Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Клиническая и молекулярно-генетическая характеристика опухолей полости рта

На правах рукописи

БУДОВСКИЙ Александр Иванович

КЛИНИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОПУХОЛЕЙ ПОЛОСТИ РТА

14.01.12 - онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 кон т

005569749

Санкт-Петербург 2015

005569749

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, профессор Евгений Наумович Имянитов

федеральное государственное бюджетное учреждения «Научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова», руководитель лаборатории молекулярной онкологии федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Официальные оппоненты:

- заслуженный деятель наук РФ, доктор медицинских наук, профессор Михаил Михайлович Соловьев, профессор кафедры хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова;

- доктор медицинских наук, Орлов Сергей Владимирович, директор НИИ Медицинской приматологии РАМН.

Ведущая организация: ФГБНУ «Томский научно-исследовательский институт онкологии» г. Томск.

Защита диссертации состоится «23» июня 2015г. в 14-00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.05.01 при федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии им. H.H. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул. Ленинградская, д.68)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт онкологии им. H.H. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (197758, Санкт-Петербург, Песочный, ул. Ленинградская, д.68) и на сайте института: www.niioncoIogii.ni/ni/node/284

Автореферат разослан «22» мая 2015 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Бахидзе Елена Вилльевна

Актуальность исследования. Опухоли полости рта и глотки, составляющие большинство в группе опухолей головы и шеи, имеют различное происхождение. Плоскоклеточные карциномы слизистой полости рта и глотки диагностируются в 90% случаев, намного реже встречаются различные типы сарком, лимфомы, меланомы слизистых оболочек, доброкачественные опухоли.

Плоскоклеточный рак полости рта и глотки занимает шестое место по количеству ежегодно диагностируемых случаев в мире [Warnakulasuriya 2009]. Ежегодно в Российской Федерации рак полости рта и глотки выявляется у 80 тысяч больных, и в 70% случаев - на поздних стадиях заболевания. Одновременно наблюдается увеличение заболеваемости среди женщин и омоложение данного вида злокачественных опухолей, сохраняется высокий уровень смертности. Кроме того, лечение таких опухолей зачастую связано с целым комплексом осложнений: инвалидизацией, нарушением физиологических функций, тяжелыми косметическим потерями, возникновением психоэмоциональных травм [Guneri et al., 2014].

Развитие опухолей всегда сочетается с генетическими нарушениями. Опухоли полости рта и глотки не составляют исключения. В клетках этого типа опухолей детектируют мутации и нарушения экспрессии генов, связанных с поддержанием и регуляцией клеточного цикла (р53, INK4A, WAF1/CIP1, CCND1, BCL-2) [Hillbertz et al., 2012]. Несмотря на достаточное количество генетических нарушений, обнаруженных в опухолях полости рта и глотки, в этой группе новообразований не выделено молекулярных подтипов [Na et al., 2007; Szyraanka et al., 2010; Stransky et al., 2011]. Помимо этого, опубликованные молекулярно-генетические исследования пока не уделяли достаточного внимания предиктивным маркерам опухолей головы и шеи - мутационным и экспрессионным характеристикам, ассоциированным со специфическим спектром лекарственной чувствительности опухолевых клеток.

В современной онкологии выбор эффективной терапии неразрывно связан с пониманием молекулярно-генетических особенностей конкретной опухоли. Так, например, исследование мутационного статуса гена EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor, рецептор эпидермального фактора роста) за последние несколько лет стало рутинным для пациентов с диагнозом рака легкого. Белок, кодируемый геном EGFR, относится к группе трансмембранных рецепторных тирозинкиназ и в норме отвечает за передачу пролиферативного сигнала внутрь клетки. Наличие определенного типа соматических мутаций EGFR связано с высокой чувствительностью опухоли к ингибиторам тирозинкиназ (гефитиниб, эрлотиниб и т.д.). Существуют отдельные свидетельства встречаемости мутаций EGFR в опухолях полости рта и глотки [Na et al., 2007; Szymankaet et al., 2010; Bahassi et al., 2013]. Подтверждение этих данных может представлять большой интерес с точки зрения появления новых перспектив лекарственной терапии данной разновидности опухолей.

Относительно новым в клинической практике является выявление транслокаций EML4/ALK, которые встречаются в 3-5% опухолей легкого [Kohno et al., 2013]. В случаях транслокацией ALK. показал свою эффективность специфический ингибитор активированной тирозинкиназы - кризотиниб [Shaw et al., 2013]. Данные о спектре этих

мутаций при опухолях полости рта отсутствуют, что связано с большой трудоёмкостью и высокой стоимостью стандартных методов выявления транслокаций. В то же время появление новых методов молекулярного анализа, позволяющих выявлять перестройки тирозинкиназ посредством теста на несбалансированную экспрессию концевых последовательностей соответствующих транскриптов, открывает возможности для систематического скрининга химерных генов [Wang et al., 2012].

