выявлялся во всех случаях, хотя уровень его экспрессии был весьма низок (р<0,05). Экспрессия факторов пролиферации и неоангиогенеза в миометрии достоверно не различалась при ассоциированных заболеваниях и изолированной ММ. При этом наибольшие значения экспрессии СЭФР в миометрии наблюдались у больных с большими размерами и быстрым ростом ММ. Экспрессия регуляторов апоптоза в интактном миометрии достоверно не различалась. Однако, так же как и в лейомиоме, отмечена тенденция к меньшей экспрессии Fas и его лиганда при ассоциированных заболеваниях.

ВЫВОДЫ

1. В структуре ассоциированных гиперпластических процессов матки у обследованных больных миома матки встречается в 95,2±1,9 %, аденомиоз -в 50,8±4,5 %, гиперпластические процессы эндометрия - в 71,0±4,1 % случаев.

2. Самыми частыми клиническими проявлениями ассоциированных гиперпластических процессов матки являются нарушения менструального цикла (в 53,2±4,5 % случаев) и болевой синдром (в 29,8±4,1 % случаев), в 6,5±2,2 % случаев отмечается бессимптомное течение. Впервые клинические проявления ассоциированных гиперпластических процессов матки наблюдаются в более старшем возрасте, чем у больных с изолированными заболеваниями (40,8±0,9 и 37,4±0,8 лет, соответственно, р<0,05).

3. Среди обследованных больных с ассоциированными гиперпластическими процессами матки в 33,9±4,3 % заболевания развивались синхронно, в 66,1±4,3 % - метахронно; рецидивы гиперпластических процессов после оперативного лечения отмечены в 13,7±3,1 % случаев. Клинические проявления синхронно и метахронно развившихся ассоциированных гиперпластических заболеваний матки однотипны. Развитие метахронных гиперпластических процессов матки в 93,9±2,6 % случаев начинается с миомы матки. Промежуток времени от первого до последующего гиперпластического процесса находится в отрицательной зависимости от возраста появления первого гиперпластического процесса (R= -0,59, р<0,0001).

4. Разработанная методика количественной оценки экспрессии молекулярно-биологических маркеров в миометрии и эндометрии, основанная на определении относительной площади кадра, занимаемой иммунопозитивными структурами, и оптической плотности изучаемых областей гистологического препарата при длине волны 450 нм, позволяет проводить быстрый анализ серии однотипных препаратов.

5. У обследованных больных с гиперплазией эндометрия, ассоциированной с миомой матки, молекулярно-биологические особенности эндометрия по сравнению с изолированной гиперплазией эндометрия проявлялись достоверным снижением в железах относительной площади экспрессии PR (14,6±4,6 и 35,1±3,3 %, соответственно, р<0,01) в сочетании с повышением относительной площади экспрессии фактора апоптоза Fas (17,2±3,7 и 2,5±1,1 %, соответственно, р<0,05).

6. В лейомиоме экспрессия рецепторов половых стероидов (ER, PR), маркера пролиферации Ki-67, факторов роста (СЭФР, ТФР-В), регуляторов апоптоза (Fas/FasL) у обследованных больных с ассоциированными гиперпластическими процессами матки и с изолированной миомой матки не имела достоверных отличий и не зависела от возраста. Выявлена тенденция к меньшей экспрессии Fas и FasL у больных с ассоциированными заболеваниями.

7. В интактном миометрии у обследованных больных с ассоциированными гиперпластическими процессами уровни экспрессии рецепторов половых стероидов (ER, PR) и факторов роста (СЭФР, ТФР-В) сопоставимы с таковыми у больных с изолированной миомой матки. При этом наибольшая экспрессия СЭФР в интактном миометрии соответствует быстрому росту миомы матки. Так же, как и в ткани лейомиомы, в интактном миометрии наблюдалась тенденция к меньшей экспрессии регуляторов апоптоза (Fas и FasL) при ассоциированных заболеваниях.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Больных с изолированной миомой матки старше 35 лет при определении тактики ведения следует рассматривать как группу риска по развитию метахронных гиперпластических процессов матки в ближайшие 5 лет.

2. При проведении консервативно-пластических операций на матке оценку риска рецидива и развития метахронных гиперпластических процессов матки и выбор стратегии реабилитации целесообразно проводить с использованием результатов исследования экспрессии сосудистого эндотелиального фактора роста и факторов системы апоптоза Fas и FasL в интактном миометрии.

3. Метод создания тканевых матриц позволяет добиться стандартизации условий проведения иммуногистохимической реакции.

4. Для сокращения временных затрат при иммуногистохимической оценке экспрессии сигнальных молекул в однотипных препаратах целесообразно использовать программы компьютерного анализа изображений.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Джемлиханова, Л.Х. Клинические особенности как факторы риска развития множественных гиперпластических процессов органов репродуктивной системы женщин / Л.Х. Джемлиханова, М.Ю. Смирнова // II международный конгресс «Репродуктивное здоровье семьи»: матер.конгр. -М., 2008.-С.216.

2. Джемлиханова, Л.Х. Экспрессия сигнальных молекул в эндометрии у больных с сочетанием гиперпластических процессов эндометрия и миомы матки / Л.Х. Джемлиханова, М.Ю. Смирнова, Д.А. Ниаури // Всеросс. форум Пироговская хирургическая неделя: матер.конф. - СПб., 2010. - С.816-817.

3. Иммуногистохимические особенности экспрессии сигнальных молекул в миометрии и эндометрии больных с сочетанными гиперпластическими процессами матки / М.Ю. Смирнова, Л.Х. Джемлиханова, М.А. Клещёв, И.Н. Костючек, Д.А. Ниаури, И.М. Кветной // Науч. ведомости Белгородск. гос. ун-та. Сер. Медицина, фармация. - 2011. - Вып. 13/1, № 4 (99). - С. 11-16.

