Автореферат и диссертация по медицине (14.03.10) на тему:Иммуногенетическое профилирование в лабораторном мониторинге эффективности лечения гепатита С у ВИЧ-инфицированных пациентов

На правах рукописи

005536538

Ковалева Екатерина Сергеевна

ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ПРОФИЛИРОВАНИЕ В ЛАБОРАТОРНОМ МОНИТОРИНГЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ГЕПАТИТА С У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ

14.03.10. - клиническая лабораторная диагностика

3 I , ,, аЛЗ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград - 2013

005536538

Работа выполнена на кафедре клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава РФ

Научный руководитель: д.м.н. Гумилевский Б.Ю.

Официальные оппоненты:

Резников Юрий Петрович Доктор медицинских наук, профессор, врач аллерголог - иммунолог ФГБУ «Поликлиника № 1» Управления делами Президента РФ

Годков Михаил Андреевич Доктор медицинских наук, руководитель отдела лабораторной диагностики ГУЗ НИИ СП им. Н.В. Склифосовского

Ведущая организация: ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская Академия имени С.М. Кирова» Министерства Обороны Российской Федерации, г. Санкт-Петербург_

Защита диссертации состоится "20"_ноября_2013 г.

на заседании диссертационного совета Д 208.071.04 при ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Минзрава РФ по адресу: 123995, г. Москва, ул. Баррикадная, д. 2/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ДПО РМАПО Минзрава РФ по адресу 125445, г. Москва, ул. Беломорская, д. 19.

Автореферат разослан " /У "_/(? 2013 г.

Учепый секретарь диссертационного совета

Луговская Светлана Алексеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Разработка современных прогностических критериев эффективности лечения гепатита С при ВИЧ-инфекции и новых методов лабораторной диагностики эффективности терапии являются наиболее актуальной проблемой в современной медицине. Поиск наиболее эффективных вариантов терапии вирусных гепатитов приобретает все большую актуальность в современной медико-биологической науке и практическом здравоохранении в связи с возросшей заболеваемостью, широким распространением среди трудоспособного населения, недостаточной эффективностью современных методов профилактики [Николаева Л.И.,2012]. Прогнозировал, характер течения вирусных заболеваний среди ВИЧ-инфицированных пациентов, выявлять предрасположенность к развитию хронических форм инфекции, отсутствие молекулярных технологий предупреждения развития осложнений; дегенеративных, фибротических и опухолевых процессов [Kelleher Т.В.,2005] представляется нерешенной задачей. У ВИЧ-инфицированных пациентов, имеющих коинфекцию вирусом гепатита С, иммунная система оказывается неспособной элиминировать вирус HCV, что позволяет ему длительно реплицироваться в гепатоцигах и ряде других клеток, приводя к хронизации инфекции. В противовирусную терапию гепатита С в настоящее время входит комбинация интерферона и рибавирина [Fried MW.,2002]. Одним из аспектов эффективности такого лечения по-видимому является иммуностимулирующий эффект, который может быть недостаточно эффективным у пациентов с ВИЧ инфекцией и связан с иммунным статусом на разных стадиях течения ВИЧ-инфекции.

Актуальным аспектом лечения гепатита С у ВИЧ инфицированных остается недостаточная эффективность противовирусной терапии, а также отсутствие четких предикторов эффективности лечебных мероприятий применительно к конкретному пациенту. Установлено, что характер и направленность изменений продукции и рецепции цитокинов не зависят от этиологического варианта вирусной инфекции и согласуются с концепцией типовых механизмов развития инфекционного процесса. Определено, что некоторые полиморфизмы в промоторных регионах генов цитокинов обладают протективным эффектом в отношении HCV-инфекции [Арсентьева Н. А.,2012]. Взаимосвязь развития хронического вирусного гепатита С с полиморфизмом промоторных участков таких генов делает актуальным поиск иммуногенетических критериев эффективности лечения гепатита С у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Цель исследования

Целью настоящей работы является оптимизация алгоритма обследования пациентов с ВГС/ВИЧ-инфекцией на основе оценки иммуногенетического профиля для повышения эффективности противовирусной терапии.

Задачи исследования

1. Исследовать зависимость эффективности терапии гепатита С от иммунного статуса и вирусной нагрузки РНК ВИЧ у ВИЧ-инфицированных пациентов в процессе лечения.

2. Оценить распределение аллельных вариантов генов системы интерферона AZIN1 (A/G), IFN (C/G), МхА (G/T), TLR4(C/T), в точках полиморфизма у ВИЧ инфицированных пациентов, проходящих лечение от гепатита С с разной эффективностью терапии.

3.Оценить распределение аллельных вариантов генов клеточного гомеостаза TRPM5 (С/Т), AP3S2 (A/G), NVL (C/G), STXBP5L (A/G), AQP2 (C/G), в точках полиморфизма у ВИЧ инфицированных пациентов, проходящих лечение от гепатита С с разной эффективностью терапии.

4,Оценить распределение аллельных вариантов иммунорегуляторных генов IL 28b (rs8099917, rsl2979860) и IL-10 (1082A/G, 592C/A) в точках полиморфизма у ВИЧ инфицированных пациентов, проходящих лечение от гепатита С с разной эффективностью терапии.

5.Разработать алгоритм прогноза течения гепатита С при ВИЧ-инфекции на основе иммуногенегических параметров и данных анамнеза.