В настоящее время появились возможности лекарственного контроля активации другой формы тирозинкиназы - RET [Kohno et al., 2013]. Активация RET является характерным событием для опухолей щитовидной железы и лёгкого, однако, в связи с упомянутыми выше техническими сложностями, систематического анализа статуса данного онкогена в опухолях головы и шеи также не проводилось.

Помимо проблемы поиска новых маркеров ответа на таргетную терапию остаётся актуальным поиск алгоритмов, позволяющих индивидуализировать применение обычных, цитостатических препаратов. Например, одной из стандартных схем в лечении опухолей полости рта и глотки является комбинация хирургического вмешательства с лучевой терапией и применением цисплатина [Bernier et al., 2004]. Существует целый ряд исследований, демонстрирующих ассоциацию между низкой экспрессией гена BRCA1 и повышенной чувствительностью карцином к платиносодержащим схемам [Imyanitov and Moiseyenko, 2011]. Подобные данные получены для опухолей молочной железы, лёгкого, желудка, однако опухоли головы и шеи в данном отношении практически не изучались.

Таким образом, в данном исследовании основное внимание было обращено на изучение молекулярно-генетических свойств опухолей полости рта, что необходимо для обоснованного назначения химиотерапевтических препаратов таргетной терапии, а также на выяснение возможной взаимосвязи между особенностями клинической картины рака полости рта и его антигенной экспрессией.

Целью исследования явилось изучение потенциально предиктивных молекулярно-генетических характеристик опухолей полости рта и глотки, а также выявление причин несвоевременной диагностики данной категории новообразований.

Задачи исследования

1. Определить наличие мутаций EGFR, ЕМЬ4/АЬК и 11ЕТ у пациентов с доброкачественными и злокачественными заболеваниями полости рта.

2. Проанализировать уровень экспрессии гена BRCA1 у больных с опухолями полости рта и слюнных желёз.

3. Выявить взаимосвязь между особенностями клинического течения заболевания и молекулярно-генетическими характеристиками опухоли.

4. Проанализировать возможные причины несвоевременной диагностики опухолей полости рта.

Научная новизна

В настоящей работе проанализирован статус генов EGFR, RET, ALK и BRCA1 у больных с опухолями полости рта.

Выявлен случай нетипичной мутации киназного домена EGFR.

Продемонстрированы признаки транслокаций онкогена RET в злокачественных опухолях слюнных желёз.

Продемонстрирована низкая осведомлённость врачей-стоматологов в отношении ранней диагностики опухолей головы и шеи.

Практическая значимость диссертации

Результаты работы свидетельствуют о потенциальной перспективности клинических испытаний специфических ингибиторов тирозинкиназы RET в отношении RET-ассоциированных карцином слюнных желёз.

В процессе обучения врачей-стоматологов необходимо уделять больше внимания различным аспектам ранней диагностики опухолей головы и шеи.

Апробация работы. Материалы диссертации обсуждены на открытом семинаре лаборатории молекулярной онкологии федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации 1 октября 2014 г.

Публикации. По материалам диссертационного исследования опубликовано 4 статьи в научных журналах.

Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных данных и выводов.

Текст иллюстрирован 40 таблицами, 18 рисунками. Список литературы включает 230 источников, из которых 51 принадлежит отечественным авторам и 179 иностранным.

Положения, выносимые на защиту

1. Мутации в гене EGFR в виде делеций в экзоне 19 и нуклеотидных замен в экзоне 21 не характерны для карцином головы и шеи. Выявлен 1 случай с мутацией p.A702S (c.2104G>T) в экзоне 18 гена EGFR; данная мутация находится в непосредственной близости от мутаций, ассоциированных с ответом на тирозинкиназные ингибиторы EGFR.

2. Отдельные случаи карцином слюнных желёз имеют признаки активации онкогена RET, что создаёт перспективы для изучения возможности терапевтического применения ингибиторов RET- тирозинкиназы.

3. Транслокации гена ALK не являются характерными для опухолей полости рта. Следовательно, применение ингибиторов тирозинкиназы ALK не может рассматриваться в качестве перспективного подхода к лечению новообразований этой локализацией.

4. Значительное изменение уровня экспрессии BRCA1 не характерно для больных с доброкачественными опухолями полости рта и слюнных желёз. Экспрессия BRCA1 у больных со злокачественными опухолями полости рта и слюнных желёз также сохраняется в диапазоне нормальных значений.

5. Несвоевременная диагностика опухолей полости рта по крайней мере отчасти объясняется недостаточной онкологической настороженностью врачей-стоматологов.

Содержание работы

Объект и методики исследования.

Детальному анализу было подвергнуто 110 историй болезни пациентов, проходивших лечение в федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт онкологии имени H.H. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации в период с 2007 по 2012 год по поводу опухолевого процесса в полости рта.

Патоморфологическое исследование опухолевого материала в стандартном объеме было выполнено у всех 110 пациентов. Молекулярно-генетические исследования были выполнены тем пациентам (п = 57), опухолевый материал которых был сохранен в достаточном количестве и был пригоден для проведения молекулярно-генетических исследований на предмет наличия мутаций рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), транслокаций гена ALK, экспрессии гена RET, а также оценки экспрессии BRCA1 (таблица 1).

