Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Клеточные цитотоксические реакции при вирусных гепатитах А и В

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР

МОСКОВСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ имени Г. Н. ГАБРИЧЕВСКОГО

___Цд права х рукописи

Ко-'ггроль'пг.] —

ДЕРЕЧИНСКАЯ Елсна^Лыювн а

КЛЕТОЧНЫЕ ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ РЕАКЦИИ ПРИ ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТАХ А и В

14.00.36—Аллергология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1991

Работа выполнена в Нижегородском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии Министерства здравоохранения РСФСР.

Научный руководитель—доктор медицинских паук Т. В. Блинова.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор В. А. Ляшенко,

доктор медицинских наук, профессор А. В. Змызгова.

Ведущее учреждение—Институт иммунологии Министерства здравоохранения СССР.

Защита состоится «_» _ 1991 г. в часов на

заседании специализированного совета К 084.18.02 Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Г. Н. Габричевского МЗ РСФСР по адресу: 125212 Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИЭМ им. Г. Н. Габричевского МЗ РСФСР.

Автореферат разослан «__»____1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

О. В. Котельникова.

'■CTSrTJte.

0Б1ЦЛЯ XAPAKTEБ1СТИКA PAFOTK.

..-.«¡на!

'-•TA,J1 ,1 Актуальность проблем. Многочисленные фэтсти нпружчшй в идауимоК

^СОрТАЦИЯ!

системе, выявленные при вирусши: гепатитах, япляотся достаточншч для признания участия иммунопатологических реакций в развитии воспалительно-деструктивных процессов в печени (А.Ф.Блюгер.Х.М.Еокслер, 1988; Г.М.Власихина с соавт.,1985; В.й.Покровский, 1985; JU.Jfrndff, с/ id., IS88; TM- ßvrweHv 1ьаб и др.). К числу возможных механизмов развили гепатоцеллюлярного повреждения относят нитотокснчоские реакции, играющие ваюгую роль в осуществлении иммунологического надзора. Способность лимфоцитов разрушать зараженные вирусом клетки обеспечивает удаление из организма инфицированных клеток и вируса, приводя к выздоровлению. С другой стороны, иммунный цитолиз, вызывая гибель значительное количества гепатоцнтов, может привести к нарушении Функции- печении и усугубить инфекционный процесс (Б.Ф.Семенов, 1983 и др.).

На экспериментальных моделях в системе гвпагоциг-лимфоциг показано, что элиминация гепатовдтов, экспрессирующих вирусный антиген, может осуществляться как цитотоксическиш Т-лвмфоцитами, так и ко Т~ клетками, проявляющими активность антителозавиоимьас или натуральшгх киллеров (Ю.П.Гичев,Ж.П.Граудкня,1986{^'^7лг<г''й7^л£., 1984 и др.).

Изучение ¿л Шп? клаточноопосредованяой адтотоксичностя затруднено из-за отсутствия доступных для широкого, применения методов.Результаты исследований относительно роли клеточных цитотоксических ■ реакций в патогенезе острых л хронических гепатитов неоднозначны,чти объясняется большим разнообразием применяемых для анализа клвток-мишеней и методов учета результатов. По мнении ряда авторов, существенная роль в повреждении гепатоцитов при вирусных гепатитах принадлежит лимфоцитам, сенсибилизированным к вирусным или вирусиндуциро ~ ванным аптигенал (A.C.Логинов,Ю.Э.Блок,I9S7; $$лггтг-й с/"¿,1986; ffciüciMi ** и др.). Другие исследова-

TuJiii признаь.л/ большее значении в атом процессе зшшсшаой от антител клеточной цптотокепчности ШЛ.Зимин с соавт.,198-1;Б.С.Каганов, 1984; М. Злг-loioUi eJafrim-,M.3zi"r>l ил!.,ШЪ-% и др.),

ШьЩ^^йЗХУ-Исоледовагь особенности изменений клеточных цитоток-спчоских реакци!! при вирусных гепатитах, определить ролг клеточно -опосредованной щп-отоксячиости в патогенеза заболевания.

Згдачи исслодокаш.я.

1. Разработать сиектрофотометричеекие методы определения антителоза-висимой клеточной цмотоксечности ( АЙКЦ ) и щпютоксической ак -тивностп ( ЦТА ) лимфоцитов, сенсибилизированных к поверхностному антигену вируса гепатита В ( НВуА^ ).

2. Изучить характер изменений ЦТ! .лимфоцитов, сенсибилизированных к Ifflj'A^, у больных острим ц хроническим гепатитом В ( ГВ ).

3. Выявить особенности изменений АЗКЦ у больных при разной форме патологии печени.

4. Установить связь выявленных клеточных цитотоксических реакций с нозологическими формами болезни, стадиями патологического процесса, степенью его выраженности.

Научная новизна работы. Разработан спектрофотсметрический метод определения ЦТА лдыфоцитов, сенсибилизированных к НВ^А^, с использованием в качестве клеток-ьшшаней ( 1Щ ) нативных эритроцитов барана ( ЭБ ), конъюгированных с Iffi^Ajj при помощи хлорного хрома.

Модифицирован спектрофотоыетрический метод оценки АЗКЦ с зашноЛ солянокислого бензццина на ортоЗенилендиамин ( ), используемый в качестве хромогена.

Впервые проведено комплексное исследование двух типов клеточной

'цитотоксичности (ЦТА лшл^штов,сенсибилизированных к ИЬчАо, и аЗКЦ )

<i

и показан их разнонаправленный характер при остром и хроническом ГВ.

