Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Кинетические характеристики эритропоэза в эритробластических островках костного мозга

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭРИТГОПОЭЗА В ЭРИТРОПЛЛСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКАХ КОСТНОГО МОЗГА

14.CXJ.lf». - патологическая фитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата Апологических наук

Челябинск, 1493

Работа выполнена в Челябинском государственном медицинском . институте

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор медицинских наук, член-корреспондент АЕН РФ, , профессор КШ.ЗАХАРОВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ;

доктор медицинских наук, профессор С.Н .ТЕПЛОВА; доктор медицинских наук, профессор Б.Г.ЮШ КОВ

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови, г.Санкт-Петербург

Зашита состоится « ^^ » 1993 г. в часов на заседа-

нии специализированного совета К 084.04,02 при Челябинском государственном медицинском институте (адрес: 454042, Челябинск, Воровского 64) . .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинского медицинского института.

Автореферат разослан « ® »., __1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета.

доктор мед. наук

Л.В.КРИВОХИЖИНА

Актуальность проблемы Эффективность диагностики и лечения ематологических заболеваний прямо зависит от достижений фун~ ^ментальных исследований в области кроветворения. Одним из. нап->эвлений таких исследований является изучение красного кровяного юстка. В настоящее время установлено, что эритролоэз у млекопита-эщих протекает в эритробластических островках (ЭО) костного мозга Бесси М.,1967; Bessis M. и др.1978). Уточнены их количественные гараметры в> единице массы гемопоэтической ткани у здоровых лю-1ей и животных, разработана формула эритробластических островов, позволяющая оценивать движение волны амплификации и соз-¡евания эритробластов в ЭО, а также описаны изменения этих параметров при стимуляции эритропоэза и его угнетении в эксперименте I при гематологических заболеваниях у человека (Захаров ЮМ,1991;За-аров ЮМ, Мельников ИЮ, 1987; Воргова J1B, Захаров Ю.М, 1990." 'ассохин А.Г, 1990). Вместе с тем. остаются не изученными механизмы реконструкции эритропоэза в ЭО, влияние на эти процессы зрит- ' оидной «короны» 30, отсутствуют оценки неэффективного эритро-юэза и ускоренного (терминального) эритропоэза, эффективного эрит-' опоэза в ЭО как в норме, так и при различных экспериментальных остояниях у животных Между тем, возможность оценки эффектив-ого к ■ неэффективного эритропоэза, знание закономерностей его ре-онструкции в ЭО в норме, условиях эритропоэтического стресса, при егенерации эритропоэза после кроеопотери или на фоне экслери-(ентальной депрессии эритропоэза во многом бы обогатила сущест-. ующие представления об этих важнейших составляющих эритропо-за. способствовало расширению базы диагностических возможностей при расшифровке патогенеза различных анемий.

Шйь_ .исследования Избить состояние эффективного и неэффективного эритропоэза и условия его реконструкций в зритроблэс-лческих островках костного 'мозга в норме и при экспериментальных" остояниях.

Задачи исследования.

1. Оценить в эритробластических островках эффективный эритро-поэз по уровню пролиферативной активности, митотическому индексу, .статмонинетическому индексу.

% Оценить зависимость реконструкции эритропозза в эритробластических островках от эритроидного состава их «короны».

3; Определить величину неэффективного эритропозза в эритробластических островках по подсчету количества ШИК-положительных клеток в «короне» эритробластических. островков.

4. Оценить насыщенность гемоглобином ретикулоцитов «короны» эритробластических островков и периферической крови путем определения их сухой массы в различные сроки эритропоэтического стресса. ■

5. Исследовать морфофункциональные характеристики, формулу и содержание эритробластических островков у экспериментальных животных после введения эритропоэтина и после кровопотерм.

Научная новизна. Впервые доказано, что реконструкция эритр! поэза в ЭО может осуществляться как на базе инволюцирующих 30. так и ЭО 3-го класса, что значительно увеличивает эритроидный «плацдарм» костного. мозга при эритропоэтическом стрессе Впервые показано, что важным. условием для реконструкции эритропозза в ЭО является уменьшение содержания в их «короне» макроретикулоци-тов. Показано, что снижение доли неэффективного эритропозза б костном мозге под влиянием эритропоэтина и ее увеличение при кроволотере также характерно и для эритропозза в-30 костного моз^ га.

Теоретическое значение работы. Исследование выявило новь Ранее не иззестные фундаментальные закономерности в формировании компенсационного эритропозза с участием ЭО костного мозга Показано,' что участие эритропоэтически активных макрофагов костяного мезга значительно ускоряет увеличение массы эритроидной ткани

в костном мозге.

- Апробация работы Материалы диссертации доложены на - конференции молодых ученых Челябинского медицинского института « Актуальные вопросы теоретической и практической медицины» в 1993 г, на расширенном заседании кафедр патологической физиологии и нормальной физиологии Челябинского медицинского института в 1993 г.

, л

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 работы

Положения, выносимые на защиту

1. Зависимость реконструкции эритропоэза от эритроидного состава «короны» ЭО.

