Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Эритробластические островки костного мозга и их место в эритроне в норме и при изменении состояния эритропоэза в организме

т.

■т.

ЯНИСТЕРрВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ?ЛЯЩНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ

и Яя правах рукописи

РАССОХИН Александр Григорьевич

>РИТРОБЛАСТИЧЕСКИЕ ОСТРОВКИ КОСТНОГО МОЗГА ИХ МЕСТО В ЭРИТРОНЕ В НОРМЕ И ПРИ ИЗМЕНЕНИИ СОСТОЯНИЯ ЭРИТРОПОЭЗА В ОРГАНИЗМЕ

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Челябинск -1997

Работа выполнена в Челябинской государственной медицинской академии.

Научный консультант: Чл. - корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор ГО.М. Захар

Официальные оппоненты: Академик АЕН РФ, доктор медицинских наук, профессор А.П. Ястр Доктор медицинских наук, профессор К.Н. Муксинова Доктор медицинских наук, профессор Ф.А. Каюмов

Ведущая организация: Санкт - Петербургский научно - исследовательский институт гематологии и переливания крови.

Защита диссертации состоится 1997 г.

часов на заседании Специализированного учёного совета ( Д - 084.04.01) Челябинской государственной медицинской академш по адресу: 454092, г, Челябинск, ул. Воровского, 64.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинске

государственной медицинской акамедин.

Автореферат разослан

"Я' уЩ^ 1997 г.

Учёный секретарь

Специализированного учёного совета, доктор медицинских наук, профессор

Л.В. Кривохия

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ. Актуальность проблемы.

Объем познаний в области гематологии огромен и постоянно возрастает. 1яясь наукой о крови, клетках крови и кроветворных органах, гематология но и прочно связана с десятками направлений теоретической и практической (ицины и биологии. Зародившись как раздел описательной гистологии в пе-•д бурного развития морфологических наук в середине XIX столетия, геология стала опорой в самостоятельном становлении и развитии цитологии «бриологии, микробиологии и иммунологии, генетики и онкологии, радиаци-юй медицины и биологии, комбустиологии и трансфузиологии. Пребывание остоянии постоянной физиологической регенерации делает клетки крови и 'ветворных органов исключительно удобной моделью для исследования зако-(ерностей клеточной пролиферации, а многообразие морфологических форм ункций позволяет изучать тонкие механизмы дифференциации и созревания ток. Вскрытие закономерностей пролиферации и дифференцировки гемопоэ-:еских клеток,играющих жизненно важную роль в организме, продолжает ос-аться фундаментальной проблемой гематологии. Поддерживая целостность )авновесность своего состояния, гемопоэтическая ткань, циркулирующая № и органы кроворазрушения чутко реагируют на изменение внутренней ды организма и формируют ответ, направленный на обеспечение гомеостаза. :пень возникающего при этом напряжения проявляет себя в транзиторных мических состояниях, лейкоцитозах и лейкопениях, снижении иммунореак-ности. Однако отличить функциональные сдвиги от симптомов специфичес-[ гематологической патологии, органических поражений и заболеваний являя сложной задачей, составляющей предмет дифференциальной диагностики, гуальной остается проблема точного прогноза направленности, течения и ода гематологических синдромов и заболеваний, эффективности их коррек-[ и медикаментозного лечения.

На разных этапах развития гематологии ее успехи и неудачи во многом оделялись уровнем развития биологических наук в целом. Сегодня, как и 10-тет назад, успешное развитие теории кроветворения обоснованно связывают )стижениями молекулярно-генетической теории (Федоров Н.А.,1976;Чертков [., Гуревич O.A., 1984; Воробьев А.И., 1985; Козинец Г.И., 1987; ЧерковИ.Л. 0; Макаров В.П. и соавт., 1992; Rich I.N., Lappin R. J., 1994 и др.). Неоспо-ibi успехи молекулярной биологии и генетики по изучению топких механиз-I управления процессами в кроветворной ткани. Обнаруженные структурные ррации хромосом, включая группы D и G, явились доказательством генетикой природы ряда острых и хронических миелопролиферативных заболева-[, важности генетических исследований в гематологии (Воробьев А.И., 1985; рамов С.М.,1987; Козинец Г.И., Погорелов В.М.,1990; Гейл Р.П., Буттурини 1991; Владимирская Е.Б. и соавт., 1996 ).

Достаточно полно охарактеризована семья гемопоэтических ростовых фак-

торов (гемопоэтинов) или колониестимулирующих факторов (КСФ), подразл ляемых на линейно - неспецифические раннедействующие и линейно - спсш фические позднодействующие, обеспечивающие поддержание пролифераци дифференцирования и созревания кроветворных клеток (ОгаваМ., 1990; Гер рманнФ. и соавт.,1990; Теста Н., 1994; Натан Д.Г., Зифф К. А., 1994; McKay] Leigh I., 1993; Nicola N. A., 1994). Клеточное происхождение и предназначен! позволили отнести также эти факторы к цитокинам и/ или интерлейкинам (Фрейдлин И.С., 1995; Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1995). Определен химическое строение, пространственная конфигурация молекул и их субъед ниц, аминокислотная последовательность белковых и функциональная роль у леводных компонентов гемопозтических гормонов, их происхождение и би логические эффекты. Установлена точная локализация на хромосомах 2, 3,4, 1, 17, 19 генов гемопозтических факторов.С помощью биотехнологий получе и используются в эксперименте рекомбинантные ростовые факторы, и неукло но расширяется, начиная с 90-х годов, их успешное клиническое применеш (Декстер Т.М., 1991; Захаров Ю.М., 1991, 1994; Долгушин И.И. и соавт., 199. 1997; Новобранцева Т.И.,1996; Metealf D., 1993; Patchen M.L. et al., 1993; Espa N.J. et al., 1994 и др.). Таким образом, на примере гемопозтических гормон< наглядно продемонстрировано важное значение взаимодействия фундаментал ной науки и практики. Другим примером плодотворного внедрения фундаме: тальных разработок в медицину стала расшифровка структуры и функции кш точных рецепторов - поверхностных молекул клеток крови и гемопоэтическ органов, определяющих клеточный фенотип, в том числе лейкозных клеток межклеточные и молекулярно - клеточные взаимодействия, столь необходим) для обеспечения нормального течения процессов кроветворения, и создание г базе полученных данных моноклональных антител для диагностики и лечеш заболеваний крови (Бронда Б.Д., 1987; Зотиков Е.А.,1987; Барышников А.Ю. соавт., 1989; Кналп В. и соавт., 1990; Кемниц Дж. и соавт, 1990; Абрамов В.К 1991; Яздовский В.В., 1991; Бочков Н.П. и соавт.,1995 и др.).

