Клеточный ответ на повреждение ДНК и предрасположенность к раку молочной железы

Соколенко, Анна Петровна

Диссертации по медицине → Онкология

Автореферат и диссертация по медицине (14.00.14) на тему:Клеточный ответ на повреждение ДНК и предрасположенность к раку молочной железы

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Соколенко, Анна Петровна Санкт-Петербург 2009 г.

Ученая степень: кандидата медицинских наук

ВАК РФ: 14.00.14

Автореферат диссертации по медицине на тему Клеточный ответ на повреждение ДНК и предрасположенность к раку молочной железы

00348354 1

На правах рукописи

Соколенко Анна Петровна

КЛЕТОЧНЫЙ ОТВЕТ НА ПОВРЕЖДЕНИЕ ДНК И ПРЕДРАСПОЛОЖЕННОСТЬ К РАКУ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Специальность: 14.00.14 - онкология 03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 ^

Санкт-Петербург 2009

003483541

Работа выполнена в ФГУ «НИИ онкологии им. H.H. Петрова Росмедтехнологий»

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Евгений Наумович Имянитов доктор биологических наук, профессор Виктория Николаевна Горбунова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Марк Абрамович Забежинский

доктор медицинских наук Вера Леонидовна Ижевская

Ведущее научное учреждение:

ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И.П.Павлова Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации»

Защита диссертации состоится "_"_200_ г. в _часов на

заседании диссертационного совета Д 208.052.01 ФГУ «НИИ онкологии им.

Н.Н.Петрова Росмедтехнологий» (197758, Санкт-Петербург, Песочный-2, ул. Ленинградская, д.68)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте института (www.niioncologii.ru).

Автореферат разослан "_"_200_г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.м.н. Е.В. Бахидзе

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Поддержание стабильности генома - одно из фундаментальных свойств живого. Клеточная ДНК постоянно подвергается действию различных генотоксических факторов экзогенной (ультрафиолетовое и ионизирующее излучение, химические мутагены) и эндогенной (активные радикалы кислорода) природы. Молекулярные механизмы клетки, обеспечивающие ответ на повреждение ДНК (DNA damage response, DDR), представлены целой сетью динамично взаимодействующих белков и белковых комплексов, которые способны распознавать повреждения ДНК, "сигнализировать" клетке о необходимости остановки клеточного цикла, устранять повреждение или элиминировать генетически-нестабильные клетки путем индукции клеточной гибели (Bartek and Lukas, 2007). Нарушения в системе ответа на повреждение ДНК могут приводить к порокам развития или иным генетически-ассоциированным патологическим состояниям, включая тяжелые иммунодефициты и нейродегенеративные синдромы, преждевременное старение и рак (Lehmann, 2003; Hoeijmakers, 2001). В частности, все известные на настоящий момент наследственные мутации, ассоциированные с развитием рака молочной железы (РМЖ), локализуются в генах репарации ДНК и/или апоптоза: BRCA1, BRCA2, СНЕК2, NBS1, PALB2 (lau et at, 2001; Simpson, 2007).

В настоящее время генетическое тестирование дефектов генов каскада ответа на повреждение ДНК в нашей стране ограничено несколькими мутациями (BRCA1 5382insC, BRCA1 4153delA, СНЕК2 llOOdelC). В работах Sokolenko et al. (2006), Семиглазова и др., (2006), Chekmariova et al. (2006) было продемонстрировано, что упомянутые мутации являются повторяющимися ("founder" - в англоязычной литературе) в российской популяции. Однако выявление данных повреждений позволяет говорить об ассоциации РМЖ с носительством наследственной мутации только у части пациенток с признаками наследственной формы данной патологии. Что важно, носительство наследственного дефекта в генах ответа на повреждение ДНК требует модификации лечебных мероприятий (Byrski et al., 2008; Foulkes et al., 2006; Plummer et al., 2008). В частности, убедительные данные получены для гена BRCA1, наследственные мутации в котором обуславливают резистентность опухоли к таксанам и высокую чувствительность к препаратам платины и PARP-ингибиторам (Kennedy et al., 2004; Tutt A and Ashworth A, 2008; Byrski et al., 2008). Таким образом, молекулярно-генетический анализ в данном случае становится компонентом индивидуализации химиотерапии.

Представляется целесообразным детально охарактеризовать спектр наследственных мутаций, ассоциированных с развитием рака молочной железы, в российской популяции у пациенток с признаками наследственной предрасположенности к данной патологии.

железы с признаками наследственной предрасположенности и здоровых женщин без случаев онкологической патологии в фенотипическом тесте на изменение экспрессии генов после индукции повреждения ДНК гамма-излучением (Jen and Cheung, 2003).

Цели и задачи исследования

Цель настоящей работы - охарактеризовать спектр наследственных мутаций в известных РМЖ-ассоциированных генах ответа на повреждение ДНК, а также выяснить, существуют ли отличия в способности к ответу на повреждение ДНК у здоровых женщин без случаев онкологической патологии в семье и пациенток с раком молочной железы.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Оценить встречаемость повторяющихся РМЖ-ассоциированных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, СНЕК2, PALB2, NBS1 в группе пациенток с клиническими признаками наследственного рака молочной железы в российской популяции.

2) Проанализировать полную кодирующую последовательность гена BRCA1 на предмет редких повреждений в группе пациенток с клиническими признаками наследственного рака молочной железы, негативных в отношении повторяющихся мутаций.

3) Оценить возможность применения высокоточного анализа кинетики плавления продуктов полимеразной цепной реакции для анализа полной кодирующей последовательности гена BRCA1.

4) Оценить встречаемость крупных перестроек гена BRCA1 в группе пациенток с клиническими признаками наследственного рака молочной железы, негативных в отношении повторяющихся мутаций.

5) Сравнить транскрипционный ответ на повреждение ДНК у здоровых женщин и больных раком молочной железы в фенотипическом тесте на изменение экспрессии генов после облучения.

Научная новизна полученных результатов

В настоящей работе впервые подробно охарактеризован спектр наследственных мутаций в РМЖ-ассоциированных генах в Северо-Западном регионе России. Впервые исчерпывающе проанализирован статус гена BRCA1 на большой выборке пациенток с клиническими признаками наследственного рака молочной железы. Показана возможность использования высокоточного анализа кинетики плавления ПЦР-продукта как альтернативы полному секвенированию гена BRCA1. С помощью фенотипического теста был продемонстрировано, что у пациенток с признаками наследственной формы рака молочной железы выраженность транскрипционного ответа на повреждение ДНК отличается от таковой у здоровых женщин.

Практическая значимость

Полученные данные о частоте встречаемости различных мутаций в генах BRCAI, BRCA2, СНЕК2, NBS1, PALB2 могут быть использованы в молекулярно-эпидемиологических исследованиях, направленных на выявление повреждений, ассоциированных с другими новообразованиями. Продемонстрирована возможность использования фенотипического теста для выявления лиц с нормальным и слабым транскрипционным ответом на повреждение ДНК.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Мутации BRCA1 5382insC, 4153delA, 185delAG, СНЕК2 1 lOOdelC, IVS2+1G>A, NBS1 657del5 ассоциированы с развитием существенной доли наследственного рака молочной железы в Северо-Западном регионе России.

2) В группе пациенток "высокого риска" значительна общая доля редких мутаций в гене BRCA1, что ставит вопрос о необходимости тестирования полной кодирующей последовательности.

3) У пациенток с признаками наследственной предрасположенности к раку молочной железы отмечен более слабый транскрипционный ответ на повреждение ДНК по результатам фенотипического теста.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на Ежегодной Конференции Американской Ассоциации по изучению рака (AACR Annual Meeting 2007, 14-18 апреля, Лос-Анджелес, США), на Международной Конференции "Генетика в России и в мире", посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН, 2006 (28 июня-2 июля, Москва), на Международном конгрессе по изучению противоопухолевой терапии (ICACT 18th International Congress on Anti Cancer Treatment, 6-9 февраля 2007, Париж, Франция) и на Российской конференции по фундаментальной онкологии "Петровские чтения-2009" (17 апреля, Санкт-Петербург).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 119 страницах и состоит из введения, глав материалов и методов, результатов, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 13 таблицами. Библиографический указатель включает 174 источника, в том числе 8 отечественных и 166 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Общая схема исследования

Диссертационная работа содержит две части: основная часть посвящена характеристике спектра наследственных мутаций в генах ВЯСА1, ВЯСА2, СНЕК2, ЫВ81, РАЦВ2; дополнительная - анализу экспрессии генов, индуцированной, радиацией, в лимфоцитах больных и здоровых женщин. Далее схематично представлены основные этапы работы (рис.1).

N=336

Детекция мутаций:

BRCA1 5382insC, BRCA1 4153delA, BRCA1 185delAG, BRCA1 300T>G, BRCA2 6174delT, CHEK2 1 lOOdelC, CHEK2 IVS2+1G>A, NBS1 657del5

Детекция мутации

PALB2 1592delT

Анализ полной кодирующей последовательности гена BRCA1

Анализ потери гетерозиготности

Дополнительный анализ мутации BRCA1 2080delA (N=95)

N=81

Детекция крупных перестроек в гене BRCA1

Фенотапический тест: анализ изменения экспрессии генов (12 образцов от 6 индивидуумов) в результате облучения

Рисунок 1. Общая схема работы.

Группа пациенток, использованная в основной части работы

Для настоящей работы из банка образцов ДНК из лейкоцитов и срезов морфологически нормальной ткани молочной железы больных РМЖ, проходивших лечение в НИИ онкологии им. H.H. Петрова в период с 1999 по 2008 гг. (Санкт-Петербург), было отобрано 336 случаев с косвенными клиническими признаками наследственного РМЖ. К косвенным клиническим признакам были отнесены раннее начало заболевания (до 40 лет включительно), отягощенный семейный анамнез (случаи рака молочной железы и/или яичников у матери и/или сестры), билатеральность поражения. Исследуемая группа включала 148 пациенток с билатеральным РМЖ и 188

случаев ранних и/или семейных форм монолатерального РМЖ. В обобщенном виде характеристика пациенток представлена в таблицах 1 и 2.

Таблица 1. Описание пациенток с билатеральным и монолатеральным РМЖ.

Билатеральный РМЖ (N=148)

Средний возраст Iм опухоль: 49,6 лет /2м опухоль: 55,7 лет

Возрастной интервал 1м опухоль: 25- 85 лет / 2"" опухоль: 28 - 87 лет

Возраст на момент постановки диагноза 1-ой опухоли <40 лет >40

34 (23%) 114(77%)

Семейный анамнез Положительный Отрицательный

30 (20%) 118(80%)

Синхронный или метахронный рак Синхронный Метахронный

56 (38%) 92 (62%)

Монолатеральный РМЖ (N=188)

Средний возраст 43,7

Возрастной интервал 25-78

Возраст <40 лет >40

101(54%) 87 (46%)

Семейный анамнез Положительный Отрицательный

101(54%) 87 (46%)

Таблица 2. Характеристика группы по количеству клинических признаков наследственного рака

Билатеральный РМЖ (N=148)

3 признака (молодой возраст, семейная история, билатералыюсть) 13 (9%)

2 признака 38 (26%)

Молодой возраст + билатеральность 21 (14%)

Семейная история + билатеральность 17 (12%)

1 признак (билатеральность) 97 (65%)

Монолатеральный РМЖ (N=188)

2 признака (молодой возраст + семейная история) 14 (8%)

1 признак 174(92%)

Молодой возраст 87 (46%)

Семейная история 87 (46%)

Пациентки и здоровые женщины, лимфоциты которых были подвергнуты фенотипическому тесту

В данной части работы использовали образцы лимфоцитов от двух здоровых женщин и 4 пациенток с РМЖ. Пациентки с РМЖ были отобраны из числа женщин, подвергнутых молекулярно-генетическому анализу на предмет носительства 8 вышеупомянутых повторяющихся мутаций. Характеристики пациенток были следующие: 1) метахронный БРМЖ, возраст на момент возникновения первой опухоли - 43 года, без случаев онкологической патологии в семье; 2) синхронный БРМЖ, 58 лет, носитель мутации BRCA1 4153delA; 3) синхронный БРМЖ, 44 года, РМЖ у матери; 4) РМЖ, 74 года, без случаев онкологической патологии в семье. В исследование входили только те пациентки, которые не принимали химиопрепараты и не подвергались лучевой терапии, по меньшей мере, в течение года до эксперимента. Критерием отбора здоровых женщин являлось отсутствие больных онкологической патологией в семье.