Ьыявлены особенности динамики ИГА сонсибиллзировашшх к ИЯ^лимфо-iíütodhA3KU в зависимости от формы гепатита, тяжести течения болезни ч периода обследования, активности патологического процесса и сос. -тояния иммунологического статуса организма.

Впервые проведен сравнительный анализ динамики АЗКЦ при острых 1А и ГВ, хроническом ГВ и хронических заболеваниях желчевыводящих путей ( ЖВП }. Выявлены общие закономерности изменений уровня АЗКЦ, заключающиеся в снижении активности К-клвток, более выраженном при труcmtx гепатитах.

Практическое и теоретическое значение работы. Исследование ЦТЛ лимфоцитов, сенсибилизированных к HB¿Aj, и АЗКЦ позволяет расширить возможности лабораторной диагностики иммунологических нарушений при вирусных гепатитах и заболеваниях печени иной этиологии.Полученные данные об особенностях шкг очных цитотоксичэсшк реакций и их связи с другими к/мунологическими и биохимически.«! показателями активности патологического процесса в печени могут быть полезны для углубления представлений о патогенезе вирусных гепатитов. Установленная связь частоты выявления и степени изменения ЦТА лимфоцитов,сенсибилизированних к HBjAj, и АЗКЦ с тяжестью течения острых; ГА и ГВ позволяет рекомендовать определение клеточноопосредованной цитотоксичности в качестве дополнительного теста для оценки активности патологического процесса.

Разработанные спектрофотометрические методы определения ЦТА лимфоцитов, не требующие дорогостоящих реактивов, оборудования и Применения радиоактивных изотопов, могут быть использованы для оценки сос-тоянияклеточного иммунитета больных вирусными гепатитами и другими заболеваниями печени. По материалам работы составлены методические рэкошадации "Йспольэованиэ стктрофотометриче ского метода для определения цитотоксической активности сенсибилизированных к НВ^лимфо-дашшв",утверждены МЗ РСФСР 16 марта 1989 г, и опубликованы в 1989г.

Принцип метода может бить использован при изучении ЦТА лимфоцитов, сенсиоплизировашшх к другим антигенам.

Внедрениь результатов в практику._Походи определения ЦТА лимфоцитов, сенсибилизированных к и АЗКЦ внедрены в клинике Ни -жогородского 1ШЭЫ и Нижегородской клинической инфекционной больни -це Я2, а также использованы в учебном процессе на биологическом фа -кулътота Нижегородского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. С'пектрофотоыетрический метод определения ЦТА лимфоцитов, сенсибилизированных к НБуА^, может быть использован для оценки активности эффектороного звена при вирусном гепатите В,

2. При остром и хроническом ГВ с высокой частотой установлено дош -шешш ЦТА сенсибилизированных к ШуАдлимфоцитов, свидетельствую -щое о значительной активации аффекторного звена клеточного имму -штата и патогенетической роли сенисбилизированных к НБ^лимфо -цитов при этой инфекции.

При вирусных ГА и ГВ установлено закономерное снижение АЖЦ, связанное с нозологической формой заболевания, тяжестью и стадией патологического процесса и свидетельствующее о нарушении неспевд-фических иммунологических реакций при данной патологии, 4. Изучение показателей клеточноолосредованной цитотоксичности у солышх вирусними гепатитами может бить использовано в качества дополнительного критерия оцешш тяжести болезни, полноты виздоров-лашш и прогноза заболевания.

Дисоерташя апробирована на совместном заседании межотделенчес-к:л1 конференции проблемного семинара "Иммунология и инфекционная патология" к Учено го совета Нижегородского НШШ ИЗ 25.04.1991г.

Цуотшации.Основное содержание работы отражено ь 7 научных. счупих в центральной и республиканской печати.

Структура и объем работы.Диссертация написана по обычно»,ту плану и включает следующие раздели .-введение, обзор литература, 3 главы с описанием результатов собственных исследований, включая " Материаш и матодн", заключение, выводы, список литературы ( 363 источника, в том числе 165 - на русском языке ). Работа изложена на 1ВЗ страницах , включая 99 страниц текста, 27 таблиц и 17 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования, Дли выполнения поставленных задач обследовано 177 больных в возрасте от 16 до 60 лет, госпитализи -рованных в клинику (главный врач - к.м.н. В.М.Григорьев) Нижегородс -когоНИИИЭМ (директор - академик АМН СССР И.Н.Блохина) в течение 19851988 гг. Из них у 63 был диагностирован ГА,, у 64 - ГВ, У 17 - хронический ГВ (7 - хронический .гктивннй гепатит - ХАГ, 10 - хронический персистирутощий гепатит - ХиГ), у 33 - хронические заболевания ЖВП. Контрольную группу составили 60 практически здоровых лиц.

Диагноз вирусных гепатитов ставили на основании клинико-эпвдеми-олггических данных, лабораторного обследования и подтверждали обнаружением в сыворотке крови НВ^Ад и антител к нему, антител класса и к НВсАр, антител класса к вирусу ГА. Диагноз хронических за -болеваний ЖВП ставили на основании клинической картины и данных лабораторного и инструментального обследования. Клиническую оценку больных проводили совместно с врачами П и Ш отделения клиники (зав. отд. к.м.н. И.В.Шутова и Т.К.Бочкарева соответственно).