Среди охарактеризованных более чем 100 специфических рецепторов,списс которых постоянно пополняется (Козлов И.Г. и соавт., 1995), наряду с реце торами к гемопоэтическим гормонам, важнейшее функциональное значение д гемолоэтических клеток имеют рецепторы контактного взаимодействия с мол кулами межклеточного матрикса и другими клетками, составляющими строи кроветворных органов или, как говорили ранее, гсмопоэтическое микроокруж ние (Фридснштсш! Л.Я., ЛурияЕ.А., 1980; Чертков Л.И., Гуревич O.A., 198¿ СадовниковаЕ.Ю. и соавт., 1988; Ястребов А.П. и соавг., 1988; Ругаль В.И. соавт., 1991; Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., 1994; КантороваВ.И., 1994; Юшю Б.Г. и соавт., 1994; Tavassoli М.,1974; Trentin J.J.,1978; Armstrong .T.W., Chape S.K., 1994; Wilson J.G., Tavassoli M., 1994 и др.). В настоящее время эти стру туры объединены в понятие молекул адгезии ( САМ - cell adhesion molecule насчитывающих 5 подсемейств и более 50 индивидуальных молекул: супсрс мейство иммуноглобулинов, ингегрины, селектины, кадхерины, протеогликаг

оценовский В.А., Барышников А.Ю., 1994; Адаменко Г.П., 1995; Козлов И.Г. оавт., 1995; Александров А.В. и соавт.,1997; Faull R.J. et al.,1994; Funk Ph. et 1994 и др.).

Наиболее наглядно и убедительно концепция роли межклеточных взаимо-[ствий и кооперативных отношений различных ростков кроветворения в ¡спеченин нормального функционирования гемопоэтической ткани проявила л на примере эритробластических островков (ЭО) костного мозга, представ-ощих собой ассоциацию клеток моноцитарного ряда и эритроидных клеток :ssis M., 1958 - 1991). Обнаруженные вначале у больных с железодефицигной !мией на электронограммах костного мозга при изучении инкорпорации гра-1 ферритина в эритробласты (Bessis M., Breton-Gorius J.,1956), ЭО не сразу яи признаны морфо - функциональными единицами эритропоэза (Захаров М., Мельников И.Ю.,1984).Только благодаря разработке достаточно простых годов выделения и подсчета ЭО, удалось развернуть широкое фундаменталь-: изучение их в эксперименте ( Le Charpentier Y., Prenant M.,1975; Prenant M., 10; Zakharov Y.M., Prenant M., 1982). С 1982 года в Российской Федерации логичные исследования стали проводиться в Челябинском медицинском ин-ггуте в лаборатории профессора Ю.М. Захарова Благодаря этим исследова-IM, удалось вкрыть функции, выполняемые макрофагами ЭО в отношении вивающихся эритроидных клеток, однако многие детали процесса фагоцито-1 лизиса ядер нормобластов и неполноценных эритроцитов, обеспечения проидных клеток пластическим материалом, поддержания высоких концент-[ий эритропоэзрегулиругощих факторов, создания специфического эритропо-ческого микроокружения, регуляции комплементарное™ клеток в ЭО оста-:я малоизученными до сих пор. Не в полной мере исследовано значение фун-юнальной активности макрофагов ЭО для поддержании эритропоэза в ост-1ках. Учитывая, что макрофаги занимают ключевую позицию в цитокиновой уляторной сети, продуцируя и выделяя более 75 разнообразных молекул >ейдлинИ.С., 1995), можно считать перспективным углубленное изучение роли в поддержании эритропоэза в организме.Оставаясь частью системы фа-.итирующих мононуклеаров, макрофаги островков могут реагировать на воздающие и повреждающие воздействия, ослабляя эршроиоэтическую функ-о, что непосредственным образом может сказаться на состоянии эритропоэза зганизме и привести к анемии. Вполне вероятно, что таков механизм разви-анемий при ожоговой травме, радиационном воздействии, инфекциях и ин-сикациях. Исследования в этом направлении могут помочь в поиске адекват-í способов профилактики и лечения анемических состояний, что делает изу-ие ЭО костного мозга особо привлекательным. Для медицины актуальным ается получение точных и обоснованных критериев оценки состояния эрит-юэза в организме, и, как представляется, количественный и качественный лиз ЭО костного мозга, эритропоэза в островках полностью отвечает на дан-i запрос практики.

Цель исследования.

Целью выполненной работы явилось определение на основе новых метод« количественного и качественного анализа роли и места эритробластически островков костного мозга в обеспечении пролиферации, дифференцирования созревания эритроидных клеток в условиях физиологической нормы и при том нении состояния эритропроэза в организме при возмущающих и повреждаюпц воздействиях.

Задачи исследования.

В рамках поставленной цели решались следующие задачи:

1. Разработать, апробировать и внедрить в практику научных и клинически исследований методы количественного и качественного анализа эритробласт* ческих островков костного мозга человека и животных, классифицировал островки.

2. Апробировать и внедрить в практику научных исследований модифицир ванные методы прижизненного исследования эритробластических островков

3. Изучить становление гемопоэтической функции эритробластических островков у животных в периоде раннего постнатального онтогенетическог развития.