Новизна исследования

Проведено комплексное исследование особенностей функционирования различных звеньев специфического иммунитета у пациентов с ВГС/ВИЧ-инфекцией в зависимости от эффективности лечения гепатита С.

Изучена взаимосвязь полиморфизма генов ключевых цитокинов с течением вирусного гепатита С у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Проведена оценка корреляции и взаимосвязи между генотипом ключевых цитокинов с неэффективной ПВТ и особенностями иммунного статуса при смешанной ВГС/ВИЧ-инфекцией.

Научно-практическая значимость и внедрение результатов исследования

1. Разработан клинико-диагностический алгоритм, включающий комплекс определенных генетических и иммунологических маркеров, что позволит прогнозировать результат ПВТ, и уровень прогрессии вирусного гепатита С.

2. Диагностический алгоритм позволит индивидуализировать терапию дня каждого пациента со смешанной ВГС/ВИЧ - инфекцией, вследствие чего увеличится время и качество жизни ВИЧ инфицированных пациентов с хроническим гепатитом С.

3. Полученные данные используется при подготовке студентов и интернов, на курсах ФУВ на кафедре клинической лабораторной диагностики ВолгГМУ

Личный вклад

Проведено обследование 80 ВИЧ-инфицированных пациентов с коинфекцией вирусным гепатитом С, получающих противовирусную терапию рибавирин + ПЕГ-интерферон-альфа. При обследовании больных использованы современные лабораторные методы исследования, в том числе иммунологическое исследование субпопуляций лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD69, CD25), определение вирусной нагрузки методом ПЦР (РНК ВИЧ, ВГС), биохимическое определение ферментов (активность АЛТ, ACT), генотипирование ВГС, определение полиморфизмов генов цитокинов (AZIN1 (A/G), IFN (C/G), МхА (G/T), TLR4(C/T), TRPM5 (СЯ), AP3S2 (A/G), NVL (C/G), STXBP5L (A/G), AQP2 (C/G), IL 28b (rs8099917, rsl2979860) и IL-10 (1082A/G, 592C/A)). Автором лично формировалась база данных, проводилась их статистическая обработка и обобщение полученных результатов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Эффективность противовирусной терапии гепатита С ВИЧ-инфицированных пациентов определяется уровнем вирусной нагрузки ВИЧ и степенью активации CD4+CD25+ Т-лимфоцитов совместно с вирусологическим и биохимическим критериями у ВИЧ-инфицированных пациентов низким.

2. Индивидуальные особенности функционирования в системе генов интерферона играют важную роль в эффективности лечения гепатита С у ВИЧ-инфицированных пациентов.

3. Различия в регуляции внутриклеточного гомеостаза у ВИЧ-инфицированных пациентов оказывают влияние на эффективность противовирусной терапии гепатита С.

4. В качестве благоприятных прогностических признаков эффективности терапии пегилированным интерфероном-a и рибавирином выступают аллельные варианты иммунорегуляторного гена IL-10 (1082A/G).

5. Установленная связь полиморфизмов генов цитокинов с достижением устойчивого вирусологического ответа является основой для получения оценки прогноза эффективности лечения, что позволит в ранний период терапии, еще до получения вирусологического ответа индивидуализировать и оптимизировать терапию гепатита С.

Апробация работы

Апробация диссертации проведена на межкафедральном совещании кафедр: клинической лабораторной диагностики, иммунологии и аллергологии, молекулярной биологии и генетики ГБОУ ВПО ВолгГМУ города Волгограда 13.06.2013 г.

Материалы работы были представлены на научно-практической врачебной конференции «Инновационные технологии в лабораторной диагностике» (Волгоград, 2009), 68-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2010), 69-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2011), III Всероссийском научно-практическом семинаре для молодых ученых «Методологические аспекты экспериментальной и клинической фармакологии» (Волгоград, 2011), Первой всероссийской научной конференции молодых ученых-медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» (Москва, 2012), 71-ой открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2013)

Публикации

По материалам работы опубликовано 7 печатных работ, из них 2 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, главы, посвященной результатам собственного исследования, обсуждения результатов и выводов. Работа изложена на 123 страницах машинописного текста, иллюстрирована 15 таблицами, 15 рисунками.

Библиографический указатель содержит 149 источников, из них 17 на русском, 132 на иностранном языке.

Материалы и методы

В основу работы положены клинические и лабораторные исследования, выполненные с 2008 по 2012 годы в период лечения больных на базе ГКУЗ «ВО ЦПБ СПИД и ИЗ».

Исследуемая группа состояла из 80 ВИЧ-инфицированных пациентов (возраст от 20 до 50 лет) с коинфекцией вирусом гепатита С и стадией ВИЧ ШБ - IVA. Все пациенты получали противовирусную терапию. Наличие ВИЧ-инфекции и вирусного гепатита С подтверждались с помощью иммуноферментного анализа и качественного ПЦР.

Пациенты были включены в исследование при соблюдении следующих условий: Критерии включения пациентов в исследование:

- пациенты со смешанной ВГС/ВИЧ инфекцией;

- возраст 18-60 лет;

- приверженность лечению

- подписшшое информированное согласие Критерии исключения из исследования:

- пациенты, не соблюдающие режим противовирусной терапии;

- туберкулез в анамнезе;

- беременность и лактация;

- социально незащищенные группы пациентов

Выбор сроков исследования иммунологических, биохимических и вирусологических параметров у пациентов проводили на основании стандартных схем обследования пациентов с вирусным гепатитом С (до начала ПВТ, при начале лечения, через 1,3,6 и 12 месяцев лечения).