Тяжесть и варианты течения гепатита определяли по общепринятым критериям с учетсм приказа МЗ СССР № 408 от 12 июля 1989 г. По тяжести течения острого гепатита больные распределялись следующим образом: легкая форма - 57,1* больных ГА и 18,8$ - ГВ, среднетяжелая - 42,9% больных ГА и 57,8$ - ГВ, тяжелая - 23,4% больных 1В.

У всех больных проводились общепринятые биохимические исследовав

1иш. Б шышюкс иммунологического оболедошшш входило: определении ^аКЦ. но методу I).И.Зимина с соавт.( 1984) в нашей модификации; вн -явление ЦТА сенсибилизированных к НЬ^Ад лимфоцитов по разработан -ному нами методу; определение в сыворотке крови циркулирующих иммунных комплексов ( ЦИК) в модификации Б.А.Ыолотилова с соавт. ( 1902); определение абсолютного содержания популяций лимфоцитов вариантами метода розегкообразовавия: суммарные Т-яимфоциты - ноМ.^ошШ ( 1972) в пашой модификации ( Горбацавич Г.С. с соавт., 1979), Г -сунрессорн - по \l.jiLorcUu г/(1и77), В-лммфоцити - по А.И.Чередее-ву ( 1976) в ншей модификации ( Горбацевич Г.С. с соавт., 1981),

Полученные результаты анализировали в зависимости от формы тяжести' и стадии заболевания. Ыагернал обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики, механизмы взаимосвязи показателей •исследовали путем анализа корреляций (Т ) и корреляционные отноии -ниИ ( }) ) ( И.И.Ашмарцн, Р.В.Воробьев, 1976; Н.А.Добротина. Г.Л.Еже-Еа, 1986).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2. Моли^икышя метопа определении АЗКН. Для определания АЗКЦ нами бил модифицирован спектрофотоматрический метод Ю.И.'Зимина с соавт. ( 1934), основанный на определении в инкубационной среде относительного количества гемоглобина, вшедшего из лизировашцх КМ ( ЭВ, сенсибилизированные антителами). Данный метод имеет определенные преимущества по сравнению с радиометрическим, так как не тре -бует специального оборудования,радиационной защити, культур клеток. Однако, применение авторами солянокислого бензидина в качестве хромогена имеет, на наш взгляд, существенный недостаток, заключающийся в трудности фиксации ыакашалыюго окрашивания реакционной смеси.

Наша модификация способа онршш ощфекта АЗКЦ заключается в замена иред/юзллшого Ю.И.Зиминым с соавт. бензцпшювого доактыш на

ОВД. Реакция гемоглобина о (Щ аналогична взаимодействию его с бен-оидином.но тлеет существе иное преимущество, заключающееся в возможности фиксации ее добавлением серной кислоты, что значительно упрощает процедуру учета результатов и повышает пропускную способность метода. В процессе работы били шбранн оптимальные условия о преде -ления в растворе малых количеств гемоглобина с использованием ОВД в качестве хромогена'. Результаты реакции учитывали на фотоэлеитроло -лориметре КФК-2 при длине волны 490 им.

Данный способ оценки эффекта АЗКЦ был применен нами при изучении ЦТА лимфоцитов, сенсибилизированных к .

2. (Определение ЦТА лимфоцитов, свнсибдлизировашпя к ШкАу. Для определения ЦТА лимфоцитов, сенсибилизированных к , нами

был разработан спэктрофот(.,>етрич9ск1Ш метод, в основу которого по -ложен радиометрический ыеч,д, предложенный сА. ЛИегИ с соавт. в 1977 г. Это позволило исключить использование изотопов, упростить процедуру анализа и сделать его более доступным для лабораторной практики.

Принцип метода заключается в том, что при инкубации КЭ, содержащихся в суспензии мононуклеарных клеток периферической крови больных, с КМ, которыми служат нативные ЭБ, коньюгироваяные с 1%Ад, происходит лизис КМ. Степень лизиса КМ определяют спектрофотометри-чески по выходу гемоглобина в инкубационную среду.

Конъюгацию ЭБ с НВ^А^ проводили с помощью хлорного хрома. Б процессе работы изучено влияние на гемосенспбилизацшо концентрации ПВ5Ад, ЭБ и хлорного хрома, длительности контакта реагентов, рН и температуры реакционной смоси и отработаны оптимальные условия конъюгации нативннх ЭБ с НВ$Ау . Качество конъюгации контролировали в реакции пассивной гемагглптинации ( РИГА) с антиснвороткой против 1%Ад .

Специфичность питотоксичесной реакции лимфоцитов, сенсибилизи-

ровшшшс к НВ^Ад , против ЭБ, копъюгировщшшс с НВ^А^ , подтверждали в реакции ингибирования цитотоксичносги ( РИД) ТаЛ^втв-нтами антител к ЙВуА^ . КМ в РИЦ служили нативные ЭБ, конъюгирован-ные с НВ^Ад , и обработанные Зтх1~ фрагментами антител против НВ^А^. ^пользование цельной антисыворотки или антител для блокирования

находящегося на К1.1, нецелесообразно, так как может стимулировать проявление АЗКЦ. Как показали предварительные исследования, применение (¿Яг^^-фрагментов. сопровождалось агглютинацией ЭБ, что затрудняло процесс и цитолиза. В дальнейшем мы использовали -фрагменты антител, применение которых исключало проявление нежела -тельных эффектов, перечисленных ешэ. Эффект блокирования НВуА^ УаЛ' -фрагментами антител контролировали в РИГА,

Ш$А<1 и антнсыЕоротка к нему были получены из отделения НВ -диагностикумов Нижегородского предприятия по производству бактерийных препаратов ( нач,отд.С.В,Зубов); -фрагменты антител к были выделены методом аффинной хроматографии из козьей антисыворотки в лаборатории иммунохимии Нижегородского НШЭМ к.б.ц.В.В.Немовым ( рук.даб.к.б.н.И.А.Киселева).

