Автореферат и диссертация по медицине (14.00.10) на тему:Клинические и иммуно-патогенетические закономерности генерализованных инфекций перинатального и раннего постнатального периодов

Федеральное агентство по здравоохранению и социальному развитию Новосибирская государственная медицинская академия

На правах рукописи

ИЗВЕКОВА Ирина Яковлевна

КЛИНИЧЕСКИЕ И ИММУНО-ПАТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫХ ИНФЕКЦИЙ ПЕРИНАТАЛЬНОГО И РАННЕГО ПОСТНАТАЛЬНОГО ПЕРИОДОВ

14.00.10 - инфекционные болезни 14.00.15 - патологическая анатомия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Новосибирск - 2005

Работа выполнена в Новосибирской государственной медицинской академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию и в Научном центре клинической и экспериментальной медицины СО РАМН.

Научные консультанты:

академик РАМН, Засл. деятель науки РФ, доктор медицинских наук,

профессор ШКУРУПИЙ Вячеслав Алексеевич

доктор медицинских наук,

профессор КРАСНОВА Елена Игоревна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор ОБЕРТ Анатолий Сергеевич

доктор медицинских наук,

профессор БЕЛОУСОВА Тамара Владимировна

доктор медицинских наук ФИЛИМОНОВ Павел Николаевич

Ведущая организация: Уральская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.

Защита состоится^ 2005 г. в 14.00 на заседании диссертационного совета Д 208.062.01 при Новосибирской государственной медицинской академии Росздрава по адресу 630091, г. Новосибирск, Красный проспект, 52.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Новосибирской государственной медицинской академии.

Автореферат разослан/^ ноября 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент

Патурина Н. Г.

¿#>6-Y 125021b

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Внутриутробные инфекции (ВУИ) и неонатальный сепсис являются наиболее актуальными и дискуссионными проблемами современной неонатологии. Новые вопросы в их диагностике и лечении возникают при применении современных методов, использующих молекулярно-биологические и генные технологии, способствующие возросшей выявляемости ВУИ, позволившие пересмотреть взгляд на внутриутробную патологию плода и считать ее преимущественно инфекционной (В. Ф. Учайкин, 2003; Л. Л. Нисевич, 2003).

Круг нерешенных вопросов, связанных с проблемой ВУИ, широк; разноречивы показатели доли ВУИ в структуре перинатальной смертности — от 2 до 65,6 % (Г. А. Самсыгина, Г. Н. Буслаева, 1997; И. С. Сидорова, И. Н. Герниченко,1998; Л. Л. Нисевич, А. Г. Талалаев, 2002; Л. Л. Нисевич,

A. Г. Талалаев, 2003; А. Д. Царегородцев, 2001; Д.В.Комарова, В. А. Цинзер-линг, 1999; P.H.Wise. et al. 1995; L Barton. et al., 1999; P. Y. A. Ancel, 2001; R. L. Goldenberg, 2003; B. J. Stoll et al., 2002). При проведении специальных исследований частота выявления только вирусных инфекций у умерших как в раннем неонатальном периоде, так и на первом году жизни детей доходит до 88-92% (Л. Л. Нисевич, 2002; О.В.Шарапова, А. А. Корсунский, 2003), при этом, по мнению Л. Л. Нисевич и А. Г. Талалаева (1999), у подавляющего большинства умерших детей имеются основания для диагностики врожденного хронического генерализованного заболевания смешанной вирусной природы. Эти данные входят в противоречие с официальной статистикой, согласно которой инфекционные причины в структуре младенческой смертности составляют только около 7 %. В остальных случаях причинами младенческой смертности принято считать состояния перинатального периода (50 %), болезни органов дыхания (15 %), отравления (5 %), врожденные аномалии (23 %), т. е. состояния как бы неинфекционной природы, что «принципиально неправильно, и, конечно, вредно, поскольку недооценка инфекционной природы, как ведущей причины патологии, исключает возможность реализовать наиболее эффективный этиотропный принцип лечения» (В. Ф. Учайкин, 2003).

Иммуно-патогенетические взаимоотношения между ВУИ и перинатальными инфекциями бактериальной и грибковой природы остаются неясными; высказывается мнение, что антенатальные вирусные инфекционные процессы могут быть причиной врожденного иммунодефицита, что повышает риск интранатального бактериального или нозокомиального инфицирования и ведет к развитию сепсиса (Н. П. Шабалов, 2000).

По мере расшифровки механизмов антиинфекционной защиты и накопления новых данных происходит эволюция взглядов на природу генерализованных инфекций и сепсиса с трансформацией понимания сути этого патологического процесса: от ведущей роли инфекционного начала к приданию существенного значения реактивности макроорганизма (R. С. Bone, 1996; А. А. Останин, 2002; Ж. А. Ребенок, 2004). Несовершенство диагностических параметров SIRS в возрастном аспекте затрудняет унификацию показателей системного воспаления при септической патологии детского возраста (П.И.Миронов, 2001; Г. В. Яцык 2000; S. В. Brodie, 2000;

B. А. Таболин, 2001; Г. А. Самсыгина, 1), изучение сепсиса направлено, в большей мере, в стовдщд ^у^р^тея Особенностей

3 ! ;

-п |.т , |. , ---— Г*

эффекторных биохимических структур (токсинов, цитокинов, медиаторов), реализующих воспалительный септический процесс (В. Beutler, 2001; J. Е. Butler, 2002; Н. А. Коровина, 2003). Однако ориентироваться на динамику уровня цитокинов у детей ненадежно, так как первоначальные представления о решающей роли неконтролируемых каскадно-медиаторных процессов в генезе полиорганных повреждений нуждаются в пересмотре с позиций гомеостатических взаимоотношений между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами с уточнением механизмов иммуносупрессии. В связи с этим поиск интегративных показателей системной воспалительной реакции, которые позволили бы оценить тяжесть и прогноз развивающихся септических реакций, особенно актуален для раннего детского возраста (Н. Dollner, 2001; М. С. Banerjea, 2002; А. П. Мощич, Е. Н. Хохлова, 2002).

Насущной потребностью практической медицины является дальнейшее совершенствование способов посмертной дифференциальной диагностики и патоморфологической характеристики состояния поражаемых органов при тяжелых инфекционных заболеваниях с изучением иммунных нарушений в них (М. Chiswick, 1995; V. Dhar, 1998; G. J. Escobar, 1998). Очевидно, что при всех генерализованных НУ И и постнатальных инфекциях закономерно выявляют поражения печени. В то же время, печень — основной орган гомеостазирования млекопитающих, наиболее крупный компартмент системы мононуклеарных фагоцитов организма, которая, как филогенетически древняя, еще в антенатальном периоде участвует в раннем воспалительном ответе. Изучение особенностей структурной организации и воспалительных реакций в печени в зависимости от этиологии генерализованных инфекций новорожденных позволит разработать методы диагностики и подходы к коррекции развивающихся органных поражений.

Цель работы

Изучить клинические и иммуно-патогенетические закономерности генерализованных инфекций новорожденных и на их основе разработать критерии дифференциального диагноза и прогноза.

Задачи исследования

1. Изучить клинико-лабораторные проявления и выявить критерии дифференциальной диагностики ВУИ (TORCH), бактериальных, грибковых и сочетанных инфекций новорожденных.

2. Исследовать количественные и функциональные параметры иммунной системы, оценить характер воспалительных реакций при TORCH-, бактериальных, грибковых и полимикробных инфекциях новорожденных, выявить критерии дифференциального диагноза и прогноза.

3. Исследовать патоморфологические изменения в печени погибших больных детей в условиях перинатального инфицирования различной этиологии. Оценить системность проявлений апоптоза в различных органах.

4. Изучить влияние возбудителей TORCH-инфекций на иммуноморфогенез изменений в печени в условиях перинатального инфицирования бактериальной и грибковой этиологии.

5. Исследовать в эксперименте (у мышей) патоморфологические изменения в печени в условиях спонтанного генерализованного грибкового процесса и на фоне лечения амфотерицином В.

Научная новизна работы

1. Впервые проведена комплексная клинико-иммунологическая оценка генерализованных инфекций перинатального периода моно- и попимикробной этиологии и выявлены особенности иммунопатогенеза, позволяющие разработать критерии дифференциального диагноза и прогноза. В частности показано, что у детей с генерализованными моноинфекциями снижение пролиферативного ответа лимфоцитов ассоциировано с повышенным апоптозом МНК; у детей с TORCH-ассоциированными инфекциями максимальная выраженность иммуносупрессорной активности сыворотки сопровождается снижением содержания клеток, экспрессирующих антигены 2-го класса гистосовместимости, с последующим нарушением антиген-презентирующей функции моноцитов и ко-стимуляторной функциональной активности Т-клеток; кандидозные и кандида-ассоциированные инфекции сопровождаются максимальным угнетением функциональной активности лимфоцитов (анергией).

2. Впервые изучено влияние персистирующих возбудителей TORCH-инфекций на течение воспалительного процесса и морфогенез изменений в паренхиме печени в условиях перинатального инфицирования бактериальной и грибковой этиологии, которое проявляется индукцией апоптоза гепатоцитов и меньшими масштабами деструктивных изменений.

3. Впервые изучена структурная организация печени и закономерности развивающихся изменений в условиях пролонгированного эксперимента генерализованного инфицирования животных грибами С. albicans, которые проявляются гранулематозным воспалением, деструктивными изменениями в паренхиме печени и внутри гранулем, подавлением пролиферативных процессов, имеющими волнообразную динамику.

Практическая и теоретическая значимость работы. Проведенные исследования позволили разработать клинико-иммунологические и клинико-морфологические дифференциально-диагностические критерии генерализованных инфекций перинатального периода моно- и полимикробной этиологии; предложить клинико-иммунологические критерии тяжести заболевания и риска летального исхода.

Проведенная комплексная оценка клинической картины и морфометрических данных позволила выяснить характер влияния персистирующих возбудителей ВУИ на течение воспалительного процесса и иммуноморфогенез изменений в печени в условиях постнатального инфицирования различной этиологии, а также изучить масштабы и механизмы гибели гепатоцитов (взаимоотношения некроза и апоптоза) и репаративной регенерации при генерализованных инфекциях различной этиологии у новорожденных.

Пролонгированный эксперимент генерализованного инфицирования мышей грибами С. albicans позволил уточнить характер структурных преобразований в печени и морфогенез развивающихся изменений в услових кандидозного и медикаментозного (амфотерицином В) воздействия.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на съезде инфекционистов СНГ (Суздаль, 1992), на съезде педиатров (Москва, 1995), на заседаниях областной ассоциации врачей-инфекционистов (Новосибирск, 1995, 1997, 1999, 2002), врачей-педиатров (Новосибирск, 1997, 2000), врачей-невропатологов (Новосибирск, 1998, 2001-2005), врачей-неонатологов (Новосибирск, 2004, 2005), анестезиологов-реаниматологов (Новосибирск, 2002), акушеров-гинекологов (Новосибирск, 2004), на науч.-практ. конф. «Актуальные вопросы современной медицины» (Новосибирск, 1996, 1998, 2000), на научно-практической конференции врачей, посвященной 10-летнему юбилею детской клинической больницы № 3 и 30-летию кафедры детских инфекционных болезней НГМА (Новосибирск, 2000), на Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы:

фундаментальные, экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004), на научно-практической конференции анестезиологов-реаниматологов и онкологов «Актуальные вопросы современной медицины» (Барнаул, 2004), на международной конференции неонатологов (Атланта, США, 2004). Результаты работы используются на базе МУЗ МДКБ № 3, МУЗ МДКБ № 1 и других детских больниц и родильных домов Новосибирска. Материалы работы используются при чтении лекций на факультете усовершенствования врачей (инфекционистов, невропатологов, анестезиологов-реаниматологов).

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 302 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, характеристику наблюдений и методов исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические рекомендации и список литературы, включающий 639 источников (113 отечественных и 526 зарубежных авторов). Работа иллюстрирована 49 таблицами, 74 рисунками и 8 выписками из историй болезни.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Дифференциально-диагностическими признаками различных по этиологии генерализованных инфекций новорожденных являются' а) полимикробные инфекции — полисистемность поражения на фоне инфекционного токсикоза, отсутствие стойкой лихорадки и лейкоцитоза, невысокий уровень ферментов цитолиза гепатоцитов, угнетение функциональной активности лимфоцитов в сочетании с повышенной иммуносупрессорной активностью сыворотки крови (CARS-синдром);

б) бактериальные инфекции — инфекционный токсикоз в сочетании с лейкоцитозом, нейтрофилезом и наличием гнойных очагов, гепатомегалия и повышение уровня трансаминаз, коррелирующее со степенью тяжести инфекции, высокая провоспалительная активность сыворотки (SIRS-синдром);

в) ВУИ (TORCH) — инфекционные экзантемы, затяжная конъюгационная и/или холестатическая желтуха, слабая выраженность синдрома цитолиза и гепатомегалии при отсутствии спленомегалии, повышение провоспалительной и противовоспалительной активности сыворотки (MARS-синдром);

г) кандидозные инфекции — длительное течение и симптомы хронической интоксикации, продуктивно-гранулематозные воспалительные процессы в органах, гепатоспленомегалия при слабой выраженности цитолиза гепатоцитов, прогрессирующая нейтропения, снижение показателя функции тимуса и глубокое угнетение функциональной активности лимфоцитов.

2. Критериями тяжести и прогноза генерализованных инфекций новорожденных являются нарастание токсикоза и полиорганных дисфункций, сопровождающиеся отечным и геморрагическим синдромами при бактериальных инфекциях, геморрагическим синдромом и синдромом угнетения ЦНС при TORCH-ассоциированных инфекциях, прогрессирующей гепатоспленомегалией и геморрагическим синдромом при кандида-ассоциированных инфекциях. Иммунологическими критериями высокого риска летального исхода являются степень снижения показателя стимулированной КонА пролиферативной активности лимфоцитов и содержания HLA-DR+ активированных моноцитов при высокой супрессорной активности сыворотки.

3. Снижение пролиферативной активности Т-лимфоцитов, усиление апоптоза иммунокомпетентных клеток и появление в сыворотке крови провоспалительной и иммуносупрессивной активности свидетельствует о развитии иммунных нарушений, характер и степень которых определяется этиологией инфекции.