Выделение нуклеиновых кислот. Под контролем световой микроскопии была проведена микродиссекция парафиновых блоков с целью обогащения образцов опухолевыми клетками. Выделение ДНК и РНК проводили с помощью оптимизированного экспресс-протокола на основе метода фенол-хлороформной экстракции [Imyanitov et al., 2001]. На матрице РНК с помощью обратной транскриптазы M-Mulv («СибЭнзим») получали кДНК.

Таблица 1.

Объем патоморфологических и молекулярно-генетических исследований по разным нозологическим формам заболеваний.

№ пп Заболевания Число имеющихся патоморфологичес ких заключений Число молекулярно- генетических исследований

1 Доброкачественные новообразования слюнных желёз. 36 13

2 Плоскоклеточный рак слизистой оболочки полости рта. 42 28

3 Злокачественные опухоли слюнных желез 44 16

4 Итого 110 57

Молекулярно-генетический анализ. Наличие частых мутаций в гене EGFR проводили с помощью аллель-специфической ПЦР (мутация L858R) и анализа длин ПЦР-фрагментов в 10% полиакриламидном геле (микроделеции в 19 экзоне). Праймеры для анализа частых мутаций EGFR представлены в таблице 2. Для исследования полной кодирующей последовательности киназного домена гена EGFR использовался метод анализа кривых плавления с высоким разрешением (High Resolution Melting Analysis, HRMA); ПЦР-амплификацию выполняли для 23 частично перекрывающихся фрагментов гена EGFR, соответствующих экзонам 18-24. Фрагменты с аномальными кривыми плавления подвергались секвенированию по Сэнгеру. Специфические праймеры для амплификации киназного домена EGFR представлены в таблице 3.

Кроме того, нами был проведен анализ наличия несбалансированной экспрессии 5' и 3' фрагментов мРНК EGFR. Это тестирование основано на сравнении уровней экспрессии экзопов 5-7 и экзонов 21-23 гена (праймеры представлены в таблице 4).

Таблица 2.

Праймеры для детекции частых мутаций гена EGFR.

Мутация Праймер 5'-3' последовательность Длина амплифицируемого фрагмента

Делецин в 19 экзоне HGFR прямой CTGTCATAGGGACTCTGGAT wt: 127 п.о. mut: размер фрагмента зависит от типа делеции

обратный CAGCAAAGCAGAAACTCACAT

EGFR L858R wt CACCCAGCAGTTTGGCCA 120 п.о.

mut CACCCAGCAGTTTGGCCC

общий GCATGAACTACTTGGAGGAC

Таблица 3.

Специфические праймеры для амплификации киназного домена EGFR.

Праймер 5-3 последовательность Длина амплифицируемого фрагмента

EGFR-EX18F1 CATGGTGAGGGCTGAGGTG 191 п.о.

EGFR-EX18R1 CTGTGCCAGGGACCTTACC

EGFR-EX18F1 CATGGTGAGGGCTGAGGTG 152 п.о.

EGFR-Exl8Rl-2 ACCGGAGCCCAGCACTTTG

EGFR-Exl8F2 TGAGGATCTTGAAGGAAACTG 155 п.о.

EGFR-Exl8R2 AGCTTGCAAGGACTCTGGG

EGFR-Exl8Fl CATGGTGAGGGCTGAGGTG 254 п.о.

EGFR-Exl8R2 AGCTTGCAAGGACTCTGGG

EGFR-Exl9Fl GTGCATCGCTGGTAACATCC 150 п.о.

EGFR-Exl9Rl AATTCCTTGATAGCGACGGG

EGFR-Exl9F2 GATCCCAGAAGGTGAGAAAG 158 п.о.

EGFR-Exl9R2 AGACATGAGAAAAGGTGGGC

EGFR-Exl9Fl GTGCATCGCTGGTAACATCC 260 п.о.

EGFR-Exl9R2 AGACATGAGAAAAGGTGGGC

EGFR-Ex20Fl ACCATGCGAAGCCACACTG 118 n.o.

EGFR-Ex20Rl-l TGCACGGTGGAGGTGAGG

EGFR-Ex20Fl ACCATGCGAAGCCACACTG 205 n.o.

EGFR-Ex20Rl-2 TTGAGCAGGTACTGGGAGC

EGFR-Ex20Fl ACCATGCGAAGCCACACTG 157 n.o.

EGFR-Ex20Rl-3 TCCAGGAGGCAGCCGAAG

EGFR-Ex20F2 TCTGCCTCACCTCCACCG 155 n.o.

EGFR-Ex20R2 CCCGTATCTCCCTTCCCTGA

EGFR-Ex21F CTCACAGCAGGGTCTTCTC 206 n.o.

EGFR-Ex21R CTGACCTAAAGCCACCTC

EGFR-Ex21Fl ATGACCCTGAATTCGGATGC 165 n.o.