Материалом для исследования служила кровь, собранная из вены утром натощак, до приема медикаментов, физиопроцедур и рентгенологического обследования, в пробирки с антикоагулянгом 3% ЭДТА.

Методы исследования:

I. Оценка иммунного статуса и молекулярно-генегический анализ:

1. Подсчет лейкоцитов и лейкоцитарной формулы.

2. Фенотипирование лимфоцитов крови (CD3, CD4, CD8, CD69, CD25).

3. Молекулярно-генегический анализ полиморфизма ключевых генов цитокинов (AZIN1 (A/G), IFN (C/G), МхА (G/T), TLR4(C/T), TRPM5 (С/Т), AP3S2 (A/G), NVL (C/G), STXBP5L (A/G), AQP2 (C/G), IL 28b (rs8099917, rsl2979860) и IL-10 (1082A/G, 592C/A)).

II. Определение эффективности противовирусной терапии:

1. Анализ данных амбулаторного наблюдения пациентов с ВГС/ВИЧ-инфекцией.

2. ПЦР исследование для количественного определения ВИЧ и ВГС.

3. Генотипирование ВГС методом ПЦР.

4. Биохимический анализ крови (определение активности АЛТ, ACT)

Подсчет лейкоцитов и лейкоцитарной формулы проводили на автоматическом гематологическом анализаторе Sysmex КХ-21

Иммунофенотшшрование лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии на проточном цитофлюориметре BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США), с использованием моноклональных антител к поверхностным рецепторам лимфоцитов CD3+, CD4+,CD8+, CD69+, CD25+, меченные FITC, РЕ, АРС, PerCP (Becton Dickinson, США).

Молекулярно-генетический анализ полиморфизма ключевых генов цитокинов (AZIN1 (A/G), IFN (C/G), МхА (G/T), TLR4(C/T), TRPM5 (С/Т), AP3S2 (A/G), NVL (C/G), STXBP5L (A/G), AQP2 (C/G), IL-10 (1082A/G, 592С/А)) и IL 28b (rs8099917, rsl2979860) проводили с использованием наборов для определения полиморфизмов генов цитокинов («Литех», Москва) и «ИммуноГенетика IL28B» (ДНК-Технология, Москва) методом полимеразной цепной реакции с электрофорезной детекцией и детекцией в режиме «реального времени» на приборе IQCycler (BioRad) соответственно.

Определение вирусной нагрузки, выявление и дифференциация генотипов вируса гепатита С проводилось методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией на приборе IQCycler (BioRad) с использованием набора реагентов «АмшшСенс ВИЧ-Монитор-FRT», «АмплиСенс HCV-Монитор-FRT», «АмплиСенс HCV-reHOTim-FL».

Определение активности АлАт (АсАт) вьшолнялось на полуавтоматическом биохимическом анализаторе HUMALYZER 2000 (HUMAN, Германия) кинетическим методом согласно рекомендациям IFCC (Международная Федерация по Клинической Химии).

Статистический анализ

Для статистической обработки результатов использовались компьютерные программы Microsoft Excel 2007, Statsoft Statistica 8.0.

Количественные данные, подчиняющиеся закону нормального распределения, описывались с помощью средней арифметической величины и стандартного отклонения (М±о). Если распределение данных отличалось от нормального, они описывались значением медианы (Me), первого и третьего квартилей (Ql, Q3). Качественные величины описывались частотой встречаемости (%). Для анализа параметрических выборок с нормальным распределением использовался t-критерий Стьюдента, а для

непараметрических использовался U-критерий Манна-Уитни [Кобзарь А. И.,2006, Реброва О. Ю.,2002]. Критический уровень значимости (р) при проверке статистических гипотез принимался равным 0,05. Оценка относительного риска и доверительных интервалов рассчитывались по Вульфу в программе Statsoft Statistica 8.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В ходе выполнения работы было проведено проспективное исследование 80 ВИЧ-инфицированных пациентов (возраст от 20 до 50 лет) с коинфекцией вирусом гепатита С. Все пациенты получали противовирусную терапию Рибавирином и ПЭГ-интерфероном альфа. Наличие ВИЧ-инфекции и вирусного гепатита С подтверждались с помощью иммуноферментного анализа и качественного ПЦР. В качестве критериев эффективности проводимой терапии использовались:

• отсутствие РНК HCV в плазме крови через 12 месяцев от начала терапии (вирусологический критерий)

• нормализация уровней АЛТ и ACT (биохимический критерий)

У 57,5 % пациентов наблюдалось достоверное снижение концентрации РНК ВГС в плазме крови после курса ПВТ (рис. 1).

Уровень РНК ВГС на протяжении ПВТ

600000 500000 400000 300000 200000 100000 о

_1_ 2

□ эффективное лечение_В отсутствие эффекта

Рисунок 1. Уровни вирусной нагрузки в группах с различной эффективностью ПВТ (* - значимые отличия внутри группы р<0.05)

Согласно вирусологическому критерию о достижении устойчивого вирусологического ответа (отсутствие детекции РНК HCV в плазме через 24 недели лечения) полученные данные свидетельствуют об эффективности проведенной терапии. У 42,5% пациентов эффект от лечения отсутствовал.

