Автореферат и диссертация по медицине (14.01.12) на тему:Некоторые клинико-биологические особенности рака языка и дна полости рта

7 -

7

На правах рукописи

Нистратов Григорий Павлович

НЕКОТОРЫЕ КЛШШКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАКА ЯЗЫКА И ДНА ПОЛОСТИ РТА

14.01.12- онкология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 9 ш 2015

005561501

Ростов-на-Дону - 2015

005561501

РАБОТА ВЫПОЛНЕНА В ФЕДЕРАЛЬНОМ ГОСУДАРСТВЕННОМ БЮДЖЕТНОМ УЧРЕЖДЕНИИ «РОСТОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ» МИНИСТЕРСТВА ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ (директор - д.м.н., профессор О.И. Кит)

Научный руководитель: доктор медицинских иаук, профессор

Светицкип Павел Викторович

Официальные оппоненты: Семин Дмитрии Юрьевич - доктор

медицинских наук, Медицинский

радиологический научный центр им. А.Ф. Цыба филиал федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский

радиологический центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации, врач-онколог отделения радиохирургического лечения закрытыми радионуклидами

Шишкин Дмитрии Александрович - кандидат медицинских наук, Федеральное

государственное бюджетное научное учреждение «Томский научно-

исследовательский институт онкологии», старший научный сотрудник отделения опухолей головы и шеи

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное

учреждение высшего профессионального образования «Северный государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится " /5 ■■ А- 2015 г. в часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.208.083.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения Российской Федерации (344037, г. Ростов-на-Дону, 14 линия, 63).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www.rnioi.ru ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан " ££ 2015 г.

Ученый секретарь совета

по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук, профессор —" ззднякова В.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Заболеваемость и смертность раком органов полости рта в последние годы имеет тенденцию к росту во всем мире и в структуре онкопатологии составляет 2,3 %. Ежегодно у 90 тысяч человек впервые диагностируются опухоли данной локализации (Holmes J.D. et.al., 2010).

Для рака органов полости рта характерны следующие особенности: быстрый темп роста, раннее метастазирование, низкая эффективность лечения, высокая смертность, достигающая 60-70 % (Грекова В.И.,1996). Местные рецидивы даже после комбинированного и комплексного лечения возникают в 25-40% (Пачес А.И., 2000; Кропотов М.А., 2004). Регионарные метастазы после комбинированного лечения развиваются у 40-75% больных, а отдаленное метастазирование - у 15%. (Нуммаев Г.М. и соавт., 1996, Пачес А.И., 2000).

Данная ситуация требует поиска новых эффективных подходов к диагностике и лечению больных раком органов полости рта. Одной из основных причин роста и распространения опухолевых заболеваний отводится дисбалансу процессов пролиферации и апоптоза (Петров C.B., Райхлин Н.Т. 2012; Gerdes J. et al. 1984). Детальное изучение этих процессов у больных раком языка и дна полости рта, особенно при его рецидивирова-нии и регионарном метастазировании могли бы дать ценную информацию о механизмах прогрессирования опухоли. Среди факторов, способствующих диссеминации опухоли, значимым является неоангиогенез, обеспечивающий ее метастазирование (Parums D.V. et al., 1990; Weidner N. et al., 1991). Несмотря на длительную историю изучения лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации и других факторов локального иммунитета, их роль в прогрессировании опухоли продолжает оставаться не совсем ясной и, по-видимому, зависит от многих причин, связанных как с особенностями опухоли, так и состоянием организма опухоленосителя (Шапошников A.B. и соавт. 2011; Шамилов Ф.А. 2012).

В последние годы большое внимание стало уделяться исследованиям, по-священным связи онкопатологии и вирусных инфекций. Было доказано, что более чем в 15% этиологическими агентами различных новообразований являются вирусы (гигНаиБеп Н. 1999). При этом большая роль вирус ассоциированного рака орофарингеальной зоны отдается вирусам папилломы человека и Эпштейна-Барр (Дранник Г.Н. 2006; Казмирчук В.Е., Мальцев Д.В. 2009).

Все вышеизложенное послужило основанием к изучению возможностей повышения эффективности лечения больных раком языка и дна полости рта.

Цель исследования

Дать сравнительную оценку некоторых клинико-биологических особенностей больных раком языка и дна полости рта без регионарных метастазов, с регионарными метастазами и рецидивами.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

1. Оценить сроки появления регионарных метастазов и рецидивов V

1

больных раком языка и дна полости рта при различных видах неадъювант-ного лечения;

2. Изучить особенности микрососудистой инвазии в опухолях языка и дна полости рта при рецидивировании и регионарном метастазировании;

3. Оценить экспрессию молекулярно-биологических маркеров р53, кь 67 в опухолях больных сравниваемых групп;

4. Исследовать инфицированность ткани опухоли больных папиллома-вирусами человека различного онкогенного риска и вирусом Эпштейна-Барр;

5. Изучить Т-лимфоцитарный, макрофагальный и цитокиновый состав ткани опухоли и перитуморальной области у больных сравниваемых групп.

Научная новизна исследования

Впервые на основании результатов молекулярно-биологических, имму-ногмстохимическнх, иммунологических и вирусологических исследований показаны различия некоторых характеристик опухолевой ткани рака языка и дна полости рта у больных с разным клиническим течением заболевания. Так в первичной неметастазирующей опухоли обнаружена наименьшая пролиферативная активность, микрососудистая плотность и диаметр капилляров, наиболее выраженная инфильтрация С068+ макрофагами и С08+ Т-лимфоцитами. В рецидивных опухолях выявлена умеренная пролиферативная активность, выраженная микрососудистая плотность и мак-рофагапьная инфильтрация. Опухоли, дающие регионарные метастазы, характеризуются максимальной пролиферативной активностью клеток и диаметром капилляров, частым выявлением ВЭБ, минимальной инфильтрацией макрофагами и С08+ Т-лимфоцитами при выраженной микрососудистой плотности.