3. Поотацо^ка реакции шп'отоксичностц. КЗ служили мононуклеар-ные клетки, выделенные из периферической крови больных в градиенте плотности фшсолд-ьерографлн {.Ж.НЬбуит, 1968). КМ слуаили нативные ЭБ, сенсибилизироьашше антителами ( АЗКЦ) или конъюгированные с НВ^Ад ( ЦТА лимфоцитов, сонсиОилнзлроЕанних к НЩ'Ад). Перед поста -новкой реакции цитотоксичности КЭ и КМ разводили до соответствующей

А Р

концентрации ( КЭ - 2x10 кл/мл; КМ - 4х10^кл/мл) в растворе Хенкса или среде 109 без фенолового красного, с добавлением ионов Са+2и М^ 20 ьМ ИЕРЕ5 , 2 мМ глютаминовой кислоты и 80 мкг/мл гентами-цина.

Реакцию цитотокеичности ставили в кругладонных планшетах для ишунологических реакций ( Ленинградский аавод биополимеров). Наряду с опытной пробой, содержащей КЭ и соответствующие КМ, ставили

контрольные гробы на спонтанный и максимальный лизис ЮЛ. Соотношение эффектор.-мшень = 5:1. Все пробы ставили в 3-х - 4-х повтор -ностях.Эффект цитотоксичности определяли после 18-20 часовой ин -кубации при 37°С во влажной атмосфере, содержащей Ъ% СО^.-,

4. Анализ 1ГГА лимфоцитов. сенсибилизированных к . UTA

лимфоцитов, сенсибилизированных к ШЗ^Л^ , у здоровых лиц колебалась от 0 до 6,25;?. В среднем цитотоксический ивдекс ( Ш) составил 2,10 ± 0,31%, что согласуется с датами, получеипти радиометрическим способом Л. At&ertL с соавт. ( 1977),.

При остром 113 в разгар заболевания Ш1 лимфоцитов, сенсибилизированных к IШ5jA^ , определялся повышенным у 71,2% обследованных лип. При этом более чем у половины из них величина ЦИ превышала нормальный уровень в 5-20 раз, составляя в среднем 19,9 + 1,83$, У 28,8,1 обследованных величина ЦИ • олебалась в пределах ее значений у эдо -ровых лиц. С наибольшей частотой повышение ЦП выявлялось при тяже -лой и среднетяжелой форме болезни ( соответственно у 86,7$ и 70,6$ больных против 50% - при легком течении. К периоду ранней реконва -лесЦенции ¡¡ТА лимфоцитов оставалась высокой и выявлялась еще у значительного числа больных. При этом резкое повышение Ш отмечено у 46,больных с тяжелой, у 36,1$ - со среднетяжелой и у 25,0,t - с легкой формой ГВ.

Сохранение высокой сенсибилизации лимфоцитов к JfflfA^ в период реконвалесценции может быть связано с формированием клеточной памяти к HBfAij ( Л.Ф.Блюгер с соавт. ,1988), Наш при обследовании группы лиц ( 18 человек), перенесших острый ГВ в период с 1977 по 1986 г.г, повышение UTA лимфоцитов, сенсибилизированных к HBj-A^ , было зарегистрировано у 55,50$ из них. ПИ в этой группе составил 17,2 + 2,89$. У остальных ( 44,54$) ЦИ был в пределах его колебаний у здоровых лиц.

Дальнейший анализ UI выявил достоверное повышение его среднего

IQ

уроыт у Оилыш l'b fio сравнению со здоровыми, зависящее от формы тяжести 1'В { табл.1). При среднетнкелом и тяколом течении ГЪ максимальное повышение ЦИ определялось в периоды разгара п спада желтухи, к периоду ранней рекоивалесценции ЦИ достоверно снижался. ílaripoTüB, в группе с легким течением ГВ повышение Ш в среднем ówio монотонно умеренным на протяжении всего периода ооследоваиия. Повышение ЦП в острый период болезни при среднетяжелом и тяжелом течении ГВ было достоверно выше, чем при легком течении ,

Анализ корреляций между показателями ЦТА сенсибилизированных к лимфоцитов и титром в сыворотке крови больных ГВ поз-

волил выявить нарастание прямой линейной связи от слабой в периоде разгара желтухи до средней в периоде спада болезни (Í - 0,47, P¿0,02 при среднетяжелом течении болезни и К- 0,49, P¿ 0,02 - при тяжелом ГВ). При тяжелом течении болезни достоверная связь между показате -лями (1 = 0,55, P<¿0,05) определена также и в периоде ранней рекоивалесценции.

Изучение коррелятивных отношений между ЦТА лимфоцитов, сенси -бшшзированных к ИВа'А^ , и биохимическими показателями ( активность аланинаминотрансферази и содержание билирубина) показало наличие взаимосвязи между ними. Следует отметить, что при среднетяжелой и тяжелой формах ГВ в качестве ведущего признака чаще выступает показатель Щ'А лимфоцитов, сенсибилизированные к HTi^Ag , что свидетельствует в пользу патогенетического значения этого феномена.