4. Патоморфологические изменения в печени при генерализованных инфекциях проявляются деструктивными (дистрофическими и некротическими) процессами с поражением от 70 до 98 % гепатоцитов при низком уровне репаративной регенерации. Соответствие между морфологическими изменениями в печени, биохимическими маркерами поражения гепатоцитов, клиническими симптомами и иммунологическими нарушениями присуще генерализованным бактериальным инфекциям. Для полимикробных инфекций свойственно отсутствие соответствия между тяжестью клинических проявлений, интенсивностью синдрома цитолиза и морфологическими изменениями в печени.

5. Экспрессия маркеров апоптоза гепатоцитов имеет отличия в зависимости от этиологии генерализованных инфекций. Течение TORCH-ассоциированных инфекций сопряжено с повышенным апоптозом и сниженной регенераторной способностью гепатоцитов. Угнетение функциональной активности Т-лимфоцитов у больных кандида-ассоциированными инфекциями сочетается с максимальным подавлением пролиферативных репаративных процессов в печени и повышенной экспрессией антиапоптотического маркера Вс12. При бактериальных инфекциях интенсивная деструкция паренхимы печени с низким представительством двуядерных гепатоцитов сочетаются с ограничением апоптоза гепатоцитов и стимуляцией генов клеточной пролиферации.

6. Инфицирование С. albicans в условиях эксперимента сопряжено с деструктивными изменениями в паренхиме и внутри гранулемы, а также с подавлением пролиферативных процессов. Выраженность гранулемогенеза, характер некротических, дистрофических и репаративных процессов в печени на фоне экспериментального кандидоза мышей связан с длительностью течения висцерального кандидоза. Лечение амфотерицином В эффективно в отношении С. albicans и проявлений гранулематоза, но сопряжено с дистрофическими и некротическими изменениями гепатоцитов, которые существенно выше при использовании АмфВ у неинфицированных животных.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 36 печатных работ, в том числе 9 — в центральных рецензируемых журналах.

Содержание диссертации

Материалы и методы исследования. Проведено клиническое наблюдение, анализ историй развития и историй болезни 180 новорожденных детей, включающий результаты комплексного патоморфологического исследования секционного материала 45 детей, умерших в отделениях патологии новорожденных МУЗ МДКБ N° 3 г. Новосибирска. В основу отбора положено наличие признаков генерализованной инфекции при рождении или ее развитие в неонатальном периоде. Посевы материалов (крови, мочи, кала, соскобов со слизистых) на среды проводили в течение первых 48 часов от поступления в стационар и повторяли 1 раз в 10 дней Молекулярно-биологическая диагностика с помощью метода ТТЦР использована посредством простой выборки (слепой рандомизации) пациентов по наличию признаков текущей инфекции (161 человек). Новорожденные с нарушенным синдромом адаптации и отрицательными результатами посевов, ПЦР и ИФА диагностики из дальнейшего анализа были исключены (29 детей). У 135 детей проведено иммунологическое обследование (табл. 1). Контрольную группу для оценки характера иммунологических изменений составили 30 здоровых доношенных детей: 10 детей первых суток жизни и 20 новорожденных в возрасте 4—6 суток жизни. Контрольную группу для оценки результатов морфометрического исследования составили 10 плодов при нормально протекавшей беременности, прерванной по медицинским показаниям (неврологические расстройства у матери, юная первородящая и другие) при сроке гестации 27 недель путем амниоцентеза с последующим введением простагландинов, с отрицательными результатами исследования тканей на присутствие возбудителей.

Таблица 1

Общая характеристика методов исследования и количества обследуемых

Методы исследования Количество обстедуечых в группах Bcei о

1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа 6 группа

Клинический 50 37 14 48 20 10 180

Молекулярно-биологичес-кий 45 37 14 45 20 10 161

Иммунологический 35 29 - 41 20 10 135

Имтчуно-гистохимический 15 8 14 7 - - 45

Свеюоптический 15 8 14 7 - - 45

Морфометрический 15 8 14 7 - - 45

Среди больных новорожденных выделены шесть групп наблюдения, которые отражали основные этиологические факторы ГИ перинатального периода (табл. 2): в 1 группу вошли дети с бактериальными инфекциями; 2 группу составили новорожденные с бактериальными инфекциями, протекавшими на фоне инфекций ТХЖСН-комплекса; в 3 группе бактериальные

+ TORCH-инфекции сопровождались развитием кандидемии и/или инвазивного висцерального кандидоза; 4 группа включала детей с ассоциированной бактериемией + кандидемией; в 5 группу были включены дети с инфекциями TORCH-комплекса без бактериального и кандидозного инфицирования; 6 группу составили дети с инвазивными грибковыми инфекциями, TORCH и бактериальные инфекции у которых были исключены.

1-4 группы умерших новорожденных были выделены по результатам молекулярно-биологическш о исследования секционного материала. TORCH-инфекция и грибковые инфекции вне ассоциации с другими инфекциями как причина смерти новорожденных выявлены не были. Среди выживших больных не были выявлены пациенты с ассоциированными бактериально-грибковыми инфекциями на фоне ВУИ группы TORCH, что может быть объяснено как особой тяжестью течения с высокой вероятностью неблагоприятного исхода, так и в ряде случаев недостаточным объемом или эффективностью диагностических мероприятий у пациентов с полимикробными инфекциями (табл. 2).

Таблица 2

Распределение больных по группам и в связи с гестационным возрастом и длительностью пребывания

в стационаре

Пациенты Бакгерии-альная 1 группа TORCH + бактериальная 2 группа TORCH+ бакгериал. + грибковая 3 группа Бактерии- альная + грибковая 4 группа TORCH 5 группа Грибковая 6 группа Всего

Выжившие 35 29 - 41 20 10 135

Доношен, % 54,3 27,5 - 9,7 45 80 30

Недоношенн всего,% Недоношен. П-ГУ ст., % 45,7 8,3 72,5 24,2 - 81,3 31 55 20 70 39

Длительность пребывания в стационаре, койко-дней (М±т) 39,3±12,2 43,6±13,1* от V 60,3±10,3* от I, V 21,4± 9,1* от IV, VI 78,4±17,6* ОТ 1,П, V

Умершие 15 9 14 7 - - 45

Доношенные, % 46,6 11,1 28,5 28,5 - - 35

Недоношенн. всего, % Недоношенн. ПЛ/ ст., % 53,4 33 89,9 55,6 71,5 50 71,5 57 65 69

Длительность пребывания в стационаре, койко-дней (М±т) 20,3±10,2 16,3±11,7 42,8+13,7 * от1, П 47,8±11,1 * от!,П

Примечания: * — достоверные различия величин показателей в сравниваемых группах — р < 0,05

Большинство детей наблюдали в возрасте до 1 месяца. Однако в группе детей с ГИ, вызванными несколькими возбудителями и/или грибами, наблюдение продолжалось более длительные фоки, что было связано с течением основного патологического процесса, начавшегося в перинатальном периоде (табл. 3). Для анализа клинического течения заболевания, анамнеза и лечения новорожденных детей составляли карты клинико-морфологического исследования, включавшие паспортные данные в объеме историй развития новорожденных и историй болезни, акушерский, I инеколш ический и соматический анамнез матери, сведения о течении настоящей беременности и родов, результаты клинического наблюдения, данные лабораторных и инструментальных методов исследования.

Таблица 3

Распределение больных по возрасту

Возраст больных Количество обследуемых в группах Всего

lrpyima 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа 6 группа

1-7 суток 5 - - - 2 - 7

8-14 суток 14 8 - 6 9 - 37

15-21 сутки 12 13 - 12 7 2 46

22-29 суток 19 9 7 17 2 3 57

> 1 месяца 6 3 5 5 - 2 21

> 2 месяца 4 3 2 4 - 2 15

> 3 месяцев - 1 - 2 - 1 4

Всего 50 37 14 48 20 10 180

Для изучения характера нарушений функций печени при ГИ различной этиологии проводили клиническое наблюдение и анализ историй болезни всех (как выживших, гак и умерших) детей, а также морфометрическое исследование печени погибших детей и механизмов апоптоза в печени. В связи с отсутствием в структуре инфекционных причин смерти грибковых инфекций (в качестве моно-этиологичной инфекции) была создана модель экспериментального кандидоза на двухмесячных мышах-самцах линии С57В1/6 с целью исследования кандидозного и медикаментозного (амфотерицином В) характера поражения печени.

Иммунологическое обследование новорожденных. Иммунологическое обследование включало изучение основных показателей клеточного и гуморального иммунитета. При исследовании иммунного статуса больных и здоровых новорожденных методом проточной цитофлюориметрии (FACS, Becton Dickinson), используя соответствующие моноклональные антитела (ТОО «Сорбент», Москва), определяли содержание различных субпопуляций клеток (CD3+, CD4+, С08+Т-лимфоцитов, СОгО^-лимфоцитов, CD16+ NK-клеток), а также относительное количество моноцитов и лимфоцитов, экспрессирующих HLA-DR антигены, и средний уровень экспрессии HLA-DR-молекул на моноцитах и лимфоцитах. Определяли иммунорегуляторный индекс CD4/ CD8. В культурах моноклональных клеток оценивали интенсивность спонтанной и индуцированной митогеном (анти-СОЗ и конканавалин А (КонА) 15мг/мл) пролиферации (радиометрически по включению 3Н-тимидина). Концентрацию сывороточных иммуноглобулинов IgA, IgM, IgG определяли методом скоростной нефелометрии на иммунохимическом анализаторе (ICS П, Beckman, USA).

Определение фагоцитарной активности гранулоцитов. Активность фагоцитирующих клеток исследовали на иммуноцитометре FACS Calibur (Becton Dickinson, USA) с использованием программы Cell Quest (Becton Dickinson, USA).

Оценка уровня апоптоза среди свежевыделенных клеток крови (лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов). Методом проточной цитофлюориметрии определяли процентное содержание апоптотических клеток (лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов), которые вследствие фрагментации ДНК формируют характерный гиподиплоидный пик при окрашивании пропидиум иодидом (Sigma, 50 мкг/мл). Уровень апоптоза оценивали среди свежевыделенных клеток лейковзвеси, а также среди лимфоцитов, культивированных in vitro в течение 24 часов в безмитогенной среде (спонтанный апоптоз).

Определение сывороточных медиаторов/цитокинов по величине супрессорной и воспалительной активности сыворотки крови. Наличие в сыворотке больных иммуносупрессорной активности оценивали по степени снижения КонА-индуцированной пролиферации МНК тест-доноров (п = 2-3) в присутствии 10 °/г интактной сыворотки больных (опыт) в сравнении с уровнем митоген-индуцированного ответа в присутствии 10 % интактной сыворотки доноров (контроль). Рассчитывали индекс супрессорной активности (ИСА) по формуле ИСА = О-гК.

О суммарной активности эндогенных медиаторов воспаления в сыворотке больных судили по величине индекса воспалительной активности (ИВА). В лейковзвеси тест-доноров (п = 2-3), инкубированной в течение 45 минут с интактной сывороткой больных (опыт) или доноров (контроль) в объемном соотношении 1:1, определяли активность нейтрофилов по продукции перекиси водорода (Н202), ИВА высчитывали по формуле ИВА = O-f-K. Сопряженность изменений биоактивности сыворотки крови с концентрацией/соотношением про- и противовоспалительных медиаторов, отражающих состояние цитокинового баланса, подтверждена у больных хирургическим сепсисом. (А. А. Останин, Е. Р. Черных, 2002).

Метод молекулярно-генетической диагностики внутриутробных инфекций у детей. Методом ПЦР проведена диагностика с целью выявления вируса простого герпеса (ВПГ), цитомегаловируса (ЦМВ), вируса гепатита В (ВГВ), возбудителей хламидиоза (Chlamydia trachomatis), микоплазмоза (Mycoplasma hominis) и уреаплазмоза (Ureaplasma urealyticum), токсоплазмоза (Toxoplasma gondii)- В 2004-2005 годах после лицензирования соответствующей тест-системы проводили детекцию РНК вируса краснухи. Для исследования использовали образцы крови (0,5-1,0 мл), мочи (1,0-1,5 мл), СМЖ (0,5 мл). Для исследования частоты и значения персистируюших инфекций, вызванных данными возбудителями ВУИ, методом ПЦР проведена диагностика в тканях 45 новорожденных, умерших от ГИ бактериальной и бактериально-грибковой природы, использовали ткани печени (37), селезенки (17), почек (17), легких (15), мозга (16), сердца (12).

Методы пато-гистологического и ультраструктурного исследований. Для световой микроскопии образцы печени фиксировали в 10 %-м растворе формалина, обезвоживали по стандартной методике в серии этилового спирта и заключали в парафин. Парафиновые срезы толщиной 4—5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином в комбинации с реакцией Перлса, по ван Гизону с докраской эластических волокон резорцин-фуксином Вейгерта, ставили

ШИК-реакцию. Просмотр препаратов и микрофотосъемку проводили на световом микроскопе Jenaval (фирмы Carl Zeiss, Jena, Германия).

Методы морфометрического анализа ткани печени у новорожденных детей. Печень фиксировали в 10г#-м нейтральном растворе формалина, гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином. Морфометрическое исследование включало подсчет объемной плотности (Vv) очагов дистрофически и некротически измененных гепатоцитов, отражающих выраженность деструктивных изменений в паренхиме печени; объемной плотности (Vv) двуядерных гепатоцитов и их численной плотности (Ndl), позволяющих характеризовать компенсаторные репаративные реакции паренхимы печени.

Иммуногистохнмическое исследование маркеров апоптоза в клетках печени умерших новорожденных детей. Материалом для исследования служили парафиновые срезы толщиной 1-3 мкм. Просмотр препаратов и микрофотосъемку проводили с помощью светового микроскопа Jenaval (фирмы Carl Zeiss, Jena, Германия). Для иммуногистохимических реакций использовали моноклональные антитела Novostain Super ABC Kit производства Novocastra Lab. Ltd (United Kindom): 1) p 53 Protein (DO-7) (RTU-p53-D07); 2) bcl2 Oncoprotein (RTU-bcl-2); 3) p57 Protein (Kip2) (NCL-p57); 4) cytoceratin 19 (NCL-CK19); 5) Ki67 Antigen (NCL-L-Ki67-MM1).

Выделение культуры грибов для создания экспериментальной модели генерализованного кандидоза у мышей. Культура С. albicans № 483 была получена от больного JI. А. (история болезни № 6487). Грибы выращивали на плотном агаре Сабуро при 37 °С в течение 2-х суток, смывали дистиллированной водой, суспензию центрифугировали при 1500g в течение 15 минут и готовили суспензию клеток гриба в стерильном физиологическом растворе. Полученную взвесь клеток С. albicans вводили однократно интраперитонеально в дозе 2,5x109 микробных тел С. albicans в объеме 0,2 мл изотонического раствора NaCl.