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови пациенток

235 образцов ДНК для анализа мутаций были получены из лейкоцитов периферической крови. Выделение ДНК из лейкоцитов проводилось посредством модифицированного соль-хлороформного метода (Miillenbach et ai, 1989). Кровь собирали в пробирки, содержащие 0.5М раствор ЭДТА из расчета 30 мкл на 1 мл крови. Гипоосмотический лизис эритроцитов достигался посредством 3-кратного разведения 5 мл крови дистиллированной водой, охлажденной до 44 °С. Затем лейкоциты осаждали центрифугированием. Полученный осадок ресуспендировали в 1 мл раствора Трис-НС1 (рН = 8,3), 1 мМ ЭДТА. Для разрушения цитоплазматической мембраны клеток к суспензии добавляли Тритон Х-100 до конечной концентрации 1%. Ядра осаждали центрифугированием. Осадок вновь ресуспендировали в 1 мл Трис-HCl (рН = 8,3) и лизировали посредством добавления лаурилсульфата натрия до конечной концентрации 1%. Протеолиз белков и деградация комплексов «белок-ДНК» осуществлялась посредством инкубации пробы в присутствии протеиназы К (200 мкг/мл) при +60 °С в течение 12 часов. Затем к лизату добавляли раствор хлорида натрия до конечной концентрации 1.5М и равный объем хлороформа. Экстракция проводилась в течение 30 минут при медленном покачивании с целью удаления из раствора ДНК нерастворимых компонентов клеточного лизата - белков и липидов. При необходимости процедура повторялась дважды.

Последующее центрифугирование приводило к образованию в пробирке трех четко различимых фаз. Верхняя водная фаза содержала растворенную ДНК и неорганические соли, промежуточная - белки и нижняя, хлороформная, - гидрофобные компоненты. Для осаждения ДНК к осторожно отобранной верхней фазе добавляли два объема абсолютного этанола и оставляли на 20 минут при температуре -20 °С. Осадок затем собирали центрифугированием в течение 5 минут при 12000 g. Отмывание осадка от солей производили в 1 мл 70% этанола и затем, после центрифугирования, растворяли в 0,5 мл 200 мМ раствора Трис-ЭДТА (рН = 7,6). Полученный раствор ДНК хранился при температуре -20 °С до использования в эксперименте.

Выделение ДНК из архивных патоморфологических образцов

101 образец ДНК для анализа наследственных мутаций был получен из морфологически нормальных тканей молочной железы. Выделение ДНК из архивных

патоморфологических срезов нормальных тканей молочной железы проводилось посредством оптимизированного экспресс-протокола (¡туапйоу е! а1, 2001). С парафиновых блоков, содержащих только нормальную ткань, были получены срезы толщиной 15 мкм. Ткани очищались от парафина при помощи промывания препаратов в трёх сменах ксилола по 20 мин при комнатной температуре. Регидратацию клеток осуществляли инкубацией по 10 минут в двух сменах этанола: 96% и 70%. После удаления этанола образцы погружались в лизирующий раствор (ЮмМ Трис-НС1, рН=8,3; 1 мМ ЕБТА; 2% Тритон Х-100, протеиназы К - до 500 мкг/мл). Лизис клеток проводился при 65 °С в течение 12 часов и завершался инактивацией фермента посредством нагревания препарата до 95 °С. Дальнейшая экстракция и очистка ДНК проводилась в соответствии приведенному выше протоколу выделения ДНК из лейкоцитов периферической крови, и включал этапы фенол - хлороформной очистки, преципитации в абсолютном этаноле и отмывания в 70% этаноле. После растворения концентрация всех образцов была измерена с помощью спектрофотометра. Полученный раствор ДНК хранился при температуре -20 °С до использования в эксперименте.

Детекция наследственных мутаций

В исследовании проводился анализ мутаций в известных РМЖ-ассоциированных генах, вовлеченных в сигнальные пути клеточного ответа на повреждение ДНК. Мутации ВЯСА1 5382ш5С, 4153с1е1А, 185с1е1АО, 300Т>С, ВЯСА2 6174с1е1Т, СНЕК2 1100с1е1С, 1У52+Ю>А, N881 657с1е15 были проанализированы в вышеописанных группе из 336 пациенток. Мутация РАЬВ2 1592с1е1Т была протестирована в группе из 114 образцов (87 монолатеральных и 27 билатеральных РМЖ), сформированной из случаев, негативных в отношении перечисленных мутаций. Далее 94 случая, в которых не было обнаружено ни одной из вышеуказанных мутаций, были подвергнуты анализу полной кодирующей последовательности гена ВЫСА1 с использованием высокоточного анализа кинетики плавления ПЦР-продукта. Мутация ВЯСА1 2080с1е1А была дополнительно протестирована в 95 образцах ДНК. И наконец, 81 случай из описанных групп, в которых не удалось обнаружить указанные наследственные мутации, были протестированы на предмет изменения копийности кодирующих участков гена ВЯСА1.

Детекция мутаций BRCA1 5382insC, BRCA1 4153delA, BRCA1185delAG, BRCA1 300T>G, BRCA2 6174delT, CHEK2 UOOdelC, CHEK2 IVS2+1G>A, PALB2 1592delT методом аллельспецифической полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

Аллельспецифическая ПЦР в режиме реального времени проводилась на приборе "¡Q iCycler" ("Bio-Rad"). ПЦР-амплификация происходила в объеме 20 мкл. В состав реакционной смеси входили: 1 ед. "hot-start" Taq-полимеразы "Thermostar" («Синтол», Москва), однократный ПЦР буфер, 50 нг ДНК, 1,5 - 3,0 мМ MgCb, по 200 мкМ каждого из дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дЦТФ, дГТФ, дТТФ) и 100 нМ каждого олигонуклеотида, или праймера. Последовательности всех праймеров были подобраны самостоятельно с помощью Интернет-ресурса Gene Bank и программы Gene Runner. К описанной выше ПЦР-смеси добавляли интеркалирующий краситель SYBR-Green I (20х раствор, добавляется из расчета 1/100 объема реакции), который флуоресцирует при

связывании с малой дорожкой (minor groove) двухцепочечной ДНК. Еще одним компонентом, не участвующим в реакции, но необходимым для корректной работы прибора, является другой флюорофор FAM (fluorescein) (400 нМ раствор, добавляется из расчета 1/50 объема реакции). Реакция начиналась с фазы активации Taq-полимерэзы (95 °С, 7 мин). Последующие 45 циклов ПЦР состояли из фаз денатурации (95 °С, 15 с), отжига (60 °С - 65 °С, 30 с) и элонгации (72 °С, 30 с). Оптимизация условий ПЦР: подбор концентрации MgClj и температуры отжига праймеров - производилась эмпирически с целью увеличения специфичности и исключения ошибочных результатов.

Детекция мутации МВБ! 657(1е15 методом полимеразной цепной реакции

Состав смеси для полимеразной цепной реакции был таким же, как описано выше, без добавления флуоресцентных красителей. Условия реакции соответствовали описанным выше. Визуализация амплифицированных фрагментов осуществлялась путем гель-электрофореза в 12% полиакриламидном геле - по разнице длин нормального и мутантного фрагментов.

Детекция мутаций в гене BRCA1 методом высокоточного анализа кинетики плавления и секвенирования

Геномная ДНК, выделенная из лимфоцитов, была подвергнута амплификации с помощью 42 пар праймеров, полностью перекрывающих кодирующую последовательность гена BRCA1. Состав полимеразной цепной реакции соответствовал описанной выше, кроме того, в смесь добавляли интеркалирующий сатурированный краситель LC Green в концентрации, рекомендованной производителем. Условия амплификации были стандартными, программа плавления заключалась в увеличении температуры на 0,1° в каждом цикле продолжительностью 2 с, температурный интервал плавления составлял от 75 до 95°. Высокоточный анализ кинетики плавления (high resolution melting analysis, HRM) основан на регистрации различий между кривыми плавления амплификата, синтезированного с нормальной или мутантной последовательности (Wittwer et al., 2009). Анализ плавления выполнялся на приборе LightScanner (Idaho Technology, USA). Так как данный метод позволяет лишь установить факт изменения последовательности, но не конкретный тип мутации, для точного определения типа мутации требуется дальнейшее секвенирование. Все образцы, продемонстрировавшие наличие аберрантных кривых плавления, были подвергнуты секвенированию с использованием праймеров, специфичных к тем фрагментам, в которых было обнаружено изменение. Секвенирование было выполнено на приборе ABI PRISM® 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) по протоколам производителя.

Анализ потери гетерозиготности гена ВЯСА1

Анализ потери гетерозиготности гена BRCA1 в образце ДНК опухолевой ткани молочной железы носительницы мутации С1706Е проводили с помощью

аллельспецифических олигонуклеотидов, специфичных к нормальной (01706Е)-0:СООАСАСТСАААТАТТТТСТАОО, и мутантной последовательностям (С1706Е)-А:СССАСАСТСАААТАТТТТСТАСА, и общего олигонуклеотида (С1706Е)-ЯЕУ: ТАССТСТАААААТОСААТТСГСА методом аллельспецифической полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Условия аллельспецифической ПЦР описаны выше. О потере нормального или мутантного аллеля судили по разнице в кинетике амплификации с олигонуклеотидами, специфичными к соответствующему аллелю.

Анализ изменения копийности экзонов BRCA1 методом множественной лигазозависимой амплификации проб

Все экзоны гена BRCA1 были подвергнуты количественному анализу с применением наборов MLPA probe kits Р002 and Р087 (MRC Holland, Amsterdam, The Netherlands) по протоколу производителя. Принцип метода заключается в следующем: геномная ДНК подвергается гибридизации с олигонуклеотидными пробами, затем соседние пробы лигируются, а продукты "сшивания" подвергаются амплификации и анализируются с помощью капиллярного электрофореза. Относительное количество каждого экзона определяется по измерению пика относительной флюоресценции, соответствующего данному фрагменту. Анализ каждого образца с изменениями копийности экзонов был выполнен дважды, после чего повреждение дополнительно подтверждалось при анализе с другим набором экзон-специфических проб.

Фенотипическое исследование реакции лимфоцитов на облучение у пациентов с раком молочной железы и здоровых женщин

Функциональный этап работы включал анализ радиационно-индуцируемой экспрессии генов у больных билатеральным раком молочной железы и здоровых женщин без случаев онкологической патологии в семье. Известно, что в результате действия гамма-излучения в структуре ДНК образуются двуцепочечные разрывы -мощные активаторы каскада клеточного ответа на повреждение ДНК (Газиев А.И.,1999; Khanna and Jackson, 2001). Запуск данного каскада сопровождается активацией белка р53, обеспечивающего транскрипцию ряда генов, которые и определяют исход ответа на повреждение (Coultas and Strasser, 2000). Очевидно, что по уровню экспрессии р53-зависимых молекул можно оценить "эффективность" работы сигнальных путей клеточного ответа на повреждение.

В данной работе для анализа экспрессии генов использовали микрочипы, содержащие олигонуклеотидные пробы (зонды), специфичные ко всем известным на настоящий момент транскриптам (согласно базе данных NCBI).

Выбор дозы для облучения основан на данных работы Jen and Cheung (2003), в которой показано, что доза 3 Гр вызывает повышение уровня экспрессии р53-зависимых генов в течение 2-6 часов после облучения.

