Автореферат и диссертация по медицине (14.01.26) на тему:Клеточная терапия застройной сердечной недостаточности

КРИВЕНЦОВ Александр Викторович

КЛЕТОЧНАЯ ТЕРАПИЯ ЗАСТОЙНОЙ СЕРДЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ (экспериментальное исследование)

14.01.26 - сердечно-сосудистая хирургия 14.03.03 - патологическая физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

4 МОП

Санкт-Петербург - 2011

4851674

Работа выполнена в ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени

С.М.Кирова» МО РФ

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ -

Лауреат Государственной премии РФ доктор медицинских наук профессор

ХУБУЛАВА Геннадий Григорьевич доктор медицинских наук профессор

АЛЕКСАНДРОВ Виктор Николаевич

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук профессор ГРИЦЕНКО Владимир Викторович доктор медицинских наук ТЮКАВИН Александр Иванович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования» Министерства здравоохранения и социального развития РФ.

на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 215.002.10 при ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова» МО РФ (194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, дом 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С. М. Кирова» МО РФ.

Защита диссертации состоится

2011 г. в 14 часов

Автореферат разослан эня 2011 г.

УЧЕНЫЙ СЕКРЕТАРЬ СОВЕТА: доктор медицинских наук профессор САЗОНОВ Андрей Борисович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

В общей структуре причин госпитализации сердечная недостаточность (СН) занимает третье место, при этом у лиц старше 65 лет она является основной [Свистов A.C. и др., 2005]. Такая заболеваемость обуславливает высокую смертность от данной патологии. Это в большей степени относится к случаям застойной СН резистентной к медикаментозной терапии.

В нашей стране однолетняя смертность больных с клинически выраженной СН достигает 26-29 %, это означает, что в РФ за один год умирает от 880 до 986 тысяч больных СН [Даниелян М.О., 2001].

Среди причин развития застойной СН дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) занимает второе место, уступая лишь ишемической болезни сердца [Бокерия Л.А. и др.. 2009; Davis R.C. et al., 2003]. К сожалению, на сегодняшний день не разработано универсального метода консервативного лечения застойной СН, обладающего высокой эффективностью [Рекомендации ВНОК и ОССН 2009]. Альтернативой медикаментозной терапии является хирургическое лечение, и в первую очередь - как единственно радикальный способ - трансплантация сердца. Вместе с тем, жесткие критерии отбора доноров и сопряженный с этим дефицит донорских органов направляют врачей на поиск иных вариантов лечения, способных помочь больным, в ожидании трансплантации (системы вспомогательного кровообращения и др.). Одним из таких методов является клеточная терапия [Шумаков В.И. и др., 2003; Шевченко Ю.Л., 2006: Perin Е.С. et al., 2004].

На этом пути ведется активный поиск клеток-кандидатов - от эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) до соматических стволовых клеток (ССК), - как стволово-клеточных трансплантатов для регенерации миокарда.

Результаты этого поиска свидетельствуют, что в регенерации поврежденного миокарда у экспериментальных животных [Bittner R.E. et al., 1999; Makino S. et al., 1999] и у пациентов [Assmus В. et al., 2002; Perin E.C. et al., 2004] способны участвовать не только ЭСК [Klug M.G. et al-, 1996] и ССК (получение которых не обременено, в отличие от первых, этическими проблемами), а также мезенхимальные стволовые клетки (МСК) [Makino S. et al., 1999] и гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) мононуклеарной фракции костного мозга [Bittner R.E. et al,, 1999],

Таким образом, метод, определяемый как клеточная кардиопластика, может быть эффективным, он имеет клинические перспективы. Но, как и у любого нового метода есть проблемы, требующие своего решения: какой тип клеток использовать, как лучше их' доставить в миокард, и в какой оптимальной концентрации [Владимирская Е.Б. и др., 2005].

Цель и задачи исследования

Целью работы является поиск оптимального варианта клеточной терапии застойной сердечной недостаточности мононуклеарной фракцией костного мозга.

Для реализации представленной цели сформулированы следующие

задачи:

1. Разработать экспериментальную модель застойной сердечной недостаточности.

2. Оценить эффективность клеточной терапии застойной сердечной недостаточности при разных способах доставки в сердце заданной концентрации клеток.

3. Оценить -эффективность клеточной терапии застойной сердечной недостаточности различным количеством клеток при определённом пути их введения в сердце.

4. Установить оптимальный вариант клеточной терапии застойной сердечной недостатЬчности.

5. Исследовать возможные механизмы эффектов клеточной терапии застойной сердечной недостаточности.

Научная новизна исследования

Впервые показано, что условием, способствующим участию клеток мононуклеарной фракции костного мозга в репарации диффузно пораженного миокарда, является создание в нем распространенной, максимально возможной концентрации клеток трансплантата. Вариантом реализации подобного условия у животных с экспериментальной застойной СН и ДКМП является комбинированный (внутрикоронарно-внутримиокардиальный (ВК-ВМ)) способ доставки клеток в миокард в количестве ЮхЮ6.