Создание экспериментальной модели генерализованной кандидозной инфекции на мышах линии C57BI/6. Работу выполнили на мышах-самцах линии C57BI/6 с массой тела 20-22 г в возрасте 2-х месяцев. Экспериментальный кандидоз моделировали введением 2,5х109 микробных тел С. albicans в объеме 0,2 мл изотонического раствора NaCl интраперитонеально (О. К. Хмельницкий, В. Л. Белянин, 1993). Животных разделили на четыре группы по 10 животных в каждой. Мышам 1-й группы вводили только С. albicans, моделируя экспериментальный кандидоз и исследуя характер поражения печени в течение длительного периода от начала инфицирования. Мышам 2-й группы вводили амфотерицин В в дозе 250 ЕД/кг массы тела в 0,2 мл 5 % раствора глюкозы внутрибрюшинно. Мышам 3-й группы на 2-е сутки после введения С. albicans начинали введение амфотерицина В. Группой контроля служили нелеченные животные, которым вводили внутрибрюшинно изотонический раствор NaCl в объеме 0,2 мл. Материал для исследования получали на 10, 28 и 56 сутки от начала введения препаратов и соответственно через 11, 29, 57 дней от начала инфицирования.

Морфометрический анализ печени мышей на фоне генерализованной грибковой инфекции и после лечения Амфотерицином В. Исследовали численную (Nj,) плотность в тестовом поле (5,63x10 мкм2), клеточный состав инфильтратов и гранулем печени: относительные количества макрофагов, эпителиоидных клеток, нейтрофилов, лимфоцитов, эозинофилов. Исследовали

объемную (Vv) плотность зон дистрофически измененных гепатоцитов и некрозов в печени мышей, отражающих альтерацию паренхимы печени; численную (Nal) плотность двуядерных гепатоцитов в тестовом поле (5,63x10 мкм ), как показатель репаративной активности паренхимы печени.

Всем больным в комплексе параклинического обследования проведено исследование общего анализа периферической крови, биохимических показателей крови (общий белок, фракции, тимоловая проба, трансаминазы, билирубин, щелочная фосфатаза, лактат дегидрогеназа, креатин фосфокиназа, протромбиновый индекс, глюкоза, электролиты, креатинин, мочевина), СМЖ (по показаниям) в динамике заболевания. Инструментальное обследование включало повторные УЗИ-исследования головного мозга (НСГ) и брюшной полости, доплерографию сосудов головы и шеи, по показаниям компьютерную или магнитно-резонансную томографию головного мозга.

Статистическая обработка полученных результатов. Математическую обработку полученных данных проводили методами описательной, параметрической и непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программ Microsoft Excel, «Statistica 5.0» и «Statistica 6.0». Статистическая обработка вариационных рядов включала подсчет средних арифметических величин (М) и ошибок средних (т), для среднего уровня ферментов печени дополнительно определяли медиану (md), доверительный интервал при 95 % значимости. Сравнение вариационных рядов осуществляли с помощью параметрического критерия Стъюдента (р) и непараметрических критериев Вальда-Вольфовица, Вилкоксона-Манна-Уитни (ри), критерия знаков. Проведен корреляционный анализ полученных результатов с вычислением коэффициента линейной корреляции Пирсона (г) и непараметрической ранговой корреляции Спирмана (R). При вычислении нормативных значений величин иммунного статуса использован метод Herrera L. Расчет относительной частоты риска смерти произведен по формуле В. В. Двойрина.

Результаты исследования и их обсуждение

Сравнительный анализ результатов этиологической расшифровки генерализованных инфекций у умерших и выживших новорожденных.

Выявленный микробный пейзаж представлял собою общую картину микробных находок на фоне течения как ранних, так и поздних инфекций новорожденных. В этиологической структуре инфекций у выживших пациентов преобладали Гр+ возбудители, среди которых основное значение имели малопатогенные CoNS, в то время как такие облигатные патогены новорожденных, как стрептококки гр. В, золотистый стафилококк составляли около 10 % всей флоры. Нарастание тяжести ГИ и ухудшение прогноза сочетались с увеличением доли энтерококков и Гр" флоры (рис. 1) как в исходно стерильных, так и в нестерильных локусах. Развитие сочетанньтх инфекций у выживших больных ассоциировалось с повышением доли в общем микробном профиле стерильных локусов эпидермального стафилококка, Гр~ бактерий и грибов (рис. 2). У умерших пациентов полимикробная этиология инфекций ассоциировалась с увеличением доли грибов, неферментирующих Гр" бактерий и энтерококка (рис. 3).

10

□ выжившие

20

■умершие

40 50 60

Частота обнаружения %

Рис. 1 Общий микробный пейзаж стерильных локусов выживших и умерших пациентов

0 10 □ мономикроб этиология

20 30

■ сочетанная этиология

40 50 60

Частота обнаружения, %

Рис. 2 Сопоставление микробного пейзажа стерильных сред организма при моно- и соче!анных инфекциях у выживших новорожденных

Candida E coll Klebs Ps aerug Acinetobac

® Str ф В Enterococ St haem St aureus St epiderm Г+

0 10 20 30 40 50 60 70 80

--, ~ ---- Частота обнаружения, %

□ мономикроб этиология ■ сочетанная этиология "

Рис 3. Сопоставление микробного пейзажа стерильных сред организма при моно- и сочетанных инфекциях у умерших новорожденных

Степень относительного риска летального исхода возрастала при развитии септицемии, вызванной Гр~ флорой (показатель риска 6,05; г = 0,37) и энтерококками (показатель риска 5,6; г = 0,15), при этом вероятность летального исхода на фоне септицемии, вызванной Ps. aeruginozae (13,7; г = 0,34), по сравнению со С1афилококковыми септицемиями (показатель риска 1,0; г = 0,034) была выше более, чем в 10 раз. Вероятность летального исхода при появлении кандидемии (] ,4; г = 0,07) была сопоставима с риском для жизни септицемий, вызванных St. aureus и Acinetobacter (1,5; г = 0,026).

Эффективная детекция геномов возбудителей ВУИ методом ТТЦР в крови и/или моче новорожденных детей (161 человек) была получена у 29,8 % обследованных пациентов (табл 4). Чаще других выявляли ДНК ЦМВ (12,4 % из числа всех обследованных; 42,5 % от числа положительных результатов) и ДНК ВПГ (5,6 и 19,1 %). У 8,7% обследованных детей были выявлены различные сочетания геномов возбудителей ВУИ (29,8 % всех положительных результатов). Из 45 умерших детей при жизни методом ПЦР были обследованы 32 ребенка (13 детей обследованы не были в связи с тяжестью и скоротечностью заболевания); диагноз ВУИ (TORCH) был верифицирован у 8 (25 %). Детекция геномов возбудителей в структурах печени с помощью ПЦР позволила диагностировать ВУИ (TORCH) еще у 16 пациентов (43,4%), что повысило частоту обнаружения данных инфекций до 53,3 %. В тканях от 20 погибших детей метод ГТЦР, помимо печени, был применен к миокарду, головному мозгу, легким, селезенке: нуклеотидные последовательности возбудителей искомых инфекций были обнаружены в 52 образцах, что составило 70,8 % от числа проведенных исследований (табл. 5).

I аблица 4

Результаты обследования новорожденных детей методом ПЦР

Выявленные нуклеотидные последовательности Количество исследований

Абс. %

Отрицательный результат 114 70,1

Всего положительных результатов 47 29,8

ДНКВ11Г 1,2 6 3,7

ДНК ЦМВ 14 8,7

РНК краснухи 2 1,2

ДНК Toxoplasma gondii 3 1,9

ДНК Chlamydia trachomatis 3 1,9

ДНК Mycoplasma hominis 3 1,9

ДНК Lysteri a monocytogenes 2 1,2

РНК ЭВИ + ДНК ЦМВ 1 0,6

ДНКВП1 + ДНК ЦМВ 3 1,9

ДНК ЦМВ + ДНК Lystena monocytogenes 2 1,2

РНК краснухи + ДНК Chlamydia trachomatis 2 1,2

РНК краснухи + ДИК ВЭБ 1 0,6

ДНК Chlamydia trachomatis + ДНК Mycoplasma hominis 2 1,2

РНК краснухи + ДНК Toxoplasma gondii 1 0,6

ДНК Toxoplasma gondii + врожденный сифилис 2 1,2

Превалирующей инфекцией при исследовании секционного материала являлась также цитомегаловирусная. ДНК ЦМВ выявлена в 33 % проведенных исследований и в 63 % среди всех положительных результатов в виде моноинфекции или в ассоциации с другими внутриутробными инфекциями. У 22 % детей ВУИ (ТОКСН) протекала в виде смешанных инфекций (41,6 % из общего числа положительных результатов). При исследовании в тканях не проводили детекцию РНК краснухи и энтеровирусов, что не позволило сделать вывод об истинной структуре ТСЖСН-инфекций, причастных к летальным исходам от генерализованных ВУИ.

Таблица 5

Распределение частоты встречаемости нуклеотидных последовательностей в исследованном секционном материале от детей, погибших вследствие генерализованных инфекций перинатального периода

Выявленные нуклеошдные последовательности Количество исследований

Абс. %

Отрицательный результат 21 46,6

11оложительные результат! 24 53,3

ДНК ВПГ 1,2 (при жизни из крови) 5 11

ДНК ЦМВ в ткани печени 3 7

ДНК ЦМВ в лег ких 1 2

ДНК ЦМВ в мозге 1 2

ДНК ЦМВ в ткани печени + ДНК Chlamydia trachomatis в крови при жизни 1 2

ДНК 1 [MB в ткани печени + ДПК Chlamydia trachomatis в мозге 1 2

Выявленные нуклеотидные последовательности Количество исследований

Абс. %

ДНК ЦМВ + ДНК Toxoplasma gondii в ткани печени + ДНК ВПГ 1,2 + ДНК Lystena monocytogenes + ДНК ЦМВ + ДНК Toxoplasma gondii в сердце 1 2

ДНК ЦМВ+ ДНК Chlamydia trachomatis в ткани печени 1 2

ДНК ЦМВ в ткапи печени и мозга + ДНК Chlamydia trachomatis в мозге 1 2

ДНК ЦМВ+ ДНК Toxoplasma gondii в ткани печени 4

ДНК ЦМВ+ ДНК Toxoplasma gondii в ткани печени + ДНК Toxoplasma gondii в мозге 1 2

ДНК ЦМВ в ткани печени и мозга + ДНК Toxoplasma gondii в сердце 1 2

ДНК ЦМВ+ ДНК Toxoplasma gondii в ткани печени и сердца 1 2

ДНК ЦМВ + ДНК Chlamydia trachomatis в мозге + ДНК Toxoplasma gondii в ткани печени 1 2

ДНК Lystena monocytogenes в печени 1 2

ДНК Toxoplasma gondii в ткани печени 2 4

Исследование закономерностей в изменении микробного пейзажа с оценкой смены «микробного лидера» в течение заболевания позволило выявить отличия в группах наблюдения в зависимости от моно- или полимикробного инфицирования. Обсемененность как стерильных, так и нестерильных сред организма у выживших детей 1-й группы в динамике снижалась, в то время как у погибших детей, наоборот, усиливалась, но изменения характера колонизации стерильных в норме биологических сред со сменой «микробного лидера» как у выживших, так и у умерших детей не происходило.

При микробиологическом мониторировании у больных 5-й группы бактериемии выявлено не было, в посевах со слизистых и из кишечника превалировали Гр+ бактерии (преимущественно CoNS) — до 78 % всех высевов. У больных 6-й группы в гемокультуре (40 %) или СМЖ (60 %) выявляли различные виды грибов Candida, у 50 % больных не более, чем в одном из посевов крови, были высеяны различные стафилококки (S aureus — 3; St. epiderm. — 2), появление которых в крови не сопровождалось SIRS-реакцией и в дальнейшем больше не повторялось. В высевах из исходно нестерильных биосред организма доминировали Гр+ бактерии.

Колонизация всех биологических сред огранизма у выживших и умерших детей 2-й группы нарастала в течение болезни как за счет, преимущественно, Гр+ бактерий (кровь), так и за счет Гр" возбудителей (кал, моча) и грибов (кал, моча). Смена «микробного лидера» была выявлена у 13,7 % выживших больных, у большинства же выживших и умерших больных на всем протяжении мониторинга продолжали высевать один и тот же возбудитель, как и у больных с моно-бактериальными инфекциями

Наиболее разнообразные и частые варианты «смены микробного лидера» и ассоциаций флоры в стерильных и нестерильных локусах организма были выявлены у детей с течением кандида-ассоциированных инфекций. Так, у погибших детей 3-й группы обсемененность стерильных локусов (кровь,

мокрота, моча) усиливалась преимущественно за счет увеличения количества и разнообразия Гр~ флоры, уменьшения доли Гр+ возбудителей и нарастания колонизации тгих сред грибами Процент высевов грибов из крови при втором и третьем контроле составил 64,3 и 66,7 % соответственно, из мочи — 71,4 и 66,7 % с появлением видов грибов Candida, которые принято относить к нозокомиальным возбудителям (С. cruzei, С. tropicalis). У 42,9 % детей этой группы было выявлено изменение этиологии септицемии (смена «микробного лидера»), в том числе у 21,4% больных — неоднокрлшое. Ассоциации возбудителей в гемокультуре умерших пациентов были обнаружены у 37,5 % больных: CoNS (37,5 %) в сочетании с С. albicans (28,6 %), реже — Гр~ возбудители (14,2 %) в сочетании с другими видами Candida (7,1 %). Данные прижизненого микробиологического мониторинга, несмотря на высокий процент высева ассоциированной флоры, отличались от результов посевов секционного материала, в которых смешанная бактериально-грибковая флора была выявлена в 100 %.

С учетом данных ПЦР диагностики, согласно которым у всех больных 3-й группы в тканях был обнаружен генетический материал возбудителей TORCH-инфекций, позволяющий говорить об их персистенции, ГИ у пациентов данной группы имели полимикробный характер, при этом TORCH-инфекции дебютировали, по-видимому, антенатально (что подтверждается тканевой репликацией возбудителей), а бактериальные и грибковые инфекции присоединялись интра- и постнатально (табл. 6).