Кровь в количестве 10 мл от 4 пациенток с билатеральным раком молочной железы и 2 здоровых посетительниц донорского пункта НИИ онкологии им. H.H. Петрова набирали в вакутайнеры с гепарином. Забор крови осуществлялся в одно и то же время суток: с 10 до 11 часов утра. Кровь делили на две порции, одну из которых облучали

гамма-излучением в суммарной дозе 3 Гр. Далее из каждой порции выделяли лимфоциты путем наслаивания на раствор фиколла и центрифугирования в течение 45 минут. Мононуклеарную фракцию отбирали и промывали дважды в фосфатно-солевом буфере. Полученные клетки помещали в питательную среду RPMI с добавлением телячьей эмбриональной сыворотки до концентрации 20% и инкубировали в гуманизированных условиях (37 , 5% ССЬ) в течение 4 часов. По истечении времени инкубации клетки отмывали от среды в фосфатно-солевом буфере, центрифугировали и использовали для выделения РНК.

Выделение РНК осуществляли путем лизиса в 1 мл Trizol®Reagent (Invitrogen, USA) и далее по протоколу производителя (www.invitrogen.com). Концентрация всех образцов РНК была измерена на приборе NanoDrop-1000 (Thermo Scientific, USA). Образцы с общим содержанием тотальной РНК не менее 10 мкг были отобраны для дальнейшего анализа экспрессии генов. Всего для анализа экспрессии было использовано 12 первичных культур лимфоцитов от 4 больных РМЖ и 2 здоровых женщин (до и после облучения).

Анализ экспрессии генов путем гибридизации на микрочипах

РНК в количестве 10 мкг конвертировали в двуцепочечную кДНК с использованием наборов Superscript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit (Invitrogen, USA) по протоколу производителя. Коротко, процесс синтеза двуцепочечной кДНК включал два этапа: реакцию обратной транскрипции и последующий синтез второй цепи кДНК на матрице РНК-ДНК дуплекса с использованием РНКазы Н и ДНК - полимеразы Т4. Комплиментарную ДНК далее метили флуоресцентным красителем СуЗ и гибридизовали в течение 18 часов на микрочипах для анализа экспрессии 4Х72К (Roche NimbleGen, USA) с использованием NimbleGen Hybridization System 4*. Каждый микрочип позволяет одновременно определить уровень экспрессии 24 ООО транскриптов. По окончании времени гибридизации, микрочипы отмывали и сканировали на приборе GenePix 4000В. Подробный протокол подготовки кДНК и проведения всех манипуляций с микрочипами представлен на сайте производителя (www.nimblegen.com). Полученные изображения обрабатывали с помощью программы NimbleScan v2.5 (Roche NimbleGen, USA), извлеченные данные сохранялись в файлах формата "CALLS" и далее подвергались детальному анализу с использованием программного обеспечения ArrayStar2.1 (DNASTAR, USA).

Статистическая обработка результатов

Обработка данных производилась с использованием статистического пакета SPSS Version 13. Различия считались значимыми при р<0.05. Сравнение частот мутаций в различных группах проводили с помощью теста хи-квадрат. При обработке данных, полученных с микрочипов, использовали функции программного обеспечения ArrayStar2.1, в частности расчет коэффициента корреляции R~ и метод иерархического кластерного анализа. При сравнении транскрипционного ответа в группах использовали критерий Уилкоксона.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Спектр наследственных мутаций в РМЖ-ассоциированных генах, участвующих в клеточном ответе на повреждение ДНК, среди пациенток с косвенными признаками наследственного рака молочной железы

Для повышения вероятности обнаружения наследственных мутаций в генах-участниках клеточного ответа на повреждение ДНК, ассоциированных с развитием рака молочной железы, была сформирована группа пациенток с так называемыми косвенными клиническими признаками наследственного рака. Эти признаки - молодой возраст на момент заболевания, семейная кластеризация, первично-множественный характер - являются основными в клинике наследственных опухолевых синдромов и логично связаны с генетическим механизмом их наследования. Так, известно, что наследование опухолевых синдромов происходит по аутосомно-доминантному типу. Этот факт позволяет предполагать возможное наличие такой же онкологической патологии у родственниц первой линии родства (матери, сестры, реже, дочери). Характерное для наследственных опухолевых синдромов раннее начало заболевания принято связывать с нарушенной функцией опухоль-ассоциированных генов, как правило, вовлеченных в поддержание геномной стабильности и ответ на повреждение ДНК. У носителей наследственной мутации остается лишь один "полноценный" аллель гена, вероятность инактивации которого высока. В случае полного "выключения" одного указанных генов в любой клетке органа-мишени нарушение механизмов поддержания геномной стабильности приводит к скорому накоплению остальных трансформирующих повреждений и, как следствие, раннему возникновению опухоли. Первично-множественный характер опухолевого процесса связан с высокой вероятностью независимой инактивации второго аллеля в разных клетках организма. Исходя из вышеизложенного, в группу пациенток с клиническими признаками наследственного рака молочной железы вошли больные женщины молодого возраста (до 40 лет включительно), пациентки с отягощенным семейным анамнезом (наличие рака молочной железы и/или яичников у матери и/или сестры) и больные билатеральным раком молочной железы.

Анализ 8 повторяющихся мутаций: ИКСА1 5382т$С, 4153с1е1А, ¡Я5(1е!АО, 300Т>С. ВКСА2 6174(1е1Т. СНЕК2 1100с1е1С, 1УЯ2+1С>А. ЫВБ! 657с1е15

На первом этапе в данной группе было проведено генотипирование 8 повторяющихся мутаций: ВЯСА1 5382т5С, 4153с1е1А, 185с1е1АС, 300Т>С, ВЯСА2 6174с1е1Т, СНЕК2 1100<1е1С, 1У82+Ю>А, N681 657с1е15. Частоты мутаций приведены в таблице 3. Вариант ВЯСА1 5382т&С отчетливо преобладал среди других мутаций: данный генетический дефект был выявлен у 37 (11%) из 336 пациенток. На втором месте находился аллель СНЕК2 1100(1е1С, частота которого составила 1.8% (6 пациенток из 336). Аллель ВЯСА1 4153<1е1А обнаруживался у 3 (0.9%) женщин, СНЕК2 1У82+Ю>А - у 2 (0.6%) и ВГ1СА1 185с1е1АО - у 3 (0.9%). Один случай (0.3%) носительства мутации был зарегистрирован для аллеля ВИСА2 6174с1е1Т, еще два случая (0.6%) имели мутацию N881 657ёе15. Мутация ВИСА1 300Т>С (С6Ю) не была выявлена ни в одном из проанализированных случаев. В целом, наследственные мутации присутствовали у 22/148 (15%) пациенток с билатеральными карциномами и в 32/188 (17%) случаях раннего и/или семейного РМЖ. Таким образом, общее количество РМЖ-ассоциированных аллелей, обнаруженных среди пациенток с косвенными

признаками наследственного рака, на данном этапе составило 54 (16%). Мутации в гене ВЯСА1 значимо преобладали над другими генетическими дефектами, составляя 80% (43/54) от всех вариантов и присутствуя у 13% (43/336) обследованных женщин.

При анализе распределения мутаций среди пациенток с синхронным и метахронным БРМЖ никаких особенностей выявлено не было. Частоты мутаций незначительно преобладали в случаях синхронного БРМЖ (10/56 (18%) в синхронных опухолях уб. 12/92 (12%) в метахронных опухолях, р=0.575).

Связь между вероятностью обнаружения "{Ъипс1ег"-мутаций и числом косвенных клинических признаков наследственного рака (билатеральность, молодой возраст, семейная история) проанализирована в таблице 4. Для мутаций ВЛСА1 была выявлена тенденция к аккумуляции у пациенток с несколькими признаками генетической предрасположенности к РМЖ (2 или 3 признака: 14/65 (21.5%); 1 признак: 29/271 (10.7%); р = 0.032). Однако если оценивать все мутации вместе, эта зависимость не достигает статистической достоверности (2 или 3 признака: 15/65 (23%); 1 признак: 39/271 (14.4%); р = 0.127). Наибольшая частота мутаций наблюдалась у пациенток молодого возраста с билатеральным раком молочной железы (28.6% и 31%, в сочетании билатеральное™ и молодого возраста и всех трех признаков, соответственно).

Таблица 3. Встречаемость повторяющихся мутаций в РМЖ «высокого риска».

Билатеральный РМЖ (n = 148) Ранний и/или семейный монолатеральный РМЖ (п= 188) Всего (п = 336)

BRCA1 5382 insC 17(11.5%) 20(10.6%) 37(11%)

BRCA1 4153delA 1 (0.7%) 2(1%) 3 (0.9%)

BRCA1 185delAG 1 (0.7%) 2(1%) 3 (0.9%)

BRCA1 300T>G - -

BRCA2 6174delT 1 (0.7%) - 1 (0.3%)

CHEK2 1 lOOdelC 1 (0.7%) 5 (2.7%) 6(1.8%)

CHEK2 IVS2+1G>A 1 (0.7%) 1 (0.5%) 2 (0.6%)

NBS1 657del5 - 2(1%) 2 (0.6%)

Всего 22 (15%) 32(17%) 54(16%)

Таблица 4. Количество косвенных клинических признаков наследственного РМЖ и вероятность носительства наследственной мутации.

Клинический признак наследственного РМЖ BRCA1 мутации (%) Все наследственные мутации (%)* Описание мутаций

3 признака: билатерапьность + молодой возраст + семейная история 3/13 (23%) 4/13 (31%) ВЯСА1 5382тзС (п = 3), СНЕК2 1У82+Ю>А(п= 1)

2 признака 11/52 (19.6%) 11/52 (19.6%) ВЯСА1 53821шС (п = 9), ВКСА1 4153с1е1А(п= 1), ВКСА1 185с1е1АО (п= 1)

билатеральность + молодой возраст 6/21 (28.6%) 6/21 (28.6%) ВЯСА1 5382т$С (п = 4), ВКСА1 4153с1е1А (п = 1), В11СА1 185(1е1АО (п = 1)

билатеральность + семейная история 2/17(11.8%) 2/17(11.8%) В11СА1 5382т5С (п = 2)

молодой возраст + семейная история 3/14(21.4%) 3/14(21.4%) В[?СА1 5382Ш5С (п = 3)

1 признак 29/271 (10.7%) 39/271 (14.4%) ВЯСА1 5382тзС (п = 25), ВКСА1 4153<1е1А (п = 2), ВКСА1 185ёе1АС (п=2), В1*СА2 6174с1с1Т (п = 1), СНЕК2 110(Ие1С (п = 6), СНЕК2 1У52+Ю>А (п = 1), ЫВ51657с1е15(п = 2),

билатеральность 8/97 (8.2%) 10/97(10.3%) В11СА1 5382шьС (п = 8), ВЯСА2 6174с1е1Т (п = 1), СНЕК2 1100с1е1С (п = 1)

молодой возраст 10/87(11.5%) 14/87(16.1%) ВИСА1 5382ш$С (п = 6), ВЯСА1 4153с1е1А (п = 2), СНЕК2 1 Ю0с1е1С (п = 2), ЫВБ1 657(к15 (п = 2), ВКСА1 185с1е1АО (п=2)

семейная история 11/87(12.6%) 15/87 (17.2%) В1*СА1 53821шС (п= 11),СНЕК2 1100с1е1С (п = 3), СНЕК2 ГУ52+Ю>А (п = 1)

*Кроме мутаций в ВИСА!, учитывали наследственные мутации в СНЕК2, ВЯСА2 и ЫВБ!.

Анализ мутации PALB2 l592delT в случаях с клиническими признаками наследственного рака молочной железы

Анализ 114 случаев РМЖ (87 монолатеральных РМЖ и 27 билатеральных РМЖ), негативных в отношении описанных выше мутаций, не выявил не одного случая носительства мутации PALB2 1592delT. Тем не менее, учитывая сообщения о выявлении различных мутаций в гене PALB2 при раке молочной железы в других популяциях, представляется целесообразным провести дальнейший анализ полной кодирующей последовательности этого гена в нашей популяции.