2 Состояние эффективного и неэффективного эритропоэза в «короне» ЭО при различных состояниях системы эритрона.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на страницах машинописи, иллюстрирована таблицами и рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, моделей и методов исследования, изложения результатов собственных исследований с обсуждением в 2-х главах заключения и выводов Список цитируемой литературы состоит из 227 названий, из них 151 иностранных

МАТЕРИАЛЫ. МОДЕЛИ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на 495 лабораторных белых беспородных крысах-самках весом от 90 до 350 г. В качестве модели для угнетения эритропоэза выбрана, посттрзнсфузионная яолицитемия, которая достигалась однократным • внутрибрюшинным ; введением эрйтроцитар-яой взвеси 7% от массы тела" Состояние стимулированного эритропоэза моделировалось путём однократного введения эритропоэтинсо-цержащей плазмы полицитемичным рвотным, по 2 ЕД/100 г массы. Плазма получена из крови крыс, анемизированных фенилгидразином л облучением (Взнер Э. и др. 1984) и откалибрована на содержание зритропоэшна (Гудим ВЦ 1982 Еф/ А_), 1986)' по стандарту, по-,

лученному их .мочи больных с апластической анемией в лаборатории Терри фокса (Ванконвер). Другой моделью активированного эрйтро-поэза служила постгеморрагиуеская анемия; которая составляла 2% от массы тела. Показатели периферической крови: гематокрит (%), содержание ретикулоцитов (%°) с оценкой их по стадиям зрелости {%) определялись по общепринятым методикам (Абрамов М.Г., 1985 ). Уровень гемоглобинизации эритроцитов (пг) определялся методом интерферометрии (Гольдберг ЕД и др., 1983). Исследование количества ЭО костного мозга проводилось подсчетом их содержания в бедренных костях (Захаров КМ и др., 1984). Получение клеточных препаратов проводилось с использованием приемов цитоцентрифу-гирования (Рассохин АГ. и др., 1985). ЭО классифицировались ло классам 'зрелости (Захаров КМ и др, 1990) с выделением ЭО 12.3 классов, ЭО инволюцирующих и ЭО реконструирующихся. Анализ изменений в качественном составе ЭО дополняли расчетные коэффициенты, включающие «Показатель вовлечения КОЕ-Э в эритроид-ную дйфференцировку». «Показатель повторного вовлечения центрального макрофага ЭО в эритропоэз» и «Показатель созревания» (Воргова Л.В.,Захаров ЮМ, 1990). Содержание гемоглобина ретику-лоцитами инволюцирующих и реконструирующихся ЭО (отн.ед.) определялось на окрашенных бензидином препаратах (реакция • Lepeh-пе) (Хейхоу ФХДж, Кваглино Д 1983). Уровень пролиферативной активности эритробластов оценивался по статмокинетичеекому индексу (Astaldi, 1960). Гликоген исследовался в эритроидных клетках «короны» ЭО по Мак-Манусу (1946). .

Данные обрабатывались, методом вариационной статистики. Достоверности различий между группами определялись-с помощью t-критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при р<0.05.

■ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние эртролаэтинсодержащей плазмы на эритропоэз в ЭО, костного мозга полщигемичных животных .

Проведено исследование изменения содержания и состава ЭО в

костном мозге попицитемичных крыс в ответ на однократное подкожное введение эритропозтинсодержащей плазмы в количестве 2 ЕД/100 г веса тела. Показатели эритрона исследовались через 12, 24. 36, 48 и 72 часа после' введения плазмы. У контрольных животных -попицитемичных крыс, которым вводился физиологический раствор в том же объеме, что и эритропоэтинактивная плазма, костный мозг исследовался на 24 и 48 часы после введения раствора. Воспроизведение посттрансфузионной полицитемии на 6-е' сутки приводило к почти полному исчезновению ретикулоцитов из периферической крови. закономерному повышению гематокрита и уменьшению количества ЭО в костном мозге, которое сопровождалось характерными изменениями 8 формуле 30. которые проявлялись в уменьшении количества 30 1, 2, 3 и реконструирующегося классов за счет увеличения доли инволюцирующих 30.

Введение эритропоэтинактивной плазмы полицитемичным хры-сам приводило к ретмкулоцитозу и массовому появлению в периферической крови макроретикулоцитов с повышенным содержанием гемоглобина с 36-го часа исследования. Наибольшее увеличение уровня ретикулоцитов (40.6+6.0%о) и гемоглобина в эритроцитах (17,7+0.37 пг) от контроля (3,2+1,6% о и 11,410,5 пг) соответствовало 72-му часу наблюдений. Единичные макроретикулоциты регистрировались уже с 24-го часа эксперимента.'

Факт увеличения количества ретикулоцитов в периферической крови в ответ на эритропоэтинозый стимул является закономерной реакцией костномозгового кроветворения на воздействие гормона (Моисеева ОИ. 1985; Гудим ВИ. 1982; Везэ!^ М. и др, 1978). Появление в периферической крови макроретикулоцитов также является известным компонентом эритропоэтичёского стресса (Вез^э М,Вгес-кег в., 1975; Ц*; 1962) и. объясняется подключением механизмов «терминального» (ускоренного) эритропоэза В качестве другого механизма образования макроретикулоцитов можно предположить

участие в их продукции особой популяции эритроидных клеток, что не исключается и другими исследователями (Варыпаева Л.П, 1985', Захаров Ю.М, 1986; Рябов СИ, Шостка ГД. 1973)

• . Показатель гематокрита претерпел достоверное падение только на 72-й час исследования (58,6^2,5%) по сравнению с контролем (6б,5±3,0%), что согласуется с данными, полученными ранее в нашей лаборатории (Мельников И.Ю., 1987).