EGFR-Ex21Rl TGATCTTGACATGCTGCGG

EGFR-Ex21F2 AGGAACGTACTGGTGAAAAC 181 n.o.

EGFR-Ex21R2 CTTCCCACTAGCTGTATTGT

EGFR-Ex21F2 AGGAACGTACTGGTGAAAAC 128 n.o.

EGFR-Ex21R2-l CTGACCTAAAGCCACCTCC

EGFR-Ex21F3 GCATGAACTACTTGGAGGAC 180 n.o.

EGFR-Ex21R3 GGCTGACCTAAAGCCAC

EGFR-Ex22F ACTAATAGTTGTCTCACTGCC 150 n.o.

EGFR-Ex22R TACAAACTCATTAGCATCAGG

EGFR-Ex23F AGCTAGGCAGTGTGGACAG 204 n.o.

EGFR-Ex23R TTTCTTGCTTCATCCTCTCAG

EGFR-Ex23R TTTCTTGCTTCATCCTCTCAG 145 n.o.

EGFR-Ex23Rl TCGATGGTACATATGGGTGG

EGFR-Ex23F AGCTAGGCAGTGTGGACAG 138 n.o.

EGFR-Ex23Fl ACGGAATCCCTGCCAGCG

EGFR-Ex24F TTTCTTCCAGTGTTCTAATTGC 177 n.o.

EGFR-Ex24R TCCCAATGGAAGCACAGAC

EGFR-Ex24F TTTCTTCCAGTGTTCTAATTGC 143 n.o.

EGFR-Ex24Rl AATGACAAGGTAGCGCTGG

ЕСЕЯ-Ех24Р2 ТСССССАААСТТССОТОАС 107 п.о.

ЕОЕЯ-Ех24Я ТСССААТСОААССАСАСАС

Таблица 4.

Праймеры для оценки уровней экспрессии 5' и 3' фрагментов гена ЕСт.

Ген Праймер 5'-3' последовательность Размер фрагмента

БОНА Прямой ССАСТСССТАТГССАСАСС 102 п.о.

Обратный САСТСССССГТСТССАТСА

Зонд НЕХ-АССОТСТСТСССАТАТСАТАССА-ВНд

ЕвЕЯ ех5- 7(5'- порция) Прямой СААСГОССАОАААСТСАССА 138 п.о.

Обратный САСАССАСССАСТСССТС

Зонд РАМ-СААСТСССССАСТОАСТССТСС-ВНС?1

ЕвЕЯ ех21-23 (У- порция) Прямой АТССАОААССАСССАААСТС 117 п.о.

Обратный ТСАТСААСТСССАААСАОТС

Зонд ЕАМ-САТСАСТСГСОТССОТАТАОАТТС-ВНС! 1

Анализ уровня экспрессии мРНК ВЯСА1 проводили методом ПЦР в режиме реального времени: амплифицировались участки гена-мишени (ВЯСА1) и референсного гена (ЗОНА) в присутствии TaqMan-зoндoв. Последовательности праймеров и зондов для измерения уровня экспрессии ВЯСА1 представлены в таблице 5.

Таблица 5.

Последовательности праймеров и зондов для измерения уровня экспрессии ВЯСА1.

Ген Праймер 5'-3' последовательность Длина амплифицируемого фрагмента

ЭЭНА Прямой ССАСТСОСТАТТОСАСАСС 102 п.о.

Обратный САСТСССССТТСТССАТСА

Зонд НЕХ-АСССТСТСГССОАТАТОАТАССА-ВНд

BRCA1 Прямой GGCTATCCTCTCAGAGTGACATTTTA 69 п.о.

Обратный GCTTTATCAGGTTATGTTGCATGGT

Зонд FAM-CATGGTATCCCTCTGCTGAGTGGTT-BHQ

Поиск транслокаций гена ALK проводился как с помощью экспрессионного метода (оценка соотношения экспрессии 5'(экзон 5-7) и 3' (экзон 21-23) фрагментов гена), так и путем ПЦР-амплификации 5 наиболее частых типов транслокаций (EML4exl3/ALKex20, V.l; EML4ex20/ALKex20, V.2; EML4ex6/ALKex20, V.3; EML4exl8/ALKex20; EML4ex2/ALKex20) [Wang et al., 2012; Mitiushkina et al., 2013]. Известные транслокации ALK детектировались разделением ПЦР-продуктов в 10% полиакриламидном геле. В качестве контроля амплификации кДНК использовался фрагмента гена SDHA. Праймеры для анализа ALK-транслокаций представлены в таблицах 6 и 7.

Таблица 6.

Праймеры для анализа ALK-транслокаций экспрессионным методом.

Ген Праймер 5'-3' последовательность Размер фрагмента

SDHA Прямой CCACTCGCTATTGCACACC 102 п.о.

Обратный CACTCCCCGTTCTCCATCA

ALK ех9-11 (5'-порция) Прямой CCTCTCCTCGATGTGTCTGA 135 п.о.