4. Исследовать характер изменений эритропоэза в эритробластических ос ровках костного мозга при стимуляции эритропоэза в организме на фоне острс кровопотери, гемолитической анемии и при введении эритропоэтина.

5. Исследовать характер изменений эритропоэза в эритробластических ос ровках костного мозга при угнетении эритропоэза в организме на фоне пост трансфузионной полицитемии.

6. Изучить характер количественных и качественных изменений эритробла тических островков костного мозга при повреждающих воздействиях: термич< ком ожоге и общем однократном радиационном облучении организма в разны дозах.

7. Выявить характер количественных и качественных изменений эритробла тических островков при модуляции эритропоэтической функции их централь ных макрофагов на фоне иммунизации организма и при введении иммуномод) ляторов.

8. Изучить механизмы комплементарности клеток в эритробластическш островках и защитные эффекты ряда лекарственных средств в отношении под держания в них эритропоэза.

9. Исследовать особенности эритробластических островков костного моз1 у гематологических больных и больных с гематологической симптоматикой.

10. Определить нормативные количественно - качественные характеристик островков и эритропоэза в эритробластических островках костного мозга.

Научная новизна.

На основе вновь разработанного метода исследования эритробластических ровков ( Авторское свидетельство № 1309735 "Способ определения эритро-стических островков" от 8 января 1985 г.) у гематологических больных и [ьных с гематологической симптоматикой охарактеризованы признаки нару-тай нормальных межклеточных взаимоотношений эритроиднойи моноци-ной линий кроветворения, имеющие важное диагностическое, дифферен-шьно - диагностическое и прогностическое значение, и показано, что эритро-1стические островки костного мозга отражают сохранность или отклонения правильной организации эритропоэза у больного.

При экспериментальном моделировании различных состояний физиологи-кого напряжения гемопоэтических функций организма или патологических тояний доказана универсальная важная роль эритробластических островков рганизации и регуляции эффективного эритропоэза у человека и животных. ;рвые проведённые расчеты позволили получить количествешше характе-тики объемов островкового и внеостровкового эритропоэза. Впервые разработана классификация эритробластических островков, отра-ощая объем и интенсивность вовлечения в эритропоэз в эритробластических ровках костного мозга эритроидных колониеобразующих клеток, объем и рость амплификации эритроидных клеток, интенсивность и эффективность созревания, выделены формы островков, свидетельствующие о глубоком (авлении эритропоэза ("атипичные" островки) и, напротив, - о гиперрегене-орном течении эритропоэза ("суперостровки").

Впервые доказано, что наиболее важными, с функциональной точки зрения, актеристиками состояния эритропоэза в эритробластических островках слу-• число митозов, количество ядросодержащих клеток и число ретикулоцитов троидной "короны", определенные в островках разных классов зрелости; готическая активность эритроидных клеток охарактеризована также с попью включения метки 3Н-тимидина и определения статмокинетического (екса по числу К-митозов.

Наличие среди эритробластических островков "суперостровков", с числом осодержащих клеток более 32, находящихся на одной стадии развития, до-ывает возможность прохождения эритроидными колониеобразующими гками шести, а не пяти, как считалось ранее, последовательных делений. Впервые на примере эритробластических островков продемонстрирована нсциональная гетерогенность компартмснтов костного мозга трубчатых гей и их различный реактивный ответ на повреждающие воздействия. Впервые проведено углубленное изучение становления гемопоэтической кции эритробластических островков в раннем постнатальном онтогенезе, ®лена этапность этого процесса и особенности течения эритропоэза в ровках у молодых животных.

Зпервые получены полномасштабные доказательства важного значения для держания эритропоэза в эритробластических островках активного функци-

онального состояния центральных макрофагов, в частности, их лизосомально-пластинчатого комплекса цитоплазмы. In vivo и in vitro продемонстрирован, чувствительность макрофагов эритробласгических островков к действию гор мона эритроноэпша, охарактеризована субпопуляция макрофагов костного мозга, тройных к эритропоэзу, как имеющая развитый лизосомальный аппарат

Впервые расшифрованы механизмы комплементарности клеток вэритро бластических островках, нарушаемых при гемолитической анемии, термических ожогах, общем радиационном облучении организма, и показано, что вовлечение макрофагов эритробласгических островков в процессы иммунологиче! кой направленности снижает их гемолоэтический потенциал.

На моделях термической травмы и общего радиационного облучения орг низма продемонстрированы протекторные эффекты церулоплазмина и прет рата БИТО в отношении эритробластических островков костного мозга.

Теоретическое и практическое значение работы.

Полученные в работе результаты имеют фундаментальное значение для ме дицинской науки. На примере эритробласгических островков ликвидируете} пробел в понимании роли межклеточных взаимодействий в подцержанш эритропоэза в организме, в частности, участия в нем клеток моноцитарного pi да, и конкретным содержанием наполняются понятия: клеточно-кл сточные и гуморальда-клеточные механизмы обеспечения процессов нормального гемоп эза, специфическое гемопоэтическое микроокружение и гемопоэтические ни ши. В экспериментальных исследованиях количественный и качественный анализ эритробластических островков костного мозга представляет собой тот кий и чувствительный инструмент вскрытия интимных механизмов нарушенш процессов нормального кроветворения, раннего обнаружения неблагоприятны: последствий воздействия возмущающих и повреждающих факторов. Полученные в работе результаты исследований открывают широкую перспектив целенаправленного научного поиска средств и методов коррекции нарушений эритропоэтической функции организма при длительных космических полета> хронических производственных интоксикациях, при экологическом загрязне нии среды обитания.

Раскрытые механизмы комплементарное™ клеток эритробластических ост ровков позволяют ио-новому взглянуть на проблему диагностики и лечена анемией различного генеза, включая постгеморрагическую, гемолитическую, ожоговую, пострадиационную гипорегенераторную и вызванную инфекцион ным началом. Разработка простого и доступного для практической медицины метода выделения и анализа эритробластических островков костного мозг человека позволяет использовать его для оценки эффективности лечебных mi роприятийи прогнозирования течения заболеваний.