Введение эртролоэтинэктивной плазмы полицитемичным крысам резко активировало эритропоэз в ЭО. Через 36 часов после ее инъекции количество ЭО на бедренную кость увеличивалось в 1,5 раза против контроля (р<0,05) и на 48-72 часы исследования продолжало оставаться недостоверно выше контрольных значений (табл.1). Такие результаты совпадают с предыдущими исследованиями (Мельников ИЮ, 1987) и объясняются сохранением в костном мозге поли-цитемичных животных популяции макрофагов (Рассохин А.Г., 1990). способных к . формированию новых ЭО под влиянием эритропоэтина.

Увеличение числа ЭО в бедренной кости в ответ на стимуляцию эритропоэза сопровождалось перераспределением ЭО по классам 'зрелости , (табл.1). На 12-24 часы эксперимента произошло закономерное увеличение числа реконструирующихся ЭО (ЭО рек.) Одновременно выросли значения «Показателя вовлечения КОЕ-Э в дифференциацию в ЭО» (контроль. - .59.40+7,68) и «Показателя повторного вовлечения макрофагов ЭО .в эритропоэз» (контроль - 0,26+0,03) и к 24-му часу иссладованйя их величины составили 108,40+9,80 и • 0,7 7 ¿0,02 соответственно (р<0.05). Субстратом для • образования ЭО рек., вероятно, послужили инеолюцирующие островки(ЭО ина), чис-леность которых уменьшалась синхронно росту количества ЭОрек. К 24-му' часу после введения эритропоэтина произошло увеличение числа ЭО 3-го класса Пополнение состава этих ЭО к 24-му часу исследований было синхронизировано лишь с увеличением абсолютного'содержания. ЭОрек,-но не . было связано ни с опережающим, ни с

Таблица 3

Абсолютное количество ЭО и их распределение по классам зрелости посла 2$ кровопотври (М ±/я )

30«Ю3 { Э01-Ю3 | Э02-Ю3 | Э03.103 ¡Э0инв..Ю3 ¡ЗОрок.-Ю3

Контроль </! »3) 250,00±26,21 10,02±1,01 5,00±2,51 Ю,01±2,53 168,75±13,75 56,25+6,75 233,32^20,44 4,66±2,52 4,0^2,60 ?,00±3,16 156,00±7,80 60,49^11,43

Опыт,12 чао </1«. 3)

Опыт, 24 чао (л - 5)

Опыт, 36 чао » 5)

Опыт, 48 час 5)

Опит, 72 чао 5)

186,74+25,22 2,99^,27* 3,36+1,09 8,59+3,27 102,40^6,86м 66,6115,79

257,33+24,23 24,70±3,51а 8,22+2,97 7,71±1,41 147,51±7,02 68,88±5,Э4

286,24±33,14 7,15+2,98 7,15±1,85 П,44±4,81 163,02*6,50 97,34±4,21я

409,35±46,4* 14,32^6,36 16,36£4,92* 22,49±5,52* 226,99±24,79* 128,36*10,70я

к.

параллельным ростом содержания 30 1-го и 2-го классов Возникает предположение, что увеличение 30 3-го класса на 24-й' час после введения эритропоэтина связано с их образованием из числа 30 рек. В пользу зтого вывода указывает способность эритропоэтина ускорять процессы созревания эритробластов почти в 2 раза (Козинец Г.И. и др., 1963; Наша 1Я и др., 1969) против физиологических условий. Увеличение количества 30 инв к 36-му часу исследований с одновременным падением численности 30 3-го класса, вероятно, завершило волну амплификации; 30 инв.-> 30 рек-> ЭО 3-го класса.

К 36-му часу с момента активации эритропоэза. на фоне продолжения роста численности 30 рек и высоких значений «Показателя повторного вовлечения макрофагов в эритролоэз» (0.67±0,03, р<0,05) происходило резкое увеличение абсолютного количества 30 1-го и 2-го классов и «Показателя вовлечения КОЕ-Э в эрит-роидную дифференцировку» (171,68±7,30,р<0,05). К 48-му часу следовал подъем численности 30 3-го класса, что. на наш взгляд, завершило прохождение волны амплификации эритробластов, начавшейся от сформировавшихся под влиянием эритропоэтина 30 1-го класса путем вовлечения в эритролоэз макрофагов костного мозга, способных играть роль центральной клетки в 30. Данное предположение подтверждается фактом увеличения абсолютного количества ЭО в бедренной кости начиная с 24-го часа после активации эритропоэза, что, в свою очередь, и способствовало резкому. подъему численности ЭО 1-го и 2-го классов зрелости к 36-му часу эксперимента. Такое течение событий наводит на мысль, что под влиянием эритропоэтина новые волны деления эритробластов образуются .как в «короне» ЭО рек." так и в «короне» впервые вовлекзёмых в эритролоэз. макрофагов костного мозга, что подтверждается достоверный увеличением абсолютного количества ЭО в бедренной |состо к 36-му часу эксперимента

К 72-му часу с момента стимуляции эритропоэза пул ЭО инв. продолжал увеличиваться на фоне снижения количества ЭО 1-го, 2-го и 3-го классов, которые созревая, пополняли состав ЭО инв Численность же ЭО рек. и к- 72-му часу не отличалась от уровня, отмеченного к исходу 2-х суток после введения эритропоэтина, о чем свидетельствуют высокие значения «Показателя вовлечения КОЕ-Э в эритроидную дифференцировку» ( 102,99^1,36,р<0,05). Это наблюдение может -быть интерпретировано в свете данных (Захаров Ю.М., 1989; Zakharov Y., Prenant M.. 1983), указывающих на повышение аффинитета макрофагов ЭО к эритроидным клеткам, возможно, в :ипу способности центрального макрофага ЭО аккумулировать эрит-золоэтин или усиливать его образование при стимуляции эритропоэза В этом случае становится понятным продолжающееся формиро-зание новых ЭО на основе макрофагов ЭО инв. и через 72 часа после зведения эритропоэтина и отсутствие образования новых ЭО 1-го (лзсса в эти сроки на основе макрофагов, ранее не участвовавших в формировании ЭО. .