G целью выяснения взаимосвязи ЦТА лимфоцитов, сенсибилизрова-иных к ¡ffijAg , с иммунологическими показателями была проанализпро -вала дшашка содержания л/.мунокошетентных клеток. Наиболее значимые изменения отмечены в популяции Т-Лпыфохцм'ов ( E-РОК) и их суп -рессорной фракции ( ЕА-РОК), которые 'проявлялись в снижении количества клеток на протяжении всего периода обследования. При атом у больных с 1'якелоИ и среднетижелой формой ГЬ уровень Ь- и ЕА-РОК до-

Таблзла I

динамика ЦТА лж£огоггов, сенсибилизированных к НВвАд , у больных острым ж хроническим ГЗ I X + /л)

Группа об- : следоЕаннкх: Оорма тяяе- : стп гепатита: Период обследования

»''1 : разгар : Р : Спад : Р : Ранняя реяоквал- -я: ?

- : дяд2кс гштотоксечеости, .3

Острый ге- легкая 12 8,52+ 1,82 < 0.СС1 8,30+0,87 ¿0,001 8,73+0,59 ¿.0,001

патит В средняя 37 14,22+1,18 Р1<а,С5 <0,001 14, ЭГ-+1,51 г 0,001 ¿0,001 9,67+С,28+ Р-^О.ОБ <0,С01

тяжелая 15 13,33+0,47 <0,001 12,47+1,34 Р1-;С,02 <0,001 Э,31+1,40+ Р1-=0,05 ¿0,001

Хрошгаеский 1ЛГ 7 II,02+2,£2 ¿0,01 11,03+о,56 <0,С2

ГВ . ХПГ 10 8,86+1,77 ¿0,001 8,33+1,81 <0,01

Здоровые , 45 2,10+0,31

Достоверность различий: Р.- 20 сравнении с группой здорозьх;

Р^- по сравнении с легким течаяжем ГБ;

+ - по сравнение с периодом разгара.

стоьсрно отличался от" такового у здоровых лиц ( Р<от Ü.UUI до 0,05 в зависимости от периода обследования); кроме того в период разгара болезни при тяжелом течении ГВ содержание Е-РОК достоверно ниже, чем при легкой и среднетяжелой форма ( PC 0,05 и Р .¿0,U2 соответственно) . Достоверные отличия В-лимфоцитов ( EAG-P0K) от нормы отме -чаны лишь при тяжелом течении ГВ в периоды разгара ( Р< 0,05) и ранней реконвалесценции ( Р^0,02), а также в периоде разгара ( Р<:0,02) ври среднетяжолом ГВ. Сопоставление уровня ЦТА лимфоцитов, сенсибилизированных к , с показателями содержания в периферической крови шлмуыокошютентных клеток показало, что при остром ГВ усиле -ние эффекторной функции сенсибилизированных к НВ^А^ лимфоцитов происходит, как правило, на фойе выраженного дефицита по Т-лимфоци~ там и, особенно, их супрессорной фракции. Наиболее ярко это прояв <-ляется при тяжелой течении болезни. Об этом же свидетельствует на -личие обратной корреляционной связи (t = -0,33, PC 0,05) между по г. казателями Щ1 и количества Т-супрессоров в период спада при средне-тяжелом течении ГВ. :

При хроническом ГВ ( ХАГ и Х11Г) установлена высокая частота выявления повышенной ЦТА лимфоцитов, сенсибилизированных к ШЗуА^ , как в фазу обострения ( 70?'), тшс. и в период ремиссии ( 60$). Величина среднего уровня Щ превышала норму в 4-5 раз независимо от периода обследования и формы болезни ( табл.1).

Следует отметить, что усиление UTA лимфоцитов, сенсибшшзиро -ванных к Ш^А^ , при хронических ГВ, так же как и при остром га, происходит на фоне выраженного Т-клеточного дефицита. Выявлено наличие обратной связи между показателями ЦТА лимфоцитов и количеством Т-супрессоров (t;= -0,65, Р^0,02).

В качестве группы ' сравнения на наличие цта лимфоцитов, сенсибилизированных к НВдАд , были обследованы больные острым ГА и хро -ничэскими заболеваниями Ш1. Среди больных ГА ( 38 человек) умеренная ЦТА лш/фоцитов, против ЗБ., конгюгировашшх с НЪуА^ , определена

лишь у 26,3% обследованных. Выявление сенсибилизации лимфоцитов к НВуА^ у больных с клиническим диагнозом Г'А может быть связано с наличием смешанной инфекции, а также возможной недостаточностью традиционных методов клинико-эпидемиологических критериев разграничения гепатитов А и В. При воспалительных заболеваниях НВП умеренное повышение ЦТА лимфоцитов выявлялось у 36$ обследованных. Следует отме -тить, что практически все эти лица значительный период времени ( от 5 до 20 лег), неоднократно лечились в стационарах, получали инъекции, что позволяет предположить у них возможность предварительного контакта с вирусом гепатита В.