Обратный CTTGTCCTCTCCGCTAATGGT

ALK ех22-23 (3'-порция) Прямой TGTGCTCTGAACAGGACGAACT 132 п.о.

Обратный TGAGCTCCAGCAGGATGAACC

Таблица 7.

Праймеры для анализа присутствия известных ALK-транслокаций.

Вариант транслокации Праймер 5'-3* последовательность Размер фрагмента

EML4exl3/ALKex20, V.l Прямой TGGAGCAAAACTACTGTAGAG 134 п.о.

Обратный GTCGAGGTGCGGAGCTTG

EML4ex20/ALKex20, V.2; Прямой CTAACTCGGGAGACTATGAAAT 118 п.о.

Обратный GTCGAGGTGCGGAGCTTG

EML4ex6/ALKex20, V.3; Прямой CATAAAGATGTCATCATCAACCA V3a- 113 п.о. V3b -146 п.о.

Обратный GTCGAGGTGCGGAGCTTG

EML4ex 18/ALKex20 Прямой ACACAGACGGGAATGAACAG 133 п.о.

Обратный GTCGAGGTGCGGAGCTTG

EML4ex2/ALKex20 Прямой GATGTTTTGAGGCGTCTTGC 158 п.о.

Обратный GTCGAGGTGCGGAGCTTG

Поиск транслокаций гена RET был осуществлен посредством анализа несбалансированной экспрессии 5'- и З'-концевых последовательностей гена (5' фрагмент - экзоны 6-7, З'-фрагмент - экзоны 12-14). Праймеры для анализа RET-транслокаций представлены в таблице 8.

Таблица 8.

Праймеры для анализа RET-транслокаций экспрессионным методом.

Ген Праймер 5'-3' последовательность Размер фрагмента

SDHA Прямой CCACTCGCTATTGCACACC 102 п.о.

Обратный CACTCCCCGTTCTCCATCA

RET ех6-7(5'-порция) Прямой CACCTGCCCAGTACCTACTC 133 п.о.

Обратный CACCAGAGGAATGCAGCTTGT

RET ех12-14 (3'-порция) Прямой GTGAAGATGCTGAAAGAGAACG 139 п.о.

Обратный TGAGGAGGAGCGGGCCATC

Опрос врачей стоматологов. Для оценки уровня осведомленности стоматологов в области профилактики онкологических заболеваний полости рта нами был проведен опрос практикующих врачей (191 человек) на профессиональном интернет-портале. В исследовании была использована анкета, составленная на основе работы Хоровитц и соавт. [Horowitz, 2000].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Клиническая и биологическая характеристика опухолей полости рта

В результате анализа архива историй болезней НИИ онкологии им. H.H. Петрова было обнаружено 110 пациентов, проходивших лечение по поводу опухолевого процесса полости рта в течение 2007-2012 гг. За исследованный период у 42 пациентов (38,2%) был диагностирован рак полости рта и глотки, у 30 пациентов (27,3%) - рак слюнных желез, 38 человек (34,5%) наблюдались по поводу доброкачественных новообразований полости рта (в большинстве случаев с диагнозом плеоморфная аденома).

Средний возраст больных с диагнозом рак полости рта и глотки составил 57 лет (от 21 до 79 лет), при этом в 76% случаев опухоли были диагностированы у мужчин. В 40 случаях опухоль гистологически была определена как плоскоклеточный рак различной степени дифференцировки. Единичными случаями были представлены веретеноклеточная саркома языка неизвестной первичной локализации с высокой пролиферативной активностью и нейрогенной дифференцировкой и низкодифференцированная лейомисаркома языка. Более 80% опухолей были диагностированы на III и IV стадии.

Рак слюнных желез за исследуемый период был диагностирован у 17 женщин (56,7%) и 13 мужчин (43,3%), средний возраст пациентов составил 57 лет (от 25 до 82 лет на момент лечения).

Несмотря на доступность самостоятельного осмотра пациентом полости рта и посещение стоматолога, в основном регистрируются достаточно крупные новообразования - у большинства пациентов размер опухоли превышал 2 см в наибольшем измерении, а у 12 составил более 4 см. Кроме того, у более чем 70% пациентов были обнаружены метастазы в регионарные лимфатические узлы шеи, что связанно с особенностями анатомического строения, кровообращения и лимфоснабжения данной области, а также поздним обнаружением опухоли.

Таблица 9.