Аначиз полной кодирующей последовательности гена BRCA1

Повреждения гена BRCA1 имеют наибольшую клиническую значимость в отношении развития рака молочной железы. Учитывая это, на втором этапе было решено провести анализ полной кодирующей последовательности гена BRCA1 с целью ответа на два вопроса: действительно ли выбранная панель из 8 мутаций включает все наиболее распространенные в нашей стране дефекты этого гена и какая доля повреждений BRCA1 представлена редкими ("non-founder") вариантами.

94 случая (86 монолатеральных РМЖ и 8 билатеральных РМЖ), в которых не было обнаружено ни одной из 8 вышеуказанных мутаций, были подвергнуты высокоточному анализу кинетики плавления ПЦР-продуктов. При этом было выявлено 6 новых мутаций с повреждающим эффектом: 2080delA (K654SfsX47), 4808 C>G (Y1563X), 5236 G>A (G1706E), 5214 C>T (R1699W), 5460G>T (E1781X), 5622 C>T(R1835X). Пять из указанных повреждений уже были описаны в других популяциях (Curci et al., 2002; BIC database; Osorio et al., 2002), тогда как мутация 5460G>T представляется новой. 4 мутации (2080delA, 4808 C>G, 5460G>T, 5622 C>T) приводят к сдвигу рамки считывания или преждевременному образованию стоп-кодона и поэтому обладают очевидным патогенным эффектом. Миссенс-мутация 5214 С>Т (R1699W), по классификации базы данных BIC (Breast Information Core, research.nhgri.nih.gov/bic/), также относится к РМЖ-ассоциированным. Другая обнаруженная нами миссенс-мутация, 5236 G>A, приводит к замене глицина на глютаминовую кислоту в позиции 1706. Согласно базе данных BIC, значение этой мутации остается неясным. Тем не менее, в ряде исследований приводятся весомые доказательства в пользу патогенного влияния этой замены (Osorio et al„ 2002; Abkevich et al, 2004; Mirkovic et al, 2004; Carvalho et al., 2007; Easton et al, 2007; Gomez Garcia et al, 2009). Кроме того, нами был выполнен анализ потери гетерозиготности BRCA1 в опухолевой ткани молочной железы пациентки с данной мутацией. В результате была обнаружена делеция нормального аллеля, что косвенно свидетельствует о повреждающем характере мутации G1706E.

Отметим, что ни одна из новых мутаций, обнаруженных при секвенировании, не повторялась в нашем исследовании. Суммарная частота редких повреждений в группе, негативной в отношении "founder''-мутаций, составила 6/94 (6%).

Ранее в нашей стране была описан только один случай носительства вышеупомянутых редких мутаций - 2080delA при раке яичника (Smirnova et al, 2007). Кроме того, мутация 2073delA, описанная Gayther и соавторами (1999) также в российской популяции, является, по сути, тем же самым повреждением (в данном участке находится последовательность из 8 адениловых нуклеотидов). Таким образом, данный вариант может рассматриваться как повторяющийся в нашей популяции. В связи с этим мы дополнительно протестировали еще 95 образцов из группы РМЖ

"высокого риска" и выявили еще один случай носительства данного повреждения. Частота данной мутации в группе монолатерального РМЖ составила 1/184 (0.5%).

Таким образом, все вышеописанные варианты, за исключением 2080delA, могут быть отнесены к числу редких ("non-founder").

Клинические характеристики пациенток с редкими мутациями представлены в таблице 5.

Анализ крупных перестроек в гене BRCA1

Далее, методом множественной лигазозависимой амплификации проб в двух из 81 образца (2.5%) детектированы крупные мутации (делеция экзонов 1-2 в одном случае и делеция экзонов 3-7 - в другом) (таблица 5).

Таблица 5. Характеристика пациенток с редкими повреждениями ВЯСА1, включая крупные перестройки.

# Мутация BRCA1 Монолатеральный/ билатеральный РМЖ Возраст на момент диагноза Семейная история

1083 K654SfsX47 (2080delA) билатеральный, синхронный 44 нет

498 4808 C>G (Y1563X) монолатеральный 36 нет

566 5236 G>A (G1706E), монолатеральный 31 нет

DS-Ki 5214 C>T (R1699W), монолатеральный 30 РМЖ у матери

360 5460G>T (E1781X) монолатеральный 43 РМЖ у матери

1100 5622C>T (R1835X) монолатеральный 32 РМЖ у матери

178 Делеция экзонов 1-2 монолатеральный 44 РМЖ у сестры

990 Делеция экзонов 3-7 монолатеральный 39 нет

1012 K654SfsX47 (2080delA) монолатеральный 47 рак яичника у матери

Итого, в результате исследования обнаружено 63 наследственные мутации, что позволило говорить об ассоциации РМЖ с носительством наследственной мутации у 18.7% обследованных пациенток. 37 (60%) из них составили носительницы аллеля ВИСА! 5382ш5С, 6 (10%) - СНЕК2 1100ёе1С, 3 (5%)- ВЫСА1 4153ёе1А, 3 (5%)-

ВЫСА1 185с1е1АО, 14 (22%) - пациентки с другими генетическими дефектами. При этом на долю четырех наиболее частых выявленных мутаций - ВЯСА1 5382т8С, 4153с1е1А, 185delAG, СНЕК2 110(Ме1С - приходится 80% всех обнаруженных повреждений. Число мутаций в гене ВЯСА1 составило 52 (83%), включая редкие варианты и крупные перестройки. Общее количество обнаруженных различных типов мутаций составило 15.

Таким образом, значительное число наследственных РМЖ в России может быть выявлено с помощью небольшого числа относительно простых ПЦР-тестов. Некоторые мутации (ВКСА1 5382Ш5С, ВЯСА1 4153ае1А, ВИСА1 185delAG и СНЕК2 1100delC и) заслуживают наиболее пристального внимания и должны быть рекомендованы для обследования всех больных РМЖ. Детекция мутаций СНЕК2 1У82+Ю>А, ВИСА2 6174delT и ИВ81 657del5 в «случайной» выборке РМЖ представляется менее целесообразной; анализ этих вариантов может быть ограничен группами высокого риска. Следует также принять во внимание тот факт, что доля редких мутаций в гене ВКСА1 довольно значима (6 из 52 (11%) выявленных повреждений). В ряде случаев, на наш взгляд, можно рассматривать вопрос об анализе всей последовательности ВИСА1 и, возможно, ВЯСА2. Еще несколько лет назад это казалось для нашей страны нереалистичным, однако, быстрое развитие методологии молекулярного анализа и, в частности, появление технологии высокоточного анализа кинетики плавления делает возможным быстрый анализ полной последовательности генов. Учитывая значительную долю редких повреждений ВКСА1 и высокую предиктивную значимость носительства мутаций в этом гене, целесообразно выполнять анализ полной кодирующей последовательности ВЯСА1/2 в группе пациенток "высокого риска" РМЖ, негативных в отношении повторяющихся мутаций.

Анализ экспрессии генов после воздействия гамма-излучением в лимфоцитах больных раком молочной железы и здоровых женщин

На первом этапе анализа были отобраны гены, экспрессия которых изменялась в результате облучения в два и более раз. Отбор производили путем построения графика рассеяния на образцах лимфоцитов, полученных от здоровых доноров. Коэффициент корреляции базальных уровней экспрессии в этих образцах был равен И =0.8089. В результате было отобрано 2347 генов, экспрессия которых изменялась в результате действия облучения в суммарной дозе 3 Гр.

Далее уровни экспрессий в образцах после облучения были нормализованы относительного базального уровня (до облучения) и подвергнуты иерархическому кластерному анализу по 2347 переменным. В результате кластерного анализа нами был выделен сет из 62 генов, по уровням экспрессий которых образцы статистически достоверно разделились на две группы (р<0.001, критерий Уилкоксона). Дендрограмма представлена на рисунке 2.

Рисунок 2. Результат кластерного анализа нормализованных по базальному уровню экспрессии генов образцов после облучения. На представленной дендрограмме (heat map) столбцы соответствуют образцам, а ячейки - отношениям уровней экспрессии до и после воздействия, выраженным в log2. Отношения экспрессий варьировали от -3.2 (синий цвет) до +5.4 (красный цвет).

Сравнение групп, выделенных при кластерном анализе, по средним уровням экспрессии 62 генов позволило обозначить группу "со слабым транскрипционным ответом" (справа на дендрограмме) и группу "с нормальным транскрипционным ответом" (слева на дендрограмме) (таблица 6).

Таблица 6. Уровни экспрессии генов в группах со слабым и нормальным транскрипционным ответом на облучение в дозе 3 Гр через 4 часа. В таблице представлены гены, продемонстрировавшие наибольшее различие в группах.

Номер мРНК в базе данных GeneBank Ген Нормализованные уровни экспрессии в группе со слабым ответом, log 2 Нормализованные уровни экспрессии в группе с нормальным ответом, 1о%2 Снижение экспрессии в группе со слабым ответом (разы)

NM_022767 ISG20L1 -0.72133 3.22529 15.418

NM_006273 CCL7 -1.00012 1.6332 6.204

NM_001511 CXCL1 -1.27491 1.31704 6.029

NMJXJ1030287 ATF3 -0.64922 1.71078 5.133

NMJ 75876 EXOC8 -0.88838 1.44909 5.054

NM_004110 FDXR -0.34601 1.92224 4.817

NM_021127 PMAIP1 0.09891 2.33922 4.724

NM_032413 C15orf48 -0.51153 1.64355 4.453

NM_052889 COP1 -0.63314 1.49815 4.381

NM_005084 PLA2G7 -0.26714 1.77877 4.129

NM_022763 FNDC3B -0.38 1.6278 4.021

NM_016283 TAF9 -0.15149 1.64911 3.483

NM_018664 SNFT -1.03636 0.76339 3.481

NM_080593 HIST1H2BK -0.42824 1.37075 3.479

NMJM4417 BBC3 -0.03694 1.72168 3.383

NM_000107 DDB2 -0.28151 1.45821 3.339

NM_002592 PCNA 0.09021 1.77157 3.207

XM_926913 LOC653328 -0.25966 1.38563 3.128

XM_497072 LOC389787 -0.42344 1.21392 3.11

NM_002123 HLA-DQB1 -0.22421 1.40075 3.084

Детальный анализ данного кластера в отношении функций образующих его генов и их регуляции белком р53 (таблица 7) выявил, что не менее 25% составляющих его генов являются р53-зависимыми и относящимся к радиационно-индуцируемым (Stoyanova Т et al, 2009; Yang ТГ et al., 2009; Takahashi К et al, 2009; Demidova AR et al, 2009; Reynolds R et al., 2004; Stoimenov I and Helleday T, 2009; Rozenfeld-Granot G et al., 2002; Liu G et al., 2002; Sunirmal P et ai, 2008; Kawase T et al, 2008; Zhou J et al., 2002). Это, в свою очередь, позволило сделать вывод, что изменение экспрессии данных генов отражает транскрипционный ответ на повреждение ДНК, вызванное радиацией.

Таблица 7. Функции генов предполагаемого "кластера транскрипционного ответа на повреждение ДНК".

Ген Описание, функция Есть данные о регуляции белком р53

ISG20L1 (AEN) Apoptosis Enhanced Nuclease, разрезание ДНК при апоптозе да

CCL7 хемокин нет

CXCL1 GROl, хемокин, есть данные об индукции радиацией да

ATF3 транскрипционный фактор, апоптоз, регуляция клеточного цикла, ингибирует фосфатазу Cdc25 да

EXOC8 exocyst complex component 8, формирование микровезикул нет

FDXR апоптоз, индуцированный оксидативным стрессом да

PMAIP1 (NOXA) апоптоз да

C15orf48 (FOAP-11) Normal mucosa of esophagus specific 1, функция не известна нет

COP1 убиквитин-лигаза, взаимодействует с р53 да

PLA2G7 фосфолипаза, воспаление нет

FNDC3B не известна нет

TAF9 транскрипционный фактор, взаимодействует с р53 да

SNFT транскрипционный репрессор, ATF-like 3 нет

HIST1H2BK гистон нет

ВВСЗ (PUMA) апоптоз да

DDB2 Damage-specific DNA binding protein 2, репарация ДНК да

PCNA репарация ДНК да

LOC653328 схожий с рибосомальным белком S27 нет

LOC389787 схожий с Translationally-controlled tumor protein нет

HLA-DQB1 антиген лимфоцитов нет

В таблице 8 приведено сравнение характеристик пациенток и здоровых женщин из групп со слабым и нормальным транскрипционным ответом на повреждение ДНК.