Таким образом, анализ частоты выявления ЦТА сенсибилизированных к ИВ^А^ лимфоцитов, проведенный в группах больных с заболеваниями печени различной этиологии показал, что для ГВ характерно, как прави -ло, выраженное повышение Ц11, проявляющееся с высокой частотой в острый период заболевания, что свидетельствует о достаточной специфич -ности данного тоста. Усиление клеточных иммунных реакций на при острых и хронических вируснцх ГВ и их отсутствие в большинстве случаев у больных с другими заболеваниями печени и желудочно-кишечного тракта позволяет предположить важную роль лимфоцитов, сеасисшли -зированных к ШуА^ , в развитии гепатоцеллюлярного повреждения. Это положение подтверждает также установленная зависимость уровня Щ от тяжести течения и периода болезни. Причиной избыточной активности. КЭ может служить нарушение дисбаланса иммунокомпетентных клеток и их регуляторных популяций. В условиях выявленного нами и друтими авто -рами Т-супресеорного дефицита у больных ГВ существует возможность нарушения регуляции иммунного ответа, в том числе и продукции цито -токсических лимфоцитов, избыточное количество которых может привести к углублению и хронизации патологического процесса в печени ( А.Ф. Блтогер,1986; А.С.Логинов и Ю.З.Ьлок,1й87; В.М.Мохов с соавт.,1983; С.II.Соринсон, 10Е7;У/?.Шпдк. <¿«¿,1984; Л. X. Ш еМЯЫоп. ,1987 и др.).

5. Анализ антителозависимой.клеточной татотоксичности. АЗКЦ в группе практически здоровых лиц ( 60 чел.) колебалась в пределах от 16,3 до 42,8$. В среднем ВД составил 25,9 + 0,97$, что соответствует имеющимся в литературе данным ( Е.Н.Алекандрова, 1985; Г.Н. Драшшк с соавт.,1985; З.О.Караев, Е.Л.Голикова, 1989 и др.).

Изучение АЗКЦ у больных острыми ГА и ГВ, хроническими ГВ и заболеваниями КВП позволило выявить общие закономерности изменения уровня АЗКЦ, заключающееся в снижении активности К-клеток по сравнению с нормой в острый период заболевания и постепенное повышение ее к периоду ранней реконвалесценши. Однако, степень и динамика выявляемого снижения АЗКЦ зависели от нозологической формы, тяжести течения болезни и периода обследования.

Сравнительный анализ частоты выявляемого снижения АЗКЦ при острых ГА и ГВ показал, что в период разгара болезни резкое снижение активности К-клеток выявлялось чаще при ГВ ( 1Ъ%), чем при ГА (64 ,6$ При тяжелом течении ГВ и среднетяжелом течении ГА резкое снижение ЦИ определялось чаще ( у 93,3$ и'73,1$ обследованных соответствен -но), чем при легких формах гепатита ( при ГВ у 70$ и у 60$ при ГА). Аналогичная зависимость сохранялась в периоды спада и ранней рекон-валесценции.

Анализ средних величин уровня АЗКЦ показал, что как при ГВ, так и при ГА максимальное снижение АЗКЦ отмечено в острый период болезни, к периоду ранней реконвалесценции уровень АЗКЦ достоверно понимался по сравнению с периодом разгара ( табл.2). Следует отметить, что при тяжелом течении ГВ среднее значение Ш было значительно ниже, чем при легком ( Рг 0,05 на протяжении всего периода болезни) и среднетяжелом ( Р^ 0,05 в период разгара) течении гепатита. В то же время при ГА зависимость величины ВД от тяжести болезни проявлялась лишь в периоде ранней реконвалесценции ( Р^ 0,001).

Анализ изменений АЗКЦ при остром и хроническом ГВ показал, что

Таблгпа 2.

днтителоззЕЕСжмак клеточная штотоксичвость при

Екруснкх гепатитах и хронических заболевании. ЕБП ( 2 + л? ).

Группа обсле- ¿оша : Период обследования

дованных тякестк: К : разгар : ? : Рт-: спад : Р : Ранняя рек-к : Р Рт

индекс пгтотоксячност::,*

Остры!: ГА Легкая 12 44 О.ООК 0,05 12,44+0,82 <0,001 20,72+1,13*° <0,02 >0,2

Средняя 27 13,33+2 0 <0,001^0,1 11,81^1,06 <С,001 14,82±0,97" <0,001 < о,о:

Легкая 12 12,51+1,14 <0,001<0,02 17,5^2,09 < С, 001 £1,74^2,3£Г >0,05 >0,5 Средняя 37 12,38+1,60 0,001 -сО,05 13,70+1,48 <3,001 11М&+1,63+0 < 0,01 ^0,05 Тяжелая 15 5,36+0,£5 <г 0,001 < 0,001 10, 94+1,42<0,001 15,20+1,5С4'0 <0,001 <0,01Й

лоонЕческиС 7 8,76+1, ,99 < 0.0С1 <0,001 т3 ,83+3, ,57 <0, ,01 < 0,02

хпг 10 5,00+0, ,55 <0,001 <0,001 13; ГЧ г- ,73+ < 0, ,001 <0,01

33 17,43+1. ,67 < 0,001 23, ,97-2, ,40+ > с, о

Здоровые 60 25,32+1" ,07

Достоверность различий: Р - ло сразневпю с группой здоровые; Рт - по срззненгг; с группой бальных ЕБП; + ло сравнению с периодом разгара; 0 - по сравкенжс с периода;

при хронических гепатитах резкое снижение' АЗКЦ выявляется чаще,чем при остром ( соответственно у 88,2$ и 78$ обследованных в период разгара болезни и у 64,7$ и 32,8$ - в период ранней реконвалесЦен-ции). Средняя величина ВД била резко снижена как в период обострения, так и в фазу умеренной активности при обоих формах хронического гепатита В ( табл.2).