Впервые доказано, что комбинированный вариант доставки ЮхЮ6 клеток мононуклеарной фракции костного мозга в миокард безопасен, позволяет создать диффузно . распространенную максимальную концентрацию клеток в пораженной ткани с наименьшими их потерями.

Новыми являются результаты исследования, в которых показано, что клетки мононуклеарной фракции, трансплантированные в диффузно поврежденный миокард, персистируют в нем не менее 30 дней, индуцируют неоангиогенез, ограничивают воспалительно-некротические процессы и гибель кардиомиоцитов, участвуя в репарации и улучшении функции миокарда.

Впервые показано, что модель застойной СН и ДКМП может быть воспроизведена у кроликов внутривенными инъекциями доксорубицина в концентрации 10 мг/кг массы тела.

Теоретическая и практическая значимость работы

Работа посвящена анализу эффективности путей доставки и концентраций трансплантированных клеток при клеточной кардиопластике ДКМП. Теоретическое значение полученных данных состоит в изучении условий, необходимых и достаточных для максимальной реализации биологического потенциала трансплантированных клеток при диффузном поражении миокарда.

Результаты сравнительного исследования разных путей доставки клеточного продукта и концентраций клеток в нем позволяют рассматривать комбинированный вариант доставки с количеством клеток не менее 10x10° как безопасный и эффективный способ поддержания функции миокарда при ДКМП.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Доксорубицин в конечной концентрации 15 мг/кг массы тела крысы и 10 мг/кг массы тела у кролика, введенный шестикратно внутрибрюшинно крысе или внутривенно кролику в течение 12 дней, индуцирует токсическое повреждение миокарда с нарушением сократительной функции и развитием признаков застойной сердечной недостаточности.

2. Степень восстановления структурно-функциональных показателей сердца при клеточной кардиопластике экспериментальной модели застойной сердечной недостаточности зависит от пути доставки клеток в сердце. Комбинированный (внутрикоронарно-внутримиокардиальный) вариант доставки клеточного материала является лучшим, по безопасности и эффективности относительно его составляющих, для клеточной терапии экспериментальной модели застойной сердечной недостаточности.

3. Степень восстановления структурно-функциональных показателей сердца при клеточной кардиопластике экспериментальной модели застойной

недостаточности // Вестн. Рос. Воен. - мед. Акад. : приложение. - 2009. -№4(28). -С. 138-139.

8. Хубулава Г.Г., Кривенцов A.B., Александров В.Н., Сухов В.Ю., Настуев Э.Х. Выбор пути введения стволовых клеток в миокард при застойной сердечной недостаточности II Вторая науч. - практ. Конф. кардиохирургов северо-зап. региона России «Хирургическое лечение сердечной недостаточности» : программа и тезисы. - Петрозаводск, 2009. -С. 50-51.

9. Хубулава Г.Г., Кривенцов A.B., Александров В.Н., Сухов В.Ю., Настуев Э.Х. Моделирование застойной сердечной недостаточности // Вторая науч. - практ. Конф. кардиохирургов северо-зап. региона России «Хирургическое лечение сердечной недостаточности» : программа и тезисы. - Петрозаводск, 2009. - С. 51 - 52.

10. Белевитин А.Б., Никитин А.Э., Цыган В.Н., Хубулава Г.Г., Кривенцов A.B., Александров В.Н., Сазонов А.Б., Свистов A.C., Румакин В.П., Калюжная Л.И., Сухов В.Ю., Талантов C.B., Полуботко Е.В., Бабашев Ф.А., Максимов А.Г., Перекрест C.B. Поиск оптимального варианта клеточной терапии застойной сердечной недостаточности неишемического генеза в эксперименте // Вестн. Рос. Воен. - мед. Акад. - 2010. - № 3(31). - С. 112-120.

11. Белевитин А.Б., Никитин А.Э., Цыган В.Н., Хубулава Г.Г., Сазонов А.Б., Кривенцов A.B., Александров В.Н., Колюжная Л.И., Перекрест C.B. Клеточная терапия патологии миокарда (обзор литературы) // Вестн. Рос. Воен. - мед. Акад. - 2010. - № 2(30). - С. 194-200.

12. Soukhov V.Y., Khubulava G.G., Kriventsov A.V., Nikitin A.E., Svistov A.S., Aleksandrov V.N., Nastuev E.H., Kolyuzhnya L.I. Challenging stem-cells delivery method for treatment of congestion heart Failure // Eur. J. Med. Mol. Imaging. - 2010. - Vol. 37, suppl. 2. - P. S240.

Подписано в печать об. 06.11 Формат 60x84/16

Обьем 1 п,л. Тираж 100 экз. Заказ №428

Типография BMA, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, б.