Таблица 8. Характеристики пациенток и здоровых женщин, лимфоциты которых были подвергнуты фенотипическому тесту.

Группа со слабым ответом Группа с нормальным ответом

1. Пациентка с метахронным БРМЖ, первая опухоль в 43 года 1. Здоровая женщина

2. Пациентка с синхронным БРМЖ, возраст на момент диагноза 44 года, РМЖ V матери 2. Здоровая женщина

3. Пациентка с синхронным БРМЖ, 58 лет, носитель мутации ВЯСА! 4153delA 3. Пациентка с РМЖ, 74 года

Из данного описания видно, что 3 пациентки, имеющие признаки наследственной предрасположенности (относительно молодой возраст, семейный анамнез, носительство наследственной мутации), формируют группу со "слабым" ответом на повреждение ДНК. В то же время, пожилая пациентка, не имеющая случаев заболеваний в семье, оказывается в группе с "нормальным" ответом, что указывает на предположительно спорадический характер ее заболевания.

Следует учесть, что данное функциональное исследование, выполненное на ограниченном количестве образцов, носит предварительный ("пилотный") характер. Полученные на данном этапе результаты требуют подтверждения в расширенном исследовании с использованием ограниченной группы генов, продемонстрировавших наибольшие различия в группах со слабым и нормальным транскрипционным ответом на повреждение ДНК.

выводы

1) У российских пациенток с клиническими признаками наследственного РМЖ обнаруживается высокая частота некоторых «повторяющихся» мутаций в генах ВЯСА1 (5382шбС - 11%; 4153с1е1А - 0.9%; 2080с1е1А - 0.5%), СНЕК2 (1100с1е1С -1.8%; СНЕК2 ¡уз2+Ю>А - 0.6%) и ЫВ51 (657с1е15 - 0.6%).

2) Повторяющиеся мутации ВЯСА1 300Т>С и РАЬВ2 1592с1е1Т в исследовании обнаружены не были, что может свидетельствовать об их незначительном вкладе в развитие наследственного РМЖ в России.

3) Уникальные РМЖ-предрасполагающие варианты гена В11СА1 встречаются реже повторяющихся дефектов данного гена. В ходе работы обнаружены следующие мутации в гене ВЯСА1: 52 МОТ, 5460С>Т, 5236С>А, 48080С, 52МОТ, делеции экзонов 1-2 и 3-7.

4) Высокоточный анализ кинетики плавления ПЦР-продуктов представляется эффективным экспресс-методом поиска мутаций в генах наследственного рака.

5) Транскрипционный ответ лимфоцитов на облучение у больных с признаками наследственной предрасположенности к РМЖ отличается от такового у здоровых женщин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Семиглазов В.Ф., Бит-Сава Е. М., Соколенко А.П.. Имянитов E.H. Клинические и генетические аспекты наследственного рака молочной железы II Медицинский академический журнач-2ООб.-т. 6.-С.95-101

2. Соколенко А.П., Розанов М.Е., Митюшкина Н.В., Шерина Н.Ю., Иевлева А.Г., Чекмарева Е.В., Буслов К.Г., Шилов Е.С., Того A.B., Бит-Сава Е.М., Воскресенский Д.А., Чагунава O.JL, Трофимов Д.Ю., Коваленко С.П., Devilee P., Cornelisse С., Семиглазов В.Ф., Имянитов Е.И. Наследственные мутации при ранних, семейных и билатеральных формах рака молочной железы у пациенток из России // Сибирский онкологический .журиал-2()0?,.-ТЗ.-С. 43-49.

3. Sokolenko А.Р.. Mitiushkina N.V., Buslov K.G., Bit-Sava E.M., Iyevleva A.G., Chekmariova E.V., Kuligina E.Sh., Ulibina Y.M., Rozanov M.E., Suspitsin E.N., Matsko

D.E., Chagunava O.L., Trofimov D.Yu., Devilee P., Cornelisse C., Togo A.V., Semiglazov V.F., Imyanitov E.N. High frequency of BRCA1 5382insC mutation in Russian breast cancer patients // Eur. J. Cancer-2006.-V.42,- P. 1380-1384.

4. Chekmariova E.V., Sokolenko A.P.. Buslov K.G., Iyevleva A.G., Ulibina Y.M., Rozanov M.E., Mitiushkina N.V., Togo A.V., Matsko D.E., Voskresenskiy D.A., Chagunava O.L., Devilee P., Cornelisse C„ Semiglazov V. F., Imyanitov E.N. CHEK2 1 lOdelC mutation is frequent among Russian breast cancer patients // Breast Cancer Res. Treat.- 2006.-V. 100.-P. 99-102.

5. Buslov K.G., Iyevleva A.G., Chekmariova E.V. Suspitsin E.N., Togo A.V., Kuligina E.Sh., Sokolenko A.P.. Matsko D.E., Turkevich E.A., Lazareva Y.R., Chagunava O.L., Bit-Sava

E.M., Semiglazov V.F., Devilee P., Cornelisse C., Hanson K.P., Imyanitov E.N.. NBS1 657del5 mutation may contribute only to a limited fraction of breast cancer cases in Russia Hint. J. Cancer-2005.-V. 114. -P. 585-589.

6. Sokolenko AP. Rozanov ME, Mitiushkina NV, Sherina NY, Iyevleva AG, Chekmariova EV, Buslov KG, Shilov ES, Togo AV, Bit-Sava EM, Voskresenskiy DA, Chagunava OL, Devilee P, Cornelisse C, Semiglazov VF, Imyanitov EN. Founder mutations in early-onset, familial and bilateral breast cancer patients from Russia // Fam. Cancer- 2007.-V. 6.-P. 281286.

7. Olivia Fletcher, Nichola Johnson, Isabel dos Santos Silva, Outi Kilpivaara Kristiina Aittom, Carl Blomqvist, Heli Nevanlinna, Marijke Wasielewski, Hanne Meijers-Heijerboer, Annegien Broeks, Marjanka Schmidt, Laura van 4 Veer, Michael Bremer, Thilo Doerk, Elena Chekmariova, Anna Sokolenko. Evgeny Imyanitov, Ute Haman, Muhammad Rashid, Hiltrud Brauch, Christina Justenhoven, Alan Ashworth, Julian Peto. Family history, genetic testing and clinical risk prediction: pooled analysis of CHEK2*1100delC in 1,828 bilateral breast cancers and 7,030 controls // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. -2009. -V. 18. -P. 230-234.

8. Anna P Sokolenko. Dmitry A Voskresenskiy, Aglaya G Iyevleva, Elena M Bit-Sava, Nadezhda I Gutkina, Maxim S Anisimenko, Nathalia Yu Sherina, Nathalia V Mitiushkina, Yulia M Ulibina, Olga S Yatsuk, Olga A Zaitseva, Evgeny N Suspitsin, Alexandr V Togo, Valéry A Pospelov, Sergey P Kovalenko, Vladimir F Semiglazov and Evgeny N Imyanitov Large family with both parents affected by distinct BRCA1 mutations: implications for genetic testing // Hereditary Cancer in Clinical Practice- 2009. - V. 7. -P.2.

9. Suspitsin EN, Sokolenko AP. Voskresenskiy DA, Ivantsov AO, Shelehova KV, Klimashevskiy VF, Matsko DE, Semiglazov VF, Imyanitov EN. Mixed epithelial/mesenchymal metaplastic carcinoma (carcinosarcoma) of the breast in BRCA1 carrier// Breast Cancer- 2009.-[Epub ahead of print].

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю сердечную признательность научным руководителям диссертационной работы профессору Евгению Наумовичу Имянитову и Виктории Николаевне Горбуновой за постоянное внимание и ценные рекомендации.

Выражаю глубокую благодарность к.м.н. Воскресенскому Д.А., км.н. Долматову Г.Д., а также сотрудникам радиологического отделения за помощь в подготовке материала.

Приношу сердечную благодарность сотрудникам лаборатории генетики опухолей Немецкого Центра Исследований Рака (DKFZ, Гейдельберг, Германия) за помощь в выполнении работы.

От всей души благодарю своих друзей и коллег из лаборатории молекулярной онкологии к.м.н. Суспицына E.H., Иевлеву А.Г., к.б.н. Кулигину Е.Ш., к.б.н. Того A.B., к.б.н. Улыбину Ю.М., Митюшкину Н.В., Городнову Т., Зайцеву O.A., Яцук О.С., Рикунову Л.В., к.м.н. Буслова К.Г. за неустанную поддержку, помощь и теплое отношение.

Подписано в печать «29» октября 2009 г. Формат 60x84/16 Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ № 4-174

Типография «Восстания-1» 191036, Санкт-Петербург, Восстания, 1.

Оглавление диссертации Соколенко, Анна Петровна :: 2009 :: Санкт-Петербург

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Рак молочной железы

1.1.1. Эпидемиология

1.1.2. Факторы риска

1.1.3. Происхождение, развитие и прогрессия рака молочной железы

1.2. Молекулярно-генетическая характеристика рака молочной железы

1.2.1. Молекулярные подтипы рака молочной железы

1.2.2. Молекулярные особенности билатерального рака молочной железы

1.2.3. Наследственные мутации в РМЖ-ассоциированных генах

1.2.4. Тестирование наследственных мутаций в аспекте выбора терапии опухолей молочной железы

1.3. Механизмы клеточного ответа на повреждение ДНК

1.4.Клеточный ответ на повреждение ДНК и канцерогенез 40 1.4.1. Вариации клеточного ответа на повреждение ДНК и предрасположенность к злокачественным новообразованиям

Введение диссертации по теме "Онкология", Соколенко, Анна Петровна, автореферат

Актуальность проблемы

Поддержание стабильности генома — одно из фундаментальных свойств живого. Клеточная ДНК постоянно подвергается действию различных генотоксических факторов экзогенной (ультрафиолетовое и ионизирующее излучение, химические мутагены) и эндогенной (активные радикалы кислорода) природы. Молекулярные механизмы клетки, обеспечивающие ответ на повреждение ДНК (DNA damage response, DDR), представлены целой сетью динамично взаимодействующих белков и белковых комплексов, которые способны распознавать повреждения ДНК, "сигнализировать" клетке о необходимости остановки клеточного цикла, устранять повреждение или элиминировать генетически-нестабильные клетки путем индукции клеточной гибели (Bartek and Lukas, 2007). Нарушения в системе ответа на повреждение ДНК могут приводить к порокам развития или иным генетически-ассоциированным патологическим состояниям, включая тяжелые иммунодефицита и нейродегенеративные синдромы, преждевременное старение и рак (Lehmann, 2003; Hoeijmakers, 2001). В частности, все известные на настоящий момент наследственные мутации, ассоциированные с развитием рака молочной железы (РМЖ), локализуются в генах репарации ДНК и/или апоптоза: BRCA1, BRCA2, СНЕК2, NBS1, PALB2 (Iau et al., 2001; Simpson, 2007).

РМЖ с носительством наследственной мутации только у части пациенток с признаками наследственной формы данной патологии. Что важно, носительство наследственного дефекта в генах ответа на повреждение ДНК требует модификации лечебных мероприятий (Byrski et at, 2008; Foulkes et al., 2006; Plummer et at, 2008). В частности, убедительные данные получены для гена BRCA1, мутации в котором обуславливают резистентность опухоли к таксанам и высокую чувствительность к препаратам платины и PARP-ингибиторам (Kennedy et at, 2004; Tutt and Ashworth, 2008; Byrski et at, 2008). Таким образом, молекулярно-генетический анализ в данном случае становится компонентом индивидуализации химиотерапии.