Впервые показаны особенности выявления ДНК ВПЧ и ВЭБ у больных раком языка и дна полости рта при различной степени дифференцировки опухоли, распространенности процесса и их значение для прогноза выживаемости: у ВПЧ-позитивных больных был отмечен более высокий процент выживаемости, чем у ВПЧ-негативных.

Практическая значимость работы Применение результатов исследования у больных раком языка и дна полости рта позволяют оптимизировать их ведение путем выбора наиболее эффективной тактики лечения.

Основные положения, выносимые па защиту 1. У больных раком языка и дна полости рта по мере прогрессирования опухолевого процесса меняется ряд биологических характеристик опухоли: возрастает пролиферативная активность, диаметр внутриопухолевых капилляров и микрососудистой инвазии, частота выявления ВПЧ ВКР и ВЭБ-инфекции, снижается макрофагальная и СЭ8+ Т-лимфоцитарная ин-

фильтрация и частота выявления ВПЧ НКР.

2. У больных раком языка и дна полости рта вне зависимости от наличия регионарных метастазов и рецидивов частота выявления ДНК ВПЧ и ВЭБ в опухолях различается при разной степени дифференцировки и распространенности опухоли, а также при различной выживаемости больных после лечения; тканевые уровни цитокинов также не связаны с прогресси-рованием опухоли, во всех случаях они преобладают в опухолевой ткани по сравнению с немалигнизированной.

Внедрение результатов исследования

Данные, полученные в результате исследования, используются в работе отделения опухолей головы и шеи ФГБУ «Ростовского научно-исследовательского онкологического института» Минздрава России.

Апробация работы

Апробация диссертации состоялась 26 февраля 2015 года на заседании Ученого Совета Ростовского научно-исследовательского онкологического института.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Основные научные положения и выводы, описанные в диссертационной работе, соответствуют паспорту специальности 14.01.12 - онкология.

Результаты работы соответствуют пункту 2 области исследования (исследования по изучению этиологии и патогенеза злокачественных опухолей, основанные на достижениях ряда естественных наук: генетики, молекулярной биологии, морфологии, иммунологии, биохимии и др.).

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 12 печатных работах (из них 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки России).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результатов исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка научных работ,

опубликованных по теме диссертации, указателя литературы, включающего 82 отечественных и 129 зарубежных источников. Работа содержит 33 таблицы и 31 рисунок.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы п методы исследования. Набор клинического материала осуществлялся на базе отделения опухолей головы и шеи ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский онкологический институт» Минздрава России.

Обследовано 100 больных раком языка и дна полости рта, проходивших лечение в отделении опухолей головы и шеи в период с 2010 по 2014 гг.: 70 больных составили ретроспективную группу (2010-2012 гг) и 30 больных - проспективную группу (2012-2014гг).

На основе медицинской документации (истории болезни) в группе ретроспективных больных проведен анализ первичного очага (локализация, распространенность процесса, темп роста опухоли, анатомическая форма опухоли, гистологический тип, методы лечения и их последовательность), у больных с рецидивами изучались время его возникновения, предшествующее лечение, у больных с метастазами в лимфатические узлы шеи определяли время возникновения, предшествующее лечение первичного очага. Так же в этой группе при помощи методов иммуногистохимического исследования и полимеразной цепной реакции изучены экспрессия р53, кь 67, опухолевая микрососудистая инвазия и инфицированность ВПЧ и ВЭБ.

В группе проспективных больных, помимо клинико-диагностических исследований, изучали экспрессию р53, 1а-67, опухолевую микрососудистую инвазию, тканевые уровни некоторых цитокинов, локальное содержание макрофагов и Т-лимфоцитов основных субпопуляций, а так же наличие в опухоли ДНК инфицированность папилломавирусом и вирусами группы герпеса человека.

Всем больным проведено хирургическое лечение. В послеоперационном периоде проводилась терапия согласно стандартам лечения.

Больные (п=100) были разделены на 3 группы: первая — больные раком языка и дна полости рта без регионарных метастазов (п=36), вторая -больные с регионарными метастазами (п=34), третья — больные с рецидивами (п=30).

Иммуногистохимическое исследование проводили на срезах из парафиновых блоков, предназначенных для стандартного морфологического исследования.

Применяли следующие критерии оценки маркеров:

1) опухоль считали положительной по р53, если было окрашено более 25% ядер опухолевых клеток

2) для оценки пролиферативной активности (ПА) опухоли подсчитывали количество ki-67-положительных опухолевых клеток, приходящихся на 200-300 опухолевых клеток. Индекс ki-67 определяли по формуле:

ПА= число ki-67 положительных клеток х 100/общее количество клеток.

3) Для оценки ангиогенеза в опухолях использовали индекс внутриопухолевой микрососудистой плотности (intratumor microvessel density - MVD). Микрососуды окрашивали антителом CD34. Количество сосудов определяли в каждом поле зрения препарата при использовании объектива х40 с использованием программы AxioVs40 v-4.8.1.0

При морфологическом и иммуногнстохимическом исследовании наличие лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрации определяли в строме и паренхиме опухолевой ткани, а также в перифокальной зоне; результаты определения количества макрофагов (CD68+) и субпопуляций Т-лимфоцитов: Т-хелперно-индукторных (CD4+) и Т-цитотоксических (CD8+) выражали в процентах.