Появлению в периферической крови макроретикулоцитов с повы-иенным содержанием гемоглобина к Зб-му часу исследований пред-иествовало их обнаружение в «короне» ЭО инв. 'и ЭО рек уже к 24-/iy часу с момента активации эритропоэза. Наряду- с обнаружением аких ретикулоцитов s «короне» . ЭО были выявлены различия в ха-актере гемсглобинизации ■ ЭО инв. и ЭО рек. на протяжении исследу-мого периода. Так, в «короне» ЭО инв. это явление отмечается с 24-о по 48-й час после введения эритропоэтина, и лишь кратковремен-о (до 24-го часа) наблюдается в «короне» ЭО рек. Образование в ЭО ек. ретикулоцитов с повышенной гемоглобинизацией (р<0,05) к 24-ty часу от момента активации эритропоэза (181,5±4,14; контроль -6787+3,88 отнед), вероятно, объясняется стимуляцией эритропоэ--1Н0М вовлечений ранних эритрсидных клеток в контакт с макрофа-зми ЭО инв. Такие ЭО рек. несут в своем составе макроретикупоци-

ты, которые, судя по быстроте их появления, могли быть следствием терминального деления эритробластов, Сниженное же количество макроретикулоцитов в «короне» ЭО рек. с 24-го по 48-й часы после введения эритропоэтина заставляет думать о низком, по сравнению с 30 ина аффинитете макроретикулоцитов к адгезивным для них участкам мембраны центрального макрофага ЭО рек., что обусловливает их быстрый выход в циркулирующую кровь. Существование «плато» повышенной гемоглобинизации мзкроретикулоцитов (р<0,05) у 30 инв. с 24-го (184,40^5,67) по 48-й час (181,60±2.61;контроль -165,0^2,81). вероятно, обязано перходу в их состав ЭО 3-го класса зрелости, образующихся в ходе последовательной амплификации ЭО 1-го и 2-го классов зрелости и усиленному накоплению гемоглобина эритробластами их «короны». Это позволяет предпопагатъ, что центральный макрофаг ЭО инв. обладает более значительной комплементарной связью с ретикулоцитами, и что, в свою очередь, способствует большему накоплению ими гемоглобина Можно также предположить, что в образовании ; мзкроретикулоцитов ЭО инв. после 24-го часё воздействия эритропоэтинсодержащей плазмы участвуют и иные ', чем терминальное деление, механизмы перестройки эритропоэза, .связанные с формированием новой субпопуляции эритроцитов, отличающихся большим диаметром, объемом и большим содержанием гемоглобина подобно тому, как это происходит при адаптации эрит-рона к длительным тепловым .воздействиям (Варшзева ЛП, 1985; Захаров ЮМ и др.. 1986).

Обнаруженное различие в содержании макроретикулоцитов-в' «короле» ЭО инв. и ЭО рек. также позволяет высказать гипотезу о том, что для вовлечения ранних эригроидных клеток в контакт с макрофагами ЭО инв.,возможно, важным является уменьшение в «короне» последних эритроидных клеток, в том числе. макроретикулоцитов. -Возможно, что ЭО инв. присоединяют молодые эритроидные клетки, способные к реконструкции эритропоэза,только после уменьшения

количества ретикулоцитов (или общей массы гемоглобина) в «короне» ЭО до определенной «критической» величины. Очевидно также, что качественный состав клеток «короны» ЭО 1,2 и 3-го классов ограничивает присоединение новых родоначальных. кроветворных клеток к этим ЭО. так как ни в физиологических условиях, ни при компенсаторной активации эритропоэза этого не наблюдалось в ЭО 1 и 2 классов, и лишь под воздействием эритропоэтина реконструкция возникает в инволюцирующих ЭО 3-го класса. Механизм взаимодействия эритроидной клетки-предшественницы с макрофагом не вполне ясен, однако, известно, что созревающие эритроидные клетки могут выделять вещества, тормозящие новообразование эритроидной ткани (Zakharov У., Prenant М„ 1983) С другой стороныдопускэется образование макрофагами развивающихся 30 рестриктинов (Zipori D, 1989), препятствующих контакту с ЭО новых КОЕ-Э Поэтому существование ЭО рек. с макроретикулоцитзми в «короне», очевидно, объясняется влиянием эритропоэтина как на вовлечение ранних эритроидных клеток в эритропоэз, так и на повышение аффинитета центральных макрофагов созревающих ЭО 3-го и ЭО инв.. классов к ранним эритроидным клеткам-предшественницам.