Для сравнения динамики АЗКЦ при вирусной и певирусной патологии печени было обследовано 33 больных хроническими заболеваниями ВВП. Резкое снижение АЗКЦ в этой группе в период обострения выявлено у 36,4$ обследованных,что достоверно реже,чем при острых ГА и ГВ (Р40,01 и Р0,001 соответственно) и при хроническом ГВ (Р<0,001). В фазу ремиссия резкое снижение АЗКЦ зарегистрировано лшць у 6% боль-1шх ЖВП,что также достоверно реже,чем в других группах больных ( во всех случаях Р<£ 0,001) .Средний уровень 1Ш в этой группе был, как иравило,достоверно выше, чем в других группах ( табл.2.).

Таким образом, проведенный анализ частоты и степени снижения АЗКЦ позволяет сделать вывод о том, что при заболеваниях печени происходит снижение функциональной активности К-клеток периферической крови,, более выраженное при вирусных гепатитах.

АЗКЦ является одним из иммунологических феноменов, осуществляющих защиту организма от чужеродных агентов через антитела к ним и в норме функционирует на определенном уровне (Н.Д.Беклемишев,1986; А.Н.Маянский,1983; Р.Б.Петров,1987 и др.).Снижение АЗКЦ среди монокукле арных клеток периферической крови может быть связано как с миграцией К-меток в орган-мишень, так и с действием инактивирующих факторов: антител и аутоантител, ЦИК,токсических метаболитов. При этом может происходить как блокирование Рс-рецепторов К-клеток,так и нарушение их экспрессии в процессе дифферешщювки (Ю.И.Зимин с соавт. ,1986;Б.С.Каганов, 1984;А.Н.Маянский, 19831984 и др.]

Для выявления связи уровня АЗКЦ с наличием в сыворотке инак-тивирующшс факторов била проведена оценка степени взаимосвязи ее с содержанием ЦИК. Корреляционный анализ позволил выявить досто -верную обратную связь между этими показателями {% = от -0,30 до -0,78). Более сильные корреляции выявлены в периоды разгара и спада при острых гепатитах ГА и ГВ. При диализе корреляционных отношений между АЗКЦ и БИС установлена взаимосвязь сродней и высокой силы, при этом в качестве ведущего признака чаще выступает показатель ЦИК, особенно при среднетяжелой, тяжелой и хронической формах гепатита. Все это свидетельствует о возможном ингибируищем влиянии на АЗКЦ иммунных комплексов, содержание которых резко увеличивается в острый период гепатита А и В ( Н.С.Асфиндиярова,1987; В.Я.Ви-трищак с соавт.,1988; И.А.Скороход, 1388; Т. Мс/ч^о ,1089 и др.).

Обсуждая патогенетическое значение снижения АЗКЦ при вирусных гепатитах,' следует отметить, что. с одной стороны дефект данных эф-фекторных реакшй может способствовать персистенщш вирусной инфекции. С другой стороны, наличие при вирусных гепатитах антител к вирусным антигенам и аутоантител создает определенные услоглзс для иццукции АЗКЦ, направленной против собственных клеток оргалита ( Ю.И.Зимин с соазт.,1986; Б.С,Каганов, 1985 и др.). При этом разрушение покриых антителами ИД через механизм АЗКЦ может быть бо -лее эффективным, чем через комплементзависимый цитолиз, так как реакция АЗКЦ протекает при экстремально низких концентрациях антител ( Ю.В.Иервиков и Л.Б,Эльберт,1984). В то же время можно шла -гать, что выявленное нами снижение интенсивности АБКЦ, которое возможно происходит чорез блокирование К-клеток мшунними комплексами препятствует в определенной степени нарастанию аутоиммунного процесса, способствует сохранению гомеосгаза и выключение из иммунного ответа одного из механизмов разрешения гепатоцитов в период наиболее массивной атаки на печень.

Острый гепатит В легкая ЦИ "А средняя

(•?'Орнн тпжести) ЦИ % тяжелая

Г:0-1510

/

м

20 15

юн

5 О

20. 15 10 5

V

/

т ? з

I 2 3

Хронические гепатиты В

ЦИ % ,

20 ..

15 „ 10 .

5 .. О .

X А Г

/

ЦИ # 20 "

15

10

5

О

X П Г

/

/

обострение ремиссия

/

обострение ремиссия

Рис.1. Динамика АЗКЦ и ЦТЛ лимфоцитов, сенсибилизированных к НВ&А^, у больных гепатитом В.

'-- ЦТА лимфоцитов, сенсибилизированных к НВ5А(|,

------ АЗКЦ

Период обследования: I - {язгар, 2 - спад

3 - ранняя рекоквалесценция

О

■-1

С целью выяснении патогенетической роли изученных цитотокепчес--ких реакций был проведен их сравнительный анализ при остром и хроническом ГВ, который позволил выявить неоднотипный характер динамики двух типов клеточной цлтотокснчности (рис.1): в острой фазе заболевания - снижение уровня АЭСЦ и повышение UTA сенсибилизированных к Ш^А^ лимфоцитов по сравнению с нормой, а в периоде ранной реконвалесцешцш - напротив, тенденцию к повышению уровш! АЗКЦ и снижение Ц'ГА лимфюци-тов,сенсибилизированных к ИЕ^А^возвращение показателей к норме).