Для детской гематологии выявленные закономерности становления гем( поэтической функции эритробластических островков костного мозга могут быть полезными в расшифровке патогенеза анемий раннего детского возраста

Положения, выносимые на защиту.

1. Эффективный эритропоэз в организме человека и животных протекает в ггробластических островках костного мозга, представляющих собой морфо-нкционалъные единицы эритрона, количественный и качественный анализ горых дает исчерпывающую характеристику состояния эритропоэза.

2. Только становление гемопоэтической функции эритробластических ост-шов костного мозга обеспечивает адекватную продукцию эритроцитов в раз-¡ающемся организме при переходе кроветворения из печени и селезенки в ггнъш мозг.

3. Снижение комплементарное™ клеток эритробластических островков на не возмущающих либо повреждающих воздействий ведет к их диссоциации, )ушению нормальных взаимоотношений между клетками моноцитарного и ггроидного ряда, увеличению количества "атипичных" островков и эритроид-■шх клеток вне островков, увеличению объема внеостровкового эритропоэза.

4. Наиболее полную и точную характеристику состояния эритропоэза в эрит-зластических островках дает количественный анализ числа митозов эритро-:шх клеток, самих ядросодержащих эритроидных клеток и ретикулоцитов, введенный в островках разных классов зрелости.

5. Популяция костномозговых клеток моноцитарного ряда, принимающих 1стие в образовании эритробластических островков, является частью системы гоцитирующих мононуклеаров, и модуляция функционального состояния ионуклеарных фагоцитов отражается на течении эритропоэза в островках.

Внедрение результатов исследования в практику.

Практическое внедрение результатов исследования осуществлялось по мере полнения плановых государственных научно-исследовательских работ и преставления отчетных материалов:

. Гуморально - клеточные взаимодействия в эритробластических островках ягного мозга в норме и их место в системе эритрона при некоторых экспери-ггальных состояниях. ( 1986 - 1988 гг., № гос. регистрации 01860004736 ). . Задание Государственного комитета СССР по науке и технике от 4 августа 58 г. №281 "О проведении дополнительных научно - исследовательских ют в области медицинской науки и техники ЦНИЛ Челябинского медицинс-

0 институтаМЗ РСФСР." ( 1988 - 1990 гг.).

. Морфо-фунциональныс свойства эритробластических островков,поддержи-эщие гемопоэз межклеточные взаимодействия у гематологических больных ри экспериментальных моделированиях эритропоэза. ( 1989 - 1993 гг., № :. регистрации 01880086968).

. Изучение роли межклеточных взаимодействий и нейро-гуморальных меха-¡мов в регуляции кроветворения в норме и патологии. ( 1989 - 1991 гг., Дого-

1 № 14/118/14, № гос. регистрации 01890046006).

. Молекулярные и клеточные механизмы регуляции кроветворения в норме и ологии. ( 1991 - 1995 гг., Договор № 14/ 235/ 29 ).

6. Роль клеточно - гуморальных взаимодействий и особенности метаболизма регуляции эритрона в норме и патологии (экспериментальные состояния) и npi анемиях различной этиологии у больных . ( 1994 - 1995 гг.).

Под грифом Министерства здравоохранения РСФСР издано и распростране но методическое письмо: "Количественная и качественная оценка эритропозз; с помощью определения эритробластических островков костного мозга."

Метод количественного и качественного анализа эритробластических остро ков костного мозга человека внедрен на базе гематологического отделена Челябинской областной клинической больницы № 1 и Челябинского городско! гематологического центра. Метод признан изобретением (A.c. № 1309735).

Исследование эритробластических островков костного мозга в эксперимеш внедрено в практическую деятельность 15 учебных и научных учреждени России и зарубежных стран (Болгария, Украина), на рабочих местах обучен более 30 врачей - лаборантов, аспирантов и стажеров - исследователей.

Апробация работы.

Материалы диссертационного исследования представлены и обсуждены н< симпозиумах, научных конференциях и конгрессах: "Кроветворные клетки-предшественники в механизмах повреждения и компенсации системы крош (Челябинск, 1986 ); I съезд физиологов Уральского региона "Механизмы физи< логических функций" (Уфа, 1986); Второй Всероссийский съезд гематологов и трансфузиологов (Челябинск, 1986); "Факторы клеточного и гуморального иммунитета при физиологических и патологических состояниях" (Челябина 1986,1988,1990); Республиканская конференция "Молекулярные и клеточные механизмы адаптации" (МоскваД986);ХУ съезд Всесоюзного физиологическо] общества им. И.П. Павлова (Ленинград, 1987); XIII научная конференция пате физиологов Урала "Патология дыхания, крови и регулирующих систем органи ма и принципы коррекции нарушений" (Ижевск, 1989); IV Всесоюзный съез; патофизиологов "Нарушения механизмов регуляции и их коррекция" (Москвг 1989); II съезд физиологов Уральского региона "Физиологические механизмы адаптации человека и животных " (Свердловск, 1990); конференция "Лабора торные животные дня медико - биологических и биотехнологических исследог ний (Москва, 1990 ); конференция ассоциации физиологов Европы (Чехослова кия, Прага,1990); конференции патофизиологов Урала "Системные и клегочнь механизмы адаптации организма к действию повреждающих факторов" (Чел) бинск,1991); 1 Учредительный конгресс международного союза патофизиологе (Москва, 1991); III Всесоюзный съезд гематологов и трансфузиологов (Mocke 1991); Российский научный симпозиум "Экологические факторы и кроветворс ние (Москва, 1992); XXXII конгресс международного союза физиологически наук ( Англия, Глазго, 1993); Ш (XVI) Учредительный съезд физиологическо! общества России им. И.П. Павлова (Пущино, 1993); 14 международный симпс зиум "Диоксин" (Япония, Киото, 1994); международная конференция "Новы технологии в медицине" (Трехгорный, 1996); конференция "Механизмы адапт;

и организма" (Томск, 1996); III Всероссийский съезд гематологов и трансфу-

элогов (Санкт - Петербург, 1996).