содержит 11 таблиц. Список литературы представлен 122 источниками литературы, из которых 48 отечественных и 74 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Эксперименты были выполнены на 120 самках крыс Вистар массой 250-300 г. и 50 самок кроликов породы шиншилла массой 1,2-1,5 кг. Животных содержали в стандартных условиях вивария: 12 - часовой световой день, свободный доступ к воде и пище, температура помещения 2324° С.

Поражение миокарда вызывали доксорубицином [Белоусов Ю.Б. 2000]. Доксорубицин готовили ex tempore и вводили 6 раз через день в объеме 1,0 мл 0,9 % раствора натрия хлорида: крысам внутрибрюшинно, кроликам внутривенно в конечной концентрации 15 и 10 мг/кг массы тела соответственно. Контрольным животным вводили равный объем 0,9 % раствора натрия хлорида. Состояние сердца животных опытной и контрольной групп оценивали на 30-е сутки после последней инъекции препарата. Сравнивали показатели систолической функции левого желудочка методом эхокардиографии на аппарате «Sequoia 512» (Acusón, США) и уровень перфузии миокарда путём планарной перфузионной сцинтиграфии (ППС) и однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ). Использовали двухдетекторный однофотонный эмиссионный компьютерный томограф «E.CamVarAngle» (Simens. Германия). В качестве радиофармпрепарата (РФП) применяли технеций-99т-сестамби и Тс-99ш-тетрофосмин. Исследование выполняли через 15-30 мин после внутривенного введения экспериментальным животным РФП. Крысам препарат вводили в вену хвоста, кроликам - в краевую вену уха. Для количественной оценки уровня перфузии использовали показатель соотношения среднего значения уровня накопления РФП в миокарде к таковому в референтных органах и тканях. После обследования, сердца и лёгкие выведенных из опыта животных, фиксировали в 10 % нейтральном формалине для подготовки парафиновых блоков и срезов, которые окрашивали гематоксилином и эозином.

За модель застойной СН, используемую для решения поставленных задач, принимали животных при наличии достоверного снижения

систолической функции сердца на 30 сутки после последней инъекции доксорубицина.

Оценка эффективности клеточной терапии застойной сердечной недостаточности при разных способах доставки в сердце заданной концентрации клеток включила исследование комбинированного (внутрикоронарно-внутримиокардиального) (КБ) способа, как альтернативы его составляющих: внутрикоронарного (ВК) и внутримиокардиального (ВМ) путей доставки клеток.

Наркотизированным с искусственной вентиляцией легких крысам инсулиновым шприцом инъецировали 2x10й клеток в объеме 100 мкл 0,9 % забуференного раствора натрия хлорида (ЗРНХ). При ВК пути 100 мкл клеточного продукта вводили в восходящий отдел аорты в момент ее временного пережатия выше места инъекции. При ВМ пути по 50 мкл клеточной суспензии вводили в верхушку и боковую стенку левого желудочка. При комбинированном способе 50 мкл суспензии инъецировали в восходящий отдел аорты в момент ее пережатия выше места инъекции и по 25 мкл в верхушку и боковую стенку миокарда левого желудочка. Животным контрольной группы при прочих равных с опытными крысами условиях вместо клеток вводили равный объем 0,9 % ЗРНХ.

В качестве клеточного продукта использовали мононуклеарную фракцию костного мозга бедренных и большеберцовых костей крыс. Все манипуляции, связанные с выделением костей, клеток из них и отмыванием последних проводили в асептических условиях. Крыс-доноров забивали цервикальной дислокацией, удаляли бедренные и большеберцовые кости. Костномозговые каналы многократно промывали 0,9 % ЗРНХ шприцом на 2 мл с иглой № 25. Клетки, собранные в объеме 2 мл, разводили 1:3 0,9 % ЗРНХ, наслаивали на перколл (Sigma) плотностью 1,077, центрифугировали (400 g 40 мин). Выделенную мононуклеарную фракцию трижды отмывали в 0,9 % ЗРНХ. Клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл 0,9 % ЗРНХ. Выход мононуклеаров составлял 95 %.

Клетки перед введением для визуализации их распределения в миокарде крыс-реципиентов покрывали гексаметил-пропилен-аминоксимом (ГМПАО), меченным технецием-99м (99м-Тс). Дважды отмывали от свободного РФП, разводили до заданной концентрации (2x106 в 100 мкл), определяли жизнеспособность. В тесте исключения трипанового синего жизнеспособность клеток была не ниже 97 %. Содержание клеток в миокарде

оценивали в пределах 1-3 часов и через 24 часа после трансплантации. Животным выполняли сцинтиграфию всего тела и отмечали места повышенного накопления 99м-Тс. Использовали ОФЭКТ «E.CamVarAngle» (Simens, Германия) и параллельный низкоэнергетический коллиматор общего назначения. Накопление РФП в сердце оценивали полуколичественно в процентном отношении к общей введенной активности.