Митотическая активность эритроидных клеток исследовалась в «короне» ЭО разных классов зрелости. Однако, при идентификации ЭО pete'В .их «короне» часто обнаруживались остановленные колхицином митозы полихроматофильных клеток. Данный факт можно объяснить присоединением КОЕ-Э к-30 3-го класса в силу возросшего аффинитета между макрофагами этих ЭО и эритроидными предшественницами под влиянием высоких доз эритропоэтина. В «короне» отдельных ЭО 1-го класса также отмечались единичные случаи присутствия митозов клеток другой, более поздней генерации, что также можно объяснить активацией реконструкции эритропоэза на базе не созревших ЭО (ЭО 3-го класса), что приводит к одновременному присутствию в «короне» ЭО разных" волн созревания эритроидных.

Таблица 2

Митотичаокая активность аритровдшос клеток в 30 различных кяассов зрелости у полицнтемичных крно посла введения эрктропоэтинактивной шмзмн (М ±т )

Кяасо зрелости 30

Срок после кровопо-тери

I клаос Митозы ! Митозы

ции на {рации 100 кяе—} ток |

Ш класс

Митозы |не способ- !

{Заканчивавшие создавайте 20 Ш класса

Т

Не споеоб-

кштизи «до уиу^ии— ' «по ицивди-

на 100 |ше к дзлв-}Мато8Н'{НН0 к дв-клвток ш клетки сносок-, ,ных К ( [делению]

1

¡ленив |югетк2

Рекоцс

вся

Матозы молодой генерации нз 100 клеток

ТЙйтозы ¡предыдущей ге-|пбрацин

Контроль,24-48 чао в в> 1,2 * 10,0± 2,9 150,8± 18,6 6,% 1,3 93, 1,3 5,5± 1.0. и*

Опат, 24 чао и - 5) 70,8±х 3,5 77,4±* 2,4 77, 8,2 17,0£* 2,5 83,0±* 2,5 72,2±* 4,1 42,6* 6,2

Опыт, 36 чао <//- б) 73,4±* 2,1 4,0± X, 5 70,2±я 3,6 101,6** 7,4 21,8±* 4,2 78,2+к 4,2 75,4+* 8,5 " 41,2± 3,2

Опыт, 48 чао <//« 5) 75,4±* 6,3 15,4* 1,4 62,3±* 0,8 172,04; 10,3 24,8±* 1,4 75,2±* Г,4 ■81,4** 3,6 92,2± 5,7

Опыт, 72 чао </1» 5) 1,2 7,3± 2,3 76,8+35 2,2 200,5/ 8,2 36,7±* 1,2 63,3^ 1,2 86,0±* 3,2 65,7± 5,1

я - р< 0,05 в сравнепии с контролем; + - р< 0,05 й сравнении с ЭОрвк.

клеток. При идентификации ЭО инв. было обнаружено, что воздейст-. вие колхицином в некоторых случаях не позволяет завершить' полное формирование ЭО инволюцирующего типа. Такие ЭО имели в своей «короне» менее 16 ядросодержащих клеток, представленных полих-роматофильными клетками с заблокированными митозами и не способными к делению поздними полихроматофильными и окс.ифнльн-ыми нормобластами, ■ а также- ретикулоцитами Такие ЭО объединялись в одну статистическую фуппу со сформировавшимися ЭО инв, которая также использовалась для изучения процессов созревания «короны» ЭО и была обозначена как «заканчивающие созревание ЭО 3-го класса».

Введение эритропоэтинактивной плазмы вызвало резкую активацию митотической активности эритроидных клеток (табл.2), что явпя-ется закономерной реакцией костного мозга на эритропоэтический стимул (Нефедов ВП, Гомзякова НВ, 1968; Matoth 1, 1962). Отсутствие снижения лролиферативной активности до конца тестируемого периода, соответствующего 3-м суткам от момента введения эритропоэтинактивной плазмы можно объяснить определяющей ролью центрального макрофага ЭО, способного регулировать эритропоэз с помощью выделяемых им веществ (БПА, ЭП) (Bessis M. и др.,1978; Zak-harov Y., Prenant M, 1982,1983) и усиливать эффект эритропоэтина при .небольших (ниже фармакологических) его концентрациях (Murphy М.,1978; Zakharov Y, 'Prenant M, 1983).

Сравнивая митотическую активность проэритробластов. и базо-фильных эритробластов в «короне» ЭО 1-го и реконструирующегося классов с полихроматофильными клетками «короны» ЭО 3-го класса как у контрольных, так и у. экспериментальных# животных можно констатировать равно выраженную величину пролиферации эритроидных клеток размой степени зрелости при однократном введении эритропоэтина на протяжении тестируемого периода. _ Однако, при сравнении статмокинезов ранних эритроидных клеток в «короне» ЭО 1-го

и ЭО рек. классов после активации эритропоэза обнаружено преобладание количества митозов в «короне» 30 рек., приобретающее достоверные размеры к концу срока исследований. Такое' же распределение событий имеет место при сравнении митотической активности лолихроматофильных клеток 30 3-го класса с молодыми клетками 30 рек. Таким образом, напрашивается вывод о более выраженной пролиферативной активности в «короне» 30 рек в сравнении с 30 1-го и 3-го классов зрелости.

Изначальное угнетение эритропоэза приводит к накоплению в «короне» заканчивающих созревание 30 3-го класса поздних, не способных к делению эритроидных клеток. Этот факт объясняет сниженное количество статмокинезов в «короне» заканчивающих созревание 30 3-го класса у контрольных животных по сравнению с экспериментальными. Зритропоэтиновая стимуляция сдвигает эту пропорцию в сторону более молодых, делящихся эритроидных клеток, активируя переход поздних эритроидных клеток в стадию безъядерного ретикулоцита.