Публикации.

Всего по материалам диссертационного исследования опубликовано 56 работ, них - 29 статей в центральных и международных периодических изданиях, удах международных и Всероссийских конференций. Структура и объем диссертации.

Диссертация представлена на420 страницах машинописного текста, иллюст-рована 65 таблицами, 21 рисунками и 111 микрофотографиями. Состоит введения, обзора литературы, 2 глав материалов и методов исследования, дав с изложением результатов собственных исследований, обсуждения, закрепил, выводов и списка использованной литературы, включающего 732 гочников, в том числе 520отечественных и 212 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и традиционные методы исследований.

Клинические наблюдения проведены совместно с сотрудниками кафедры утренних болезней № 2 Челябинской медицинской академии на базе гемато-гического отделения областной клинической больницы № 1 (зав.- М.И.Исаен-). У 31 больного с различной патологией системы крови диагноз верифициро-1Ш на основе клинических данных, результатов традиционных лабораторных следований периферической крови и жидкой части костного мозга, получен-й пункцией грудины, а также гистологической картины трепаната подвздош-й кости. На основании дагноза, с учетом особенностей клинического течения лезни, состояния эршропоэза было выделено 2 группы больных, страдающих шгчными гематологическими заболеваниями, протекающими с активацией етроиоэза и, напротив, с угнетением эритропоэза. К последней группе примы-га больные, имеющие анемию на фоне хронического гепатита с явлениями терспленизма.

Становление гемопоэтической функции эритробластических островков кост-го мозга было изучено у беспородных крысят в возрасте 1,3,7,10,15 и 30 ей без деления по полу. Из одного помета под наблюдением оставляли не бо-; 5 де тенышей первородивших самок (п= 18). Всего обследовано 70 крысят. В различных сериях экспериментов, в разное время года было использовано 25 половозрелых крыс - самцов и самок массой 180-270 г: беспородных .щов - 175, беспородных самок-201, самцов линии "Вистар" - 319, самок нии "Вистар" - 321, самок линии "Август" -9 особей. Кроме крыс, в опытах ло задействовано 678 мышей - самцов и самок линии СВА массой 18 - 20 г с чью тестирования эритропоэтина и плазмы крови контрольных и эксперимен-гьных крыс.

Животные содержались в виварии в больших секциях или в стандартных утках по 4-5 особей без 01раничения подвижности, освещенности и доступа к

воде и пшце. Состав рациона включал молоко, зерно, хлеб, комбикорм, pacri тельный жир, зелень. Все болезненные манипуляции, включая инъекции pací воров и взвеси эритроцитов, забор крови и исследуемого материала, проводил! под ингаляционным наркозом.

Линейных животных получали из нескольких питомников:"Столбовая", Mo ковская область, "Раполово", Ленинградская область, "Рассвет", г.Томск, Фили алов № 1 и 4 Института биофизики МЗ СССР.

В соответствии с методическими рекомендациями по выведению животны из эксперимента "Эвтаназия экспериментальных животных" (Москва, МЗ СССР, 1985), крыс и мышей умерщвляли под наркозом в отдельном от вивари помещении путем дислокации шейных позвонков.

Экспериментальные исследования были проведены с моделированием раз-ричных состояний, сопровождающихся заметными сдвигами процессов крове творения. Кровопотеря была использована как общепринятая модель стимуля ции эршропоэза и изучения характера течения постгеморрагической анемш С этой целью у крыс осуществляли забор крови из хвостовых вен в количеств 1, 2 или 3 % массы тела. Объем потери крови определялся задачами опыта.

Фенилгидразиновая анемия использовалась в качестве модели гемолитичес кой анемии. Инъекции раствора солянокислого фенилгидразина делали подкои но в дозе 15,30,60 и 100 мг/кг в зависимости от задачи эксперимента. Предвар! тельно 0,6 % раствор гемолитика нейтрализовали едким натром до рН= 7,0-7,2 Термический ожог-термическую травму- воспроизводили по стандартно! методике, разработанной и апробированной в многочисленных эксперимента: на кафедре биохимии Челябинской медицинской академии. У крыс на спиню удаляли шерсть и наносили ожоговую травму площадью 15 % поверхности тел с поражением ША - ШБ степени при помощи установки свето-тенлового возде] ствия с кварцево-галогеновой лампой накаливания ГК-200 мощностью 1000 Bi В качестве модели ингибиции эритропоэза была использована поеттранефу зионная полицитемия, которую создавали двукратным введением с интервалол 24 часа внутрибрюшиняо 80 % взвеси трижды отмытых раствором Хенкса го мологичных эритроцитов животным - реципиентам. Эритроциты получали пу тем забора крови у животных - доноров. Объем вводимой взвеси составил у мь шей - 1,5 мл на мышь, а у крыс - 7 мл на 100 г массы.

Большую группу крыс подвергали однократному радиационному воздействии с помощью общего гамма - облучения на цезиевой установке "Ш'УР" поста! дартной технологии, принятой в филиале № 4 Института биофизики, при moi и ности поглощенной дозы 0,7 Гр/мин. Диапазон выбранных доз облученю включал сублстальные: 25, 50, 100, 200 и 300 сГр, и летальные: 600 и 900 сГр При этом доза 600 сГр для крыс примерно соответствовала минимально летал! ной дозе, а доза 900 сГр - минимально абсолютно летальной дозе.

Для иммунизации крыс использовали тимусзависимый антиген- эритроцит! барана, которые вводили животным впутрибрюшинно в дозе 109 эритроцитов на крысу в 1 мл физиологического раствора однократно или трехкратно, в зав!

мости от задач исследования.