Для определения ДНК ВПЧ и ВЭБ исследовали фиксированные в формалине и залитые в парафин ткани опухоли (FFPE ткани). Депарафиниза-

цню проводили по стандартной методике с использованием ксилола и этанола 96°.

Детекция ДНК и определение генотипа ВПЧ ВКР (типы: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59) и НКР канцерогенного риска (типы: 6, 11), ВЭБ проводили методом мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в режиме «реального времени» на термоциклере Rotor Gene 6000 (QI AGEN, Германия).

Материалом для иммунологического исследования явились фрагменты опухоли и пограничной здоровой ткани, удаленной во время операции (п=30). Образцы тканей гомогенизировали с помощью BD Medimachine. В гомогенатах тканей опухоли и перитуморальной зоны определяли уровни цитокинов TNF-a, 1L-1, 1L-2, 1L-6, 1L-8, IL-10, IL-1RA, IFN-a, IFN-y, а также SIgA с использованием метода ИФА с тест-системами производства «Вектор-Бест» (Новосибирск) и «Цитокин» (С-Петербург). Количество исследуемых веществ измеряли в пг/мл и пересчитывали на 1 г белка, содержание которого определяли биуретовым методом; таким образом, получали удельный уровень каждого из них.

Статистическую оценку результатов проводили в работе с помощью программы STAT1STICA 7.0 (StatSoftlnc., США) и MedCalc (версия 9.3.5.0), параметрического критерия Стьюдента при нормальном законе распределения и непараметрического критерия Манна-Уитни и двусторонний точный критерий Фишера (ТМФ) при отличии распределения показателей от нормального. При р<0,05 различия между выборками считались статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что средний возраст больных раком языка и дна полости рта без регионарных метастазов составил 52,1±0,9 лет. Опухоль локализовалась преимущественно на боковой поверхности языка (66,7%). В 69,4% дифференцировка опухоли имела высокую, а в 30,6% - умеренную степень. Появление регионарных метастазов

после лечения, наступило у 25% больных этой группы. Наибольшее количество случаев появления метастазов пришлось на первые 6 месяцев — 66,7%. Рецидивы были выявлены у 41,7% больных, в основном в течение 6-12 месяцев (80%).

У больных с регионарными метастазами средний возраст составил 58,6±0,8 лет. В 50% случаев опухоль была на боковой поверхности языка. Степень дифференцировки опухоли в 64,7% была умеренной, а в 35,3% -высокой. Появление регионарных метастазов после лечения наблюдалось в 32,4%, основная доля которых появилась в период 6—12 месяцев (63,7%). Рецидивы выявлены у 47,1% больных, большая часть которых (75%) развилась в период 6-15 месяцев.

У больных с рецидивами средний возраст составил 52,4±0,7 лет. В 40% случаев опухоль локализовалась в передних отделах полости рта, в 60% выходила за пределы одной локализации (язык+дно полости рта). Диффе-ренцировка опухоли в 90% была умеренной, и 10% - высокой. Регионарные метастазы развились у 33,3% больных, при этом в 70% появление метастазов наблюдалось в период 12-15 месяцев после лечения. Рецидивы выявлены у 53,3% больных, большая часть которых развились в период 915 месяцев (62,5%).

Проведение неоадъювантной лучевой терапии у больных раком языка и дна полости рта снижало частоту регионарного метастазирования с 38,1% (не получавшие лечения) до 30%, химиотерапии - с 38,1% до 24%, хи-миолучевого лечения - с 38,1% до 18,2%, а частоту рецидивирования не-адъювантная лучевая терапия снижала с 57,1% (не получавшие лечения) до 50%, химиотерапия - с 57,1% до 44%, а химиолучевая - с 57,1% до 27,3%.

Средние сроки появления регионарных метастазов у больных, получавших неадъювантное химиолучевое лечение (17,0±2,47 мес.) были более поздними и в 1,7, 2,2 и 2,7 раза превышали показатели при лучевой терапии (10,0±1,62 мес.), химиотерапевтической (7,8±1,71 мес.) и не получав-

ших неадыоваитное лечение (6,4±0,73 мес. ) соответственно (р<0,05). Средние сроки появления рецидивов при неадъювантном химиолучевом лечении (18,0±3,71 мес. ) были в 1,8, 2,1 и 2,2 раза больше, чем при лучевой терапии (10,5±1,18 мес.), химиотерапевтической (8,45±0,93 ) и у пациентов, не получавших неоадъговантную терапию (8,25±1,23 мес. ) соответственно (р<0,05).

У больных всех групп была исследована экспрессия р53, ki-67, CD34. Экспрессия р53 в ядрах опухолевых клеток рака языка и дна полости рта в группе без метастазов отмечена в 66,7% (24 из 36), разброс количества окрашенных клеток при этом находился в пределах от полного отсутствия окрашивания до 50% клеток, и в 45,8% (11 из 24) достиг точки разделения «cut-off» в 25% ядер опухолевых клеток.

Проведенное исследование выявило наличие достоверных различий экспрессии опухолевыми клетками р53 среди исследуемых групп. Наиболее значимые показатели экспрессии данного маркера получены в группе с метастазами, что в 2,8 и 1,8 превосходило данный показатель в группах без метастазов и с рецидивами (р<0,05). Минимальные значения отмечены в группе без метастазов, что в 1,6 раза меньше и достоверно отличалось от показателя в группе с рецидивами (р<0,05). Полученные данные отражены в табл. 1.