4. Клещёв, М.А. Возрастные аспекты экспрессии рецепторов половых стероидных гормонов при железистой гиперплазии эндометрия /М.А. Клещёв, И.Н. Костючек, М.Ю. Смирнова // Науч.-практ. конф. Актуальные проблемы медицины и биологии: матер.конф. - СПб., 2010. -С.330-331.

5. Клещёв, М.А. Возрастные особенности гиперплазии эндометрия / М.А. Клещёв, М.Ю. Смирнова // Науч. ведомости Белгородск. гос. ун-та. Сер. Медицина, фармация. - 2010. - Вып. 12/1, № 22 (93). - С. 34-39.

6. Клещёв, М.А. Особенности гормональной рецепции и пролиферации в кистозно-расширенных железах при железистой гиперплазии эндометрия /М.А. Клещёв, И.Н. Костючек, М.Ю. Смирнова // 1-я ежегодн. науч. Конф. молодых учёных и специалистов Репродуктивная медицина: взгляд молодых: матер.конф. - СПб., 2010. - С. 20-21.

7. Количественная иммуногистохимия в оценке молекулярно-биологических особенностей сочетанных гиперпластических заболеваний матки /М.Ю. Смирнова, Д.А. Ниаури, Л.Х. Джемлиханова, И.Н. Костючек, М.А. Клещёв // VI междунар. конф. Молекулярная медицина и биобезопасность: матер.конф. - М., 2010. - С.180-181.

8. Количественная иммуногистохимия: оптимизация анализа экспрессии сигнальных молекул в миометрии / М.Ю. Смирнова, Л.Х. Джемлиханова, И.Н. Костючек, И.М. Кветной, Д.А. Ниаури // Архив патологии. - 2010. - № 1. - С. 51-55.

9. Показатель оптической плотности гистологического препарата как количественное выражение результатов иммуногистохимической реакции / М.Ю. Смирнова, Л.Х. Джемлиханова, И.Н. Костючек, М.А. Смирнов // XX Симпозиум «Современная химическая физика»: матер.конф. - Туапсе, 2008. - С.360.

10. Смирнова, М.Ю. Особенности экспрессии маркеров апоптоза в миометрии больных с ассоциированными гиперпластическими процессами матки/ М.Ю. Смирнова, Л.Х. Джемлиханова, Д.А. Ниаури // Бюллетень федерального центра сердца, крови и эндокринологии им. В.А. Алмазова. -2010. - №2. Апрель. - С.215-216. - (Матер. Всероссийской научн.-практ. конф. с междунар. участием Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов).

11. Смирнова, М.Ю. Совершенствование методики количественной оценки результатов иммуногистохимического исследования экспрессии сигнальных молекул в миометрии / М.Ю. Смирнова, Л.Х. Джемлиханова, И.Н. Костючек // Там же - С.216.

12. Смирнова, М.Ю. Экспрессия факторов роста в миометрии у больных с миомой матки и аденомиозом /М.Ю. Смирнова, И.Н. Костючек, Л.Х. Джемлиханова // Там же - С.217.

13. Смирнова, М.Ю. Лиганд-рецепторные взаимодействия в узлах лейомиомы, миометрии и эндометрии у больных с сочетанными

гиперпластическими процессами матки/ М.Ю. Смирнова // XIII Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей Фундаментальная наука и клиническая медицина: матер, конф.: СПб., 2010. -С. 186-187.

14. Смирнова, М.Ю. Молекулярно-биологические особенности миомы матки у больных пременопаузального возраста / М.Ю. Смирнова, JI.X. Джемлиханова, И.Н. Костючек // IV науч.-практ. геронтол. конф. с междунар. участием Пушковские чтения: матер, конф - СПб., 2008. - С.218.

15. Смирнова, М.Ю. Молекулярно-биологические особенности узлов лейомиомы матки и миометрия у больных с миомой матки и аденомиозом / М.Ю. Смирнова // XII Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей Фундаментальная наука и клиническая медицина: матер.конф.: СПб., 2009. - С. 412-413.

16. Смирнова, М.Ю. Особенности гормональной чувствительности эндометрия при железистой гиперплазии эндометрия на фоне сопутствующих гинекологических заболеваний / М.Ю. Смирнова, М.А. Клещёв, И.Н. Костючек // 1-я ежегодн. науч. конф. молодых учёных и специалистов Репродуктивная медицина: взгляд молодых: матер.конф. -СПб., 2010.-С. 40-41.

17. Смирнова, М.Ю. Экспрессия факторов системы апоптоза в миометрии больных миомой матки и аденомиозом / М.Ю. Смирнова, J1.X. Джемлиханова // VI междунар.конф. Молекулярная медицина и биобезопасность: матер.конф.-М., 2009.-С. 211-212.

18. Экспрессия рецепторов половых стероидных гормонов и факторов роста в миометрии при миоме матки и аденомиозе / JI.X. Джемлиханова, М.Ю. Смирнова, Д.А.Ниаури, И.М. Кветной II Вести. С.-Петерб.ун-та. Cep.ll. Медицина - 2009. - Вып. 4. - С.222-229.

Подписано в печать 20.12.2011г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,4. Тираж 100 экз. Заказ № 2358.

Отпечатано в ООО «Издательство "JIEMA"» 199004, Россия, Санкт-Петербург, В.О., Средний пр., д. 24 тел.: 323-30-50, тел./факс: 323-67-74 e-mail: izd_Iema@mail.ru http://www.lemaprint.ru