Модуляция эритроиоэза в ЭО и функционального состояния центральных крофагов островков осуществлялась in vivo и in vitro. Вне организма исследу-ые вещества вносили в инкубационную питательную среду, содержащую ЭО. к тестировали эритропоэтин и определяли эффекты ферментов: трипсина, мотрипсина и гиалуронидазы. В виде инъекций крысам вводили растворы нтрикала, унитиола, цистеина, в акциз гу БЦЖ, нейтрофилокины, per os - лева-13ол. Животным, подвергнутым общему радиационному облучению или ожо-й травме, вводили БИТО(белковый препарат Челябинской областной станции реливания крови) и церулоплазмин (НПО "Иммунопрепарат", г. Уфа). Самостоятельный фрагмент исследования был связан с оценкой влияния на итропоэз в ЭО и состояние центральных макрофагов гормона эритропоэтина, едоставленного зав. лабораторией Всесоюзного Гематологического научного нтра доктором биологических наук В.И. Гудим.

В работе использовали рутинные методы определения числа эритроцитов, йкоцитов, ретикулоцитов, показателя гематокрита и гемоглобина крови. Традиционные методы исследования костного мозга включали подсчет числа росодержащих клеток и морфологический анализ мазков - отпечатков, окра-:нных по Романовскому - Гимзе. У новорожденных крысят информативной тодикой косвенной оценки интенсивности кровоснабжения костного мозга цренных костей послужило определение абсолютного числа эритроцитов и гикулоцитов как разницы между общим числом клеток в костном мозге и слом миелокариоцитов.

Цитологические исследования печени и селезенки включали морфологичес-й анализ мазков - отпечатков срезов органов, окрашенных на предметных гклах по Романовскому - Гизме. В селезенке рассчитывали также показатели зточности органа, количества ядросодержащих клеток и эритроцитов. Определение колонне- и кластерообразующей способности кроветворных гток проводили при клонировании миелоидных клеток - предшественников в азменном сгустке в диффузионных микрокамерах, а также в культуре клеток, ■< описано в работе (Гольдберг С.Д. и соавт., 1991), в НИИ Фармакологии мского научного центра.

Активность эритропоэтина в плазме крови экспериментальных животных опаляли по калибровочной кривой, построенной на основании результатов тес-рования стандартного раствора эритропоэтина, полученного из мочи больных пластической анемией, очищенного и тестированного в лаборатории Терри жеа, Ванконвер, Англия, с использованием в качестве реципиентов полиците-чных мышей. Ингибирующую эрнтропоэз активность оценивали модифици-занным методов A.J. Erslev (1986), вводя интактным мышам 2-кратно подокно по 0,5 мл исследуемой плазмы и определяя через 24 часа число ретикуло-гов их периферической крови. Достоверное снижение числа ретикулоцитов иывало на преобладание ингибирующей эритропоэз активности в материале. Исследование колоннестимулирующей активности плазмы крови экспсри-

ментальных и контрольных животных in vivo осуществляли путем подкожной введения испытуемого материала мышам - реципиентам двукратно по 0,5 мл с интервалом 24 часа. На 1, 3, 7 сутки у мышей оценивали изменение числа лейкоцитов периферической крови. Считается, что увеличение числа лейкоцитов > реципиентов более чем на 50 % начального уровня на 5 - 7 сутки после введения тестируемого материала свидетельствует о его гемопоэтической активносп Тестирование колониестимулирующей активности in vitro проведено с использованием в качестве клеток - мишеней миелокариоцитов интактных половозре лых крыс по числу образовавшихся на 7 сутки культивирования грануло -макрофагальных колоний и кластеров.

Вновь разработанные и модифицированные специальные методы исследования костного мозга и морфо-функционального состояния эритробластических островков.

Из костного мозга взрослых животных (крыс) ЭО -выделяли с помощь« модифицированного метода, разработанного в соавторстве с Ю.М. Захаровым и И.Ю. Мельниковым (1984). У крысят, имеющих вплоть до 15 дня постнаталь ного развития мягкие кости, ЭО костного мозга выделяли с особой осторожное тью, используя мягкую гомогенизацию и пипетирование клеточной взвеси.

Выделение, количественный и качественный анализ ЭО костного мозга у человека проводили с помощью оригинального метода собственной разработка (Авторское свидетельство СССР № 1309735 от 8 января 1987 г.).

Морфологический анализ ЭО проводили в препаратах, окрашенных по Романовскому - Гизме. Островки классифицировали в соответствии с собствен ной классификацией на ЭО 1, 2, 3 классов зрелости, реконструирующиеся и инволюцирующие (Захаров Ю.М., Мельников И.Ю., Рассохин А.Г., 1986). Кроме того, выделяли и подсчитывали "атипичные" ЭО - группы эригроидных клеток без центрального макрофага, и "суперостровки"- ЭО с числом ядросодер жащих эригроидных клеток более 32. Дополнительные данные о состоянии эритропоэза в островках получали, подсчитывая фигуры митозов, число ядросо держащих клеток и ретикулоцитов в островках разных классов зрелости.

На основании определения абсолютного количества ЭО разных классов зрелости осуществляли расчет функциональных показателей состояния эритропоээ вЭО по методу ЖИ.Ворговой, Ю.М. Захарова (1990) с определением общегс количества КОЕэ, вступивших в дифференцировку в ЭО, показателя интенсив ности вовлечения КОЕэ в дифференцировку, показателя длительности созревания ЭО и показателя повторного вовлечения в эритропоэз макрофагов.

В ряде экспериментов костный мозг бедренных костей делили на осевую и корковую зоны по методу Г.К.Попова и соавторов (1991) и проводили анализ ЭО в этих компартментах отдельно.

Прижизненные исследования ЭО и клеток костного мозга включали микре флюориметрическое определение количества лизосом в цитоплазме макрофаго! и измерение интенсивности свечения нуклеиновых кислот после окраски препаратов метахроматичным флюорохромом акридиновым оранжевым, а также оп-

деление pH лизосом центральных макрофагов ЭО, окрашенных нейтральным асным. Оба методических приема представляли собой модификации извест-[х методов изучения живых клеток (Зеленин A.B., 1971; Литинская Л.Л. и авт., 1979). Кроме этого, о состоянии поверхностных зарядов мембран живых еток ЭО судили по электрофоретической подвижности ЭО, используя метод С. Харамоненко и A.A. Ракитянской (1974) в собственной модификации. 5тодики с использованием переживающих клеток сочетали с определением их ^неспособности по тесту с трипановым синим.