Известно, что одним из эффектов ответа на повреждение является изменение транскрипционного профиля (d'Adda di Fagagna, 2008), обусловленное активацией транскрипционного регулятора р53 {Riley et at, 2008). Роль генетического компонента в индивидуальной способности к транскрипционному ответу на повреждение ДНК в фенотипических исследованиях уже продемонстрирована {Gatti et at, 2001; Correa et at, 2004). Представляется актуальным сравнить этот ответ у больных раком молочной железы с признаками наследственной предрасположенности и здоровых женщин без случаев онкологической патологии в фенотипическом тесте на изменение экспрессии генов после индукции повреждения ДНК гамма-излучением {Jen and Cheung, 2003).

Цели и задачи исследования

Цель настоящей работы — охарактеризовать спектр наследственных мутаций в известных РМЖ-ассоциированных генах ответа на повреждение ДНК, а также выяснить, существуют ли отличия в способности к ответу на повреждение ДНК у здоровых женщин без случаев онкологической патологии в семье и пациенток с раком молочной железы.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1) Оценить встречаемость повторяющихся РМЖ—ассоциированных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, СНЕК2, PALB2, NBS1 в группе пациенток с клиническими признаками наследственного рака молочной железы в российской популяции.

Научная новнзна полученных результатов

Практическая значимость

Полученные данные о частоте встречаемости различных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, СНЕК2, NBS1, PALB2 могут быть использованы в молекулярно-эпидемиологических исследованиях, направленных на выявление повреждений, ассоциированных с другими новообразованиями. Продемонстрирована возможность использования фенотипического теста для выявления лиц с нормальным и слабым транскрипционным ответом на повреждение ДНК.

Апробация работы

Результаты работы были представлены на Ежегодной Конференции Американской Ассоциации по изучению рака (AACR Annual Meeting 2007, 14-18 апреля, Лос-Анджелес, США), на Международной Конференции "Генетика в России и в мире", посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН, 2006 (28 июня-2 июля, Москва), на Международном конгрессе по изучению противоопухолевой терапии (ICACT 18th International Congress on Anti Cancer Treatment, 6-9 февраля 2007, Париж, Франция) и на Российской конференции по фундаментальной онкологии "Петровские чтения - 2009" (17 апреля, Санкт-Петербург).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 119 страницах и состоит из введения, глав материалов и методов, результатов, обсуждения полученных данных и выводов. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 13 таблицами. Библиографичекий указатель включает 174 источника, в том числе 8 отечественных и 166 зарубежных.

Заключение диссертационного исследования на тему "Клеточный ответ на повреждение ДНК и предрасположенность к раку молочной железы"

выводы

1) У российских пациенток с клиническими признаками наследственного РМЖ обнаруживаются следующие «повторяющиеся» мутации: BRCA1 5382insC (11%), BRCA1 4153delA (0.9%), BRCA1 185delAG (0.9%), BRCA1 2080delA (0.5%), CHEK2 llOOdelC (1.8%), CHEK2 ivs2+lG>A (0.6%), NBS1 657del5 (0.6%), BRCA2 6174delT (0.3%). Суммарная частота повторяющихся мутаций в исследованной группе составила 16%.

2) Повторяющиеся мутации BRCA1 300T>G и PALB2 1592delT в исследовании обнаружены не были, что может свидетельствовать об их незначительном вкладе в развитие наследственного РМЖ в России.

3) Уникальные РМЖ-предрасполагающие варианты гена BRCA1 встречаются реже повторяющихся дефектов данного гена (суммарная частота - 6%). В ходе работы обнаружены следующие мутации в гене BRCA1: 5214С>Т, 5460G>T, 5236G>A, 4808C>G, 5214С>Т, делеции экзонов 1-2 и 3-7.

1.5. Заключение

Представляется целесообразным охарактеризовать спектр наследственных мутаций, ассоциированных с развитием рака молочной железы, в российской популяции. Полученные в ходе исследования результаты могут служить обоснованием для включения тех или иных генетических дефектов в панель для рутинной диагностики.

Во второй части данной работы предпринята попытка выяснить, насколько велика роль индивидуальных конституциональных особенностей в предрасположенности к злокачественным новообразованиям с помощью функционального теста, а именно оценки транскрипционного ответа на повреждение ДНК, индуцированное радиацией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Общая схема исследования

Диссертационная работа содержит две части: основная часть посвящена характеристике спектра наследственных мутаций в генах BRCA1, BRCA2, СНЕК2, NBS1, PALB2; дополнительная - анализу экспрессии генов, индуцированной, радиацией, в лимфоцитах больных и здоровых женщин. Далее схематично представлены основные этапы работы

Спектр наследственных мутаций в группе РМЖ "высокого риска"

N=336

Детекция мутаций:

BRCA1 5382insC, BRCA1 4153delA, BRCA1 185delAG, BRCA1 300T>G, BRCA2 6174delT, CHEK2 llOOdelC, CHEK2 IVS2+1G>A, NBS1 657del5

Детекция мутации

PALB2 1592delT

N=94

Анализ полной кодирующей по с ледовательности гена BRCA1

Анализ потери гетерозиготности

Дополнительный анализ мутации BRCA1 2080delA (N=95)

N=81

Детекция крупных перестроек в гене BRCA1

Фенотипический тест: анализ изменения экспрессии генов в результате облучения (12 образцов от 6 индивидуумов)

2.2. Группа пациенток

Для настоящей работы из банка образцов ДНК больных раком молочной железы, проходивших лечение в НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова в период с 1999 по 2008 гг.

Санкт-Петербург), было отобрано 336 случаев с косвенными клиническими признаками наследственного рака молочной железы. К косвенным клиническим признакам были отнесены раннее начало заболевания (до 40 лет включительно), отягощенный семейный анамнез (случаи рака молочной железы и/или яичников у матери и/или сестры), билатеральность поражения. Исследуемая группа включала 148 пациенток с билатеральным РМЖ и 188 случаев ранних и/или семейных форм монолатерального

РМЖ. Группа билатерального РМЖ состояла из 56 синхронных и 92 метахронных случаев заболевания. В случае синхронного рака временной интервал между развитием контралатеральных опухолей составлял менее одного года. Средняя продолжительность временного интервала между развитием опухолей при метахронном РМЖ составила 9.74 года (интервал 2-32 года). Состав группы билатерального РМЖ в отношении количества косвенных признаков наследственной формы заболевания был следующий: 13 случаев с сочетанием всех трех признаков наследственного рака, 21 случай с ранним началом заболевания, 17 случаев с отягощенным семейным анамнезом и 97 случаев только с признаком билатеральности. Средний возраст пациенток на момент возникновения первой опухоли составлял 49.6 лет (возрастной интервал: 25-85 лет), контралатерального новообразования - 55.7 лет (возрастной интервал: 28-87 лет). Диагноз случаев БРМЖ, вошедших в исследуемую группу, был установлен в период с 1984 по 2006 год. 109 образцов ДНК было получено из архивного патоморфологического материала (срезы с парафиновых блоков, содержащих только нормальную ткань молочной железы) и 43 выделено из лейкоцитов периферической крови. Группа монолатерального РМЖ включала 87 случаев раннего рака, 87 пациенток, отобранных в связи с наличием семейной истории, а также 14 больных с сочетанием указанных признаков. Средний

44 возраст пациенток с монолатеральным РМЖ составил 43.7 лет (возрастной интервал: 2578 лет). Диагноз случаев монолатерального РМЖ, вошедших в исследуемую группу, был установлен в период с 1996 по 2005 год. Источником ДНК всех монолатеральных РМЖ были лейкоциты периферической крови. В обобщенном виде характеристика пациенток представлена в таблице 2.

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2009 года, Соколенко, Анна Петровна

1. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения: В 2 т. 2-е изд., перераб. и доп. - СПб.: Наука.-2008 -Т.1 -481 с.

2. Берштейн JI.M. Гормональный канцерогенез // СПб.: Наука, 2000. 199 с.

3. Берштейн Л.М. Онкоэндокринология: традиции, современность и перспективы // СПб.: Наука, 2004. 343 с.

4. Имянитов Е.Н., Хансон К.П. Молекулярная онкология: клинические аспекты // Издательский дом СП6МАПО.-2007.- 211 с.

5. Мерабишвили В.М. Выживаемость онкологических больных // СПб.: ООО «Фирма Коста».-2006. 400 с.

6. Мерабишвили В.М. Злокачественные новообразования в мире, России, Санкт-Петербурге // СПб: ООО «Издательско-полиграфическая компания "Коста"», 2007.-424 С.

7. Семиглазов В.Ф., Бит-Сава Е.М., Соколенко А.П., Имянитов Е.Н. Клинические и генетические аспекты наследственного рака молочной железы // Медицинский академический журнал.- 2006. Т. 6.-С. 95-101.

8. Abkevich V, Zharkikh A, Deffenbaugh AM, Frank D, Chen Y, Shattuck D, Skolnick MH, Gutin A, Tavtigian SV. Analysis of missense variation in human BRCA1 in the context of interspecific sequence variation // J Med Genet, 2004, V. 41, P. 492-507.

9. Arizti P, Fang L, Park I, Yin Y, Solomon E, Ouchi T, Aaronson SA, Lee SW. Tumor suppressor p53 is required to modulate BRCA1 expression // Mol Cell Biol.-2000.-V. 20.-P. 7450-7459.

10. Assenmacher N, Hopfner KP. MRE11/RAD50/NBS1: complex activities // Chromosoma.-2004.-V. 113.-P. 157-166.

11. Bakkenist CJ, Kastan MB. DNA damage activates ATM through intermolecular autophosphorylation and dimer dissociation //Nature.-2003.-V. 421.-P. 499-506.

12. Bartek J, Bartkova J, Lukas J. DNA damage signalling guards against activated oncogenes and tumour progression // Oncogene.-2007.-V. 26.-P. 7773-7779.

13. Bartek J, Lukas J, Bartkova J. DNA damage response as an anti-cancer barrier: damage threshold and the concept of 'conditional haploinsufficiency' // Cell Cycle.-2007.-V. 6.-P. 2344-2347.

14. Bartek J, Lukas J. DNA damage checkpoints: from initiation to recovery or adaptation // Curr Opin Cell Biol.-2007.-V. 19.-P. 238-245.

15. Bogdanova N, Enssen-Dubrowinskaja N, Feshchenko S, Lazjuk GI, Rogov YI, Dammann O, Bremer M, Karstens JH, Sohn C, Dork T. Association of two mutations in the CHEK2 gene with breast cancer // Int J Cancer.-2005.-V. 116.-P. 263-266.

16. Brozek I, Ochman K, Debniak J, Morzuch L, Ratajska M, Stepnowska M, Stukan M, Emerich J, Limon J. High frequency of BRCA1/2 germline mutations in consecutive ovarian cancer patients in Poland // Gynecol 0ncol.-2008.-v. 108.-P. 433-437.

17. Campisi J and d'Adda di Fagagna F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells // Nature Reviews.-2007.-V.8.-P.729-740

18. Camplejohn RS, Hodgson S, Carter N, Kato BS, Spector TD. Heritability of DNA-damage-induced apoptosis and its relationship with age in lymphocytes from female twins // Br J Cancer.-2006.-V. 95.-P. 520-524.

19. CHEK2 Breast Cancer Case-Control Consortium: CHEK2*llOOdelC and susceptibility to breast cancer: a collaborative analysis involving 10,860 breast cancer cases and 9,065 controls from 10 studies // Am J Hum Genet.-2004.-V. 74.-P. 1175-1182.

20. Clemons M, Goss P. Estrogen and the risk of breast cancer // N Engl J Med.-2001.-V. 344.-P. 276-285.

21. Correa CR, Cheung VG. Genetic variation in radiation-induced expression phenotypes // Am J Hum Genet.-2004.-V. 75.-P. 885-890.