Данные по стадиям, возрасту и полу пациентов

№ ID* пациента Год лечения Возр аст Пол т N М Стадия

1 001 2012 55 М 3 1 0 III

2 002 2011 55 М 2 1 0 III

3 003 2011 73 М 2 1 0 III

4 004 2011 49 м 3 2 0 IVa

5 005 2011 73 ж 3 X 0 III

6 006 2011 47 м 3 0 0 III

7 007 2011 50 м 3 1 0 III

8 008 2011 41 м 4а 1 0 IVa

9 009 2011 51 M 3 0 0 III

10 010 2011 37 M 4 0 0 IV

11 Oil 2011 74 Ж 2 0 0 II

12 012 2011 63 M 1 1 X III

13 015 2010 50 M 1 0 0 I

14 016 2011 71 M 4 2 1 IVc

15 017 2010 57 M 4 2b 0 IVc

16 018 2010 50 M 2 1 0 III

17 019 2010 57 M 3 1 0 III

18 020 2010 73 M 2 0 0 II

19 021 2010 38 M 2 3 0 IVb

20 026 2010 79 M 2 2 0 IVa

21 030 2011 64 M 4 2 1 IVc

22 031 2010 59 Ж 3 X 0 III

23 034 2009 55 Ж 2 0 0 II

24 035 2009 63 M 2 1 1 IVc

25 039 2009 68 M 2 3 0 IVb

26 040 2010 21 ж 2 3 1 IVc

27 041 2010 69 M 2 3 0 IVb

28 042 2009 55 M 3 2b 0 IVa

29 043 2009 47 M 1 1 0 III

30 044 2009 50 M 2 1 0 III

31 045 2009 58 M 1 0 0 I

32 046 2009 54 M 3 1 0 III

33 047 2009 52 M 2 1 0 III

34 051 2008 66 M 2 2 0 IVa

35 052 2007 77 ж 3 0 0 III

36 053 2007 59 M 2 2 0 IVa

37 054 2007 69 ж 2 2 1 IVc

38 055 2007 77 ж 2 1 0 III

39 056 2007 49 Ж 2 0 0 II

40 061 2009 62 ж 3 0 0 III

41 062 2008 72 м 2 1 0 III

42 063 2007 64 м 2 0 0 II

I Итого 42 человека Период -6 лет Ср. возр аст- 57 м-32 Ж-10 Т1 -4 Т2 -21 N0-12 N1 -15 мо- 36 Ml -5 I- 2 II-5 III-19

лег тз-12 Т4 -5 N2-9 N3-4 Nx-2 Мх-1 IV-16

В целом, среди пациентов, проживающих на территории Северо-Западного Федерального округа и проходивших лечение в ФГБУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова» Минздрава России в период с 2007 по 2012, данные о распространённости, стадийности, половых и возрастных особенностях заболевания соответствуют общемировым и российским среднестатистическим показателям.

Молекулярио-геиетический анализ образцов опухолей полости рта и глотки

Опухолевый материал в количестве, достаточном для молекулярно-генетического анализа, был доступен для 57 пациентов. В исследуемую группу вошло 44 случая рака полости рта или слюнных желез и 13 случаев доброкачественных поражений слюнных желез.

Анализ мутаций в гене EGFR. Анализ мутационного статуса гена EGFR проводился в 2 этапа. Сначала было проведено исследование наличия частых мутаций: микроделеции в 19 экзоне и однонуклеотидной замены L858R. Эти мутации представляют до 90% всех активирующих мутаций, обнаруженных в опухолях легкого [Furugaki et al., 2014]. Нами не было обнаружено ни одного случая с этими мутациями в исследуемой группе. Следует отметить, что в соответствии с информацией из базы данных соматических мутаций в опухолях COSMIC, спектр мутаций EGFR в новообразованиях головы и шеи может значительно отличаться от такового для опухолей легкого.

В качестве метода систематического анализа последовательности киназного домена (экзоны 18-24) EGFR нами был выбран анализ кривых плавления с высоким разрешением (High Resolution Melting Analysis, HRMA) в комбинации с секвенированием по Сэнгеру. Анализ кривых плавления с высоким разрешением является относительно новым методом - он был разработан в 2003 году [Vossen et al., 2009, Wittwer et al., 2009]. HRMA основан на регистрации флуоресценции интеркалирующих красок при нагревании продуктов ПЦР до 95°С (плавлении). Выявление малейших отклонений, вызванных однонуклеотидными заменами, в температуре или форме кривой плавления ДНК

возможно благодаря высокой разрешающей способности приборов. Кривые плавления исследуемых образцов сравнивались с кривой плавления контрольного образца без мутаций. Образцы с аномальными кривыми плавления подвергались секвенированию.

Анализ последовательности киназного домена EGFR в исследуемой группе выявил 1 образец с мутацией p.A702S (c.2104G>T) в экзоне 18 гена EGFR (рисунок 1). Мутация была обнаружена в образце опухоли корня языка. Ранее эта мутация была обнаружена в группе опухолей легкого китайских пациентов [Xu et al., 2009]. Данные о чувствительности или резистентности опухолей с этой мутацией к терапии ингибиторами тирозинкиназ в литературе отсутствуют. Однако опухоли с другой мутацией в 18 экзоне (G719S) считаются чувствительными к такому лечению.

Кроме того, нами был проведен анализ наличия несбалансированной экспрессии 5' и 3' фрагментов мРНК EGFR. Это тестирование основывалось на сравнении уровней экспрессии экзонов 5-7 и экзонов 21-23 гена. Наличие повышенного уровня экспрессии 3' фрагмента гена может говорить о присутствии в опухоли транслокации, затрагивающих киназный домен EGFR или других нарушениях, вызывающих активацию киназного домена. Тест на наличие несбалансированной экспрессии EGFR удалось провести для 51 образца. Ни в одном из них не был обнаружен повышенный уровень экспрессии 3'-фрагмента гена.