При оценке эффективности проведенной терапии по биохимическому критерию были получены следующие данные: из 80 пациентов у 46 было выявлено значимое снижение уровня АлАт и АсАт после курса ПВТ, тогда как у 34 пациентов наблюдалось лишь незначительное снижение активности ферментов на протяжении всего периода лечения (рис.2,3). Тяжесть заболевания при вирусных гепатитах пропорциональна степени увеличения активности АЛТ. При острых процессах уровень активности фермента в сыворотке крови может превышать нормальные значения в десятки раз. Повышение активности при вирусном гепатите происходит обычно еще в дожелтушный период. В период терапии при эффективном процессе лечения уровень АЛТ обычно снижается до исходных значений. [Kundrotas L.W., Clement D.J., 1993].

Рисунок 2. Изменение уровня АлАт в зависимости от эффективности лечения (* -значимые отличия внутри группы р<0.05)

Незначительные и умеренные воспалительные процессы в гепатоцитах сопровождаются высвобождением ACT из цитозоля. Митохондриальные структуры повреждаются мало, поэтому общее количество попадающего в кровь ACT невелико, в отличие от уровня АЛТ, которая целиком локализуется в цитозоле и переходит в кровь при повреждении последнего [Pratt D.S., Kaplan М.М., 2000; Davern T.J., Scharschmidt B.F.,

Изменение уровня АлАт в зависимости от эффективности лечения

эффективное лечение ■ отсутствие эффекта

62,5 35,3*

До начала 1 месяц 3 месяца 12 месяцев

лечения

2002].

Изменение уровня АсАт в зависимости от эффективности лечения

- Эффективное лечение 13 Отсутствие эффекта

108,5*

■45,2

34,6*

62

До начала 1 месяц 3 месяца 12 месяцев лечения

Рисунок 3. Изменение уровня АсАт в зависимости от эффективности лечения (* -значимые отличия внутри группы р<0.05)

Таким образом, на основании вирусологического и биохимического критериев пациенты были разделены на две группы: 1 - с эффективным лечением вирусного гепатита С и 2 - с отсутствием эффекта от терапии. Эффективным оказалось лечение у 46, что составляет 57,5% от общего числа обследованных (рис 4).

Рисунок 4. Эффективность лечения гепатита С у ВИЧ-инфицированных пациентов. Всем пациентам было проведено генотипирование вируса гепатита С. Распределение по генотипам выглядело следующим образом: 35 из 80 пациентов (43,75%) имели первый генотип НСУ, второй генотип вируса НСУ был обнаружен у 1 пациента (1,25%), а с третьим генотипом было 44 из 80 пациентов (55%) (рис. 5). В нашей выборке

Распределение пациентов в зависимости от эффективности лечения гепатита С

наиболее эффективное лечение было у пациентов с третьим генотипом ВГС 73,91% (34 из 46 пациентов), у пациентов с первым генотипом эффективность лечения составила 26,09% (12 пациентов из 46), у пациентов со вторым генотипом ВГС эффективного лечения не наблюдалось. Это соответствует данным о наиболее частой встречаемости генотипов 1Ь и За в Российской Федерации.

Частота встречаемости генотипов ВГС

Я1Ь 2 ЕЗа 1%

Рисунок 5. Распределение генотипов по частоте встречаемости в исследуемой группе.

Кроме того, выявлялась взаимосвязь между уровнем вирусной нагрузки ВИЧ до начала ПВТ и эффективностью лечения вирусного гепатита С: у 34 пациентов с отсутствием ответа на лечение, средний уровень исходной вирусной нагрузки составлял 2,3х107, а у 46 пациентов из 80 с эффективным лечением он составлял 4,5х105. Группы статистически значимо отличались друг от друга (рис.6).

Уровень РНК ВИЧ в плазме крови (коп/мл) Эффективное лечение ■ Отсутствие эффекта

1400 1200 1000 800 600 400 200 0 -200

1229,5

150*

! 150

ЦП ,_шщ

До начала лечения 24 неделя ПВТ

48 неделя ПВТ

Рисунок 6. Уровень РНК ВИЧ на этапах ПВТ

В соответствии с литературными данными [Семененко Т.А.,2000], важный механизм защиты против вирусных инфекций основан на CD4+ Т-клегочном ответе возникающем против вирусных белков. CD4+ лимфоциты инициируют продукцию антител В-клетками и активируют CD8+ лимфоциты, специфичные к вирусинфицированным клеткам. По такому механизму CD4+ лимфоциты способствуют элиминации вируса гепатита С. ВИЧ-инфекция в большинстве случаев является причиной сниженного общего числа Т-лимфоцитов и, непосредственно, CD4+ лимфоцитов. При этом соотношение CD4+/CD8+ снижается соответственно, что влечет за собой и сниженный ответ Т-лимфоцитов на вирусную инфекцию. В связи с данными литературы и полученными результатами можно сделать следующий вывод: эффективное лечение связано с более низкой исходной вирусной нагрузкой ВИЧ. Необходимо отметить, что при эффективном лечении гепатита С наблюдается и значимое снижение вирусной нагрузки ВИЧ в процессе приема пациентами противовирусной терапии. В соответствии с литературными данными [Laguno М. et al,2004], PEG-IFN-2a оказывает слабое антиретровирусное действие и на вирус иммунодефицита. Это объясняет снижение уровеня вирусной нагрузки ВИЧ в период лечения ВГС. Полученные нами данные совпадают с данными литературы. То есть при эффективном лечении гепатита С наблюдается также значимое снижение вирусной нагрузки ВИЧ.