Дополнительные сведения о функциональном состоянии центральных макро-гов ЭО получали с помощью ряда цитохимических методов. HCT - тест позволял судить об интенсивности кислородзависимых процессов пражал фагоцитарную активность макрофагов ЭО (Рассохин А.Г., Крашенин-коваЕ.А., 1989). О состоянии лизосомально - пластинчатого комплекса сви-гельствовала активность кислой фосфатазы ( Burstone, 1958 в описании Хей-у Ф.Г.Дж. и Кваглино Д., 1983) и неспецифической эстеразы (Pearse, 1960 в чожении Кисляк Н.С. и Ленской Р.В., 1978). Выявление химических групп, цержащих серу, проводили по методике щелочной тетразолиевой реакции ирсЭ., 1962). Нейтральные глюкоконъюгаты определяли с помощью ШИК-1кции (Пирс, 1962), а кислые - путем окраски препаратов раствором альциа-вого синего по методике А.Н. Яцковского (1987).

Количественную оценку цитохимических реакций проводили на микроскопе ЮМАМ-ИЗ", используя фотометрическую систему с насадкой ФМЭЛ-1Аи тоэлектронный умножитель ФЭУ-79 при стабилизации напряжения в преде-нах ±0,1 % стабилизатором ESN-550.

Пролиферативный потенциал клеток изучали с помощью авторадиографии включению 3Н-тимидина на базе лаборатории гемоцитологии профессора Козинца во Всесоюзном Гематологическом научном центре, а также путем дсчета К-митозов, т.е. митозов, остановлешшх колхицином, с определением пгмокинетического индекса эритроидных клеток в островках разных классов. Полученные результаты исследований подвергали обработке традиционными иемами вариационной статистики с определением средней арифметической жационного ряда, среднего квадратичного отклонения и средней ошибки :дней арифметической. О достоверности различий судили по t - критерию ьюдента с определением уровня значимости Р по таблицам. Достоверными пали различия при уровне значимости Р < 0,05. О связи между отдельными казателями и явлениями судили по результатам корреляционного анализа.Ма-1атическую обработку экспериментальных данных проводили на персональ-4 компьютере Pentium-100 с использованием прикладных текстовых, графи-;ких и статистических программ.

Становление гемопоэтической функции эритробластических

островков костного мозга в раннем онтогенезе у животных.

В отечественной литературе лишь в работах Л.И. Крупицкой ( 1988) и С.Б. Назарова ( 1993 ) затрагивался вопрос об изменении числа ЭО у крысят I периоде раннего онтогенеза и их взаимосвязи с кислородным обеспечением ор ганизма, причем если в первой работе изучали крысят в возрасте 1 и 3 дней, то во второй-лишь начиная с 10 дня рождения. Полная и развернутая картина становления гемопоэтической функции ЭО после рождения при переходе от печеночного и селезеночного кроветворения к костномозговому, к дыханию атмс ферным кислородом отсутствовала. Было очевидно, что параллельное становле ние функций систем пищеварения, терморегуляции, иммунной защиты, интенсивность метаболизма и двигательная активность крысят могли существенны! образом повлиять на функции кроветворных органов. В этой связи при оценке физиологической зрелости животных учитывали массу тела и ее прирост в абсс лютном и в относительном выражении, сроки открытия ушных раковин, проре зывания резцов, установление вторичного шерстного покрова и открытия глаз.

Наиболее интенсивно масса новорожденных животных увеличивалась с момента рождения до 10 дня, т.е. в ранний молочный период: в среднем- на 13% в день. Начиная с 10 дня, в поздний молочный период, наблюдалась стабилизация привеса на уровне 1,3 г/день. До 9 дня, т.е.до прорезывания резцов, питан» крысят осуществлялось исключительно материнским молоком. Из-за отсутстви вторичного шерстного покрова до 10 суток у новорожденных могли быть суще ственными теплопотери, а после открытия глаз на 14 сутки- неизбежно высоки) энерготраты организма обусловлавливались резким повышением двигателыю! активности. О высоком уровне теплопродукции у новорожденных крысят гово рит повышенная температура тела, равная 38,59°С (Петрова О.П., Иванов К.П. 1992). Перечисленные факты указывали на интенсивную функциональную нагрузку, которую испытывали системы транспорта кислорода в раннем постна тальном периоде развития крысят. Этот вывод выглядит более убедительны» если принять во внимание снижение количества эритроцитов у новорожденных крысят с 2,54±0,06 в первые сутки до 2,07±0,12 х 1012/л на третьи сутки (Р< 0,01). Феномен "физиологической анемии новорожденных" хорошо известен клиницистам и экспериментаторам (Лоттер М.Г., 1976; МосягинаЕ.Н. и соавт., 1981 и др). На 10 день постнатального онтогенеза число эритрощггов крови у крысят выросло на 40 % в сравнении с 3 днем (Р<0,01) и достигло 2,69+0,09 х 10"/ л. Это обстоятельство указывало на способность кроветворных ткане адекватно отвечать на повышенный запрос организма в переносчиках кислоро да, однако цитологический анализ органов эмбрионального кроветворения об наружил все признаки затухания эритропоэза в паренхиме печени и селезенки Так, в печени на фоне колебаний в числе митозов гепатоцитов от 3,3±1,4 и 3,2± 0,8 в первые и третьи сутки после рождения до 5,2±0,9 и 4,6±0,9 на 100 клеток на7и10сутки процентное содержание эригроидных среди гемопоэтических элементов последовательно снижалось с 25,0+2,1 на первые сутки до 2,0±0,6 нг