Между АЗКЦ и UTA сенсибилизированных к Н%А^лшфоцитов выявлено наличие коррелятивной взаимосвязи от средней до высокой силы.Ведущим признаком при средней и тяжелой форме острого ГВ на протяжении всего периода обследования.и в периоде спада при легкой форме болезни выступает показатель UTA сенсибилизированных к Щ'Ад лимфоцитов,что может свидетельствовать в пользу предположения о большой патогенетической значимости сел.сибилиди^ованиш; к ItBgAj лимфоцитов по сравнению с К-клеткшди.Дрй хронических редатит.ах .связь .между им ими показателями выражена сильнее ajpu ХАТ, чем при ХЯГ. ¡Ведущий признак дри ХАТ -показатель АЗКМ, при ХДГ - ЦТА сенсибцяизнроващцх к JIB^ лимфоцитов, что может указывать да разную роль .этих феноменов в jpa3Bnw:a силозни. А именно, в шго.генаае ХАТ сильнее выражены аутоиммунные проноси, одним юпроявлений которых может быть реакция АЗКЦ. Напротив, при ХнС большее патогенетическое значение имеют иммунные рещидш непосредственно на вирусные антигены, осуществляемые сенсибилизированными к шил лимфоцитами.

ВЫВОДЫ

I. Разработан и апробирован в клинике спектрофотометрический метод определения ЦТА сенсибилизированных к H%Ag лимфоцитов о использованием в качестве КМ нативных эритроцитов барана, конъюгирован-шх о HBjAj.

2 . Определена значимость ЦТА сенсибилизированных к HB^Aj лимфоцитор при остром и хроническом IBi

а) установлена высокая частота выявления повышенного Щ,зависящая от формы тяжести острого гепатита и периода обследования;

б) отмечено максимальное повышение ЦИ в острый период среднетя-желого и тяжелого ГВ; при легком ГВ повышение ЦИ было умеренным

в течение всего периода обследования;

в) хронический ГВ характеризовался высокой частотой повышенного уровня Ш независимо от фазы активности патологического процесса;

г) найдена прямая коррелятивная связь между ВД- и титром HB$Acj в сыворотке крови.

3. Повышение ЦТА сенсибилизированных к НВ^А^ лимфоцитов при вирусном ГВ выявлено на фоне дефицита суммарных Т-лимфовдтов и Т-супрессоров

4. Установлен однонаправленный характер изменений АЗКЦ при различных заболеваниях печени, заключающийся в снижении ЦТА K-клеток, более выраженном при вирусных гепатитах. Определена зависимость частоты и степени снижения АЗКЦ от-нозологической формы заболевания, тя -жести течения и периода обследования.

5. Выявлена обратная корреляционная связь показателей АЗКЦ с уровнем

ЦИК в сыворотке крови.

6. Показана возможность использования клеточных цитотоксических реакций при изучении патогенеза и оценки состояния иммунного статуса при острых и хронических гепатитах.

Список работе опубликовании по тамо диссертации;

1. Юшнико-патогенатическое значение датотоксичаских реакций лимфо-iuitob при гепатите В/ Е.Л.Деречииская,Т.В.Блинова,Л.Ю.Ватолина, Н.В.Неумоина//£црусный гепатит В: сб.научН.тр./под ред.проф. С.Н.Соринсона. _ Горький, 1Ш.1988.-С.35-40,

2. Деречинская E.JI. Использование пробы с полиэтиленглинолем в дифференциальной диагностике вирусных гепатитов //№одиц.реферативный журнал,- 1988. - ШЗ. - Публ. JfG02I.

3. Деречинская Е,Л. .Блинова Т.В. Спектрофотометрический метод определения цитотоксической активности сенсибилизированных к iffi^Ag лимфоцитов // Лаб.дело. - 1989. - Щ2. - С .25-29.

4. Блинова Т.В.,Деречинская Е.Л. Использование ортофетшендкашша при спектрофотоматрическом определении ацтителозависимой клеточной цитотокгагчшсти // Лаб.дело. - 1990. - Jfl. - C.67-G8. Деречинская Е,Л..Куликова Т.В. Цитотоксическая актиыюстъ ыино -нуклеарных клеток периферической крови человека при вирусных гепатитах А и В // 1-й Всесоюзный иммунологический съезд: -М.-Х309. - т.1. - С.305.

6. Сравнительный анализ антителозавнсимой клеточной цитотоксичности при гепатитах А и В / Е.Л.Деречииская,Г.С.Горбацевич,Т.В.Куликова, М.В.Пигалева // Регуляция биологических систем: сб.научн.тр./под

ред.И,Н.Блохипой, - Горький, ГГУ, 1990 - С.54-5В.

7. Применение шшуноаффинной хроматографии для очистки антител к поверхностному антигену вируса гепатита В / О,А.Незенцегь,С»В.Зубов, В.В.Дружшши.Е.Л.Деречииская // Биоорганическая и opr^iiiboiv-кая химия.4.1,Тезисы докл.УП республиканской конференции молод:» ученых-хш,!иковЛ'адлин,1987. - C.I9Q

Материалы диссертация ошщ лолощш; на заседаниях проблемного осминара "Иммунология и инфекционная патология" Нижегородского ШИШ • (I985-I99I).конференциях молодых специалистов (1986,1988.г.Н.Нов1,о-род).заседании научных обществ биохимиков (1987) и иммунологов (1988) г.Н.Новгорода, конференции молодых ученых МНИИЗМ им.Г.Н.Габричевского, (1988,г.Москва), конференции молодых ученых ШИШ им, Л.Пастора (1988,г.Ленинград).