При взаимодействии антиретровирусных препаратов с рибавирина могут возникать такие побочные эффекты как молочный ацидоз, панкреатит, декоменсаторный цирроз и анемия. Интерферон вместе с APT может вызывать нейтропению. По международным рекомендациям антиретровирусные препараты, такие как нуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы могут вызывать митохондриальную дисфункцию, что в последствии приведет к ожирению печени, токсическому гепатиту, повышению уровня билирубина.

Однако если преимущества антиретровирусной терапии значительно перевешивают риски, то ВААРТ назначается в сочетании с противовирусной терапией гепатита С.

Среди обследуемых пациентов в группе с эффективным лечением 56,22% получали сопутствующую терапию ВИЧ-инфекции. В группе с отсутствием эффекта от лечения сопутствующую терапию получали 44,13% обследованных. При анализе влияния сопутствующей терапии ВИЧ-инфекции на эффективность лечения вирусного гепатита С значимого отличия выявлено не было (рис. 7).

Наличие сопутствующей терапии ВИЧ при приеме ПВТ в группах исследования

О 10 20 30 40 50 60

Рисунок 7. Сопутствующая терапия ВИЧ при лечении гепатита С Иммунологическая реактивность при сочетании инфекций ВИЧ и ВГС изменяется в связи с состоянием иммунодефицита, ассоциированного с ВИЧ-инфекцией, и наличием вируса гепатита С [Alberti A, Clumeck N,2005]. Именно поэтому, при комплексном лечении ХГС, направленном на активацию Т-звена иммунной системы, у ВИЧ-инфицированных пациентов лечение гепатита С в определенном проценте случаев может оказаться неэффективным.

Для выяснения интенсивности иммунного ответа при лечении у ВИЧ-инфицированных больных гепатита С исследовался иммунный статус с разделением пациентов на 2 группы: с эффективным и неэффективным лечением. Иммунный статус оценивался до, в начале, в период и после лечения. При анализе лейкоцитарного состава периферической крови в начале терапии у пациентов с эффективным и неэффективным лечением не было найдено существенных различий (р>0,05).

Значимые различия (р<0,05) были обнаружены нами при сравнении лейкоцитарного состава периферической крови у пациентов с эффективным лечением в период лечения гепатита С с показателями у пациентов с неэффективным лечением. В группе с эффективным лечением через 24 недели курса ПВТ количество лейкоцитов составило 3469 кл/мкл, лимфоцитов 1299 кл/мкл, гранулоцитов 1587 кл/мкл. У пациентов с неэффективным лечением значимых отличий не выявили.

Наличие ВГС-инфекции и применение противовирусной терапии для ВИЧ-инфицированных пациентов являются неблагоприятным фактором [Bica I., McGovern R,2001], Пегилированный интерферон в некоторых случаях способен подавлять активность костного мозга, а рибавирин способствовать развитию гемолитической

анемии. При ВИЧ инфекции может наблюдаться лейкопения, которую могут усугубить побочные эффекты противовирусной терапии, применяемой для лечения оппортунистических инфекций. Исходя из данных литературы и полученных, в нашем исследовании, результатов следует, что при эффективном лечении подавление активности костномозгового кроветворения, лейкопения, тромбоцитопения и снижение количества Т-лимфоцитов проявляются в большей степени, чем у пациентов без видимого эффекта.

В результате исследования субпопуляционного состава циркулирующих лимфоцитов у пациентов с эффективным и неэффективным лечением гепатита С, было обнаружено, что у пациентов с эффективным лечением достоверно снижается (р<0,05) уровень циркулирующих С03+С069+с 42 до 34 х 106 клеток /л, СОЗ+С1)8+ с 896 до 546 х 106 клеток /л, с 585 до 449 х 106 клеток /л СП)3'С[34* Т-лимфоцитов по отношению к группе пациентов с неэффективным лечением, у которых уровни СВЗ 'СП8~, С03+С04+ лимфоцитов существенно не изменялись, а уровень С П69+ лимфоцитов значимо увеличивался (с 55 до 66 х 106 кл/л) (рис.8).

1400 1200 1000 800 600 <400 200 0

Изменение уровня С04+и С08+ в процессе приема ПВТ

----9«---Ш-

826

585*

546*

441«

483

482 @

г

в период лечеши

до лечения

в период лечения

Неэффективно

СБ4+ ЕСР8+

Рисунок 8. Изменение уровня СБ4 и С08Т-лимфоцитов во время ПВТ (* -значимые отличия внутри группы р<0.05)

Также у пациентов с эффективным лечением достоверно увеличивается уровень (р<0,05) С03+С025+ лимфоцитов (рис.9). По-видимому, в процессе лечения происходит перераспределение вирусоспецифических Т-лимфоцитов. Обычно в печени нет конституциональной лимфоидной ткани, но при вирусном гепатите происходит перераспределение внутрипеченочных Т-лимфоцитов. То есть изменяется процентное

содержание активированных Т-лимфоцитов и антиген-специфических Т-клеток, причем большинство из них имеют маркеры активации.