Таблица 6

Ассоциации возбудителей, выявленные при исследовании секционного материала от пациентов 3-й группы

№ п/п Доношенность Ассоциации возбудителей

1 Доношенный ДНК ЦМВ в ткани печени + S. faecahs + С albicans

2 Недоношенность Ш ст ДНК Listeria monocytogenes в ткани печени + S aureus + С. albicans

3 Недоношенность Ш ст ДНК ЦМВ + ДНК Chlamidia в ткани печени + S haemol. + С. albicans

4 Недоношенность IV ст ДНК Тохо в печени + Citrobacter divers + С albicans

5 Недоношенность ГП сг Bp сифилис + Ent cloacae + С albicans

6 Доношенная ДНК ВПГ 1,2 + S aureus + С. albicans

7 Доношенный ДНК ВПГ 1,2 в мозге + Kl. pneum + С. albicans

8 Недоношенность I ст ДНК ЦМВ + ДНК Тохо в печени + Kl. pneum + С. albicans

9 Недоношенность I ст. ДНК ЦМВ в ткани печени + Kl. pneum + С. albicans в желудочках мозга

10 Недоношенность I ст. ДНК ЦМВ + ДНК Chlamidia в мозге + С albicans в сердце

11 Недоношенность IV ст ДНК ЦМВ + ДНК Тохо в ткани печени + S haemol + С. albicans

12 Доношенный ДНК Тохо в ткани печени + St epiderm + С albicans

13 Доношенный ДНК ЦМВ + ДНК Toxoplasma gondii в ткани печени + ДНК ВПГ 1,2 + ДНК Lysteria monocytogenes + ДНК ЦМВ + ДНК Toxoplasma gondii в сердце + Ent cloacae + С. albicans из сердца и других тканей

14 Доношенный ДНК ЦМВ + ДНК Тохо в ткани печени + St epiderm + С. albicans

Результаты микробиологического мониторирования в 4-й группе совпадают с результатами, полученными для кандида-ассоциированных инфекций на фоне TORCH (3-я группа) и, по нашему мнению, отражают общие закономерности трансформации микробиоценоза, свойственные кандида-ассоциированным инфекциям новорожденных. Обсемененность биологических сред организма у детей 4-й группы сохранялась интенсивной в динамике; колонизация стерильных сред усиливалась преимущественно за счет увеличения количества и разнообразия Гр~ флоры, уменьшения доли Гр+ возбудителей и нарастания колонизации этих сред грибами. Частота высева грибов в крови при втором и третьем контроле составила 74,3 и 60 % соответственно, из мочи — 43,9 и 48,6 %, с появлением других, помимо С. albicans, видов Candida. Из секционного материала смешанная бактериально-грибковая флора была высеяна у всех погибших детей.

Частота обнаружений ассоциаций флоры в стерильных биологических средах организма существенно возрастала у погибших детей. Степень риска летального исхода при формировании бактериально-грибковых ассоциаций в стерильных средах (по сравнению с моно-бактериальными инфекциями) возрастала в 6,8 раза (г = 0,39). Формирование бактериально-грибковых и бактериально-бактериальных ассоциаций в стерильных средах на фоне исходного инфицирования возбудителями TORCH-комплекса сопровождало повышение риска летального исхода в 33,2 раза (г = 0,46).

При анализе соматического и акушерско-гинекологического анамнеза матерей, а также течения беременности и родов во всех группах были выявлены осложнения, вызывавшие острое или хроническое нарушение маточно-плацентарного кровообращения. Для матерей 1-й группы было характерно наличие высокой частоты хронической соматической патологии (72 %) и вредных привычек (31 %) в сочетании с патологическим течением беременности преимущественно в виде хронической фетоплацентарной недостаточности (у 48 % матерей выживших и 53,3 % матерей умерших детей), частыми инфекционными заболеваниями бактериальной и урогенитальной природы (у 62,8 % матерей выживших и 100 % матерей умерших детей) и хронической внутриматочной инфекции (53,3 %). Для матерей 5-й группы характерным было наименьшее количество соматической патологии — 40 % (с превалированием эндокринной патологии — у 35 % матерей), числа абортов и беременностей в анамнезе (у большинства матерей имела место первая беременность и первые роды), однако при этом течение беременности было патологическим на фоне хронической фетоплацентарной недостаточности и гестоза, высокой частоты угрозы прерывания и острых вирусных и рецидивирующих (герпес) инфекционных заболеваний.

Акушерский анамнез был наиболее отягощенным у матерей и 6-й групп, в которых у детей выявлены ассоциированные и грибковые инфекции: при сопоставимом возрасте матерей во всех группах, в отмеченных группах имело место среднее количество беременностей достоверно более высокое, чем при моноинфекциях бактериальной и TORCH природы, при этом в группе с кандидозными инфекциями наиболее высокое количество беременностей (3,5±0,5) сочеталось с достоверно более высоким числом абортов в анамнезе (2,0±0,26). Максимальная частота разнообразной хронической соматической патологии (92,8 %) выявлена у матерей детей 3-й группы (каждая третья при этом не наблюдалась в женской консультации) в сочетании с высокой частотой абортов и беременностей в анамнезе, патологическим течением беременности

на фоне преимущественно отечного варианта гестоза при большом разнообразии острых инфекционных заболеваний (в том числе — урогенитальной патологии) во время беременности у 100 % матерей.

При сопоставимых характеристиках соматического и акушерско-гинекологического анамнеза у матерей выживших и погибших детей, у матерей умерших детей было выявлено существенное отличие в количестве перенесенных во время беременности инфекционных заболеваний (у 100%), которые, по-видимому, сыграли ведущую роль в общем комплексе причин, в более высокой частоте формирования синдрома задержки развития плода, рождении недоношенных детей и, как следствие, провоцировании более тяжелой степени иммуносупрессии. Риск развития летального исхода в результате инфекций новорожденных был в 7,75 раз выше при наличии острых инфекционных заболеваний матери во время беременности (г = 0,38), при этом у недоношенных детей степень относительного риска развития полимикробных инфекций в 3,9 раз выше, чем инфекций моно-микробной природы (г = 0,31).

Клинико-лабораторная характеристика больных с генерализованными инфекциями перинатального периода. Под наблюдением находилось 180 детей (135 выживших и 45 умерших) от момента перевода из родильных домов на второй этап выхаживания до исхода заболевания. Несмотря на то, что синдромальная картина патологических состояний у детей всех групп была схожей, что не позволяло провести достоверную клинико-этиологическую дифференциальную диагностику без использования методов этиологической расшифровки, был выявлен ряд клинико-лабораторных различий (табл. 7).

Для большинства детей 1-й группы с 1-3-х суток жизни было характерно наличие токсикоза, дыхательной недостаточности, гнойных очагов, лейкоцитоза и нейтрофилеза в общем анализе крови (рис. 4). Основная часть детей родилась доношенными, при этом до 30 °к детей — в удовлетворительном состоянии с нарастанием тяжести состояния в 1-14-е сутки жизни. Ведущими клиническими синдромоми являлись токсикоз в сочетании с пневмонией и локальными гнойными очагами (у выживших детей) и токсикоз в сочетании с полиорганной дисфункцией (у умерших детей). В генерализованный бактериальный процесс вовлекались легкие (80%), почки (60%), печень (44 %), ЦНС (38 %) и кишечник (24 %). Поражение печени выявляли, в основном, уже на фоне течения заболевания как 2, 3 и даже 4-й очаг инфекции, что позволяет в практике неонатолога рассматривать появление клинико-лабораторных признаков поражения печени в качестве одного из критериев генерализации инфекции. Такие признаки SIRS-реакции как: лихорадка, лейкоцитоз, нарушение микроциркуляции не имели различий в степени выраженности и встречаемости среди выживших и умерших детей. Нами установлено, что риск развития летального исхода возрастал с развитием органных дисфункций, сопровождающихся отечным (в 21,1 раза при г = 0,52) и геморрагическим (в 11,6 раза при г = 0,51) синдромами, выраженность цитолиза коррелировала со степенью тяжести инфекции (рис. 5). Несмотря на то, что количество лейкоцитов даже на фоне нарастающей тяжести состояния было достоверно меньше требуемого в качестве критерия SIRS-синдрома v детей (Ю. Ф. Исаков, 2001; S. В. Brodie, 2000; В. А. Таболин, 2001; Г. А. Самсыгина, 2003; Н. Н. Володин, 2001; Н. А. Коровина,2003), в крови у умерших детей 1-й группы чаще, чем в других группах, выявляли лейкоцитоз с абсолютным нейтрофилезом (рис. 6).

Таблица 7

Сравнительная характеристика клинических проявлений инфекций перинатального периода различной этиологии

Состояние пациентов Бактериальная 1 группа TORCH + бактериальная 2 группа TORCH+ бактериал. + грибковая 3 группа Бактериаль ная + грибковая 4 группа TORCH 5 группа Грибковая 6 группа

Температура, "С

Живые 37,5±0,7 37,4±0,5 - 37,5±0,5 37,1±0,5 37,1±0,4

Умершие 37,4±1,0 36,9±0,7 37,8±0,6 36,3±0,7 - -

Лейкоцитоз, х10 /л

Живые 21,2±5,0 11,5±2,8 - 13,1±2,3 9,4±1,2 11,9±1,3

Умершие 22,3±4,1* от 4,5,6 гр 18,0±0,8 20,5±4,7 5,5+1,1* - -

Край печени из-под реберной дуги, см

Живые 2,7±0,6 1,5+0,5 - 1,75+0,3 1,5±0,4 3,2±0,4

Умершие 3,1±0,4 2±0,5 2,5±0,43 3,2+0,5 - -

AJIT, ммоль/л

Живые 1,03±0,4 0,5±0,1 - 0,6±0,3 0,7±0,2 1,1±0,3

Умершие 2,4±1,1* 1,1±0,2 1,1±0,3 0,48±0,1 - -

АСТ, ммоль/л

Живые 0,7±0,2 0,5±0,2 - 0,5±0,4 0,6±0,3 0,8±0,2

Умершие 1,7±0,5 0,9±0,3 1,1±0,3 0,47+0,1 - -

Край селезенки из-под реберной дуги, см

Живые 0,7±0,4 0,3±0,4 - 0,4±0,4 0,3±0,3 0,3±0,3

Умершие 1,7±0,б 0,4+0,3 1,б±0,4 1,6±0,4 - -

Примечание. * — досюверныс различия нока.шелей в сравниваемых группах — р < 0,05

Рис. 4. Результаты исследования общего анализа крови в раннем неонатальном периоде выживших новорожденных Примечание: * — достоверные различия показателей в сравниваемых группах — р < 0,05

5,5

----УАК 8

Количество больных УАИ 8 — у выживших детей; УАИ 9 — у умерших пациентов Рис. 5. Сопоставление уровня трансаминаз (по АЛТ) у выживших и умерших новорожденных с бактериальными инфекциями

Рис 6. Результаты исследования общего анализа крови в раннем неонатальном периоде

умерших новорожденных Примечание: * — достоверные различия показателей в сравниваемых группах р < 0,05

ТСЖСН-инфекции в первую неделю жизни сопровождали СДР, геморрагический синдром преимущественно в виде кожно-геморрагических проявлений и неврологические нарушения. 60 % детей родились в удовлетворительном и среднетяжелом состоянии, 30 % детей были выписаны из родильного дома, но через 2-20 дней госпитализированы в отделение патологии новорожденных в связи с синдромом угнетения, экзантемами,

длительной желтухой В общем анализе крови на первой неделе жизни было выявлено более низкое содержание нейтрофилов, чем у детей 1-й группы (рис. 5). Были характерны интоксикация в виде нарушения аппетита, замедленная прибавка массы тела, кратковременная субфебрильная температура, поражение легких в виде, преимущественно, интерстициальной пневмонии, апноэ, поражение ЦНС в виде менингита, менингоэнцефалита, гипертензионно-гидроцефального синдрома. Желтуха была связана с » нарушением процессов конъюгации и имела тенденцию к затяжному течению,

у 30 % больных в динамике болезни она приобретала холестатическую природу, синдром цитолиза был слабо выражен, а восстановление нормальных » величин содержания ферментов происходило, в основном, в течение месяца.

Нарушений белок-синтетической функции печени выявлено не было.

У детей с грибковыми инфекциями (в этиологии доминировала С. albicans) в клинической картине на первой неделе жизни превалировали неврологические нарушения на фоне кровоизлияний в структуры мозга. С момента рождения у детей наблюдали преимущественно тяжелое и очень тяжелое состояние. Кандидозная инфекция развивалась более длительно, чем другие моноинфекции (табл. 2), и сопровождалась хронической интоксикацией. В клинической картине превалировали симптомы поражения ЦНС в виде менингита / менингоэнцефалита (вентрикулита) с образованием гранулем и окклюзией ликворопроводящих путей у 30 % детей, развитием прогрессирующего гипертензионно-гидроцефального синдрома. У подавляющего большинства детей была выявлена гепатоспленомегалия, при этом размеры печени отличались от таковых при ВУИ TORCH-природы, но были сопоставимы с размерами печени у детей с моно-бактериальными инфекциями. Синдром цитолиза был слабо выражен, но сохранялся длительно, его выявляли у детей в течение 2-4-х месяцев болезни. Также длительно определяли и увеличенные размеры печени. У больных выявляли маркеры холестаза (повышенная щелочная фосфатаза, холестерин, признаки холестаза при УЗИ), нарушений белок-синтетической функции печени выявлено не было.

Полимикробные инфекции протекали более тяжело, чем моно-этиологичные инфекции. Новорожденные из групп с полимикробным инфицированием, так же как и с грибковыми инфекциями, чаще рождались в тяжелом и очень тяжелом состоянии (во 2-й группе — 72 % детей; в 3-й группе — 79 %; в 4-й группе — 79 % детей). У детей 2-й группы с первых дней жизни были отмечены СДР, поражение нервной системы в сочетании с геморрагическим синдромом (ВЖК различной степени у 51,7 % детей), отечный синдром, раннее появление желтухи при отсутствии достоверных изменений в составе и количестве форменных элементов крови. Большинство детей родились недоношенными: доношенные — 27,5 %, недоношенные 2-4 степени — 45 % среди живых и 67 % среди умерших. Ассоциированные инфекции 2-й группы развивались в последующем с преимущественным поражением легких (81,6%), ЦНС (71 %), печени (50%). У выживших детей чаще диагностировали экзантемы (герпетические и другие высыпания), что могло отражать раннюю фазу виремии, и помогало в своевременной постановке диагноза ВУИ У умерших детей доминировал геморрагический синдром и поражение ЦНС (внутрижелудочковые и паренхиматозные кровоизлияния,

менингоэнцефалиты, отек мозга) в сочетании с прогрессирующими явлениями полиорганного поражения. Риск смерти возрастал с присоединением геморрагического синдрома в 25,1 раз (г = 0,57), синдрома угне!ения ЦНС — в 9,6 раз (г = 0,39), дыхательной недостаточности — в 7,3 раза, (г = 0,34), отечного синдрома — в 3,8 раз, (г = 0,29). Уровень ферментемии отражал невысокую интенсивность цитолиза гепатоцитов даже на фоне СПОН (а). У 37,9 °/с выживших детей на второй — третьей неделе болезни диагностировали холестатический компонент желтухи, подтвержденный лабораторными исследованиями и результатами УЗИ.