Регистрацию в «короне» 30 рек. остановленных митозов клеток поздней генерации • можно объяснить присоединением родоначаль-ных эритроидных клеток к «короне» 30 3-го класса в силу повышения аффинитета между макрофагами этих 30 и эритроидными клетками-предшественницами под влиянием высоких доз эритропоэтина. Регистрация макроретикулоцитов в «короне» 30 рек. только на фоне повышенных доз эритропоэтина подтверждает данное • предположение. : .

- Введение активатора эритропоэза полицитемичным крысам повлияло на размеры неэффективного эритропоэза К 48-му часу исследований доля неполноценных эритроидных предшественниц от общего чйсла адросодержзщих клеток, входящих' в состав 30 всех классов зрелости, снизишсь по сравнению с контролем (3,3+0,3%) в три раза (1,0±0,0). К 72-му часу эксперимента число ШИК-позитивных

клеток несколько увеличилось (2,0±,0,4%), оставаясь при этом ниже контрольного уровня. Уменьшение доли ШИК-позитивных клеток в «короне» ЭО у экспериментальных животных является закономерным и объясняется влиянием- эритропоэтина на неэффективный эритро-поэз (Павлов АД, 1987).

При подсчете ШИК-позитивных клеток на 100 ЭО (без учета общего числа ядросодержэщих клеток, входящих в состав ЭО) было обнаруженное что несмотря на увеличение клеточности ЭО за счет увеличения доли ЭО 1-го, 3-го и реконструирующегося классов под влиянием эритропоэтина имеет место уменьшение числа ЩИК-по-зитиеных клеток и к 48-му часу отличается от контроля (6,0+1,0%) в 2 раза (3,0+0.0%). К 72-му часу их число возвращается к контрольному уровню (6,0t0,4%), что можно объяснить увеличением к этому моменту после стимуляции эритропоэзз клеточности ЭО зз счет по--вышения числа ЭО 1-го, 3-го и реконструирующегося классов, состоящих из активно размножающихся клеток.

Влияние острой кровопотери на эритропоэз в ЭО костного • мозга интзктныхживотных Для выяснения поведения показателей эритрона в условиях острой постгеморрзгической анемии у животных ■осуществлялась крозо-потеря в объеме 2%" от массы тела. Группу экспериментальных животных составили беспородные лабораторные крысы-самки весом 170200 г. Состояние эритролоэза оценивалось через 12. 24, 36. 48 и 72 часа с момента кровопотери. С этой целью исследовались показатели периферической крови и костного мозга. Исследуемые показатели периферической крови оценивались также в момент кровопотери и служили в качестве фона. Для сравнения динамики изменений параметров костномозгового эритропоэзз у* анемизироеанных животных в эксперимент была введена группа интактных крыс •

Постгеморрагическая • ¿немия сопровождалась- подъемом уровня ретикулоцитов в периферической крови (40.7±2,8 р<0.05) по срав-

нению с контролем (262+3,3 уже к первому сроку исследований (12 час) и падением показателя гематокрита до 27.8+5.6 % (р<0,05) (контроль - 43,5+1,0%) с последующим, его увеличением к 72-му часу до 35,2+4,8% (р<0.05). К концу эксперимента (72 час) ретикуло-цитоз периферической крови составлял 148,2+36%.. (р<0,05). Подобные изменения показателей периферической кроби шляются закономерной реакцией на кравопотерю (Моисеева О.И., 1985; Рябов С.И., Шостка ГД, 1973). К 24-му часу после кровопотери произошло падение абсолютного количества ЭО (табпЗ), что является закономерной реакцией костномозгового кроветворений (Мельников ИЮ,1987,Волков А.В., 1991) и объясняется перестройкой гуморальной регуляции эритропоэза (Павлов АД, Морщакова £Ф„ 1987), сопровождающейся повышением уровня эритропоэтина. К 36-му часу наблюдений количество 30 увеличилось до нормальных значений и продолжало рости, превысив контрольные значения к концу тестируемого периода в 1,6 раза, что несомненно является реакцией костномозгового кроветворения на эритропоэтин.

Постгеморрагичёская анемия повлекла за собой перераспределение ЭО по классам зрелости (таблЗ) Наблюдаемое к 24-му часу падение абсолютного количества ЭО 1-го и инволюцирующего классов, очевидно, отразило резкое ускорение процессов созревания эрит-роидных элементов «короны» ЭО с последующим их выходом в периферическое русло, что, в свою очередь, подтверждается повышенным ретикулоцитозом крови. ' Регистрируемое к этому часу увеличение (р<0,05) «Показателя повторного вовлечения макрофагов ЭО в эрит--РопоэЗ" (0,65+0,09; контроль - 0,34+0,11) до-видимому, связано с тенденцией к увеличению ЭО рек Дальнейшее увеличение числа ЭО

1-го и реконсгруирующегося классов и вслед за ним увеличение ЭО

2-гс,3-го и инволюцирующего классов на фоне высоких (р<0,05) значений «Показателя вовлечения КОЕ-Э в зритрсидную дифферен-цировку» и «Показателя • повторного вовлечения макрофагов ЭО в

Таблица d.