Таблица 1

Экспрессия опухолевыми клетками Ki-67 и р53 в исследуемых группах

Маркеры пролиферации и апоптоза Группы больных

без регионарных метастазов (п-36) с регионарными метастазами (п=34) с рецидивами (п=30)

Ki-67 24,3±2,6 46,7±4,1» 27,5±2,9 **

р53 21,2±3,9 60,1 ±3,7* 33,5±3,6* **

Примечание. * - отличия показателей статистически достоверны по отношению к группе без метастазов (р<0,05);

** - отличия показателей статистически достоверны по отношению к группе с метастазами (р<0,05).

При оценке пролиферативного потенциала опухолей исследуемых групп выявлено наличие в каждой из них опухолей с низкой, умеренной и высокой ПА. Полученные результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2.

Доля опухолей с различной пролиферативной активностью в исследуе-

мых группах (%).

Пролифератив-ная активность (ПА) Группы больных

без регионарных метастазов (п=36) с регионарными метастазами (п~34) с рецидивами (п=30)

Низкая 0-20% 66,7 (п=24) 20,6 (п=7) 56,7 (п=17)

Умеренная 21-50% 27,7 (п=10) 58,8 (п=20) 33,3 (п=10)

Высокая 51-100% 5,6 (п=2) 20,6 (п=7) 10 (п=3)

Проведенное ИГХ исследование ПА опухолей исследуемых групп выявило преобладание опухолей с низкой ПА в группах без метастазов и с рецидивами, тогда как в группе с метастазами преобладали опухоли умеренной ПА. Минимальное количество опухолей с высокой ПА выявлено в группе без метастазов, максимальное - в группе с метастазами. Соотношение доли опухолей с низкой ПА к доле опухолей с высокой ПА в группе без метастазов составило 11,9, в группе с рецидивами -5,7, тогда как в группе с метастазами - 1.

Количественная оценка внутриопухолевой микрососудистой плотности в опухолях полости рта, выявленная нами при ИГХ исследовании с использованием антител С034, позволила нам качественно оценить процесс ангиогенеза в каждой из исследуемых групп.

Все сосуды, окрашенные антителами СЭ34, в опухолях исследуемых групп были представлены капиллярами, среди них встречались посткапиллярные венулы, диаметр которых варьировал от 8 до 30 мкм и собирательные венулы (диаметр от 3 до 50 мкм). Более крупных сосудов (больше 50 мкм в диаметре) мы не наблюдали ни в одной из исследованных нами опухолей.

При оценке индекса внутриопухолевой микрососудистой плотности выявлены достоверные различия среди исследуемых групп. Минимальную

13

внутриопухолевую плотность сосудов мы обнаружили в группе без метастазов, которая составила 6,4±0,7 сосуда в 1 поле зрения. В группах с метастазами и рецидивами мы наблюдали наиболее выраженные изменения внутриопухолевой микрососудистой плотности, что выражалось в увеличении в 1,4 и 1,5 раза количества, окрашенных антителами СЭ34 сосудов и составило для опухолей данных групп 8,8±0,9 и 9,7±0,8 сосуда в 1 поле зрения соответственно, по сравнению с группой без метастазов.

Исследование молекулярных маркеров ВПЧ и ВЭБ в тканях опухоли при раке языка и дна полости рта проводили в парафиновых блоках 100 больных.

Генетический материал ВПЧ был обнаружен в 36% случаев. ВПЧ ВКР был обнаружен в 2 раза чаще, чем ВПЧ НКР. Чаще других ткани опухоли были инфицированы 16 и 11 типами (50% и 25% соответственно от общего числа опухолей, инфицированных ВПЧ).

ВПЧ 6 типа присутствовал в 3 случаях (8,33% от числа инфицированных ВПЧ), 11 типа - в 9 (25%). ВПЧ 16 типа присутствовал самостоятельно в 18 исследуемых образцах (50% от общего числа инфицированных ВПЧ больных) и в сочетании с ВПЧ 35 типа в 3 случаях (8,33%). ВПЧ в виде моноинфекции 35 был выявлен в 3-х случаях (8,33%).

Характеристика инфицированное™ опухоли внутри групп больных представлена на рис. 1.

55,88%

80,00%

|Рецидив

ВПЧ-негатиэные

НКР ВКР ВПЧ все

Рис. ¡.Частота инфицирования ткани опухоли ВПЧ в исследуемых группах.

Как видно из рис. 1 частота инфицирования ВПЧ НКР у пациентов без метастазов была чаще в 1,5 раза, чем ВПЧ ВКР (25±7,2% и 16,67±6,2% соответственно), а у пациентов с метастазами ВПЧ ВКР встречался в 4 раза чаще, чем ВПЧ НКР (35,3±8,2% и 8,82±4,9%). У больных с рецидивами встречался только ВПЧ ВКР (20±7,3%).

Статистически значимые различия были выявлены при сравнении ВПЧ НКР 11 типа у больных без регионарных метастазов (25±7,2%), тогда как с метастазами он не выявлен (0%) (р=0,0026).

Сравнение полученных результатов ВПЧ-позитивных (20±7,3%) и ВПЧ-негативных (80±7,3%) больных показало, что рецидивные опухоли статистически значимо реже были инфицированы ВПЧ (р=0,0001).

При анализе частоты инфицирования ткани опухоли разной степени дифференцировки было установлено, что у ВПЧ-позитивных больных чаще встречался высокодифференцированный рак (01) (52,77±8,3%), в большей степени это характерно для ВПЧ ВКР (19,44±6,6%), тогда как у ВПЧ-негативных больных статистически значимо чаще встречался уме-реннодифференцированный рак (67,19± 5,9%) по сравнению с высокодиф-ференцированным (32,19±5,9%) (р=0,005). Низкая степень дифференцировки (03) опухолей не была выявлена.

Анализ распространённости процесса показал, что при размере опухоли менее 2 см превалировали ВПЧ НКР, присутствовавшие в 27,8±7,5% образцов. При размере опухоли 2-4 см ВПЧ НКР обнаруживались только в 5,56±3,8% случаев. ВПЧ ВКР определялись в опухолях более крупных размеров, причем тем чаще, чем большего размера были опухоли.