Сравнительную оценку эффективности комбинированного способа доставки клеток проводили на 30 сутки после трансплантации. Исследовали систолическую функцию сердца и гистологические срезы сердца животных опытной и контрольной групп, выведенных из опыта после обследования.

Оценка эффективности клеточной терапии застойной сердечной недостаточности различным количеством клеток при определённом пути их введения в сердце состояла в сравнительном исследовании эффективности 2x106, 10х10б и 20x10 клеток, доставляемых в миокард КБ способом, как оптимальным. На 30-е сутки после терапии оценивали сократительную функцию сердца, перфузию и морфологию миокарда

Оптимальный вариант клеточной терапии (КБ способ доставки клеточного продукта с концентрацией в нем lOxltf клеток как оптимального количества и 20xl(f, как абсолютно опасного для крыс) проводили на кроликах. Подготовка животных к трансплантации клеток, включая наркоз, фиксацию, бритьё операционного поля, перевод на искусственную вентиляцию легких, и собственно операция принципиально не отличались от таковых у крыс. Контрольных животных на всех этапах исследования подвергали аналогичным манипуляциям, за исключением введения клеток - им вводили равный объем 0,9 % ЗРНХ. В то же время данный эксперимент имел две особенности. Во-первых, в качестве клеточного продукта использовали мононуклеарную фракцию аутогенного костного мозга. Во-вторых, клетки костного мозга сразу после выделения обрабатывали флуоресцентной меткой, позволяющей ее наблюдать в свете люминесценции (флуоресцентный микроскоп фирма Leica, Германия) в виде флуоресцирующих клеток на криосрезах сердца толщиной 7 мкм, изготовленных на криостатном микротоме Bright (Великобритания). Для мечения выделенных клеток использовали кит PKH26-GL, включающий красную флюоресцирующую метку с длинным алифатическим концом (РКН26 Н0"3М в этаноле) и носитель метки растворитель С.

Костный мозг забирали непосредственно перед операцией у наркотизированного, фиксированного на станке животного в контейнеры Venosafe Lithium Heparin (9 мл) пункцией крыла подвздошных костей. Цельный костный мозг центрифугировали (200 g 10 минут). Верхний слой кровяного сгустка разводили 1:3 0,9 % ЗРНХ, наслаивали на перколл, центрифугировали (400 g 40 минут) и собранную фракцию трижды отмывали. Выход мононуклеарных клеток составлял 96 %, жизнеспособность в тесте с исключением трипанового синего была не менее 97 %. Клетки вводили в объеме 200 мкл 0,9 % ЗРНХ.

Эффект клеточной терапии оценивали на 30-е сутки после операции. Систолическую функцию исследовали эхокардиографически, перфузию сердца методом ППС. Сердца выведенных или погибших после операции животных оценивали на предмет возможной причины смерти, наличия признаков репаративной регенерации, их вероятных индукторов. Левый желудочек рассекали на две равные части поперек продольной оси сердца. Одну часть фиксировали в 10 % нейтральном формалине, из нее готовили гистологические срезы с окраской гематоксилином и эозином. Вторую часть замораживали (-60 °С) и готовили криосрезы. Часть криосрезов использовали для конфокальной микроскопии с целью визуализации в миокарде меченых трансплантированных клеток. Остальные криосрезы были приготовлены для выявления типичных для эндотелиальных клеток антигенов CD31 (РЕСАМ-1), опосредующих взаимодействие эндотелиоцитов в процессе ангиогенеза. Для этого криосрезы фиксировали в ацетоне (+4 °С) в течение 10 минут. Выявление CD31 на мембране клеток проводили иммуноцитохимическим методом (стрептавидин-биотиновым) с использованием очищенных мышиных моноклональных антител (МКА) TLD-3A12 к крысиному CD31 (BD Pharmingen™ IgG,/2a и IgGl) в разведении 1:50 и системы визуализации NOVOLINK™ на основе компактного полимера RE7150-K. Подготовка препаратов к проведению реакции включала нейтрализацию эндогенной пероксидазы и блокаду неспецифических белков. Окрашивание препарата осуществляли посредством последовательной инкубации с DAB и гематоксилином.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Застойная сердечная недостаточность в эксперименте

У выживших животных на 30-е сутки после отмены доксорубицина поражение миокарда манифестировало в форме застойной СН. Фракция выброса (рис. 1) и перфузия миокарда были достоверно снижены (табл. I).