Изменение уровня CD25, CD69 Т-лимфоцитовво время ПВТ

80 70 60 50 40 30 20 10 0

до печения в перпод до лечения в период

лечения

лечения

Е CD3+69+ CD3+25+

Рисунок 9. Изменение уровня СП25, С069 Т-лимфоцитов во время ПВТ (* -значимые отличия внутри группы р<0.05)

На основании полученных результатов и данных литературы можно сделать вывод, что при эффективном лечении в результате миграции лимфоцитов из циркулирующей крови в печеночную ткань активация Т-клеток осуществляется непосредственно в печени

Для решения поставленных задач о связи генетических факторов с эффективностью лечения гепатита С у ВИЧ-инфицированных пациентов нами были выбраны 11 генов, участвующих в регуляции иммунного ответа при вирусном гепатите С: AZIN1 (A/G), IFN (C/G), МхА (G/T), TLR4(C/T), TRPM5 (С/Т), AP3S2 (A/G), NVL (C/G), STXBP5L (A/G), AQP2 (C/G), IL 28b (rs8099917, rsl2979860) и IL-10 (I082A/G, 592C/A).

Исследуемые гены были разделены на 3 анализируемых группы:

1. Гены системы интерферона AZIN1, IFN, МхА и TLR4

2. Гены, ответственные за поддержание клеточного гомеостаза TRPM5, AQP2, AP3S2,NVL,STXBP5L

3. Гены, участвующие в иммунорегуляции И 28b, 1110

Более успешные результаты ПВТ наблюдались у больных с генотипом СС гена IFNy. Мутантный гетерозиготный вариант A/G гена AZIN1, G/G гена ИФНу, Т/Т гомозиготный аллельный вариант гена TLR4 реже выявляются у лиц с эффективным лечением. Цитокины могут определять иммунопатогенез вирусных гепатитов, так как при нарушении баланса между Thl/Th2 клетками по продукции цитокинов возможна персистенция ВГС-инфекции [Сенников C.B., Курамшин Д.Х.,2003]. МхА - протеин

при ХГС.

обладает противовирусным действием на РНК-содержащие вирусы и его эффектов может быть достаточно для подавления вирусной репликации и без участия других индуцируемых интерфероном протеинов [Ank N., West H.,2006]. МхА снижает активность импортина-а и ингибирует транспорт вирусов в ядро клетки, после чего ингибирует транскрипцию вирусного генома и подавляет экспорт вирусной РНК [Veer M.J. de, Holko M.,2001]. В нашем исследовании не было найдено статистически значимых различий по частоте встречаемости аллельных вариантов гена МхА. Ген AZIN1 кодирует белок, стабилизирующий работу орнитин декарбоксилазой и защищающей ее от воздействия антизимов фермента, способствующих ее деградации [Veer M.J. de, Holko M.,2001]. По результатам полногеномного сканирования [Ank N., West H.,2006] сделан вывод об увеличении шансов развития ЦП у больных хроническим гепатитом С при наличии генотипа GG. В нашей работе различия между группами были обнаружены по частоте встречаемости аллеля A/G гена AZIN1, и его наличие связано с риском неэффективности терапии, а различия по генотипу GG находились на грани статистической достоверности. Ключевая роль в распознавании антигенов и активации иммунного ответа принадлежит продукту гена TLR4, относящийся к семейству толл-лайк рецепторов. Различия в интенсивности иммунного ответа ассоциируются с различными вариантами полиморфизмов этого гена. Полученные нами данные также связывают неэффективность терапии гепатита С с данным полиморфизмом (рис. 10).

Частоты встречаемости аллельных вариантов значимых генов системы интерферона в группах с различной эффе ктнвнстью ПВТ

Р Отсутствие эффекта

I Эффективное лечение

Рисунок 10. Частоты встречаемости значимых полиморфизмов генов системы интерферона.

Анализ оценки влияния генетических полиморфизмов гомеозизных генов на эффективность лечения хронического вирусного гепатита С, показал, что наиболее весомый вклад в развитие заболевания вносят полиморфные варианты СС гена ТКРМ5 (5 член субсемейства М потенциал-зависимых катионных каналов) (КК = 1.89, ДИ [1,32;2,56]), (Ю гена А<ЗР2 (аквапорин 2) (ЯЛ = 2.39, ДИ [1.26;4.87]). Данные полиморфизмы встречаются при неэффективном лечении с частотой в 1,5 - 3 раза выше, чем среди пациентов с наличием эффекта (рис.11). Наименьший вклад в развитие предрасположенности к хроническому течению вирусного гепатита С принадлежит полиморфизмам ТТ (ТЯРМ5) и СО (А<2Р2) с ОК от 0,0005 до 0,45.

Частоты встречаемости аллельных вариантов значимых генов клеточного гомеостаза в группах с различной эффективностью ПВТ

В Эффективное лечение

I Отсутствие эффекта

'¿Ш

Ai.

1

Щ

CG*

AQP2

Рисунок 11. Частоты встречаемости значимых аллельных вариантов генов клеточного гомеостаза.