Абсолютное количество 30 и их распределение по классам зрелости после введения эритропоэтивактивной плазмы на фоне полицитемни (М ¿ т)

j ЭО'Ю3 } eOj'IO3 j SOg.XO3 j S03'I03 ¡ЭОднв.-Ю3 j sopea. «IO3

Контроль, 240,83±40,43 I4,85±3,20 3,21+0,80 4,0I±2.6I 174,10+11,97 44,55±I2,37 84-48 чао .

U- 6)

Оа1»,12час 200,67±33,04 6,62±I,49* - 3,41+1,47 127,24+5,62 60,52±5,38 . S)

Опыт,24 час 279,9%30,90 2,00+7,80 9,60+2,98® 47,60±I5,62* 114,40+65,36* 88,40*11,79* 5)

Опыт,36 час 378,67^44,97® 48,60*8,32* II,36±2,59* H,36±3,79 184,30+13,90 . I23,08±6,28a (До 5) •

0шл,48 400 289,33±2I,37 6,51*3,13 3,98+1,44 16,28*4,54* 180,81*7,40 01,73±7,20зг </í» 5)

Опыт,72 час 327,99*23,91. 2,95*1,65й 1,64*0,88 I6,73±5,88 206,64*17,85 100,04*10,63Í* (Ла5)

* - p <0,05 в сравнении о контролем.

эритропоэз», к. 72-му часу эксперимента достигших 143,02+14.48 и 0,60+0,01- соответственно, можно, объяснить активацией дифферен-цировки ранних эритроидных клеток, вовлечением их как в реконструкцию эритропоэза. так и в контакт с впервые вовлекаемыми в эритропоэз макрофагами и последующим продвижением по пути созревания вновь образованной, более широкой волны эритропоэза.

Характер процессов гемоглобинизации ЭО инв. и ЭО рек проявился в увеличении содержания гемоглобина ретикулоцитами их «короны», что объясняется влиянием высоких доз эритропоэтина (Везв^ М, Вгескег £,1975; Ла^Ьа 1_, 1962). При этом были выявлены различия в характере гемоглобинизации этих ЭО, проявившиеся в увеличении (р<0,05) уровня гемоглобинизации «короны» ЭО инв. на протяжении всего исследуемого периода (174,75±2.75 - к 12-му часу, 157,8+3,40 - к 72-му часуконтроль - 130,67+3,10 услед) и временным его падением- на 24-й час в «короне» ЭО рек Так, к. 12-му часу уровень гемоглобина в ретикулоцитах данных ЭО составлял 170,80+3.03, (р<0,05); к 24-му - 140,10+4,30; к 72-му - 148,00±4,40 (р<0,05); контроль - 132,30+3,90. Этот факт можно объяснить низким по сравнению с ЭО ина аффинитетом макроретикулоцитов к макрофагу' ЭО рек, что обусловливает их выход в циркулирующую кровь. Образование ЭО рек с макроретикулоцитами в «короне» можно объяснить стимуляцией эритропоэтином' вовлечения ранних «красных» клеток в контакт с макрофагами заканчивающих созревание ЭО, несущими в своей «короне» макроретикулоциты. Существование «плато» повы-шеной- гемоглобинизации макроретикулоцитов в «короне» ЭО инв. на протяжении всего экспериментального периода, вероятно, отразило усиленное накопление гемоглобина эритроидными клетками в усло-. виях эритропоэтического стресса (ВезаБ М, Вгескег <3, 1975)

Усиление пролиферативной активности эритробластов в ответ на крововопотерю отражает реакцию красного кровяного ростка на гипоксию, вызванную потерей циркулирующих эритроцитов (Канаев С.В,

1968; Павлов АД Морщакова Е.Ф, 1987; Рябов С.И., 1971), что в наших опытах выразилось в увеличении статмокинезов проэритроб-лааов и базофильных эритробластов «короны» ЭО 1-го и ЭО рек классов, а также попихроматофильных клеток в «короне» 30 3-го класса (табл4). Повышение количества статмокинезов клеток поздней генерации по отношению к неспособным к делению ядросодер-жащим клеткам в «короне» заканчивающих созревание 30 3-го класса, очевидно, отражает увеличение скорости созревания клеток последних стадий зрелости, или же подключение механизмов терминального деления (ускоренный эритропоэз) с образованием ретику-лоцитов на стадии попихроматофильных клеток, что в обоих случаях приводит к быстрому освобождению зрелых клеток из «короны» 30.

Увеличение числа статмокинезов клеток поздней генерации в «короне» 30 рек можно объяснить присоединением под воздействи-' ем высокой концентрации эритропоэтина клеток-предшественниц эритропоэза к 30 3-го класса, несущим в своей' «короне» еще способные к делению поздние эритроидные клетки. Более высокая мм-тотическая активность молодых эритробластов в «короне» 30 рек, чем в «короне» 30 1-го и 3-го классов, наблюдаемая при реакции красного кровяного ростка на кровопотерю, 'очевидно, объясняется более высоким эритропоэтическим, энергетическим - и строительным потенциалом центрального макрофага 30' рек. в сравнении с другими 30.