У детей 3-й группы (умершие дети) среди ведущих синдромов, определявших тяжесть болезни с момента рождения, превалировали различные варианты поражения мозга, имевшие место у всех детей (отек мозга, кома, ВЖК, менингит, гидроцефалия, судороги) в сочетании с токсикозом (100 %), полисистемным поражением, спленомегалией и прогрессирующей гипотрофией; лихорадка и лейкоцитоз отсутствовали. Уровень ферментемии отражал невысокую интенсивность цитолиза гепатоцитов при физиологических размерах печени. В динамике у всех детей прогрессировали нарушения белкового обмена сочетанного генеза.

При сравнении степени выраженности цитолиза гепатоцитов исходя из наличия или отсутствия TORCH-инфекции, в общем количестве как у выживших, так и умерших детей достоверных отличий выявлено не было: AJ1T у всех больных без TORCH-инфицирования — 1,1 ± 0,5 ммоль/л; AJTT у всех больных с подтвержденным TORCH-инфицированием — 0,6 ± 0,4 ммоль/л. Однако, при проверке подозрения на однородность двух независимых выборок посредством использования непараметрического критерия Вальда-Вольфовица значение р-уровня оказалось равным 0,05, что позволило отвергнуть нулевую гипотезу о сходстве поражения печени у детей с TORCH- и без TORCH-инфицирования и свидетельствовало о более выраженном цитолизе гепатоцитов у детей 1, 4, 6-й групп (в общем). Таким образом, течение TORCH-инфекции, даже в ассоциации с бактериальной или бактериально-грибковой флорой, влияет на выраженность цитолиза гепатоцитов в сторону подавления ферментативной активности, что позволило предположить влияние возбудителей ВУИ — TORCH на функцию пораженных клеток печени.

Аналогичные тенденции были выявлены и при проведении статистического анализа с использованием непараметрических критериев (Вилкоксона и критерия знаков) у умерших пациентов, что представлено на рис. 7 с отражением результатов АЛТ в ммоль/л по оси у.

Наиболее тяжелым в первые дни после рождения было состояние детей 4-й группы: 90 % детей родились недоношенными, при этом у 59,3 % имела место недоношенность 2^4-й степени. У детей с рождения были выражены СДР, угнетение и гипорефлексия, парез кишечника, геморрагический синдром преимущественно в виде ВЖК различной степени тяжести, при этом достоверных изменений в общем анализе крови выявлено не было. Развитие инфекции у 71 % детей начиналось с симптомов энтероколита (в том числе, язвенно-некротического); у 28,5 % детей первым выявленным очагом был менингоэнцефалит, который диагностирован у 45,8 % больных 4-й группы. Инфекция протекала с поражением кишечника (93,7 %), легких (66,7 %), ЦНС (45,8 %). У 85 % детей формировалась гепатоспленомегалия, однако уровень

печеночных ферментов свидетельствовал об отсутствии либо слабой выраженности синдрома цитолиза. Нарушение белок-синтетической функции печени были выявлены у всех погибших детей и у 30 % выживших детей, у 25 % детей они сочетались с холестатическим компонентом. Риск летального исхода коррелировал со степенью гепатоспленомегалии (показатель степени относительного риска 34, при г = 0,61), нарастанием геморрагического синдрома (показатель степени относительного риска 7,8, при г = 0,38) и лейкопенией.

55

н

с; <

— УАК13

Количество больных ^ —УАЯ 14 \'АК 13 — у умерших детей с ТСЖСН-инфицированием; УАИ 14 — у умерших детей беч ТСЖСН-инфицирования

Рис 7 Сравнительный анализ интенсивности цитолиза гепатоцитов (по АЛТ) V умерших пациентов в зависимости от присутствия ТСЖСН-инфицирования

Н

г; <

-о- — уди*; Количество больных ° 6

УА1? 5 — у умерших больных с кандида-ассоциированными инфекциями; УАИ 6 — у выживших больных с кандида-ассоциированными инфекциями

Рис 8 Сравнительный анализ ишенсивности цитолиза гепатоцитов ) выживших и умерших детей с кандида-ассоциированными инфекциями

При сравнении степени ферментемии в зависимости от наличия кандида-ассоциированных инфекций с помощью непараметрической альтернативы критерию Стьюдента — критерия знаков, а также критерия Вилкоксона, было выявлено, что интенсивность цитолиза как у выживших, так и у умерших пациентов не отличалась от величин средних показателей для больных, не инфицированных грибами, и не изменялась, независимо от тяжести состояния и риска летального исхода (рис. 8). Таким образом, корреляция между тяжестью болезни, степенью гепатоспленомегалии и синдромом цитолиза гепатоцитов была выявлена только при бактериальных инфекциях. При ГИ другой этиологии зависимости между тяжестью состояния детей, размерами печени, селезенки и активностью ферментемии найдено не было.

Показатели иммунитета при перинатальных моно- и полимикробных инфекциях. Биологическую активность сыворотки крови здоровых новорожденных детей по сравнению с сывороткой взрослых доноров характеризовало отсутствие значимой провоспалительной и супрессорной активности. Показатели апоптоза лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов периферической крови новорожденных не отличались от аналогичных показателей взрослых доноров. Интенсивность спонтанной и КонА-индуцированной пролиферации, характеризующей альтернативный путь активации клеток, была достоверно выше у новорожденных. В то же время пролиферативный ответ Т-клеток новорожденных при классической активации через Т-клеточный рецептор анти-СОЗ антителами был достоверно ниже, чем у взрослых доноров, свидетельствуя о функциональной незрелости Т-клеток новорожденных (табл. 8).

Таблица 8

Сравнительные показатели функциональной активности лимфоцитов и биоактивности сыворотки крови здоровых новорожденных и здоровых

взрослых доноров (М±ш)

Показа! ели Новорожденные Взрослые доноры

ИВА, расч. ед. 0,89±0,05-1- 1,57±0,09

ИСА, расч. ед. 0,88±0,1 0,95±0,02

Апоптоз лимфоцитов, % 4,0±0,6 4,1±0,6

Апоптоз моноцитов, % 14,4+2,1 14,5+1,7

Апоптоз нейтрофилов, % 5,7+1,7 7,5+1,0

Пролиферация, х!0' имп/мин

Спонтанная (SPONT) 2,4+0,2* 1,6+0,2

КонА-индуцированная 72,1+5,3* 58,3±3,9

Анти-СОЗ-индуцированная 18,1+2,3** 34,7+1,8

1 [римечания * — доыоверные различия величин показателей в сравнении с таковыми в группе ¡доровых взрослых доноров р < 0,0*), *•" — р < 0,01

Показатели иммунного статуса инфицированных детей в сравнении со здоровыми новорожденными (табл. 9) отличали повышенное абсолютное количество В-лимфоцитов и дисгаммаглобулинемия, которая проявлялась повышением сывороточного уровня ^М и ^А и снижением ^О. У инфицированных детей отмечали угнетение спонтанной и КонА-индуцированной пролиферации и повышенный уровень апоптоза лимфоцитов и нейтрофилов среди свежевыделенных лейкоцитов периферической крови,

появление воспалительной и супрессорной активности, что свидетельствовало о формировании иммунной недостаточности в виде угнетения пролиферативной активности Т-лимфоцитов, повышенной гибели лимфоцитов и нейтрофилов, отражающей ответ на стимуляцию in vivo, и изменение биологической активности сыворотки.

Таблица 9

Сравнительные показатели иммунного статуса здоровых и инфицированных новорожденных (М±т)

Показатели Здоровые дети Инфицированные дети

Количество 30 135

Лейкоциты, х109/л 11,9±1,2 11,9+0,6

Лимфоциты, % 39,2+3,5 44,5+1,8

CD3, % 63,5±2,6 63,9+1,2

CD4, % 40,1±3,2 41,9+1,2

CD8, % 22,5±0,9 22,6±0,7

CD4/CD8 1,85±0,2 2,0+0,1

CD 16, % 13,3±2,7 11,0+0,8

CD72, % 13,2±1,9 16,8+1,1

011+лимфоц., % 16,0±2,3 18,5±1,1

DR+ моноц., % 86,4+2,1 84±4,1

DR-индекс 0,3±0,02 0,36+0,01

Спонт. прол., х103 имп/мин 2,4±0,2 1,8+0,1*

КонА, х103 имп/мин 72,1+5,3 30,5+2,8*

PAN 1,5±0,2 1,8+0,1

ИВА, расч. ед. 0,89±0,05 1,3+0,07*

ИСА, расч. ед. 0,88+0,1 0,5±0,05**

Апоп лф., % 4,0±0,6 9,3±0,7*

Апоп. нф., % 5,7+1,3 10,5+1,1*

Апоп. мон., % 14,4±2,1 16,1±1,0

IgM, г/л 0,18+0,1 0,4±0,1**

IgG, г/л 7,9±0,8 5,4±0,5*

IgA, г/л 0,22±0,12 0,4+0,09*

Примечания: * — достоверные различия в сравнении со здоровыми детьми р < 0,05; ** — р <0,01

Несмотря на отсутствие изменений в субпопуляционном составе лимфоцитов в общей группе инфицированных пациентов, исследуемые показатели внутри отдельных групп больных достоверно (р < 0,05) отличались от таковых у здоровых новорожденных. Так, у детей с генерализованными моноинфекциями 5 и 6-й групп определяли более низкое содержание лейкоцитов (9,4±0,7 и 8,3±1,5х109/л соответственно). У детей 1-й группы отмечали снижение доли С08+Т-клеток (19,8±0,9 %) и увеличение абсолютного количества С04+Т-клсток (2,3±0,2x107л), в то время как у больных кандидозными инфекциями выявлено снижение относительного количества С04+Т-клеток (34,0±3,2 %). У пациентов с кандида-ассоциированными

инфекциями (4 и 6-я группы), по сравнению со здоровыми детьми и больными других групп, регистрировали существенное снижение доли CD16+NK-icneTOK (9,9+1,6 и 6,4+1,4 %), что, возможно, является специфическим для кандидозных инфекций новорожденных. У детей 2-й группы отмечено повышение относительного содержания В-лимфоцитов (19,4+2,6 %) и снижение относительного содержания HLA-DR+ моноцитов (80,0+3,7 %). При этом уровень экспрессии HLA-DR-антигенов на моноцитах у больных 1, 4 и 5-й групп был выше, чем у здоровых детей.

Поскольку изменения количества и лейкоцитов и субпопуляционного состава лимфоцитов при различных инфекциях носили разнонаправленный характер, то выделенные группы порой существенно различались между собой по этим параметрам. Так, больные 1-й группы отличались от пациентов с 5-й группы более высоким содержанием лейкоцитов (16,3±1,1 и 9,4±0,7х109/л, р < 0,05) при сниженном относительном содержании лимфоцитов (38,2±3,4 и 54,4±2,8 %, р < 0,05) особенно СОв^-клеток (19,8±0,9 и 23,7±1,0 %, р < 0,05). У больных 6-й группы по сравнению с 1-й группой было выявлено более низкое содержание лейкоцитов (8,3±1,5 и 16,3±1,1х109/л, р < 0,05), CD4+ Т-клеток (34,0±3,2 и 42,2±2,3 %, р < 0,05) и С016+ЫК-клеток (6,4+1,4 и 13,4±1,9 %, р < 0,05), но более высокое содержание СЭ8+Т-лимфоцитов (24,6±2,2 и 19,8+0,9%, р < 0,05). Различия между TORCH и грибковыми инфекциями проявлялись только в содержании CD 1 б^ИК-клеток и (12,5+1,1 и 6,4±1,4х109/л, р < 0,05) и уровне экспрессии HLA-DR-антигенов на моноцитах (0,38±0,01 и 0,31±0,02, р < 0,05), которые были достоверно ниже у больных грибковыми инфекциями.

Сравнение анализируемых показателей при моно- и полимикробных инфекциях показало, что у больных 2-й группы по сравнению с пациентами 1-й группы отмечали более низкий уровень лейкоцитов (10,1±1,2 и 16,3±1,1х10 /л, р < 0,05), ОЯ+-моноцитов (80,0±3,7 и 89,4±2,1 %, р < 0,05) и ИРИ (1,8±0,2 и 2,3±0,2, р > 0,05). У больных 4-й группы по сравнению с пациентами 1-й группы было выявлено более высокое содержание С08+Т-лимфоцитов (23,8±1,4 и 19,8±0,9 %, р < 0,05), т. е. развитие ассоциированных инфекций у больных с бактериальными инфекциями приводило к прогрессированию иммунной недостаточности за счет снижения количества лимфоцитов-хелперов и экспрессии на моноцитах HLA-DR молекул (2-я группа) или нарастания количества киллеров-супрессоров (4-я группа). TORCH-бактериальные инфекции, по сравнению с TORCH-инфекциями, характеризовало более низкое содержание CD8+T-лимфоцитов (0,8±0,1 и 1,3+0,1х107л, р < 0,05) и более высокое количество HLA-DR+ лимфоцитов (20,6+1,9 и 15,9±1,8 %, р < 0,05). У больных с бактериально-грибковыми инфекциями по сравнению с грибковыми моноинфекциями выявляли более высокое содержание CD4+ Т-лимфоцитов (46,9±2,8 и 34,0+3,2 %, р < 0,05). Таким образом, наиболее выраженные проявления структурного иммунодефицита были характерны для ассоциированных инфекций.

Чтобы выяснить возможную причастность апоптоза клеток крови к иммунным нарушениям, было проведено исследование показателей апоптоза лимфоцитов, моноцитов, нейтрофилов среди свежевыделенных клеток периферической крови при различной этиологии инфекций (табл. 10).