70,5%

68,2% 1 53%

□ Контрольная групппа

■ Группа животных с застойной СН

Крысы

Кролики

Рис. 1. Фракция выброса (%) у крыс и кроликов с экспериментальной

застойной СН

Таблица 1

Показатели перфузии миокарда (уровень накопления РФП) у крыс и кроликов с экспериментальной застойной СН

Группы и число животных в них Показатели

Сердце-средостение

Крысы (40)

Контрольные (20) 2,8 ±0,17

Опытные (20) 1,5+0,07

Кролики (20)

Контрольные (10) 1,4+0,07

Опытные (10) 0,8+0,012

Достоверность различий, р < 0,05

В миокарде регистрировали диффузную дистрофию кардиомиоцитов с очагами их некроза, в легких - признаки застойного полнокровия.

*

Данная модель застойной СН некоронарогенного генеза была использована для решения поставленных задач.

Поиск оптимального варианта доставки клеточного материала

Оценка эффективности клеточной терапии застойной СН при разных способах доставки в сердце заданной концентрации клеток показала преимущество КБ способа. Во-первых, наименьшей потерей клеток из сердца в первые сутки после трансплантации (рис. 2). Во-вторых, достоверно лучшими показателями фракции выброса (рис. 3) и морфологии миокарда в третьих.

0,04

ЕД.

0,02

0,0312

0,0138

□ Внутримиокардиальн ое введение

■ Внутрикоронарное введение

Ш Комбинированное введение

Рис. 2. Перераспределение клеток трансплантата из миокарда крыс в зависимости от пути их доставки

71,5%

□ Внутримиокзрдизль ное введение

3 Внутрикоронарное введение

М Комбинированное введение

О Контрольная группа

Рис. 3. Фракции выброса (%) у крыс в зависимости от пути доставки клеток трансплантата

Миокард крыс только после КБ введения клеток был почти без периваскулярных инфильтратов и очагов дистрофичных кардиомиоцитов. Данный путь, как наиболее функциональный, был использован для поиска максимально функциональной и безопасной концентрации клеток.

Оценка эффективности клеточной терапии застойной сердечной недостаточности в зависимости от количества клеточного материала при комбинированном способе их введения в сердце

Трансплантация 20x106 клеток приводила к гибели животных почти сразу после их введения, как следствие клеточной эмболии. Дальнейшие исследования были ограничены сравнительным анализом двух групп крыс реципиентов: животных, получивших 2хЮ6 и 10x10 клеток. Клеточная терапия, как и в предшествующем эксперименте, существенно увеличивала фракцию выброса по сравнению с таковой у крыс контрольной группы, но особенно заметно у реципиентов ЮхЮ6 клеток (рис. 4).

80% -1

64%

□ Реципиенты 2х106 клеток

Реципиенты ЮхЮ6 клеток

Контрольая группа

69%

Рис. 4. Фракция выброса (%) у крыс-реципиентов 2х106 и ЮхЮ6 клеток и крыс контрольной группы

Различия в результатах эхокардиографического исследования крыс реципиентов 2хЮ6 и ЮхЮ6 клеток были предопределены состоянием кардиомиоцитов и микроциркуляции в миокарде. Перфузия миокарда крыс реципиентов ЮхЮ6 клеток была значимо лучше, чем у животных контрольной группы. А также выше в сравнении с крысами получивших только 2хЮ6 клеток (рис. 5). Полнокровие и отек миокарда у животных-реципиентов ЮхЮ6 клеток были менее заметны. Определялась более выраженная интерстициальная клеточность, представленная в основном эндотелиальными клетками и клетками сателлитами, воспалительная

инфильтрация отсутствовала. Дистрофические изменения кардиомиоцитов были слабо выраженными. 3

Рис. 5. Перфузия миокарда у крыс-реципиентов 2х106 и 10х106 клеток и крыс контрольной группы

Полученные результаты позволили заключить, что клеточная терапия диффузного поражения миокарда с застоем крови в малом и большом круге кровообращения существенно влияет на морфо-функциональное состояние сердца, кровообращение в целом и может быть самостоятельным методом или уместной опцией в лечении застойной СН вследствие ДКМП. Однако конечный полезный результат может быть существенно лучше при протоколе клеточной терапии ДКМП, включающим КБ способ доставки клеточного материала с концентрацией клеток в нем не менее 10x106.

Оценка оптимального варианта клеточной терапии (комбинированный способ доставки 10х106 клеток) выполнена на кроликах

Показатели, характеризующие функцию и морфологию сердца кроликов опытной и контрольной групп на 30-е сутки после клеточной терапии, существенно разнились. Прежде всего, отмечали достоверный прирост фракции выброса (рис. 6) ударного объёма, а равно и показателей, свидетельствующих о восстановлении диастолического компонента у кроликов, перенесших пересадку клеток. Уровень перфузии миокарда, судя по накоплению РФП, также был явно выше у животных опытной группы (рис. 7).