Анализ транслокаций гена ALK. Исследование статуса ALK в коллекции образцов полости рта и глотки проводилось как с помощью экспрессионного метода (оценка соотношения экспрессии 5'(экзон 5-7) и 3' (экзон 21-23) фрагментов гена), так и путем ПЦР-амплификации 5 наиболее частых типов транслокаций (EML4exl3/ALKex20, V.l; EML4ex20/ALKex20, V.2; EML4ex6/ALKex20, V.3; EML4exl8/ALKex20; EML4ex2/ALKex20) [Wang et al., 2012; Mitiushkina et al„ 2013]. Используя оценку соотношения экспрессии 5' и 3' фрагментов гена мы смогли оценить наличие не только известных, но и других возможных перестроек, затрагивающих киназный домен ALK.

При исследовании образцов опухолей полости рта и глотки не было обнаружено известных транслокаций EML4-ALK или повышенной экспрессии 3' фрагмента гена.

Анализ транслокаций гена RET. Для поиска возможных транслокаций гена RET в опухолях полости рта и глотки нам был использован метод сравнения уровня экспрессии 5'(экзон 6-7) и 3'(экзон 12-14) фрагментов гена.

Нами было обнаружено два образца, результаты исследования которых могут свидетельствовать о наличии транслокации, затронувшей ген RET. В первом случае был выявлен повышенный уровень экспрессии З'-фрагмента гена. Во-втором случае была обнаружена экспрессия 12-14 экзонов при отсутствии экспрессии 6-7 экзонов. Основные характеристики образцов представлены в таблице 10.

Рисунок 1. Кривые плавления (А, Б - образец отмечен стрелками) и последовательность ДНК (В, Г) образца с мутацией ЕСРЯ А702Б.

Рисунок 2. Пример детекции несбалансированной экспрессии гена RET. А -образец с повышенной экспрессией З'-фрагмента. Б - образец с равноценной экспрессией 5' и З'-фрагментов. 5' - зеленый, 3' - розовый.

Таблица 9.

Основные характеристики опухолей с обнаруженной несбалансированной экспрессией гена RET.

Возраст пациента Пол пациента Диагноз

59 Ж Мукоэпителиоидная карцинома слюнной железы

25 Ж Аденокарцинома слюнной железы

Для выявления возможного партнера транслокации в обнаруженных образцах можно применить несколько подходов:

1. Провести ПЦР-амплификацию фрагментов известных на данный момент RET-тpaнcлoкaций;

2. Провести полноэкзомный анализ кДНК данных образцов.

Применение высокопроизводительного анализа, безусловно, может значительно ускорить выявление гена-партнера транслокации. Однако низкое качество кДНК, получаемой при использовании парафиновых блоков значительно осложняет эту задачу.

Анализ уровня экспрессии мРНК ВКСЛ1. Уровень экспрессии мРНК гена ЕЖСА1 оценивался нами при проведении мультиплексной ПЦР с применением TaqMan-зoндoв. В 6 исследуемых случаях не удалось выделить РНК. Низкий уровень экспрессии BRCA1 оценивался как ёеИаС1 > 4 и не был обнаружен ни в одном из исследованных образцов, однако в целом уровень экспрессии BRCA1 в злокачественных опухолях полости рта и глотки оказался выше, чем в доброкачественных опухолях слюнных желез.

Результаты опроса врачей-стоматологов по проблемам профилактики и раннему выявлению опухолей полости рта.

При оценке клинических особенностей течения рака полости рта, прежде всего обратило на себя внимание то, что большинство больных поступают в специализированное онкологическое учреждение поздно. Численность пациентов, госпитализированных с III и IV стадиями заболевания, составляет 83%. Мы провели специальное изучение этого вопроса и установили, что скрытое течение заболевания на начальных стадиях злокачественных заболеваний полости рта - не единственная причина поздней диагностики. Нередко пациенты обращались за медицинской помощью к врачам близких специальностей задолго до госпитализации, но это не ускоряло диагностику.

Для оценки уровня осведомленности стоматологов в области профилактики онкологических заболеваний полости мы разослали 191 врачу анонимные анкеты через профессиональный интернет-портал www. 100mat.ru. При этом использовали известную анкету, составленную на основе работы Хоровитц и соавт. [Horowitz A.M., 2000].

Опрос врачей показал, что более 50% из них не проводят осмотр первичных пациентов на наличие рака полости рта или осматривают только каждого пятого. Ещё 8%

осматривают только каждого десятого. Почти 70% стоматологов не проводят пальпации лимфатических узлов шеи, либо проводят подобное обследование очень редко. Половина врачей не проводят осмотра полости рта у пожилых беззубых пациентов, либо делают это очень редко. Здесь уместно еще раз обратить внимание на выявленные нами данные о том, что частота злокачественных поражений слюнных желез резко возрастает у людей старше 60 лет и лиц старческого возраста.