Таблица 10

Апоптоз свежевыделенных клеток крови у здоровых и больных

детей (М±ш)

Группы Контроль 1 группа 2 группа 4 группа 5 группа 6 группа

Этиология Здоровые Бактер TORCH+бак Бак+гриб TORCH Грибы

п 30 45 29 41 20 10

Лимф., % 4,0±0,6 8,311,0* 12,5±2,3** 9,3±1,5* 10,4+1,3** 5,3+2,1

Моноц., % 14,4+2,1 17,2+1,5 19,8±2,4* 10,6±1,3 16,8±2,2 20,0±2,3*

Нейтр., % 5,6+1,3 9,3±1,5 9,0±2,1 9,6±2,0 15,9+2,1** 5,6+1,8

Примечания' * — достоверные различия показателей в сравнении с группой здоровых детей pL. < 0,05, ** — pL < 0,01

При бактериальных инфекциях отмечали усиление апоптоза лимфоцитов, при TORCH-инфекциях — лимфоцитов и нейтрофилов, при грибковых инфекциях — моноцитов. Характерно, что достоверное усиление апоптоза нейтрофилов выявляли исключительно у детей с TORCH-инфекциями, в то время как при бактериальной и полимикробной инфекциях повышение апоптоза нейтрофилов проявлялось лишь в виде тенденции. Поскольку генерализованная TORCH инфекция протекала более благоприятно, чем инфекции другой этиологии, усиление апоптоза нейтрофилов в этом случае могло играть благоприятную роль, заключающуюся в ограничении воспалительных реакций и своевременном развитии адекватного противовоспалительного ответа.

Сопоставление показателей апоптоза лимфоцитов, моноцитов и пролиферативного ответа выявило наличие выраженной прямой корреляционной связи между уровнем апоптоза лимфоцитов и пролиферативным ответом в КонА и в а-СОЗ-стимулированных культурах (R = 0,64; ри < 0,05 и R = 0,46; pL < 0,05 соответственно) только у больных 5-й группы (рис. 9). Прямой характер корреляционной связи является аргументом того, что апоптоз лимфоцитов при TORCH-инфекциях был четко связан с активацией лимфоцитов и, по-видимому, был проявлением feed-back регуляции иммунного ответа. При моно-бактериальной инфекции прослеживали умеренную прямую корреляционную зависимость апоптоза моноцитов с уровнем спонтанной и а-СБЗ-стимулированной пролиферации МНК (R = 0,46; Ри < 0,05; и R = 0,39; ри < 0,05 соответственно), — по-видимому, у больных 1-й группы моноциты обладали повышенной иммуносупрессорной активностью, поэтому их апоптоз приводил к усилению пролиферативного ответа Т-клеток. У больных полимикробными инфекциями (2 и 4-я группы) корреляции между апоптозом лимфоцитов и пролиферацией найдено не было.

Сравнительный анализ функциональной активности клеток крови и интегральных показателей биологической активности сыворотки крови также выявил связь с этиологией инфекции (табл. 11). Угнетение a-CD3-стимулированного ответа по сравнению со здоровыми детьми имело место при грибковой и кандида-ассоциированных инфекциях. Снижение КонА-индуцированного пролиферативного ответа регистрировали у больных детей всех групп, но максимально оно было выражено также у больных 4 и 6-й групп. Усиление биоцидности нейтрофилов, оцениваемой по продукции перекиси водорода, отмечали только у больных 2-й группы. Супрессорную активность

сыворотки выявляли у больных всех групп, однако достоверное усиление супрессорной активности в виде снижения индекса ИСА выявляли у детей 2, 4 и 5-й групп Усиление провоспалительной активности сыворотки в виде увеличения ИВА было характерным только для детей с TORCH- и бактериальными моноинфекциями.

СОКА_СРМ

Рис 9 Реч\ льтаты изучений вероятности корреляций между уровнем апопто 1а (1Л АРО) и интенсивностью КонА-сгиму шрованной (СОКА СРМ) пролиферации лимфоцитов у детей с ТОКСН-инфекциями

Таблица 1 1

Сравнительный анализ функциональной активности лимфоцитов и иейтрофилов крови и биологической активности сыворотки у детей с различной этиологией генерализованных перинатальных инфекций

(М±ш)

Группы Контроль 1 группа 2 группа 4 группа 5 группа 6 группа

Этиология Здоровые Ьактер TORCH+бак Бак+гриб TORCH Грибы

п 30 45 29 41 20 10

SPONT, хЮ3 ими/мин 2,4±0,2 1,5±0,1** 2,2±0,3 1,6±0,2* 1,6+0,2* 1,9+0,3

КонА, хЮ' ими/мин 72,1 ±5,3 34,1 ±4,3* 36,3±4,6* 18,9±2,г* 38,2±4,3* 29,4±5,4**

Индекс 36.1+4,3 22,2±2,4* 16,0±3,1** 11,7±2,1** 29,8±4,3* 20,5+5,1 *

a-CD3, xlO3 имп/мин 18,1 ±2,3 15,7±2,5 17,0+3,8 12,4±3,1* 16,1 ±2,2 10,6+3,1*

Индекс 9,2±2,5 9,9±1,4 7,7±1,5 1 6,7+1,3* 12,6+2,3 7,8+3,1

PAN 1,5±0,2 1,9±0,2 2,2±0,3* 1,9+0,4 1.3+0,1 1,3+0,1

ИВА, расч. ед. 0,89±0,05 1,6±0,1* 1,1 ±0,09 1,2+0,09 1,3+0,01* -

ИСА, расч ед. 0,88±0,1 0,62+0,1 0,28±0,05* 0,5+0,1* 0,45±0,08 •f -

Примечания * — достоверные различия величин показателей в сравнении с таковыми в группе здоровых детей pij < 0,05, — рь < 0,01

Поскольку у больных 1-й группы максимальная воспалительная активность (ИВА — 1,6+0,2 расч ед ) сочеталась с наличием слабой супрессорной активности (ИСА — 0,62+0,1 расч. ед.), это позволило расценить данную воспалительную реакцию как SlRS-реакцию. У детей 5-й группы повышенная провоспалительная активность сыворотки сочеталась с высокой иммуносупрессорной активностью (ИСА — 0,45+0,08 расч. ед.), что позволило предположить синдром смешанного антагонистического ответа (MARS), характеризующийся одновременным увеличением уровня как провоспалительных цитокинов, так и противовоспалительных медиаторов У детей всех других групп доминировала супрессорная активность, которая свидетельствовала о развитии CARS-синдрома.

У пациентов 1-й группы были выявлена обратная корреляционная связь между величинами ИСА и показателя спонтанной пролиферации лимфоцитов (R = -0,77, при pu < 0,05), а также ИСА и уровнем экспрессии DR-рецепторов на моноцитах (R = -0,70, при pu < 0,05) У больных 2-й группы были выявлены корреляционные связи между биологической активностью сыворотки и DR-экспрессией- достоверная корреляция (R) между ИВА и количеством DR+-лимфоцитов (+0,77 при pu < 0,02) и обратная корреляционная связь между ИСА и количеством DR+-моноцитов (-0,78 при pL<0,01), которые сочетались с повышением относительного количества HLA-DR+ активированных лимфоцитов при снижении HLA-DR+ активированных моноцитов у больных данной группы. Сопоставление показателей биологической активности сыворотки и пролиферации лимфоцитов у больных 4-й группы не выявило корреляционных связей между исследованными параметрами. В то же время, наиболее глубокое угнетение пролиферативной активности лимфоцитов, свидетельствующее о развитии функциональной арсактивности с возможной анергией, было обнаружены именно у пациентов кандидозными и кандида-ассоциированными инфекциями, это позволило предположить, что угнетение пролиферативной активности Т-лимфоцитов могло быть детерминировано самими грибами (С. albicans).

У погибших больных независимо от этиологии инфекций были выявлены наиболее низкие показатели функциональной активности клеток: спонтанная пролиферативная активность лимфоцитов — 1,49±0,3х103 имп/мин, индуцированная КонА пролиферативная активность — 23,3±3,1х10э имп/мин, индуцированная анти CD3-антителами пролиферативная активность — ЮД+гЛхЮ3 имп/мин, уровень HLA-DR+ активированных моноцитов — 79,8+2,1 %. Одновременно у этих пациентов определяли высокую супрессорную активность сыворотки (ИСА — 0,42+0,1 расч. ед) и повышенную биоцидность нейтрофилов (2,2+0,2), однако интегральный показатель провоспалительной активности сыворотки умерших пациентов не имел достоверного отличия от результатов в контроле (ИВА — 1,06±0,1 расч ед.). Таким образом, степень угнетения функциональной активности клеток (лимфоцитов и моноцитов) отражала тяжесть инфекции и ее прогноз; наиболее информативными среди выявленных показателей являлись показатель стимулированной КонА пролиферативной активности лимфоцитов и содержание HLA-DR+ активированных моноцитов при высокой супрессорной активности сыворотки.

Патоморфологические преобразования в печени при генерализованных перинатальных инфекциях моно- и полимикробной этиологии. Морфологические изменения в печени умерших детей имели отличия как по сравнению с результатами исследования в контрольной группе, так и между группами. Развитие ГИ у погибших новорожденных всех анализируемых групп было сопряжено с поражением деструктивными процессами от 70 до 98 % гепатоцитов, что достоверно (в десятки раз — р < 0,01) отличалось от величин этого показателя в контрольной группе Уровень и характер деструктивных изменений у погибших больных были различными в зависимости от этиологии инфекции (табл. 12).

Общий объем деструктивных изменений в печени у детей 1 и 4-й групп был достоверно большим, чем у детей 2 и 3-й групп (с TORCH-ассоциированными инфекциями) В то же время, основной объем альтерации в 4-й группе был обусловлен дистрофическими изменениями в паренхиме печени' у детей 4-й группы он превышал аналогичный показатель 2 и 3-й групп в 1,4 раза, показатель 1-й группы — в 1,3 раза. Объем некрозов в структуре деструктивных изменений был представлен по-другому: у детей 1 и 3-й групп он был достоверно большим, чем у детей 2 и 4-й групп. Наибольший объем некрозов гепатоцитов был найден у больных 1-й группы.

Объемная и численная плотности двуядерных гепатоцитов, были наибольшими у детей 4 и 2-й групп, у которых не имелось отличий по уровням репаративных процессов в сравнении с таковыми в контрольной группе У детей 4-й группы, в сравнении с TORCH-ассоциированными инфекциями (3-я группа), величины показателей активности репаративных процессов в печени по объемной и численной плотности двуядерных гепатоцитов были выше аналогичных в 3-й группе в 1,3 раза. Выраженность компенсаторных реакций в исследуемых группах была обратно пропорциональна объему некрозов в них: меньшим масштабам некрозов во 2 и 4-й группах соответствовала большая выраженность компенсаторных реакций, а в 1 и 3-й группах, где наблюдали наибольший объем некрозов, и объем, и количество двуядерных гепатоцитов были достоверно меньшими. При этом четкого соответствия между общим объемом деструктивных изменений и репаративпой активностью гепатоцитов выявлено не было Проведенное клинико-морфологическое сопоставление выявило общее в морфологических преобразованиях в печени и в тяжести полиорганных поражений, свойственное детям всех групп: все эти состояния развивались с преобладанием процессов, изымающих из функции большую часть гепатоцитов, регенеративные процессы же были неадекватны и не восполняли утрат На таком фоне в связи с тяжелыми дисметаболическими явлениями формируются грубые нарушения гомеостаза, создаются условия для формирования полиорганной недостаточности, как следствия расстройства метаболической функции, прежде всего, паренхимы печени, видимо, с нарушением биотранформации лекарственных средств.

В результате проведенного иммуногистохимического постмортального исследования печени новорожденных были выявлены отличия и в экспрессии маркеров апоптоза гепатоцитов в зависимости от этиологии ГИ (табл. 13), при этом наибольшие изменения с достоверным отличием экспрессии всех генов апоптоза от показателей других групп были обнаружены у пациентов с полимикробными инфекциями 3-й группы.

Таблица 12

Сравнительные результаты морфометрического исследования печени умерших новорожденных (М±т)

Показатели Контрольная группа 1 группа 2 группа 3 гр\ ппа 4 группа 1-2 1-3 1 -4 2-3 2-4 3-4

Бактериальная инфекция тоисн + бактерии тоясн +бактерии + грибы Бактерии + грибы р р р р р р

Дв\ ядерные гепатоциты (\'у) 7.75±0,52 5,31 ±0,59 6.11 ±1,61 4,49±0.61 7,58+1.3 > 0.05 > 0.05 <0,05'* > 0,05 > 0.05 <0,05*

Двуядерные гепатоциты (Ка1) 4.75±0.52 -I. 3 3,31+0,21 3,82±0.42 3.29+0,31 4,25±0,32 < 0.05* > 0.05 > 0,05 >0,05 > 0.05 <0,05

Объем некрозов (Уу) 4,11±1,10 *1, 2, 3, 4 16.37+1.09 11,68+1.44 14.61 ±2,34 11,84+1,56 < 0.05 4 < 0.05* <0.05* <0,05* > 0.05 < 0,05*

Объем дистрофически измененных гепатоцитов (Уу) 7,86+1.30 *1,2, 3,4 68.58+1.59 57.5+2,51 54.23±2.34 85.69±1,9 <0,05* <0.05* <0,05* > 0.05 < 0,05* < 0,05*

•о

о

Г) т ' II?

а № >

? Ъ С ! к к

О о

-I а ™ £ 5»

X >

за

[

Примечание' (*) - обозначены достоверные отличия (р < 0,05) в сравниваемых группах

Таблица 13

Ре1ультаты морфометрического иммуногистохимического исследования

маркеров апоптоза гепатоцитов умерших новорожденных (М±т)

Исследуемый параметр Контрольная группа 1 группа 2 ipyima 3 группа 4 группа

Бактериал. инфекция TORCH + бактерии TORCH +бактерии + грибы Бактерии + грибы

Ki-67 (Nai) 2,2±0,18 14,45±1,10* ** 6,61 ±0,69ас ** 2,89±0,22* 3,69±0,55аЬ а

р53 (Nai J 2,76±0,25 1,86±0,26Ьс1 ** 3,53±0,36ас 11,59±0,7* ** 1,50+0,37Ьс)

bcl-2 (Nai) 1,9±0,15 3,24±0,54Ь(1 1,89±0,2V 7,30±0,53* ** 4,25±0,73Ьс1 **

р53/ bcl-2 1,45 0,57 1,87 1,56 0,37

Примечание а обозначены достоверные разтичия в сравнении с 1-й группой (р < 0,05), Ь — в сравнении с 3-й группой (р < 0,05), с — в сравнении с 4-й группой (р < 0,05), с1 — в сравнении со 2-й группой (р < 0,05), * — достоверные отличия (р < 0,05) от всех групп, ** — достоверные отличия от показателей контрольной группы

Изменения в паренхиме печени пациентов 1-й группы сопровождала гиперэкспрессия пролиферативного гена Ю67, величина которого была наибольшей среди всех сравниваемых групп. Баланс между проапоптотическими (р53) и антиапоптотическими (Вс12) факторами оказался сдвинутым в сторону преобладания экспрессии Вс12 (р53/ Вс12 = 0,57), предназначенной, видимо, для ингибирования клеточной смерти в ответ на повреждение гепатоцитов. Уменьшение выраженности деструктивных изменений на фоне ТСЖСН-инфекций сочеталось с индукцией проапоптотических белков в виде повышения экспрессии р53, по сравнению с результатами в 1 и 4-й группах. Коэффициент р53/ Вс12 у больных с ТСЖСН-ассоциированными инфекциями отличался от показателей детей 1 и 4-й групп (табл. 13) В 3-й группе максимальная выраженность р53 была сопряжена с минимальной активностью Ю67 и минимальной регенераторной способностью гепатоцитов. В отличие от 1 и 2-й групп, гепатоциты детей, погибших от кандида-ассоциированных инфекций, демонстрировали достоверно самый низкий уровень эспрессии К¡67, несмотря на отличия в характере репаративных реакций при морфометрическом исследовании у больных 3 и 4-й групп.