Проведенные исследования позволили выявить ряд отличий (р<0,05) у ВИЧ-инфицированных пациентов с эффективным лечением гепатита С с группой пациентов с отсутствием эффекта в частоте сочетаний аллельных вариантов генов IL-10 (рисунок 15). Так, аллельный вариант G/G гена IL-10 (1082A/G) (RR=0,56, ДИ[0,33;0,90]) чаще выявляется у лиц с эффективным лечением. Среди пациентов с отсутствием эффекта А/А вариант гена IL-10 встречается в 2 раза чаще (RR = 2,09, ДИ[1,42;2.42]), чем среди пациентов с наличием эффекта. При анализе полиморфизмов гена IL28p была установлена связь между частотой встречаемости аллельных вариантов ТТ полиморфизма rsl2979860 С>Т и GG полиморфизма rs8099917 T>G с неэффективностью противовирусной терапии (RR = 3,21, ДИ[1,63;7,49] и RR = 2,4, ДИ[1,44;3,42] соответственно) (рис.13).

Частоты встречаемости аллельных вариантов значимых генов иммунорегуляции в группах исследования

□ Эффе!сгнвное лечение

I Отсутствие эффекта

Рисунок 13. Частоты встречаемости значимых аллельных вариантов генов иммунорегуляции.

Продукт гена 1128В - интерферон-Х-3 - запускает .1АК/8ТАТ-сигнальный каскад, приводя к блокировке синтеза вирусных белков. Однонуклеотидная замена тимина (Т) на гуанин (в) в регуляторной области гена 1128В получила название полиморфизма ^8099917. Он ассоциирован с генетической резистентностью к вирусным инфекциям и эффективностью лечения хронического гепатита С комбинированной противовирусной терапией и помогает прогнозировать вероятность самопроизвольной элиминации вируса.

Проведенный анализ ассоциации полиморфизма генов 1К№у, А21№, Ш<4, ТКРМ5, АС)Р2, П.28р и 11,-10 (1082А/0) с генотипами вируса гепатита С показал, что аллельные варианты Ой гена (ЯЯ = 1,96, ДИ[1,13;3,27]), ТТ гена ТЬЯ4 (ЯЯ = 2.04, ДИ

[1.04;2,62]), Св гена АС>Р2 (КЯ = 2.29, ДИ [1.22;4.65]) и СЮ полиморфизма гэ8099917 гена 1Ь28р (ЯП = 1,94, ДИ [1.12;2,91]) чаще встречаются у пациентов с генотипом 1Ь. У пациентов с За генотипом вируса в сравнении с генотипом 1Ь частота встречаемости аллельных вариантов СС (ШЫу), СО (АС>Р2) и ТТ полиморфизма ге8099917 гена 1Ь28р в 23 раза выше.

Проведенное исследование в группе ВИЧ-инфицированных пациентов с вирусным гепатитом С позволило получить данные, свидетельствующие о существенном значении показателей вирусной нагрузки РНК ВИЧ, иммунного статуса и вариантов полиморфизма генов А2П\П, ТЬЯ4, ТЯРМ5, АОР2, 1Ь28р и 1Ь-10 (Ю82А/0) в прогнозировании

результатов ПВТ. Установлено, что при низком уровне РНК ВИЧ в плазме крови, высокой степени активации Т-лимфоцитов у носителей благоприятных аллелей указанных

полиморфизмов значимых генов чаще достигается У В О, и как следствие эффективность терапии Пег-ИФН-а в сочетании с рибавирином. Полученные результаты позволят с большей вероятностью прогнозировать результат ПВТ у ВИЧ-инфицированных больных ВГС с различными генотипами ВГС, иммунным статусом и определенными генетически детерминированными факторами.

Выводы

1. Совместно с вирусологическим критерием у ВИЧ-инфицированных пациентов эффективность противовирусной терапии гепатита С определяется низким уровнем вирусной нагрузки ВИЧ и степенью активации СЭ4+С025+ Т-лимфоцитов.

2. В оценке эффективности лечения гепатита С у ВИЧ-инфицированных пациентов определяющими являются аллельные варианты СС и (Ю (1П\7у), АО (А2ГЫ1), ТТ (Т1Л14) генов системы интерферона.

3. На эффективность противовирусной терапии гепатита С у ВИЧ-инфицированных пациентов влияет наличие полиморфизмов ТТ СШРМ5) и СО (А<2Р2) генов клеточного гомеосгаза.

4. В качестве прогностических признаков эффективности терапии пегилированным интерфероном-а и рибавирином выступают аллельные варианты Сй гена 1Ь-10 (1082А/0), СС и ТТ («12979860) и вО (ге8099917) гена 1Ь28р.

5. На основании особенностей распределения аллельных вариантов генов И^у, АгШ1, Т1Л4, ТЯРМ5, АС>Р2, 1Ь28р и 1Ь-10 (Ю82А/0) в совокупности с уровнем вирусной нагрузки ВИЧ и количеством активированных Т-лимфоцитов предложен прогностический алгоритм для оценки эффективности применения рибавирина и ПЕГ-иптерферона у ВИЧ-инфицированных пациентов при лечении вирусного гепатита С. Научно-практические рекомендации

В настоящее время стандарта по обследованию и лечению вирусного гепатита С в России не существует. По последним клиническим рекомендациям Министерства здравоохранения РФ с целью диагностики гепатита С и монигорирования пациентов с гепатитом С используются следующие виды лабораторного обследования:

1. Определение специфических шпи-ВГС класса или суммарных 1дО и 1{>М иммунохимическими методами: иммуноферментный анализ (ИФА), иммунохемилюминесценция, иммуноблоттинг и т.д.