Таким образом, с увеличением распространенности опухоли установлен рост частоты инфицирования ВПЧ ВКР (р=0,0039) и наоборот для ВПЧ НКР с увеличением размера процесса его выявление статистически достоверно снижалось (р=0,001).

При анализе зависимости исходов заболевания от частоты инфицирования ткани опухоли было установлено, что среди ВПЧ-позитивных больных

доля умерших пациентов (25±7,2%) была в 3 раза меньше живых (75±7,2%) (р=0,0001). Данная тенденция характерна как для ВПЧ НКР, так и для ВПЧ ВКР. Среди неинфицированных ВПЧ количество умерших и живых больных было в равных долях (по 50± 6,3%). Среди умерших (п=41) число инфицированных ВПЧ (п=9; 21,95±6,5%) было меньше, чем ВПЧ-негативных (п=32; 78,05±6,5%) (р=0,0001).

Был отмечен ^олее благоприятный прогноз по выживаемости при инфицировании ткани опухоли ВПЧ.

Частота инфицирования ткани опухоли ВЭБ при исследовании парафиновых блоков составила 60%.

Характеристика инфицированное™ опухоли внутри групп больных представлена на рис. 2.

70,58%

66,67%^

55,56% , мтс.

80,00% 60,00%

40,00% 20,00% 0,00%

--44/44%

-29;42%—33,33%

1

I Рецидив

ВЭБ-негативные

Рис. 2. Частота инфицирования ткани опухоли ВЭБ в исследуемых группах.

Из рис.2, видно, что ВЭБ встречался реже в группе больных без метастазов (44,44±6,4%), чем у пациентов с метастазами (70,58±5,9%, р=0,031).

ВЭБ в 2 раза чаще встречался при умереннодифференцированном раке (66,67±6,1%), чем при высокодифференцированном (33,33± 6,1%) (р=0,0004), тогда как у ВЭБ-негативных пациентов эти показатели были равны (50±7,9%). Опухоли с низкой степенью дифференцировки не были выявлены.

Было отмечено, что с увеличением размера опухолевого процесса увеличилась и частота инфицирования ткани опухоли ВЭБ.

Доля умерших (48,33±6,5%) больных, инфицированных ВЭБ, была меньше чем у живых (51,67±6,5%). Однако, данные различия были статистически незначимы. В то же время у ВЭБ-негативных больных доля умерших была в 2,3 раза меньше живых (30±7,2% и 70±7,2% соответственно) (р=0,0006).

Были установлены особенности степени дифференцировки опухоли и выживаемости у больных, инфицированных ВПЧ и ВЭБ. Больные, инфицированные ВЭБ, отличались от инфицированных ВПЧ тем, что у них превалировала умеренная степень дифференцировки опухоли (для ВПЧ - высокая степень). При этом ВЭБ чаще встречался у больных с регионарными метастазами (ВПЧ у больных без метастазов) и не было статистически значимых различий выживаемости и смертности (для ВПЧ-позитивных больных показатели выживаемости были выше показателей смертности).

Нами было выполнено иммунологическое и иммуногистохимическое исследование тканевых образцов опухоли языка и дна полости рта, а также ее перитуморапьной зоны у проспективных больных (п=30). Определяли уровни про- и противовоспалительных цитокинов, секреторного 1§А (Б^А), макрофагов и основных субпопуляцнй Т-лимфоцитов.

Сопоставление исследованных показателей в ткани опухоли и перитуморапьной зоны сравниваемых групп приведено в табл. 3 и 4.

Таблица 3.

Удельное содержание цитокинов в ткани опухоли исследованных групп больных (пг/мл/г белка).

Цитокины Группы больных

Без регионарных метастазов С регионарными метастазами С рецидивами

ТЫИ-а 2,32±1,16 2,83±0,91 2,82±0,78

1Ь-8 16,3±3,5 26,7±7,2 17,0±7,4

1Ь-6 7,1 ±3,2 5,95±2,03 13,3±7,3

1Ь-10 2,5±0,33 2,92±1,1 1,23±0,4

1ЫВ 14,4±3,8 19,0±4,2 17,5±8,2

492±83 - -

0,576±0,1 0,442±0,11 -

1РЫ-у 1,3±0,2 1,26±0,17 -

1Ь-2 0,533±0,06 0,884±0,24 -

Таблица 4.

Удельное содержание цитокинов в ткани перитуморалыюй зоны иссле-

дованных групп больных (пг/мл/г белка).

Цитокнны Группы больных

Без регионарных метастазов С регионарными метастазами С рецидивами

ТЫР-а 1,47-1-0,24 3,110,96 2,3210,357*

И-8 5,5±2,33 7,3±2,78 12,7±7,2

1Ы5 0,71±0,158 1,2310,49 1,410,56

1Ы0 2,42±0,33 3,6411,69 1,8410,5

1ИВ 4,710,71 6,7±2,1 26,5И0,7*

1Ь-1ИА 397133,4 - -

1РЫ-а 0,54810,09 0,4710,08 -

1РЫ-у 1,57610,19 2,3510,76 -

11.-2 0,510,06 1,1910,56 -

Примечание. * - статистически достоверные отличия от группы боль-

ных без метастазов (р<0,05)

Как видно из табл.3 и 4. сравнительная характеристика удельных (в пересчете на 1 г белка) уровней цитокинов в тканях опухоли и перитуморалыюй зоны показала, что в опухолевой ткани по сравнению с перитуморалыюй зоной отмечено статистически значимо более высокое содержание провоспалительных цитокинов 1Ь-1В, 1Ь-6, 1Ь-8 в группе больных без регионарных метастазов; у больных с регионарными метастазами наблюдались сходные различия. При рецидивах подобная разница была отмечена только по уровню 1Ь-6, но и она статистически была недостоверна вследствие незначительного числа наблюдений и высокой индивидуальной вариабельности показателей. Тканевые уровни интерферонов, 1Ь-2 и 1Ь-10 в опухоли и в перитуморалыюй зонах были невысоки и не имели статистически достоверных различий.