%

□ Контрольная группа

I Опытная группа

Рис. 6. Фракция выброса (%) у кроликов-реципиентов 10x10 клеток и животных контрольной группы

1,2693

□ Контрольная группа ■ Опытная группа

Рис. 7. Перфузия миокарда у кроликов-реципиентов 10x10 клеток и животных контрольной группы

Различия функциональных проб были и в морфологии миокарда кроликов сравниваемых групп. Это касалось степени выраженности дистрофических изменений кардиомиоцитов, кардиосклероза и состояния микроциркуляции. По всем этим показателям миокард кроликов опытной группы (рис. 8) выгодно отличался от такового контрольных животных, в котором дистрофия кардиомиоцитов носила диффузно-очаговый характер, отмечался кардиосклероз и неравномерное кровенаполнение (рис. 9). Как следствие морфо-функционального восстановления миокарда животных опытной группы относительно миокарда контрольных кроликов нормализовалась перфузия легких (рис. 10, 11) и органов большого круга, в частности печени (рис. 12, 13). Не было признаков застойного полнокровия, переполнения вен и воспалительных инфильтратов в печени.

% .Чч* V • л * '- ^

Г5

>1

«,ч * 4 •

. •*■ М- *

ч V < • к Л ,

Рис. 8. Гистологический срез миокарда кролика контрольной группы. Окраска гематоксилином и эозином. Х100

Рис. 9. Гистологический срез миокарда кроликов опытной группы. Окраска эозином. XI00

Рис. 10. Гистологический срез легких кролика контрольной группы. Окраска гематоксилином и эозином. XI00

Рис. 11. Гистологический срез легких кролика опытной группы. Окраска гематоксилином и эозином. XI00

Рис. 12. Гистологический срез печени кролика контрольной группы. Окраска гематоксилином и эозином. XI00

Рис. 13. Гистологический срез печени кролика опытной группы. Окраска гематоксилином и эозином. XI00

Таким образом, клеточная терапия мононуклеарной фракцией костного мозга, - доступного, безопасного, лишенного этических проблем, легко и быстро получаемого клеточного продукта - может оказаться реальной альтернативой трансплантации сердца при неишемической кардиомиопатии. Однако, механизм наблюдаемого у животных улучшения функции миокарда мы, равно как и большинство других исследователей [Balsam L.B., 2004: Nygren J.M., 2004; Reinecke Н., 2004], трансплантировавших не только мононуклеарные, но и иные клетки (фетальные, мезенхимальные, скелетные миобласты и т.д.), не склонны интерпретировать, как результат замещения кардиомиоцитов. Даже наблюдая донорские клетки в миокарде кроликов-реципиентов спустя 30 суток после трансплантации мы не можем продемонстрировать их дифференцировку и интеграцию с кардиомиоцитами реципиента (рис. 15). Более убедительным является их участие в ангиогенезе (рис. 14) и, судя по морфологии миокарда, в ограничении некро-дистрофических и склеротических процессов. Принципиально то, что степень выраженности этого морфо-функционального ответа миокарда на клеточную терапию зависит от пути и количества, доставленных в миокард клеток (рис. 15) - источников ферментов, цитокинов и ростовых факторов, в необходимом и достаточном для восстановления миокарда количестве.

Рис. 14. Криосрез миокарда кролика на 30 сутки после клеточной терапии (10x106 клеток). Пролиферация капилляров с участием СБ 31 клеток. Образование очагов повышенной васкуляризации. Х400

Рис. 15. Конфокальная микроскопия. Криосрез миокарда кролика, на 30-е сутки после трансплантации. Клетки меченные красным флуоресци-ующим белком

Комбинированный способ доставки в миокард 10х106 клеток, вероятно, и является условием, обеспечивающим оптимальную и безопасную индукцию клетками трансплантата механизмов репаративной регенерации при неишемической кардиомиопатии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сердечная недостаточность занимает первое место среди причин госпитализации людей в возрасте старше 65 лет. Однако госпитализация далеко не всегда решает проблему здоровья данных пациентов. Особо это касается болезней миокарда некоронарогенного происхождения -кардиомиопатий, среди которых 60 % приходится на ДКМП [Sinagra G., 1999]. Она быстрее, чем иные кардиомиопатии, приводит к стойкой инвалидности [Мухарлямов Н.М. и др., 1986] и, по данным Фрэмингемского исследования, смерти не менее 42 % женщин и 62 % мужчин уже через 5 лет от её начала.

Неудачи консервативной терапии ДКМП ставят, как правило, вопрос о трансплантации сердца или применение систем механической поддержки, хотя сегодня вероятной альтернативой может оказаться клеточная кардиопластика, как метод восстановления функции поврежденной ткани клетками трансплантата [Шумаков В.И. и др., 2003; Шевченко Ю.Л., 2006; Perin Е.С. et al., 2004].