2. Выявление РНК ВГС, определение вирусной нагрузки и генотипирование

ВГС.

3. Генотипирование ВГС - должно выполняться всем пациентам до начала противовирусной терапии (ПВТ) в целях планирования ее продолжительности,

эффективности, в отдельных случаях - расчета дозы противовирусных препаратов

4. Определение генотипа пациента по совокупности аллельных вариантов однонуклеотидных полиморфизмов TS12979860 и rs8099917 в гене интерлейхина 28В (ИЛ 28В), которое служит надежным предиктором достижения устойчивого вирусологического ответа (УВО) на фоне проведения двойной и тройной противовирусной терапии.

Исходя из результатов проведенного исследования, после подтверждения диагноза вирусного гепатита С, качественного и количественного определения РНК ВГС и определения генотипа вируса, для улучшения прогноза эффективности лечения, необходимо выше приведенный алгоритм дополнить следующими исследованиями, выполняемыми перед началом терапии:

1. определение вирусной нагрузки ВИЧ (низкий уровень вирусной нагрузки ВИЧ является предиктором эффективного лечения ВГС при проведении двойной терапии рибавирин + ПЕГ-интерферон-а)

2. определение полиморфизмов генов системы интерферона ИФНу (rs2069707), AZrNl (rs62522600) , TLR4 (rs4986791). Наличие аллельного варианта СС (IFNy) является благоприятным прогностическим признаком.

3. определение полиморфизмов генов клеточного гомеостаза TRPM5 (rs886277 ) и AQP2 (TS2878771 ). Наличие вариантов ТТ (TRPM5) и CG (AQP2) является предиктором эффективности проводимой терапии.

4. определение полиморфизмов иммунорегуляторных генов IL-10 (TS1800896 1082A/G) и IL28P (rsl2979860 и rs8099917). Благоприятным прогностическим признаком для эффективности проводимой терапии является наличие аллельных вариантов G/G гена IL-10 (1082A/G) и СС (rsl2979860) IL28p.

• В период курса ПВТ:

1. комплексное исследование иммунного статуса и субпопуляционного состава Т-лимфоцитов (CD 4, CD8, CD69, CD25)

ИФА антн-HCV

(скрштнг и подго грждшнг)

положительный

/

■ Наличие PHKHCV • Колич мтво РНК HCV •ГшоптНСУ

®

Ггнопты

1-S129-9860IU1580999Î" г«на IL2Sß

Ггаопшы

I'S2069'0-IFN7,IS(Í2522600AZIN1, Ы986-91 TLR4.rsS862" TRPM5, rs28"?8""lAQP2,rsl800896IL10

11

UJ Планцнншик if одолкпильносга, «цш эффективно ста, расчёт доз

Перечень работ, опубликованных по теме диссертации

1. Состояние иммунной системы ВИЧ-инфицированных пациентов в зависимости от эффективности лечения гепатита С /Сохацкая Е. С. // Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины: Материалы 68-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием, посвященной 75-летию ВолГМУ - 2010 - С.172

2. Роль полиморфизмов генов INF, MXI, OAS в эффективности лечения гепатита С у ВИЧ инфицированных пациентов /Сохацкая Е.С..// Материалы 69-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» - 2011 - С.181-182.

3. Прогностическое значение комбинации аллельных вариантов гена IL-10 в эффективности лечения гепатита С у ВИЧ-инфицированных пациентов /Сохацкая Е. С., Гумилевский Б. Ю. // «Вестник» ВолгГМУ: приложение (Материалы III Всероссийского научно-практического семинара для молодых ученых «Методологическое аспекты экспериментальной и кпипической фармакологии») - 2011 - С.97-98.

4. Иммуногепетические критерии в персонализации лечения гепатита С /Ковалева Е.С.// Материалы Первой всероссийской научной конференции молодых ученых - медиков «Инновационные технологии в медицине XXI века» - 2012 - С.73-74

5. Состояние иммунного статуса и полиморфизм генов IFN как прогностические критерии эффективности лечения вирусного гепатита С у ВИЧ-инфицированных пациентов /Ковалева Е.С., Гумилевский Б.Ю7/ Инфекция и иммунитет - 2013 - Т.З (№1) - С.83-88

6. Association between IL28ß polymorphem and viral load of HIV RNA in patients with HCV/HIV co-infection during the antiviral therapy /Kovaleva E.S.// Материалы 71-й открытой научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» - 2013 - С. 160

7. Иммуногенетическое профилирование для лабораторпого мониторинга эффективности терапии гепатита С у ВИЧ-инфицированных пациентов /Ковалева Е.С., Гумилевский Б.ЮУ/ Клиническая лабораторная диагностика - 2013 - №9 - С.65

\<

Ковалева Екатерина Сергеевна

ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ПРОФИЛИРОВАНИЕ В ЛАБОРАТОРНОМ МОНИТОРИНГЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЛЕЧЕНИЯ ГЕПАТИТА С У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ПАЦИЕНТОВ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Подписано в печать 10.10.2013. Формат 60X84/16. Бумага офсешая. Гарнитура Times New Roman. Печать офсетная. Уч. -изд. л. 1,0. Тираж 100. Заказ 434/5.

Отпечатано с готового оригинал-макета заказчика в типографии издательства «Перемена» 400066, г. Волгоград, пр. им. В. И. Ленина, 27