Следует отметить, что при рецидивах в тканевых образцах перитуморалыюй зоны и опухоли утрачиваются различия по 1Ь-1В, 1Ь-6 и 1Ь-8, выраженные в двух других группах, что говорит о приближении иммунологических характеристик визуально немапигнизированной ткани к опухоле-!

вой и может косвенно свидетельствовать об утрате ею свойств, ограничивающих пролиферативный потенциал опухоли.

Содержание 81§А в исследуемых тканях представлено в табл. 5.

Таблица 5.

Удельное содержание 51§А в тканях опухоли и перитуморальной зоны исследованных групп больных (мг/мл/г белка).

Образцы тканей Группы больных

Без регионарных метастазов (п=12) С регионарными метастазами (п=9) С рецидивами (п=8)

опухоль 0,274±0,09 0,05±0,01" *»» 0,47±0,08* **

перитуморальная зона 0,293±0,15 0,142±0,08 0,08±0,02

Примечание. * - статистически достоверные отличия от показателей перитуморальной зоны; ** - статистически достоверные отличия от группы больных без метастазов; *** - статистически достоверные отличия от группы больных с рецидивами (р<0,05)

Как видно из табл. 5 в группах с наличием и отсутствием регионарных метастазов не было обнаружено различий по тканевому удельному содержанию З^Д между опухолью и перитуморальной областью, тогда как в группе с рецидивами статистически значимо более высокие уровни выявлялись в опухолевой ткани по сравнению с перитуморальной зоной. В тканевых образцах опухоли больных этой же группы количество Б^А оказалось статистически достоверно выше, чем в группе с метастазами, в которой его уровень был минимальным среди всех исследуемых групп, что свидетельствует об угнетении его локального синтеза. Не выявлено статистически достоверных различий по данному показателю между образцами перитуморальных зон больных сравниваемых групп.

Результаты ИГХ-нсследования позволили выявить ряд общих черт для опухолей сравниваемых групп. Так во всех группах отмечено преобладание в лимфоцитарно-макрофагалыюм инфильтрате СЭ8+ лимфоцитов над С04+ клетками, а также выраженная инфильтрация С068+ макрофагами, тогда как инфильтрация С04+ клетками была представлена в виде одиноч-

пых лимфоцитов, разрозненно расположенных как в строме, так и в зонах сплошного опухолевого роста.

Были обнаружены и некоторые различия между сравниваемыми группами. Так, в группе без метастазов выявлена наиболее выраженная инфильтрация С08+ лимфоцитами, как в строме опухоли, так и в паренхиме. Инфильтрация СБ68+ макрофагами была ярко выражена, составляя в паренхиме опухоли до 20%, тогда как в инфильтратах на границе опухоль-перифокальная зона - от 20 до 40% инфильтрата.

В группах с метастазами и рецидивами отмечено более низкое содержание СЭ8+ лнмфрцитов: до умеренного как в строме, так и в паренхиме опухоли в сравнении с группой без метастазов. В отдельных образцах ткани из группы с метастазами выявлены только единичные СЭ8+ лимфоциты в паренхиме опухоли и более выраженная инфильтрация на границе опухоль-перитуморапьиая зона. В группе рецидивов на отдельных участках в зонах сплошного опухолевого роста отмечено формирование скоплений из С08+ лимфоцитов по типу лимфоидных фолликулов.

В группе с метастазами инфильтрация опухоли СЭ68+ макрофагами также была снижена в сравнении с группой без метастазов. Так на долю С068+ макрофагов в лимфоцитарно-макрофагалыюм инфильтрате в паренхиме опухоли без метастазов приходилось от 10 до 20%, на границе опухОль-перитуморапьная зона от 20 до 40%. В группе с метастазами выявлено снижение доли СЭ68+ макрофагов до 10% как в строме опухоли, так и в ее паренхиме. Напротив, в группе с рецидивами отмечена обильная диффузная инфильтрация макрофагами в строме и в паренхиме, составляя до 40% инфильтрата.

Итак, результаты клинико-биологических исследований больных раком языка и дна полости рта без и с наличием регионарных метастазов, а также с рецидивами позволяют выделить ряд особенностей данной патологии. Опухолевая ткань больных без метастазов характеризуется низким уровнем микрососудистой инвазии, низкой экспрессией р53 и 1а-67, частым

присутствием в клетках опухоли ВПЧ НКР, значительной инфильтрацией макрофагами и CD8+ Т-лимфоцитами. Ткань рецидивной опухоли характеризуется умеренной пролиферативной активностью, выраженной микрососудистой плотностью при среднем диаметре капилляров, высокой мак-рофагалыюй инфильтрацией на границе «опухоль-перитуморальная зона». Опухолевая ткань при регионарном метастазировании характеризовалась максимальной ПА, выраженной интенсивностью развития внутриопухоле-вой сосудистой сети, частым выявлением в клетках опухоли ВПЧ ВКР и ВЭБ, минимальной инфильтрацией макрофагами и CD8+ Т-лимфоцитами.

Наличие ДНК ВПЧ, преимущественно низкого канцерогенного риска, в опухолях вне зависимости от первичных, рецидивных или метастазирую-щих чаще встречается при высокой степени их дифференцировки, а ВЭБ чаще обнаруживается при умеренной дифференцировке. Тканевые уровни цитокинов также не связаны с прогрессированием опухоли, во всех случаях они преобладают в опухолевой ткани по сравнению с немалигнизиро-ванной.