Клеточная кардиопластика, как одно из направлений клеточной терапии, подразумевает последовательные этапы: выделение клеток из тканей, манипуляции in vitro (очистка, фракционирование, культивирование, ген-модификация) и введение в орган-мишень с целью улучшить его функцию. В своей работе мы использовали клеточную трансплантацию как самостоятельный метод, когда трансплантацию осуществляли простой инъекцией клеток, выделенных непосредственно перед операцией. Выбор был предопределен своей физиологичностью (в отличие от генотерапии), онкогенной и инфекционной безопасностью, таящейся в использовании культуры клеток [Rubio D. et al., 2005; Tolar J. et al., 2007], простотой, то есть мотивами, безупречными для продвижения в клиническую практику. Так, нами были получены положительные результаты, используя аутологичную мононуклеарную фракцию костного мозга при лечении ишемии нижних конечностей в эксперименте [Белевитин А.Б. и др., 2008, 2009].

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

В общей структуре причин госпитализации сердечная недостаточность (СН) занимает третье место, при этом у лиц старше 65 лет она является основной [Свистов A.C. и др., 2005]. Такая заболеваемость обуславливает высокую смертность от данной патологии. Это в большей степени относится к случаям застойной СН резистентной к медикаментозной терапии.

В нашей стране однолетняя смертность больных с клинически выраженной СН достигает 26-29 %, это означает, что в РФ за один год умирает от 880 до 986 тысяч больных СН [Даниелян М.О., 2001].

Среди причин развития застойной СН дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) занимает второе место, уступая лишь ишемической болезни сердца [Бокерия Л.А. и др., 2009; Davis R.C. et al„ 2003]. К сожалению, на сегодняшний день не разработано универсального метода консервативного лечения застойной СН, обладающего высокой эффективностью [Рекомендации ВНОК и ОССН 2009]. Альтернативой медикаментозной терапии является хирургическое лечение, и в первую очередь - как единственно радикальный способ - трансплантация сердца. Вместе с тем, жесткие критерии отбора доноров и сопряженный с этим дефицит донорских органов направляют врачей на поиск иных' вариантов лечения, способных помочь больным, в ожидании трансплантации (системы вспомогательного кровообращения и др.). Одним из таких методов является клеточная терапия [Шумаков В.И. и др., 2003; Шевченко Ю.Л., 2006" Perm Е.С. et al„ 2004].

На этом пути ведется активный поиск клеток-кандидатов - от эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) до соматических стволовых клеток (ССК), - как стволово-клеточных трансплантатов для регенерации миокарда.

Результаты этого поиска свидетельствуют, что в регенерации поврежденного миокарда у экспериментальных животных [Bittner R.E. et al., 1999; Makino S. et al., 1999] и у пациентов [Assmus В. et а!., 2002; Perm Е.С. et )04] способны участвовать не только ЭСК [Klug M.G. et al., 1996] и ССК 'чение которых не обременено, в отличие от первых, этическими немами), а также мезенхимальные стволовые клетки (MC-K) [Makino S. et 1999] и гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) мононуклеарной ции костного мозга [Bittner R.E. et al., 1999].

и количества доставленного клеточного материала, улучшает функцию сердца.

3. Степень восстановления миокарда крыс с застойной сердечной недостаточностью, с помощью клеточной терапии мононуклеарной фракцией костного мозга, зависит от пути доставки клеточного материала. Лучшим вариантом доставки является комбинированный, внутрикоронарно - внутримиокардиальный, обеспечивающий прирост фракции выброса на 27 %.

4. Степень увеличения сократительной функции сердца у крыс с застойной сердечной недостаточностью при комбинированном способе введения мононуклеарных клеток зависит от их количества. Более эффективной концентрацией, как по безопасности, так и увеличению сердечной функции является 10х106 клеток в 100 мкл 0,9 % Nací. Прирост фракции выброса при трансплантации 10х106клеток составил 25 %, в то время при трансплантации 2x106 клеток только на 19 %.

5. Клеточная терапия застойной сердечной недостаточности у кроликов путём введения 10х106 собственных клеток, мононуклеарной фракции костного мозга, доставленных комбинированным способом увеличивает фракцию выброса, нормализует кровообращение в малом и в большом круге.

6. Роль трансплантированных в миокард клеток мононуклеарной фракции костного мозга в механизме восстановительной регенерации состоит в индукции ангиогенеза и ограничении некро-дистрофических процессов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Воспроизведение застойной сердечной недостаточности у кроликов возможно с помощью внутривенного введения доксорубицина в конечной дозировке препарата не более 10 мг/кг массы тела животного.

2. Полный доступ к сердцу крысы или кролика безопасно выполнять посредством продольной срединной стернотомии.

3. Клеточную терапию застойной сердечной недостаточности неишемического генеза мононуклеарной фракцией костного мозга по критерию безопасности и эффективности целесообразно выполнять доставку ЮхЮ6 клеток комбинированным (внутрикоронарно -внутримиокардиальный) способом.