Треть опрошенных стоматологов не знают основных локализаций рака полости рта или сомневаются в этом вопросе. При этом 64% врачей уверены, что в достаточной мере подготовлены к процедуре обследования полости рта. Более двух третей, опрошенных указывают, что в институте не было уделено достаточно внимания обучению в вопросах онкологических заболеваний области головы и шеи и только одна треть доверяет ранее полученным знаниям.

70 ...............................................................................................................................................................................

60 Щящтвшж .............................................................................................................

50 ...........................................................................................................................................

40

30 .................................................................................................................................................................................................

10: ..............................................ЯИИ ^ -3«

а - 111 , ...........................................ШШШЖтШ...............................,................

Обследование НЕ обследуются только обследуются 70%-ПРОВОДИТСЯ или 30%-60% пациентов 100% пациентов

только в 20% случаев

Рисунок 3. Частота осмотра врачами-стоматологами полости рта на предмет выявления злокачественных опухолей.

Таким образом, результаты профессионального опроса врачей показали, что одним из факторов поздней диагностики раковых заболеваний головы и шеи оказывает недостаточная осведомлённость врачей-стоматологов, а также их недостаточная онкологическая настороженность. Очевидно, что раннее выявление опухолей полостей рта является ключевым шагом к снижению смертности от данного типа заболевания. В первую очередь профилактические меры должны быть связаны с увеличением эффективности работы стоматологов.

выводы

1. Подавляющее большинство случаев опухолей полости рта и глотки (83%), зарегистрированных в клинике, относятся к запущенным (III и IV) стадиям заболевания.

2. Одной из вероятных причин несвоевременной диагностики новообразований полости рта и глотки является низкий уровень онкологической настороженности врачей-стоматологов.

3. Повторяющиеся соматические мутации гена EGFR (делеции в экзоне 19 и нуклеотидные замены в кодоне 858) не являются характерными событиями для опухолей полости рта и глотки. Тем не менее, полное секвенирование нуклеотидной последовательности киназного домена EGFR позволило выявить мутацию в 1 из 57 опухолей. Данная замена p.A702S (c.2104G>T) обнаружена в карциноме корня языка и находится в непосредственной близости от мутаций, ассоциированных с ответом на тирозинкиназные ингибиторы EGFR.

4. Злокачественные опухоли слюнных желёз относительно часто (2 из 16, 12.5%) содержат признаки активирующей транслокации онкогена RET, что свидетельствует о целесообразности клинических испытаний RET-ингибиторов в отношении карцином данной локализации.

5. Низкая экспрессия гена BRCA1 не характерна для новообразований полости рта и глотки; следовательно, относительно высокая чувствительность опухолей данной категории к препаратам платины связана с альтернативными механизмами.

6. Анализ опухолей полости рта и глотки не выявил случаев транслокации рецепторных тирозинкиназ ALK и EGFR.

Практические рекомендации.

1. Определение мутаций при диагностике злокачественных заболеваний полости рта и дифференциальной диагностике их с доброкачественными заболеваниями имеет низкую диагностическую значимость.

2. Индивидуальные особенности клинического течения злокачественных заболеваний не связаны с мутациями EGFR и EML4/ALK, а также уровнем экспрессии BRCA1.

3. Представляется целесообразным рассмотреть вопрос о клинических испытаниях ингибиторов тирозинкиназы RET в отношении опухолей, содержащих транслокацию упомянутого гена.

4. При подготовке врачей-стоматологов необходимо акцентировать внимание на формирование у них онкологической настороженности, особенно при осмотре пациентов старше 60 лет.

Список опубликованных работ.

1. Будовский А.И., Алексахина С.Н., Имянитов E.H. Эпидемиология и молекулярный патогенез опухолей полости рта и глотки // Вопросы онкологии.-2014,- Т. 60. - С.14-17.

2. Кашинцев A.A., Янус Г.А., Коханенко Н.Ю., Моисеенко В.М., Ханевич М.Д., Роман Л.Д., Иевлева А.Г., Соколенко А.П., Суспицын E.H., Будовский А.И., Того A.B., Волков Н.М., Фадеев Р.В., Диникин М.С., Иванова А.К., Шостко К.Г., Имянитов E.H. Встречаемость мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 у больных раком поджелудочной железы // Сибирский онкологический журнал. - 2013. - Т. 59. - № 5. - С. 39-44.

3. Будовский А.И. История развития онкологии в контексте проблем рака полости рта // Dental Magazine. - 2013. - Vol. 119. - № 11 - pp. 112-116.

4. Будовский А.И., Недостаточная осведомлённость стоматологов в области онкологии полости рта// Dental Magazine. - 2014. - Vol. 128. - № 8 - pp. 76-84.

Подписано в печать 20.05.2015 Формат 60x84 7)6 Цифровая Печ. л. 1.0 Тираж 100 Заказ № 13/05 печать

Типография «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 2, Сайт: falconprint.ru)