Таким образом, нами установлены некоторые общие и различные кли-нико-биологические характеристики у больных с первичными, рецидивными и метастазирующими опухолями языка и дна полости рта, которые могут быть использованы при оценке агрессивности опухоли и выборе оптимальной тактики лечения.

ВЫВОДЫ

1. Средние сроки появления регионарных метастазов для больных, полу-чавших неадъювантное лечение в виде лучевой терапии, составили 10,0±1,б2 мес., химиотерапевтического лечения - 7,8±1,71 мес., химиолу-чевого — 17,0±2,47 мес., в то время как для больных, не получавших неадъювантное лечение данный показатель составил 6,4±0,73 мес. Средние сроки появления рецидивов при неадъювантном лечении были равны 10,5±1,18 мес. у пациентов, получавших лучевую терапию, 8,45±0,93 мес. -химиотерапевтическое лечение, 18,0±3,71 мес. - химиолучевое и 8,25±1,23

мес. - не получавших неоадыовантную терапию. Включение в схему лечения больных раком языка и дна полости рта неоадъювантной химиолуче-вой терапии снижает частоту возникновения регионарных метастазов с 38,1% до 18,2%, а частоту рецидивирования - с 57,1% до 27,3%.

2. Наиболее высокая пролиферативная активность опухолевых клеток сопровождается интенсификацией процессов неоангионгенеза: микрососудистая плотность в тканях опухолей больных с регионарными метастазами статистически значимо выше, чем в опухолях без регионарных метастазов (8,8±0,9 против 6,4±0,7 в 1 поле зрения соответственно); при рецидивах также отмечена стимуляция неоангиогенеза (9,7±0,8) (р<0,05).

3. В опухолевых клетках больных раком языка и дна полости рта с регионарными метастазами отмечается наиболее высокая активность процессов пролиферации (1и-67 - 46,7±4,1; р53 - 60,1±3,7), что статистически значимо превышает показатели групп без регионарных метастазов (1а-67 -24,3±2,6; р53 - 21,2±3,9) и с рецидивами (1а-67 - 27,5±2,9; р53 - 33,5±3,6) соответственно (р<0,05).

4. Частота выявления вирусов папилломы человека в ткани опухолей составила 36%, при этом не выявлено различий между больными без метастазов, с регионарными метастазами и рецидивами. Обнаружены различия присутствия ВПЧ, преимущественно низкого канцерогенного риска, в опухолях с разной степенью дифференцировки: у ВПЧ-позитивных больных чаще встречался высокодифференцированный рак, чем у ВПЧ-негативных: 52,77±8,3% против 32,81±5,9%, а число умерших пациентов инфицированных ВПЧ было статистически значимо меньше, чем неинфицированных (21,95±6,5% и 78,05±6,5% соответственно; р=0,0001).

5. Частота выявления ДНК ВЭБ в тканях опухолей составила 60%. У больных с регионарными метастазами ВЭБ выявлялся чаще, чем у пациентов без метастазов (44,44±6,4 и 70,58±5,9% соответственно, р<0.05); ВЭБ был чаще ассоциирован с умереннодифференцированным раком (66,67±6,1%) (р<0,01); при этом различий по показателям выживаемости не

обнаружено.

6. У больных раком языка и дна полости рта установлено 2-10-кратное преобладание удельного содержания провоспалительных цитоки-нов 1Ь-1В, 1Ь-6, 1Ь-8 в ткани опухоли по сравнению с перитуморальной зоной; в перитуморальных зонах рецидивных опухолей обнаружено более высокое содержание 1ИВ по сравнению с соответствующими образцами больных без метастазов (26,5±10,7 и 4,7±0,71 пг/г белка соответственно) и более низкое ТЫР-а (2,32±0,36 и 1,47±0,24 пг/г белка соответственно). Тканевое содержание в метастазирующих опухолях минимально среди всех исследуемых групп (0,05±0,01 против 0,274±0,09 и 0,47±0,08), что свидетельствует об угнетении его локального синтеза.

7. Инфильтрация иммунокомпетентными клетками отмечается преимущественно на границе опухоли с перитуморальной зоной и формируется, главным образом, за счет макрофагов и цитотоксических Т-лимфоцитов, причем макрофаги преобладают в окружении рецидивных опухолей, а С08+ Т-клетки в опухолях, не дающих регионарных метастазов; в метастазирующих опухолях уровни макрофагов и Т-клеток минимальны.

Практические рекомендации

Обследование больных раком языка и дна полости рта целесообразно дополнять иммуногистохимическим и вирусологическим исследованиями с определением некоторых биологических характеристик опухоли: проли-феративной активности, микрососудистой инвазии, инфицированности вирусами папилломы человека и Эпштейна-Барр, позволяющими провести оценку агрессивности опухоли и подобрать оптимальную тактику ведения таких пациентов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Светицкий, П.В. Рак органов полости рта и глотки в Ростовской области/ П.В. Светицкий, Г.П. Нистратов// Вопросы онкологии. - 2013. -№3, - С. 514-515.

2. Светицкий, П.В. Хирургическое лечение и его прогнозирование у больных местно-распространенным раком органов полости рта и глотки/ П.В. Светицкий, Г.П. Нистратов, Т.А. Зыкова, И.В. Аединова // Онкохи-рургия. Матер. II Междисциплинарного конгресса по заболеваниям органов головы и шеи. - 2014. - V.6, - С. 100-101.