22. Coultas L, Strasser A. The molecular control of DNA damage-induced cell death // Apoptosis-2000.-V. 5.-P. 491-507.

23. Csokay B, Tihomirova L, Stengrevics A, Sinicka O, Olah E. Strong founder effects in BRCA1 mutation carrier breast cancer patients from Latvia. Mutation in brief no. 258 // Hum Mutat.-1999.-V. 14.-P. 92.

24. Dawson LA, Chow E, Goss PE. Evolving perspectives in contralateral breast cancer // Eur J Cancer.-1998.-V. 34.-P. 2000-2009.

25. Demidova AR, Aau MY, Zhuang L, Yu Q. Dual regulation of Cdc25A by Chkl and p53-ATF3 in DNA replication checkpoint control // J Biol Chem.-2009.-V. 284.-P. 4132-4139.

26. Dornan D, Wertz I, Shimizu H, Arnott D, Frantz GD, Dowd P, O'Rourke К, Koeppen H, Dixit VM. The ubiquitin ligase COP1 is a critical negative regulator of p53 // Nature.-2004.-V. 429.-P. 86-92.

27. Eliezer Y, Argaman L, Rhie A, Doherty AJ, Goldberg M. The direct interaction between 53BP1 and MDC1 is required for the recruitment of 53BP1 to sites of damage // J Biol Chem.-2009.-V. 284.-P. 426-435.

28. Falck J, Coates J, Jackson SP. Conserved modes of recruitment of ATM, ATR and DNA-PKcs to sites of DNA damage //Nature.-2005.-V. 31.-P. 605-611.

29. Fedier A, Steiner RA, Schwarz VA, Lenherr L, Haller U, Fink D. The effect of loss of Brcal on the sensitivity to anticancer agents in p53-deficient cells // Int J C)ncol.-2003.-V. 22.-P. 1169-1173.

30. Foulkes WD. BRCA1 functions as a breast stem cell regulator // J Med Genet.-2004.-V. 41.-P. 1-5.

31. Frank B, Bermejo JL, Hemminki K, Klaes R, Bugert P, Wappenschmidt B, Schmutzler RK, Burwinkel B. Re: Association of a common variant of the CASP8 gene with reduced risk of breast cancer //J Natl Cancer Inst.-2005.-V. 97.-P. 1012.

32. Gayther SA, Harrington P, Russell P, Kharkevich G, Garkavtseva RF, Ponder BA. Frequently occurring germ-line mutations of the BRCA1 gene in ovarian cancer families from Russia // Am J Hum Genet.-1997.-V. 60.-P. 1239-1242.

33. Greenberg RA, Sobhian B, Pathania S, Cantor SB, Nakatani Y, Livingston DM. Multifactorial contributions to an acute DNA damage response by BRCA1/BARD1-containing complexes // Genes Dev.-2006.-V. 20.-P. 34-46.

34. Gronwald J, Elsakov P, Gorski B, Lubinski J. High Incidence of 4153delA BRCA1 Gene Mutations in Lithuanian Breast- and Breast-ovarian Cancer Families // Breast Cancer Res Treatm.-2005.-V. 94.-P. 111-113.

35. Hakem R, de la Pompa JL, Мак TW. Developmental studies of Brcal and Brca2 knockout mice // J Mammary Gland Biol Neoplasia.-1998.-V. 3.-P. 431-445.

36. Hansen TO, Janson L, Albrechtsen A, Andersen MK, Ejlertsen B, Nielsen FC. Large BRCA1 and BRCA2 genomic rearrangements in Danish high risk breast-ovarian cancer families // Breast Cancer Res Treat.-2009.-V. 115.-P. 315-323.

37. Harper JW, Elledge SJ. The DNA damage response: ten years after // Mol Cell.-2007.-V. 28.-P. 739-745.

38. Hemminki K, Granstrom C. Familial breast carcinoma risks by morphology: a nationwide epidemiologic study from Sweden // Cancer.-2002.-V. 94.-P. 3063-3070.

39. Henderson and Feigelson. Hormonal carcinogenesis // Carcinogenesis.-2000.-V. 21.-P. 427-433.

40. Hoeijmakers JH. Genome maintenance mechanisms for preventing cancer // Nature.-2001.-V. 411.-P. 366-374.

41. Hogervorst FB, Nederlof PM, Gille JJ, McElgunn CJ, Grippeling M, Pruntel R, Regnerus R, van Welsem T, van Spaendonk R, Menko FH, Kluijt I, Dommering C, Verhoef S,

42. Schouten JP, van't Veer LJ, Pals G. Large genomic deletions and duplications in the BRCA1 gene identified by a novel quantitative method // Cancer Res.-2003.-V. 63.-P. 1449-1453.

43. Honeth G, Bendahl PO, Ringner M, Saal LH, Gruvberger-Saal SK, Lovgren K, Grabau D, Ferno M, Borg A, Hegardt C. The CD44+/CD24- phenotype is enriched in basal-like breast tumors // Breast Cancer Res.-2008.-V. 10.-P. 53.

44. Hongbing Zhang, Kumaravel Somasundaram, Yi Peng, Hui Tian, Hongxiang Zhang, Daike Bi, Barbara L Weber, Wafik S El-Deiry. BRCA1 physically associates with p53 and stimulates its transcriptional activity // Oncogene.-1999.-V. 16.-P. 1713-1721.

45. Iau PT, Macmillan RD, Blarney RW. Germ line mutations associated with breast cancer susceptibility // Eur J Cancer.-2001.-V. 37.-P. 300-321.

46. Iijima K, Ohara M, Seki R, Tauchi H. Dancing on damaged chromatin: functions of ATM and die RAD50/MRE11/NBS1 complex in cellular responses to DNA damage // J Radiat Res.-2008.-V. 49.-P. 451-464.

47. Imyanitov E.N., Hanson K.P. Mechanisms of breast cancer // Drug Discov Today Dis Mech.-2004.-V. l.-P. 235-245.

48. Imyanitov EN Breast cancer therapy for BRCA1 carriers: moving towards platinum standard? // Hereditary Cancer in Clinical Practice.-2009.-V. 7.

49. Imyanitov EN, Buslov KG, Suspitsin EN, Kuligina ESh, Belogubova EV, Grigoriev MY, Togo AV, Hanson KP. Improved reliability of allele-specific PCR // Biotechniques.-2002.-V. 33.-P. 484,486,488 passim.

50. Imyanitov EN, Grigoriev MY, Gorodinskaya VM, Kuligina ES, Pozharisski KM, Togo AV, Hanson KP. Partial restoration of degraded DNA from archival paraffin-embedded tissues //Biotechniques.-2001.-V. 3l.-P. 1000, 1002.

51. Imyanitov EN, Suspitsin EN, Grigoriev MYu, Togo AV, Kuligina ESh, Belogubova EV, Pozharisski KM, Turkevich EA, Rodriguez C, Cornelisse CJ, Hanson KP, Theillet C.

52. Concordance of allelic imbalance profiles in synchronous and metachronous bilateral breast carcinomas // Int. J. Cancer.-2002.-V. 100.-P.557-564.

53. Ivaylo Stoimenov and Thomas Helleday. PCNA on the crossroad of cancer // Biochemical Society Transactions.-2009.-V. 37.-P. 605-613.

54. Jensen HM. On the origin and progression of human breast cancer // Am J Obstet Gynecol.-1986.-V. 154.-P. 1280-1284.

55. Kaufman B, Laitman Y, Gronwald J, Lubinski J, Friedman E. Haplotype of the C61G BRCA1 Mutation in Polish and Jewish Individuals // Genet Test Mol Biomarkers.-2009.-V. 13.-P. 465-469.

56. Kawase T, Ichikawa H, Ohta T, Nozaki N, Tashiro F, Ohki R, Taya Y. p53 target gene AEN is a nuclear exonuclease required for p53-dependent apoptosis // Oncogene.-2008.-V. 27.-P. 3797-3810.

57. Khanna KK, Jackson SP. DNA double-strand breaks: signaling, repair and the cancer connection //Nat Genet.-2001.-V. 27.-P. 247-254.

58. Kiang DT, Kennedy BJ, Snover DC. Biological and histological characteristics of simultaneous bilateral breast cancer // Lancet.-1980.-V. 22.-P, 1105-1107.

59. Kobayashi J, Iwabuchi K, Miyagawa K, Sonoda E, Suzuki K, Takata M, Tauchi H. Current topics in DNA double-strand break repair 11J Radiat Res.-2008.-V. 49.-P. 93-103.

60. Kollias J, Pinder SE, Denley HE, Ellis IO, Wencyk P, Bell JA, Elston CW, Blarney RW. Phenotypic similarities in bilateral breast cancer // Breast Cancer Res Treat.-2004.-V. 85.-P. 255-261.

61. Kuo LJ, Yang LX. Gamma-H2AX a novel biomarker for DNA double-strand breaks // In Vivo.-2008.-V. 22.-P. 305-309.

62. Lafarge S, Sylvain V, Ferrara M, Bignon YJ. Inhibition of BRCA1 leads to increased chemoresistance to microtubule-interfering agents, an effect that involves the JNK pathway // 0ncogene.-2001.-v. 20.-P. 6597-6606.

63. Lee JH, Skalnik DG. Wdr82 is a C-terminal domain-binding protein that recruits the SetdlA Histone H3-Lys4 methyltransferase complex to transcription start sites of transcribed human genes // Mol Cell Biol.-2008.-V. 28.-P. 609-618.

64. Lehmann AR. DNA repair-deficient diseases, xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and trichothiodystrophy //Biochimie.-2003.-V. 85.-P. 1101-1 111.

65. Lehmann BD, Paine MS, Brooks AM, McCubrey JA, Renegar RH, Wang R, Terrian DM. Senescence-associated exosome release from human prostate cancer cells // Cancer Res.-2008.-V. 68.-P. 7864-7871.

66. Levine AJ, Hu W, Feng Z. The P53 pathway: what questions remain to be explored? // Cell Death Differ.-2006.-V. 13.-P. 1027-1036.

67. Liu G, Chen X. The ferredoxin reductase gene is regulated by the p53 family and sensitizes cells to oxidative stress-induced apoptosis // Oncogene.-2002.-V. 21.-P. 7195-7204.

68. Liu S, Bekker-Jensen S, Mailand N, Lukas C, Bartek J, Lukas J. Claspin operates downstream of TopBPl to direct ATR signaling towards Chkl activation // Mol Cell Biol.-2006.-V. 26.-P. 6056-6064.

69. Liu S, Ginestier C, Charafe-Jauffret E, Foco H, Kleer CG, Merajver SD, Dontu G, Wicha MS. BRCA1 regulates human mammary stem/progenitor cell fate // Proc Natl Acad Sci U S A.-2008.-V. 105.-P. 1680-1685.

70. Ljungman M, Lane DP. Transcription guarding the genome by sensing DNA damage // Nat Rev Cancer.-2004.-V. 4.-P. 727-737.

71. MacCallum DE, Hupp TR, Midgley CA, Stuart D, Campbell SJ, Harper A, Walsh FS, Wright EG, Balmain A, Lane DP, Hall PA. The p53 response to ionising radiation in adult and developing murine tissues // Oncogene.-1996.-V. 13.-P. 2575-2587.

72. MacLachlan TK, Takimoto R, El-Deiry WS. BRCA1 directs a selective p53-dependent transcriptional response towards growth arrest and DNA repair targets // Mol Cell Biol.-2002.-V. 22.-P. 4280-4292.

73. Mailand N, Falck J, Lukas C, Syljuasen RG, Welcker M, Bartek J, Lukas J. Rapid destruction of human Cdc25A in response to DNA damage // Science.-2000.-V. 288.-P. 14251429.

74. Mats Ljungman & David P. Lane. Transcription — guarding the genome by sensing DNA damage //Nature Reviews Cancer.-2004.-V. 4.-P. 727-737.