Учитывая полисистемный характер инфекций представляла интерес оценка закономерностей экспрессии маркеров апоптоза в других органах по сравнению с выявленными механизмами апоптоза в печени. Экспрессия пяти маркеров апоптоза (р53, р57, Ьс12, &67, СК19) была исследована в нескольких органах от 9 погибших больных различных групп (табл. 14). Согласно результатам, полученным в ходе данного исследования, можно предполагать сопоставимость и системность апоптотических тенденций в различных органах новорожденных на фоне ГИ; их характер определялся, видимо, этиологией заболевания. Обращает внимание частота экспрессии СК19 в тканях пациентов. Экспрессия СК19 была выявлена и в гепатоцитах новорожденных, погибших от генерализованных бактериально-грибковых инфекций; возможно, при

максимальном подавлении пролиферативных репаративных процессов в печени новорожденных активация этих процессов происходит с вовлечением стволовых клеток. Возможно, также, что наличие цитокератина в гепатоцитах отражает степень незрелости органа.

1 аблица 14

Результаты иммуногистохимического исследования маркеров апоптоза в парафиновых срезах секционного материала от детей, погибших вследствие генерализованных инфекций перинатального периода

№ п/п Этиология инфекции Орган р53 р57 Ьс12 Ю67 СК19

1 Бактериальная инфекция Печень + ± + + +

1-я группа Почка + + + + +

2 TORCH + бактериальная Легкое - + - + +

инфекция Головной чо<г ± + - - +

2-я группа Печень ± + - + +

3 TORCH + бактериальная Миокард - ± - - +

инфекция Готовпой чозг - - ± - -

2-я группа Печень - ± + - +

4 TORCH + бактериальная Миокард - + + + +

инфекция Головной мозг - ± - + +

2-я группа Печень - + + + +

5 TORCH + бактериальная Легкое - - - - +

+ грибковая инфекция Головной мозг - + - - +

3-я группа Печень - - - - +

Селезенка - - - - ±

6 TORCH + бактериальная Головной мозг - - - - -

+ грибковая инфекция Селезенка - + ± - -

3-я группа Печень - - ± - -

Миокард - - - - -

7 TORCH + бакт ериальная Легкое - + + ± +

+ грибковая инфекция Печень - + - - -

3-я группа Головной мозг - ± - - -

8 TORCH + бактериальная Печень - - + - +

+ грибковая инфекция Миокард - - - - -

3-я группа Головной мозг - + - - +

9 Бактериальная + грибковая Печень - + + - +

инфекция Миокард - + + - +

4-я группа Головной мозг - - - - +

Характер морфологических изменений в печени мышей на фоне кандидозного инвазивного процесса и при лечении амфотеринином В. При

исследовании образцов срезов печени в световом микроскопе наблюдали гранулемы, состоящие преимущественно из макрофагов и эпителиоидных клеток (табл. 15 и 16). Изменение количества гранулем в печени характеризовалось тенденцией к увеличению их количества от 10-го дня к 28-му дню после инфицирования и снижением почти на 100 % к 56-му дню наблюдения. Это свидетельствовало о спонтанном затухании процесса, но не дает основания утверждать о его завершении, а скорее является отражением тенденции к его волнообразному развитию.

Таблица 1 5

Результаты морфометрического исследования объемной плотности (Уу) зон дистрофически измененных гепатоцитов и некрозов, численной плотности (N¡,0 двуядерных гепатоцитов и численной плотности инфильтратов и гранулем мышей С57В1/6 при экспериментальном кандидозе (М±ш)

Параметры 10-й день 28-й день 56-й день

Интактные Кандидоз Амфотерицин Амфотер. + кандидоз Кандидо! Амфотерицин Амфотер + канлидо! Кандидоз Амфотерицин •Чмфотер. +кандидоз

Дистрофия. % 6,09+1,71 35.89+2.41* 49.44+1.54* а 35,39±2,09*Ь 41,39+1.63* 47,46±1,67* а 54,80+1,89*а 60,36+1,93* 32,21 + 1.62* а 42.59±2,05* а, Ь

Некроз, "к 1.1 ±0,02 27.54+1.13* 22.49+1,11* а 31,11+1,48*0, Ь 27,98±1,42* 27,71+1,53* 22.32±1,50* а,Ь 27,90±1,56*: а, Ь 18.98+1.18* а 28,45±1,75* Ь

Двухъядер-ные гепато-циты, N,1, 3,30±0,34 2,62±0,18* 3,1 ±0.20* 1,57+0,15* а, Ь 3,08±0.24 2,40±0,21 * 2,34+0,19* 2,20±0,19* 2,84±0,20 2,28±0,19*

Гранулемы, N0, - 0,22±0,05* - 0,17±0,04 0,28±0,05 - 0,30±0,05 0.12+0,03* - -

Примечание' * — обозначены достоверные отличия (р < 0,05) при сравнении с группой интактных животных, а — обозначены достоверные отличия (р < 0,05) в сравнении с группой инфицированных животных; Ь — обозначены достоверные различия (р < 0,05) в сравнении с группой животных, получавших амфотерицин В

Таблица 16

Клеточный состав инфильтратов и гранулем печени при экспериментальном кандидозе и его лечении амфотерицином В (М±ш)

Клеточный состав Периоды наблюдения

10 дней 28 дней 56 дней

Группа 1 Кандидоз

Эпителиоидные клетки, 23,93±4,01 33,90±4,64 33,88+2,17*

Макрофат и, °/< 59,37±3,99 50,69+4,18 47,81 ±2,24*

Нсйтрофилы, % 6,51± 1,63 4,35±1,77 3,63+0,91*

Эозинофи ]Ы, "/( 0,86±0,56 0,98+0,98 0,78±0,54

Лимфоциты, % 9,34±1,80 10,08±2,26 13,91+1,86*

Г руппа 2 К'аи.лмо! + амфотерицин В

ЭмИ1е.шоидные клетки, <7( 21,09+1,06 37,78±0,86* -

Макрофа! и, °/с 56,89+1,78 51,68+1,67 -

Нейфофилы, °/< 5,37±0,62 2,81 ±0,77* -

Эозинофилы, % 0,71 ±0,45* -

Лимфоциты, °/< 16,64+1,93 7,02+1,32* -

Примечание * — достоверные отличия в сравниваемых группах (р < 0,05)

При анализе клеточного содержания состава гранулем было установлено, что основную массу составляли макрофаги, количество которых не изменялось во все указанные периоды наблюдения На втором месте по представительству в гранулеме были эпителиоидные клетки с крупными ядрами с небольшим количеством компактного хроматина, располагавшиеся в центре гранулемы. Количество этих клеток характеризовалось тенденцией к увеличению на 28-е и 56-е сутки. Соотношение эпителиоидных клеток и макрофагов в гранулеме в каждые из исследованных периодов составляли величину близкую к 2.

При исследовании структурной организации кандидозной гранулемы было отмечено, что в центре их спонтанно возникали деструктивные процессы, механизм которых представляется неясным и по своему внешнему выражению не может быть квалифицирован как апоптоз, но при высокой плотности расположенных гранулем в определенных органах эти процессы, видимо, представляют большую опасность.

При изучении структуры организации печени у инфицированных С. albicans животных без лечения наблюдали дистрофические (вакуолярную и баллонную дистрофию) изменения в гепатоцитах, которые нарастали по мере увеличении сроков наблюдения, и на 56-й день этот процесс охватывал 60 % паренхиматозных клеток, т. е. дистрофические процессы в гепатоцитах поддерживались гораздо дольше, чем изменялось количество гранулем в печени, что могло указывать на тяжелый характер токсических повреждений клеток, 50 fc которых составляли клетки в состоянии баллонной дистрофии, о чем свидетельствовали данные по количеству клеток в состоянии некробиоза. Изучение степени выраженности некробиотических процессов в паренхиме печени выявило, что этот процесс охватывал 27 % гепатоцитов, и величина этого параметра не изменялась по мере увеличения периода наблюдения.

Динамика количества двуядерных гепатоцитов свидетельствовала о волнообразном характере репаративньгх процессов и в целом об их подавлении. Сопоставление масштабов деструктивных процессов и активности репаративньгх процессов свидетельствует о том, что они явно были недостаточны для компенсации утраченных клеток (некроз) и компенсации функции гепатоцитов в состоянии вакуолярной и баллонной дистрофии. Эти результаты предполагают, что инфицирование С. albicans в условиях данного эксперимента приводило к подавлению пролиферативных процессов, механизм которого пока неясен.

Лечение амфотерицином В инфицированных животных в дозах 0,2х 107мл указывает на его высокую эффективность, так как на 56-е сутки у леченых животных не наблюдали гранулем, но и на его высокую гепатотоксичность, проявлявшуюся дистрофическими (вакуолярная и баллонная дистрофия) и некробиотическими повреждениями. Лечение неинфицированных животных амфотеринином В было сопряжено с поражением вышеуказанными процессами от 70 до 90 % гепатоцитов Лечение же этим препаратом животных, инфицированных С. albicans, не приводило к существенному увеличению масштабов повреждения гепатоцитов по сравнению с неинфицированными животными, а на 28-е сутки наблюдений было даже меньшим, чем у неинфицированных животных. Лечение амфотерицином В животных, инфицированных С. albicans, не давало очевидных позитивных эффектов на 10-28-е сутки и было успешным в промежутке от 28 до 56 дня наблюдения, о чем свидетельствовало полное исчезновение гранулем. Эти данные предполагают, что лечение по используемым схемам не должно завершаться ранее 30-45 дня и должно ориентироваться на другие показатели инфекционного процесса. Примечательно, что амфотерицин В снижает масштабы деструктивных процессов внутри гранулем, что указывает на причастность к деструкции гранулем самих С. albicans.

Выводы

1 Структура неонатальных инфекций представлена инфекциями вирусной, бактериальной, кандидозной этиологии, а также полимикробными инфекциями, которые сопровождаются повышением риска летального исхода по сравнению с моноинфекциями, при этом их развитие на фоне исходного инфицирования возбудителями ВУИ сопряжено с наиболее значимым ростом риска смерти.

2. К дифференциально-диагностическим клинико-иммунологическим критериям генерализованных инфекций новорожденных относятся степень выраженности инфекционного токсикоза, показатели гемограммы, уровень ферментемии, степень функциональной активности лимфоцитов и иммуносупрессорной активности сыворотки крови.

3. Критериями тяжести состояния и прогноза инфекций у новорожденных являются нарастание токсикоза и полиорганных дисфункций, сопровождающиеся отечным и геморрагическим синдромами. Иммунологическими критериями высокого риска летального исхода являются степень снижения показателя стимулированной КонА пролиферативной активности лимфоцитов

и содержания НЬА-В1?+ активированных моноцитов при высокой супрессорной активности сыворотки.

4. Развитие генерализованных инфекций новорожденных сопровождается иммунной недостаточностью в виде подавления пролиферативной активности Т-лимфоцитов, повышенного апоптоза лимфоцитов и моноцитов крови, смещением цитокинового баланса в сторону системных противовоспалительных /иммуносупрессорных реакций. Характер и степень нарушений в иммунном статусе зависят от этиологии инфекции.

5. У больных полимикробными инфекциями нарастание иммуно-супрессорной активности сыворотки влияет на содержание в крови моноцитов, экспрессирующих антигены 2-го класса гистосовместимости, с нарушением ко-стимуляторной функциональной активности лимфоцитов. Генерализованные кандидозные и кандида-ассоциированные инфекции сопровождает максимальное угнетение пролиферативной способности лимфоциюв. ТСЖСН и ТСШСН-ассоциированные инфекции характеризует максимальная выраженность иммуносупрессорного потенциала сывороточных факторов

6. Патоморфологические изменения в печени при генерализованных инфекциях проявляются масштабными некротическими и дистрофическими изменениями при низком уровне репаративной регенерации Ассоциация ТСЖСН-инфекций с бактериальной или бактериально-грибковой флорой сопровождается уменьшением степени деструкции гепатоцитов и подавлением их ферментативной активности. Генерализованные бактериальные инфекции характеризуются прямой зависимостью между морфологическими изменениями в печени, биохимическими маркерами поражения гепатоцитов, клиническими симптомами и иммунологическими нарушениями. Полимикробным инфекциям свойственно отсутствие соответствия между степенью выраженности клинических проявлений, синдрома цитолиза и морфологическими изменениями в печени.

7. Соотношение между некрозом и апоптозом гепатоцитов детерминированы этиологией инфекций При бактериальных инфекциях интенсивная альтерация паренхимы печени, максимальные некрозы паренхимы и низкий уровень репаративной регенерации сочетаются с уменьшением апоптоза и стимуляцией клеточной пролиферации. При ТОКСН-ассоциированных инфекциях уменьшение деструктивных и воспалительных изменений в печени сочетается с индукцией проапоптотических белков, низкой активностью пролиферативного антигена К167 и сниженной ра енераторной способностью гепатоцитов. При кандида-ассоциированных инфекциях деструктивные изменения в паренхиме печени сочетаются с повышенной экспрессией антиапоптотического маркера Вс12 и самым низким уровнем эспрессии маркера пролиферативной активности Ю67.