3. Светицкий, П.В. Рак органов полости рта и глотки в Ростовской области/ П.В. Светицкий, Г.Г). Нистратов, И.В. Аединова // Евразийский онкологический журнал. Матер. VIII съезда онкологов и радиологов СНГ и Евразии. - 2014. - №3, - С. 196.

4. Светицкий, П.В. Факторы определяющие течение и прогноз орофа-рингеалыюго рака/ П.В. Светицкий, Г.П. Нистратов, Т.А. Зыкова, Е.Ю. Златпик, И.В. Аединова // Евразийский онкологический журнал. Матер. VIII съезда онкологов и радиологов СНГ и Евразии. - 2014. - №3, - С. 197.

5. Зыкова, Т.А. Лимфотропные вирусы в тканях опухоли эпителиального происхождения/ Т.А. Зыкова, Г.А. Неродо, П.В. Светицкий, АЛО. Максимов, М.Л. Малейко, Е.А. Неродо, Г.П. Нистратов, O.A. Богомолова // Евразийский онкологический журнал. Матер. VIII съезда онкологов и радиологов СНГ и Евразии. - 2014. - №3, - С. 99-100.

6. Светицкий, П.В. Течение рака органов полости рта с учетом ассоциированности с вирусом Эпштейна-Барр, папилломы человека и уровня некоторых цитокинов/ П.В. Светицкий, Е.Ю. Златник, Т.А. Зыкова, Г.П. Нистратов, И.В. Аединова, В.Л. Волкова, М.В. Баужадзе, O.A. Богомолова, Г.И. Закора // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований.-2014.-№11, - С. 120-122.

7. Нистратов, Г.П. Влняппе вирусов Эпштейна-Барр н папилломы человека на течение рака органов полости рта [Электронный ресурс|/ Г.П. Нистратов, П.В. Светицкий, Т.А. Зыкова, И.В. Аедннова, В.Л. Волкова, М.В. Баужадзе, O.A. Богомолова // Современные проблемы науки п образования. - 2014. - № 6. URL: www.science-ediication.ru/I20-16497 (дата обращения: 20.02.2015).

8. Светицкий, П.В. Локальные уровни некоторых цитокннов при раке полости рта/ П.В. Светицкий, Е.Ю. Златник, Г.П. Нистратов, И.В. Аедино-ва, B.JI. Волкова, Г.И. Закора // Общие вопросы диагностики и лечения в онкологии. Матер. V съезд онкологов и радиологов Казахстана. - 2014. - С. 28.

9. Zykova, Т.А. Lymphotropic viruses in tissues of tumor of epithelial origin/ T.A. Zykova, G.A. Nerodo, P.V. Svetitskiy, A.Yu. Maksimov, M.L. Maleyko, E.A. Nerodo, G.P. Nistratov, O.A. Bogomolova // ESMO 2014 (28 September 2014). Poster Display session.

10. Светицкий, П.В. Некоторые молекулярко-бнологические маркеры (Р53, KI-67, CD34) при раке органов полости рта [Электронный ресурс]/ П.В. Светицкий, H.A. Новикова, Г.П. Нистратов, И.В. Аедпнова, B.JI. Волкова, М.В. Баужадзе, Е.П. Ульянова // Современные проблемы науки и образования. - 2015. - № 2; URL: httpr/Avww.science-education.ru/ 122-17445 (дата обращения: 20.02.2015).

11. Светицкий, П.В. Некоторые факторы прогноза течения рака органов полости рта/ П.В. Светицкий, H.A. Новикова, Е.Ю. Златник, Т.А. Зыкова, Г.П. Нистратов, И.В. Аедпнова, В.Л. Волкова, М.В. Баужадзе, Е.П. Ульянова, O.A. Богомолова, Г.Н. Закора // Фундаментальные исследования, № 1 (часть 2), 2015. С. 361-365.

12. Златник, Е.Ю., Факторы локального иммунитета у больных раком слизистой оболочки полости рта и языка с отсутствием и наличием регионарных метастазов и рецидивов/ Е.Ю. Златник, П.В. Светицкий, H.A. Новикова, Г.П. Нистратов, И.В. Аедпнова, В.Л. Волкова, М.В. Баужадзе, Е.П. Ульянова, Г.И. Закора, О.Н. Селготпна // Фундаментальные исследования, № 1 (часть 5) 2015, с. 953-957.

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ

ВПЧ - вирус папилломы человека,

ВПЧ ВКР - вирус папилломы человека высокого канцерогенного риска,

ВПЧ НКР - вирус папилломы человека низкого канцерогенного риска,

ВЭБ - вирус ЭпштеГша-Барр,

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота,

ИГХ - иммуногистохимическое исследование,

ИФА - иммуноферментный анализ,

мкм- микрометр,

ООГШ - отдел «Опухолей головы и шеи»,

ПА - пролиферативная активность,

ПЗ - перитуморальная зона,

ПЦР - полимеразная цепная реакция,

РНИОИ - Ростовский научно-исследовательский онкологический институт,

РОПР - рак органов полости рта, IFN-a - Интерферон -а, IFN-y - Интерферон -у, IL -10 - Интерлейкин - 10,

IL IRA - рецепторный антагонист интерлейкина - 1,

IL - ip - Интерлейкин - 1в,

IL -6 - Интерлейкин - 6,

IL -8 - Интерлейкин - 8,

IL-2 - Интерлейкин - 2,

SIgA - Секреторный иммуноглобулин А,

TNF-a - фактор некроза опухоли -а.

Печать цифровая. Бумага офсетная. Гарнитура «Тайме». Формат 60x84/16. Объем 1.0 уч.-изд.-л. Заказ № 3995. Тираж 100 экз. Отпечатано в КМЦ «КОПИЦЕНТР» 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Суворова, 19, тел. 247-34-88