75. Matsuoka S, Rotman G, Ogawa A, Shiloh Y, Tamai K, Elledge SJ. Ataxia telangiectasia-mutated phosphorylates Chk2 in vivo and in vitro // Proc Natl Acad Sci U S A.-2000.-V. 97.-P. 10389-10394.

76. McHugh PJ, Gill RD, Waters R, Hartley JA. Excision repair of nitrogen mustard-DNA adducts in Saccharomyces cerevisiae // Nucleic Acids Res.-1999.-V. 27.-P. 3259-3266.

77. Mirkovic N, Marti-Renom MA, Weber BL, Sali A, Monteiro AN. Structure-based assessment of missense mutations in human BRCA1: implications for breast and ovarian cancer predisposition // Cancer Res.-2004.-V. 64.-P. 3790-3797.

78. Miyoshi Y, Murase K, Oh K. Basal-like subtype and BRCA1 dysfunction in breast cancers // Int J Clin Oncol.-2008.-V. 13.-P. 395-400.

79. Molavi Diana Weedman, The Practice of Surgical Pathology // Springer Science+Business Media LLC.-2008.-PP. 327.

80. Mullenbach R, Lagoda PJ, Welter C. An efficient salt-chloroform extraction of DNA from blood and tissues // Trends Genet.-1989.-V. 5.-P. 391.

81. Narod SA, Foulkes WD. BRCA1 and BRCA2: 1994 and beyond // Nat Rev Cancer.-2004.-V. 4.-P. 665-676.

82. Neuhausen SL. Founder populations and their uses for breast cancer genetics // Breast Cancer Res.-2000.-V. 2.-P. 77-81.

83. Norbury CJ, Zhivotovsky B. DNA damage-induced apoptosis // Oncogene.-2004.-V. 23.-P. 2797-2808.

84. Papi L, Putignano AL, Congregati C, Piaceri I, Zanna I, Sera F, Morrone D, Genuardi M, Palli D. A PALB2 germline mutation associated with hereditary breast cancer in Italy // Fam Cancer.-2009.-Epub ahead of print.

85. Paull TT, Gellert M. The 3' to 5' exonuclease activity of Mre 11 facilitates repair of DNA double-strand breaks//Mol Cell.-1998.-V. l.-P. 969-979.

86. Paull TT, Lee JH. The Mrel 1/Rad50/Nbsl complex and its role as a DNA double-strand break sensor for ATM // Cell Cycle.-2005.-V. 4.-P. 737-740.

87. Pierce AJ, Stark JM, Araujo FD, Moynahan ME, Berwick M, Jasin M. Double-strand breaks and tumorigenesis // Trends Cell Biol.-2001.-V. 1 l.-P. S52-59.

88. Reis-Filho JS, Tutt AN. Triple negative tumours: a critical review // Histopathology.-2008.-V. 52.-P. 108-118.

89. Reynolds R, Witherspoon S, Fox T. The infant mouse as a in vivo model for the detection and study of DNA damage-induced changes in the liver // Mol Carcinog.-2004.-V. 40.-P. 6272.

90. Rhiem K, Flucke U, Engel C, Wappenschmidt B, Reinecke-Luthge A, Buttner R, Schmutzler RK. Association of the BRCA1 missense variant R1699W with a malignant phyllodes tumor of the breast // Cancer Genet Cytogenet.-2007.-V. 176.-P. 76-79.

91. Rhiem K, Wappenschmidt B, Bosse K, Koppler H, Tutt AN, Schmutzler RK. Platinum Sensitivity in a BRCA1 Mutation Carrier with Advanced Breast Cancer // Clin Oncol (R Coll Radiol).-2009.-V. 21 .-P. 448-450.

92. Riley T, Sontag E, Chen P, Levine A. Transcriptional control of human p53-regulated genes // Nat Rev Mol Cell Biol.-2008.-V. 9.-P. 402-412.

93. Roos WP, Kaina B. DNA damage-induced cell death by apoptosis // Trends Mol Med.-2006.-V. 12.-P. 440-450.

94. Rozenfeld-Granot G, Krishnamurthy J, Kannan K, Toren A, Amariglio N, Givol D, Rechavi G. A positive feedback mechanism in the transcriptional activation of Apaf-1 by p53 and the coactivator Zac-1 // Oncogene.-2002.-V. 21.-P. 1469-1476.

95. Simpson S. PALB2-new breast-cancer susceptibility gene // Lancet C)ncol.-2007.-V. 8.-P. 105.

96. Singletary SE. Rating the risk factors for breast cancer // Ann Surg.-2003.-V. 237.-P. 474-482.

97. Sluiter M, Mew S, van Rensburg EJ. PALB2 sequence variants in young South African breast cancer patients // Fam Cancer.-2009.-Epub ahead of print.

98. Stewart GS, Wang B, Bignell CR, Taylor AM, Elledge SJ. MDC1 is a mediator of the mammalian DNA damage checkpoint //Nature.-2003.-V. 42l.-P. 961-966.

99. Stoyanova T, Roy N, Kopanja D, Bagchi S, Raychaudhuri P. DDB2 decides cell fate following DNA damage // Proc Natl Acad Sci U S A.-2009.-V. 106.-P. 10690-10695.

100. Stucki M, Clapperton JA, Mohammad D, Yaffe MB, Smerdon SJ, Jackson SP. MDC1 directly binds phosphorylated histone H2AX to regulate cellular responses to DNA double-strand breaks // Cell.-2005.-V. 123.-P. 1213-1226.

101. Sunirmal Paul, Ph.D. and Sally A. Amundson, Sc.D. Development of gene expression signatures for practical radiation biodosimetry // Int J Radiat Oncol Biol Phys.-2008.-V. 71.-P. 1236-1244.

102. Suspitsin E.N., Due E.U., Vu P., Hirvonen A., Borresen-Dale A.-L., Imyanitov E.N. TP53 mutations in synchronous and metachronous bilateral breast carcinomas // Cancer Genet. Cytogenet.-2008.-V. 184.-P. 119-121.

103. Takahashi H, Watanabe K, Takahashi M, Taguchi K, Sasaki F, Todo S. The impact of bilateral breast cancer on the prognosis of breast cancer: a comparative study with unilateral breast cancer//Breast Cancer.-2005.-V. 12.-P. 196-202.

104. Takahashi K, Niidome T, Akaike A, Kihara T, Sugimoto HJ. Amyloid precursor protein promotes endoplasmic reticulum stress-induced cell death via C/EBP homologous protein-mediated pathway//Neurochem.-2009.-V. 109.-P. 1324-1337.

105. Tan ВТ, Park CY, Ailles LE, Weissman IL. The cancer stem cell hypothesis: a work in progress // Lab Invest.-2006.-V. 86.-P. 1203-1207.

106. Tassone P, Tagliaferri P, Perricelli A, Blotta S, Quaresima B, Martelli ML et al. BRCA1 expression modulates chemosensitivity of BRCA 1-defective HCC1937 human breast cancer cells // Br J Cancer.-2003.-V. 88.-P. 1285-1291.

107. Taylor RC, Cullen SP, Martin SJ. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level // Nat Rev Mol Cell Biol.-2008.-V. 9.-P. 231-241.

108. Tereschenko IV, Basham VM, Ponder BA, Pharoah PD. BRCA1 and BRCA2 mutations in Russian familial breast cancer // Hum Mutat.-2002.-V. 19.-P. 184.

109. Tikhomirova L, Sinicka O, Smite D, Eglitis J, Hodgson SV, Stengrevics A. High prevalence of two BRCA1 mutations, 4154delA and 5382insC, in Latvia // Fam Cancer. -2005.-V. 4.-P. 77-84.

110. Timothy K. MacLachlan, Rishu Takimoto, Wafik S. El-Deiry. BRCA1 Directs a Selective p53-Dependent Transcriptional Response towards Growth Arrest and DNA Repair Targets // Mol Cell Biol.-2002.-V. 22.-P. 4280^1292.

111. Turner NC, Reis-Filho JS. Basal-like breast cancer and the BRCA1 phenotype // Oncogene.-2006.-V. 25.-P. 5846-5853.

112. Tutt A, Ashworth A. Can genetic testing guide treatment in breast cancer? // Eur J Cancer.-2008.-V. 44.-P. 2774-2780.

113. Uziel T, Lerenthal Y, Moyal L, Andegeko Y, Mittelman L, Shiloh Y. Requirement of the MRN complex for ATM activation by DNA damage // EMBO J.-2003.-V. 22.-P. 5612-5621.

114. Van't Veer LJ, Weigelt B. Road map to metastasis //Nat Med.-2003.-V. 9.-P. 999-1000.

115. Vargo-Gogola T, Rosen JM. Modelling breast cancer: one size does not fit all // Nat Rev Cancer.-2007.-V. 7.-P. 659-72.

116. Weidong Wang. Emergence of a DNA-damage response network consisting of Fanconi anaemia and BRCA proteins // Nature.-2007.-V. 8.-P.735-748.

117. Weigelt В, Bosma AJ, Hart AA, Rodenhuis S, van 't Veer LJ. Marker genes for circulating tumour cells predict survival in metastasized breast cancer patients // Br J Cancer.-2003.-V. 88.-P. 1091-1094.

118. Williams RS, Chasman DI, Hau DD, Hui B, Lau AY, Glover JN. Detection of protein folding defects caused by BRCA1-BRCT truncation and missense mutations // J Biol Chem.-2003.-V. 278.-P. 53007-53016

119. Wittwer CT. High-resolution DNA melting analysis: advancements and limitations // Hum Mutat.-2009.-V. 30.-P. 857-859.

120. Yan J, Kim YS, Yang XP, Li LP, Liao G, Xia F, Jetten AM. The ubiquitin-interacting motif containing protein RAP80 interacts with BRCA1 and functions in DNA damage repair response // Cancer Res.-2007.-V. 67.-P. 6647-6656.

121. Yang J, Yu Y, Hamrick HE, Duerksen-Hughes PJ. ATM, ATR and DNA-PK: initiators of the cellular genotoxic stress responses // Carcinogenesis.-2003.-V. 24.-P. 1571-1580.

122. Yang TT, Hsu CT, Kuo YM Amyloid precursor protein, heat-shock proteins, and Bcl-2 form a complex in mitochondria and modulate mitochondria function and apoptosis in N2a cells // Mech Ageing Dev.-2009.-Epub ahead of print.

123. Yarden RI, Pardo-Reoyo S, Sgagias M, Cowan KH, Brody LC. BRCA1 regulates the G2/M checkpoint by activating Chkl kinase upon DNA damage // Nat Genet.-2002.-V. 30.-P. 285-289.

124. Yoshida K, Miki Y. Role of BRCA1 and BRCA2 as regulators of DNA repair, transcription, and cell cycle in response to DNA damage // Cancer Sci.-2004.-V. 95.-P. 866871.

125. Yu J, Zhang L. The transcriptional targets of p53 in apoptosis control // Biochem Biophys Res Commun.-2005.-V. 331.-P. 851-858.

126. Zhang J, Willers H, Feng Z, Ghosh JC, Kim S, Weaver DT, Chung JH, Powell SN, Xia F. Chk2 phosphorylation of BRCA1 regulates DNA double-strand break repair // Mol Cell Biol, 2004, V. 24, P. 708-718.

127. Zhang X, Miao X, Sun T, Tan W, Qu S, Xiong P, Zhou Y, Lin D. Functional polymorphisms in cell death pathway genes FAS and FASL contribute to risk of lung cancer // J Med Genet.-2005.-V. 42.-P. 479-84.

128. Zhou J, Wang H, Lu A, Hu G, Luo A, Ding F, Zhang J, Wang X, Wu M, Liu Z. A novel gene, NMES1, downregulated in human esophageal squamous cell carcinoma // Int J Cancer. -2002.-V. 10l.-P. 311-316.

129. Zinkel S, Gross A, Yang E. BCL2 family in DNA damage and cell cycle control // Cell Death Differ.-2006.-V. 13.-P. 1351-1359.