8. Закономерности экспрессии маркеров апоптоза в других органах новорожденных на фоне генерализованных инфекций сопоставимы с выявленными механизмами апоптоза в печени и определяются этиологией заболевания.

9. Выраженность гранулемообразования, масштаб некротических, дистрофических и репаративных процессов в печени на фоне экспериментального кандидоза у мышей зависит от длительности развития

висцерального кандидоза и может проявляться циклическим развитием с уменьшением количества гранулем Инфицирование С albicans в условиях эксперимента сопряжено с выраженным подавлением репаративных процессов в печени и деструктивными изменения внутри гранулем.

10. Лечение амфотерицином В на фоне инвазивного микоза сопряжено с выраженной гепатотоксичностью, проявляющейся дистрофическими и деструктивными процессами в гепатоцитах, интенсивность которых выше при использовании АмВ у нсинфицированных животных; деструктивные процессы в гранулемах, гранулемообразование и «диссоциация» микотических гранулем носят волнообразный характер.

Практические рекомендации

1. Для изучения истинной этиологической структуры инфекционной заболеваемости и причин летальности новорожденных необходимо широкое и систематическое применение молекулярно-биологических методов диагностики у детей групп риска при жизни и в секционном материале.

2. Следует учитывать, что характерные маркерные признаки SIRS-реакции являются типичными проявлениями бактериальных инфекций новорожденных и не свойственны генерализованным инфекциям другой этиологии. Критериями тяжести генерализованных инфекций являются нарастание токсикоза и полиорганные дисфункции, сопровождающиеся отечным и геморрагическим синдромами при бактериальных инфекциях, геморрагическим синдромом и синдромом угнетения при TORCH-ассоциированных инфекциях, прогрессирующей гепатоспленомегалией и геморрагическим синдромом при кандида-ассоциированых инфекциях, а также степень подавления пролиферативной КонА-стимулированной активности лимфоцитов и снижения содержания DR-активированных моноцитов при высокой иммуносупрессорной активности сыворотки (CARS-синдром).

3. Клинические проявления поражения печени зависимы от этиологии инфекции, характера и выраженности иммунной недостаточности. Заключения о степени поражения печени, исходя из результатов клинико-лабораторного обследования, можно делать только при условии достоверной расшифровки этиологии генерализованной инфекции и установления вариантов ассоциаций различной флоры у конкретного больного.

4. Выявленные закономерности в иммунном статусе, про- и антивоспалительном ответе у новорожденных с генерализованными моно- и полимикробными инфекциями могут представлять собою очередное патогенетическое звено, коррекция нарушений которого должна учитываться при выборе терапевтической тактики, а также в оценке тяжести и прогноза.

5. Следует учитывать, что гепатотоксичность амфотерицина В может оказаться существенно выше при использовании у неинфицированных пациентов, что предполагает высокую ответственность при назначении эмпирической терапии микозов в отсутствии расшифровки этиологического диагноза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Извекова И. Я., Спиридонова Э. А., ФефиловаН. П. Диагностика кандидозных менингитов у детей раннего возраста // Педиатрия. — 1994. — №6, — С. 61-63.

2. Извекова И. Я. Трудности лечения — в поздней диагностике // Медицинский курьер. — 1998. — № 2. — С. 42-43.

3. Извекова И. Я., Курнаева А. Н., Зобина Н. Б., Никифорова Н. А. Эффективность дифлкжана в лечении менигоэнцефалита кандидозной этиологии у детей раннего возраста // Актуальные вопросы современной медицины: тез. докл. 4-й науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 1994. — С. 305-306.

4. Извекова И. Я., Курнаева А. Н. Особенности кандидозного менингоэнцефалита у детей грудного возраста // Тез. докл. 54-й итоговой науч. конф. студентов и молодых ученых. — Новосибирск, 1993. — С. 75.

5. Извекова И. Я., Спиридонова Э. А., Никифорова Н. А., Волков И. В., Синещекова Ю. В. Анализ особенностей бактериально-грибкового сепсиса у детей // Актуальные вопросы современной медицины: тез. докл. науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 1998. — С. 425.

6. Извекова И. Я., Волков И. В., Аргунова Л. А., Дегтярева В. А. Исходы кандидозного менингоэнцефалита у детей раннего возраста // Актуальные вопросы современной медицины: тез. докл. науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 1997. — С. 392 — 393.

7. Извекова И. Я., Никифорова Н. А. Проблемы кандидозной инфекции у детей г. Новосибирска // Актуальные вопросы современной медицины: тез. докл. науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 1997. — С. 398-399.

8. Извекова И. Я., Береснева О. Л., Фишер Е. Л. Возможности нейросоно-графии при перинатальной патологии новорожденных // Новые методы лечения и профилактики инфекционных заболеваний: тез. докл. науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 2000. — С. 14.

9. Извекова И. Я., Изучение механизмов воспаления при сочетанных бактериально-грибковых инфекциях у детей раннего возраста // Новые методы лечения и профилактики инфекционных заболеваний.: тез. докл. науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 2000. — С. 52.

10. Сафонова С. О., Извекова И. Я. Инфекции в отделении реанимации и интенсивной терапии // Новые методы лечения и профилактики инфекционных заболеваний: тез. докл. науч.-практ. конф. врачей — Новосибирск, 2000. — С. 109.

11. Извекова И. Я., Волков И. В. Использование гранулоцитарного колоние-стимулирующего фактора в лечении генерализованных бактериальных инфекций у детей // Актуальные вопросы современной медицины: тез. докл. науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 1998. — С. 19

12. Извекова И. Я. Нозокомиальные кандидозные инфекции у детей // Консилиум. — 2000. — № 2 (12). — С. 25-31.

13. Извекова И. Я., Курнаева А. Н. Дифференциальный диагноз кандидозного и бактериального менингоэнцефалитов у детей // Актуальные вопросы

современной медицины: тез. докл. науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск,

1997. —С. 398-399.

14. Крапива Л. А., Курнаева А. Н., Извекова И. Я. Нозокомиальный сепсис у детей раннего возраста // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: II науч. конф. с междунар. участием. — Новосибирск, 2002. — С. 245.

15. Извекова И. Я., Пирожкова Н. И., Спиридонова Э. А., Волков И. В. Использование гранулоцитарного колоние-стимулирующего фактора в лечении генерализованных инфекций у детей раннего возраста // I Всероссийский съезд врачей-инфекционистов. — М., 1998. — С. 205.

16. Никерова Т. В., Извекова И. Я., Никифорова Н. А. Особенности клиники, диагностики и лечения неонатальной герпетической инфекции // Актуальные вопросы современной медицины: тез. докл. 11-й науч.-практ. конф. врачей. — Новосибирск, 2001. — С. 191.

17. Малков Е. М., Помогаева А. П., Кравец Е. Б., Извекова И. Я. Гриша-ева О. Н., Тюнников Г. И., Ишалина Н. Ю., Петрова И. Д., Смердова М. А., Петров В. С Внутриутробные инфекции у новорожденных- использование генодиагностики, клинические особенности и подходы к лечению // Педиатрия. — 2002. — № 1. — С. 36-40.

18. МалковаЕ. М., Терещенко И. П., Гришаева О. Н., Извекова И. Я. Тюнников Г И., Петрова И Д., Петров В. С., Гришаева М. П., Краснова Е. И. Изучение роли вируса краснухи в формировании врожденных пороков развития методом РТ-ПЦР // Детские инфекции. — 2004. — № 3. — С. 5-8.

19. Извекова И. Я. Иммунометаболические нарушения при инвазивных микотических инфекциях у детей раннего возраста // Фундаментальные и клинические аспекты хронического воспаления: тез. докл. II Всероссийского симпозиума «Хроническое воспаление», посвященного памяти заслуженного деятеля науки РФ, профессора Д. Н. Маянского. — Новосибирск, 2000. — С. 74.

20. Извекова И. Я., Надеева А. П., Шкурупий В. А. Клинико-морфологические особенности поражения печени у детей при генерализованных кандида-ассоциированных полимикробных инфекциях перинатального периода // Проблемы медицинской микологии. — 2005. — Т. 7, № 1. — С. 22-27.

21. Извекова И. Я., Черных Е. Р., Останин А. А., Краснова Е. И. Системная воспалительная реакция при полимикробных инфекциях новорожденных // Журнал экспериментальной и клинической медицины. — 2004. — № 3. — С. 89-92.

22. Извекова И. Я., Черных Е. Р., Останин А. А., Леплина О. Ю. Иммунологические нарушения при генерализованных инфекциях у новорожденных детей // Всероссийская науч.-практ. конференция «Инфекционные заболевания у детей: проблемы, поиски, решения». — СПб., 2004. — С. 60.

23. Надеев А. П., Шкурупий В. А., Извекова И. Я. Травин М. А., Сыпко М. А. Генетическая детерминация особенностей кандидозного воспаления в эксперименте // Проблемы медицинской микологии. — 2004. — Т. 6, № 2. — С. 102.

24. Извекова И Я , Иванов Г. Я., Черных Е. Р Некоторые особенности течения моно- и полимикробных инфекций у новорожденных детей // Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний : международная конференция. — Новосибирск, 2004. — С. 58.

25. Надеев А. П., Шкурупий В. А., Травин М. А., Извекова И. Я., Овсянко Е. В Приставко А. А. Эффект лизосомотропной формы амфотерицина В при лечении висцерального кандидоза в эксперименте // Проблемы медицинской микологии. — 2005. — Т. 7, № 2. — С. 112.

26. Извекова И. Я. Диагностика и лечение кандидозных менингитов у детей раннего возраста // Юбилейная науч.-практ. конф., посвященная 90-летию МДИКБ № 1. — Новосибирск, 1994. — С. 66.

27. Извекова И. Я., Черных Е. Р., Краснова Е. И. Системная воспалительная реакция при генерализованных инфекциях у детей первых трех месяцев жизни // Медицина и образование в XXI веке: ежегодная науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвященная 70-летию НГМА. — Новосибирск, 2004, — С. 141-144.

28. Извекова И. Я., Иванов Г. Я., Никифорова Н. А. Некоторые клинико-этиологические закономерности течения генерлизованных инфекций у новорожденных // Инфекционные заболевания на современном этапе: достижения, проблемы, перспективы: юбилейная науч.-практ. конф. врачей, посвященная 100-летию МКИБ № 1. — Новосибирск, 2004. — С. 118-119.

29. Извекова И. Я., Черных Е. Р., Останиным А. А., Краснова Е. И. Некоторые особенности про- и антивоспалительного ответа у новорожденных с системными моно- и полимикробными инфекциями // Компенсаторно-приспособительные процессы фундаментальные, экологические и клинические аспекты: мат. Всероссийской конф. — Новосибирск, 2004. — С. 29-30.

30. Извекова И. Я., Надеев А. П., Шкурупий В. А. Особенности компенсаторных процессов в печени умерших новорожденных при перинатальной микст-инфекции // Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты: мат. Всероссийской конф. — Новосибирск, 2004. — С. 53-54.

31. Надеев А. П., Шкурупий В. А., Травин М. А., Извекова И. Я., Курилин В. В. Компенсаторные реакции в печени при воздействии амфотерицина В и его пролонгированной формы // Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные, экологические и клинические аспекты: мат. Всероссийской конф. — Новосибирск, 2004. — С. 53-54.

32. Надеев А. П., Шкурупий В. А., Травин М. А., Извекова И. Я., Овсянко Е. В., ЛузгинаН. Г. Динамика клеточных преобразований в кандидозных гранулемах лимфатических узлов при лечении лизосомотропной формой амфотерицина В в эксперименте // Морфология. — 2005. — Т. 128, № 4. — С. 73-76.

33. Извекова И. Я., Корасакова Т. Г., Сафонова С. О. Некоторые клинико-морфологические закономерности поражения печени при генерализованных кандида-ассоциированных перинатальных инфекциях у детей // Человек и лекарство: матер, конгресса. — М., 2005. — С. 681.

34. Извекова И. Я., Надеев А. П., Иванов Г. Я., Гришаева О. Н., Никифорова Н. А. Морфологическая картина поражения печени при

генерализованных полимикробных инфекциях перинатального периода // ИТ Конгресс педиатров-инфекционистов России. — М., 2004.— С. 86.

35. Гришаева О. Н., Малкова Е. М., Терещенко И. П., Петрова И. Д., Извекова И. Я., Петров В. С., Мычка Н. В., Липатникова С. В., Тюнников Г. И. Влияние вируса краснухи на возниконовение врожденных пороков развития // VI Российский съезд врачей-инфекционистов. — СПб., 2003. — С. 229.

36. Малкова Е. М., Гришаева О. Н., Терещенко И. П., Петрова И. Д., Извекова И. Я., Петров В. С., Мычка И. В., Корабельщиков Г. Д., Шелковников Д. С., Ишалина Н. Ю., Булышевой И. В., Тюнников Г. И. Изучение роли краснухи при врожденных пороках развития // Актуальные вопросы современной медицины. — Новосибирск, 2003. — С. 83-84.

Список терминологических сокращений

AJTT — аланиновая аминотрансфераза

ACT — аспарагиновая аминотрансфераза

ВЖК — внутрижелудочковое кровоизлияние

ВУИ — внутриутробные инфекции

ГИ — генерализованные инфекции

ИРИ — иммунорегуляторный индекс

ИФА — иммуноферментный анализ

МНК — мононуклеарные клетки

ПЦР — полимеразная цепная реакция

СДР — синдром дыхательных расстройств

СМЖ — цереброспинальная жидкость

СГТОН — синдром полиорганной недостаточности

ЦМВ — цитомегаловирус

ЦНС — центральная нервная система

CARS — синдром системной противовоспалительной реакции

CoNS — коагулазонегативный стафилококк

HSV — вирус герпеса

Ig — иммуноглобулин

GSB — стрептококк группы В

MARS — синдром системной антагонистической (смешанной) реакции

PAN — показатель активации нейтрофилов

SIRS — синдром системной провоспалительной реакции

TORCH — аббревиатура, использованная для сокращенного названия исследованных этиологических факторов ВУИ

Подписано в печать 17.11 05 г. Формат 60x84/16 Усл. печ л 2,0. Тираж 100 экз. Изд. № 146п/05. Заказ № 170п

Ориг инал-макет изготовлен издательством «Сибмедиздат» НГМА i. Новосибирск, ул. Залесского, 4 Тел.: (383) 225-24-29. E-mail, sibmedisdat@rambler.ru

Отпечатано в типографии НГМА г Новосибирск, ул Залесского, 4. Тел.: (383) 225-24-29

;

РПЬ Русский фонд

2006-4 27491