Глубокие изменения метаболизма, возникающие в гемопоэтичес-кой ткани после кровопотери (Захаров ЮМ, Якушев В.С.,1976; Ястребов АП. и др 1988;) повлияли на размеры неэффективного эритропоэза в «короне» 30. Так, если у интактных животных его величина составляла 5,2±0.4%, то уже к "12-му часу эксперимента доля ШИК-позитивных эритроидных клеток достоверно увеличилась (10,4+1,0%) и продолжала оставаться выше контроля до конца исследуемого периода. к 72-му часу составляя 8.3+0,5% (р<0,05) При подсчете ШИК-

• Таблица

Митотичвская активность арятроидных клеток а 00 различных классов • зрелости-у крыс после 25? яровопотери (М ±/п )

¡Заканчивающие соэ-|Реконс {резание 20 Ш клас-} !са I

Кадсс зрелости 90

Срок

поолв кро-вопотври

I.

! I класс !■

Ш класс

{Митозн |Митозы Iмолодой Гпрвдыду-}Гэнвра-|дой гаие-на | рации .

|клеток |

|Мятозн |Не способна 100 »ныв к дело-{кяаток {шло кяет-}способ-!ки

¡НИХ К I

{дэлвнйю}

7 ¡Не способ-■} Митозы }НК9 к деле-У }Нав клетки

! ! ! ! ! !

!Т^ИРУМДИ'

вся

Матозы ;Митозы ^молодой првднду-,генера-}щей гв-ла {нерации

|клотоа |

Контроль (/»Я 3) . 31.3± 5,8 2,7± 0,9 42,5± 6,6 93,7± 4,0 15,04; 1,7 85,0± 1,7 39, 2,6 12,0+ 1,1

Опыт, 12 час 5) 57,4+к 1,3 9,8+* 2,5. 0 ИХ$: 32,2/ 3,4 67,8+" 3,4 77,8/ 2,0 31,0/ 5,1

Опыт, 24 час 63,6+*'+ 3,9 И,4+к 2,4 80,%* 1,6 104,4+ 7,2 30,8+й 3,8 " 69Д+35 3,8 " 84,0/ 2,4 52,0+* 5,8 ~

Опыт, 36 чао {ит 5) 57,8± 6 Д 15,6/ 2,4 68+ 4,9 96,6± 9,2 29,8^ 2,5 70,2+ 2,5 85,0+ 4,2 52, б/ 3,3

Опыт, 48 чао {/г* 8> 54,2/»+ 9,6 2,7 59,4± 16,0 92,4± 16,7 29,6+й 3,4" 70,4+к 3,4 " 79,б/ 2,1 60,2/ 4,8

Опыт, ?2 чае О?» 5) 39,8±+ 3,9 10,2/ 1,6 49,6+ 3,7" Ш,8±к 7,3 22,8/ 2,6 77,2+* 2,6 " 58,2+* 4,9 20,0/ 2,0

* т>/ п.ПК я гупяпнятги с контоояем: + - Г) / 0.05 а сиавнении о ЗОрек.

позитивных клеток, в «короне» 100 ЭО (без учета Общего числа' ядро-■ содержащих клеток) отмечалась сходная картина изменения .продукции ШИК-положительного материала,на всех этапах исследования превышавшее контрольные значения. Эти результаты совпадают с наблюдениями АФ.Кэюмовой (1990), отметившей увеличение неэффективного эритропоэза у крыс с фенилгидразиновой анемией на фоне высокого содержания эритропоэтина в крови животных

ВЫВОДЫ

1. Высокие концентрации эритропоэтина повышают аффинитет центрального макрофага ЭО к эритроидным клеткам-предшественницам. делая возможной реконструкцию эритропоэза как в «короне» инволюцирующих ЭО, так и ЭО 3-го класса. Важным условием для возможности реконструкции эритропоэза в ЭО является уменьшение в их «короне» макроретикулоцитов.

2. Возможности вариантов реконструкции эритропоэза:

30 инв.-> ЭО рек-> ЭО 3-го класса и ЭО 3-го класса -> ЭО рек значительно повышают долю участия центральных макрофагов ЭО в' увеличёнии эритроидного «плацдарма» при эритропоэтическом стрес-.се.

' 3. На фоне высокого титра эритропоэтина как у полицитемичных, так и у анемизированных крыс- наибольшая митотическая активность эритробластов регистрируется • в «короне» реконструирующихся 'ЭО.

'■ 4 Эритропоэтический. стресс приводит к повышению степени ге-моглобинизации ретикулоцитов' и росту их диаметра в «короне» ЭО и периферической крови. • Ретикулоциты ■'более быстро высвобождаются из «короны» реконструирующихся ЭО, чем от связи с макрофагами инволюцирующих ЭО.

. • 5. Под влиянием' эритропоэтина снижается величина неэффективного эритропоэза в «короне» 30 у полицитемичных животных. *

Напротив, кроволотеря вызывает увеличение образования функционально неполноценных клеток в «короне» ЭО.

Список работ, опубликованных то теме диссертации 1. О влиянии ингибирующих м ссгамулирующих зритропоэз факторов на эритробластический- острова^// Актуальные . вопросы теоретической и практической медицины: ¡Матжонф- Челябинск. 1993-С.77-78

2 О связи пролиферативной активности и обмена гликозаминог-пиканов в эритробластических островках после острой кроволотери/ / Актуальные вопросы теоретической и практической медицины Матконф- Челябинск. 199а - СВ5436 (соавт Корнилова НВ)

Подписано ж печатая 24.0S.93. 5рр0зтБбШВ4 1/16. Печ. л. 1,5. 7д.-изд. л. 1,25. ТсраЕ ЮО эгз.ь3аваз;334. ТОН издательства.