4. Трансплантация в сердце крыс и кроликов комбинированным способом мононуклеарной фракции костного мозга в количестве более 10x10* клеток несёт риск фатальной клеточной эмболии.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Хубулава Г.Г., Александров В.Н., Кривенцов A.B., Шарова Л.А., Настуев Э.Х. Моделирование застойной сердечной недостаточности у крыс // Сердечно - сосудистые заболевания. - 2008. - Т. 9, № 6. - С. 167.

2. Хубулава Г.Г., Сазонов А.Б., Александров В.Н. Маслянюк О.В., Кривенцов A.B. Экспериментальная модель клеточной терапии ишемии нижних конечностей // Сердечно - сосудистые заболевания. - 2008. - Т. 9, №6.-С. 291.

3. Белевитин А.Б., Хубулава Г.Г., Сазонов А.Б., Александров В.Н., Маслянюк О.В., Кривенцов A.B. Использование аутологичных стволовых клеток для стимуляции артериогенеза при критической ишемии нижних конечностей // Вести. Рос. Воен. - мед. Акад. - 2008. -№ 3(23). - С. 176-179.

4. Белевитин А.Б., Цыган В.Н., Хубулава Г.Г., Александров В.Н., Сазонов А.Б., Маслянюк О.В., Кривенцов A.B., Богданов А.Н., Румакин В.П., Лесничий В.В., Калюжная Л.И., Пивоварова Л.П., Перекрест C.B. Клеточная терапия критической ишемии конечностей в эксперименте // Вести. Рос. Воен. - мед. Акад. - 2009. -№ 2(26). - С. 89-95.

5. Александров В.Н., Богданов А.Н., Кривенцов A.B., Макеев Б.Л., Маслянюк О.В., Сазонов А.Б., Хубулава Г.Г., Румакин В.П. Способ лечения терминальной ишемии конечностей // ПАТЕНТ на изобретение. - 2009. - № 2369399.

6. Кривенцов A.B., Хубулава Г.Г., Александров В.Н., Сухов В.Ю., Настуев Э.Х. Моделирование застойной сердечной недостаточности у кроликов // Сердечно - сосудистые заболевания. - 2009. - Т. 10, № 6. - С. 103.

7. Хубулава Г.Г., Кривенцов A.B., Никитин А.Э., Свистов A.C., Александров В.Н., Настуев Э.Х., Колюжная Л.И., Сухов В.Ю. Выбор пути доставки клеток в миокард при застойной сердечной

недостаточности // Вестн. Рос. Воен. - мед. Акад. : приложение. - 2009. -№4(28).-С. 138-139.

8. Хубулава Г.Г., Кривенцов A.B., Александров В.Н., Сухов В.Ю., Настуев Э.Х. Выбор пути введения стволовых клеток в миокард при застойной сердечной недостаточности // Вторая науч. - практ. Конф. кардиохирургов северо-зап. региона России «Хирургическое лечение сердечной недостаточности» : программа и тезисы. - Петрозаводск, 2009. -С. 50-51.

9. Хубулава Г.Г., Кривенцов A.B., Александров В.Н., Сухов В.Ю., Настуев Э.Х. Моделирование застойной сердечной недостаточности // Вторая науч. - практ. Конф. кардиохирургов северо-зап. региона России «Хирургическое лечение сердечной недостаточности» : программа и тезисы. - Петрозаводск, 2009. - С. 51 - 52.

10. Белевитин А.Б., Никитин А.Э., Цыган В.Н., Хубулава Г.Г., Кривенцов A.B., Александров В.Н., Сазонов А.Б., Свистов A.C., Румакии В.П., Калюжная Л.И., Сухов В.Ю., Талантов C.B., Полуботко Е.В., Бабашев Ф.А., Максимов А.Г., Перекрест C.B. Поиск оптимального варианта клеточной терапии застойной сердечной недостаточности неишемического генеза в эксперименте//Вестн. Рос. Воен. - мед. Акад. - 2010. - № 3(31). - С. 112-120.

11. Белевитин А.Б., Никитин А.Э., Цыган В.Н., Хубулава Г.Г., Сазонов A.B., Кривенцов A.B., Александров В.Н., Колюжная Л.И., Перекрест C.B. Клеточная терапия патологии миокарда (обзор литературы) II Вестн. Рос. Воен. - мед. Акад. - 2010. - № 2(30). - С. 194-200.

12. Soukhov V.Y., Khubulava G.G., Kriventsov A.V., Nikitin A.E., Svistov A.S., Aleksandrov V.N., Nastuev E.H., Kolyuzhnya L.I. Challenging stem-cells delivery method for treatment of congestion heart Failure // Eur. J. Med. Mol. Imaging. - 2010. - Vol. 37, suppl. 2. - P. S240.

Подписано в печать 06.06.11 Формат 60x84/16

Обьем 1 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 428

Типография BMA, 194044, СПб., ул. Академика Лебедева, 6.