дьмые. Среди эритроидных клеток отсутствовали про-, эритробласты, и число 1тозов практически равнялось нулю. В селезенке наблюдалась иная картина, ос, до 7 суток среднедневной прирост массы органа был равен 26,8 % и в 2 ра-превышал прирост массы тела. На фоне увеличения массы селезенки с 15,8± 1 г на 1 сутки до 50,2 ± 6,9 г на 7 сутки (рост в 3,2 раза, Р<0,01) количест-эритроцитов в ней недостоверно выросло в 1,7 раза, неэритроидных гемопоэ-ческих клеток - в 3,8 раза (Р<0,01) и эритроидных клеток - 3,7 раза (Р<0,01). щако, если активация миелопоэза затем сопровождалась планомерным рос-

Рис. 1.Содержание эритроидных клеток среди гемопоэтических в разных органах крысят

м числа неэритроидных элементов, достигших уровня 181,2 ±22,2 х 106 на ган к 30 дню, то количество эритроидных клеток неравномерно колебалось от ,6 + 1,5 до 21,6 ± 2,3 х 106 в разные сроки наблюдения. В конечном итоге, и в лезенке наступало затухание эритропоэза (рис. 1). Количественный и качест-нный анализ состояния костного мозга бедренных костей свидетельствовал о реходе гемопоэза от печени и селезенки к костному мозгу (табл. 1).

Таблица 1. Показатели костномозгового к роветворения у крысят

Возраст, ДНИ (число крысят) Общее число ядросодер-жащих клеток, х10°/бедро Неэритро-идные клетки, хЮ6/ бедро Эритро- идные клетки, хЮ6/ бедро Число эритро-, ретикуло-цитов, хЮ6/ бедро Число ЭО, хЮ3/ бедро

1(7) 0,03± 0,005 0,025+ 0,004 0,0055+ 0,0009 0,89± 0,10 не определяется

3(6) 1,27±0,26 0,98+0,18 0,30±0,08 0,53±0,13 7,2±2,0

7(6) 4,10±0,65 2,30±0,40 1,80+0,30 4,00±1,10 43,3±3,8

10(7) 14,2+0,60 8,60±0,60 5,50±0,30 11,2+1,20 68,6+5,9

15(7) 16,7+1,60 11,1+1,20 5,60+0,60 14,]±1,90 92,6±4,7

30(7) 30,5±3,60 20,7+2,50 9,70±1,20 20,3±2,70 339,0+36,1

В первые сутки после рождения среди неэритроидных клеток наибольшую лъ составляли недифференцированные элементы, а в парциальной эритро-шме доля зрелых эритроидных клеток, полихроматофилышх нормобластов жсифильных нормоцитов, а также их ядер, превышала 80 %. На третьи сутки

после рождения происходило оживление эритропоэза в костном мозге крысят, что проявилось в 2-кратном повышении числа митозов эритроидных клеток и 3-кратном увеличении числа проэритробластов и эритробластов.К седьмым суткам волна амплификации и созревания эритроидных клеток достигала полихро-матофильных нормобластов и оксифильных нормоцитов с увеличением их количества в среднем в 2,5-3 раза по сравнению с первым днем. В это же время сохранялась высокой митотическая активность эритроидных клеток. С 10 дня и до конца наблюдений об интенсивном течении эритропоэза у обследованных крысят по сравнению со взрослыми животными свидетельствовало высокое содержание в костном мозге оксифильных нормоцитов и "голых" ядер нормобластов, более чем в 10 раз превышающее показатель взрослых животных.На этом фоне на 15 сутки отмечались признаки некоторого замедления течения эритропоэза, проявившиеся, в частности, в отсутствии роста количества ядросодержахцих эритроидных клеток в костном мозге,Волнообразные сдвиги эритропоэза указывали на сложный характер становления гемопоэтических функций костного мозга в раннем постнатальном онтогенезе. Этот вывод подтвердило количественно-качественное исследование эритробластических островков. В первый день после рождения статистически значимого количества ЭО в костном мозге бедренных костей не определялось (табл. 1), а встречающиеся в цитологических препаратах группы клеток представляли собой ассоциации недифференцируемых элементов Среди них отсутствовали клетки, способные захватывать маркерный краситель нейтральный красный. К третьим суткам постнатального развития ЭО стали четко определяться во взвеси костномозговых клеток, и их число составило 7 тысяч на одну бедренную кость, причем среди них, в отличие от взрослых животных, преобладали ЭО пролиферирующих классов: ЭОь Э02 и реконструирующиеся, тогда как инволюцирующих островков было, напротив, в 2 раза меньше. Морфологический анализ показал, что на 3 день в костном мозге

Таблица 2. Распределение эритробластических островков по классам _зрелости у крысят разного возраста (%). _

Возраст,дни (число крыс) ЭО, эо2 Э03 ЭОрск. ЭОнна

1 (5) - - - - -

3 (5) 18,0±1,2 22,0±2,5 12,0±2,5 20,0±1,6 28,0±2,5

7 (5) 14,0±0,9 20,8±1,0 33,2±2,7 16,0+1,4 16,0±2,3

10 (5) 12,4±0,7 12,8+1,0 24,8±2,3 24,0+1,8 26,0+1,9

15 (5) 10,8+1,0 12,4+0,7 20,4±2,7 25,2+1,5 31,2+0,8

30 (5) 8,8+0,5 15,б±1,3 22,0±1,4 23,2+1,0 30,4+1,2

присутствовали колонии гемопоэтических клеток, которые можно было отнеси к смешанным островкам, т.к. в их составе обнаруживались лимфоидные, моно-цитарные, гранулоцитарные, мегакариоцитарные и эритроидные элементы.

Особенно резкое, шестикратное, увеличение числа ЭО произошло к 7 дню постнатального развития. Отрезок времени между 3 и 7 днем можно считать началом становления гемопоэтической функции ЭО костного мозга.

Созревание эритроидных клеток в островках после 7 дня сопровождалось поеденным снижением содержания ЭО 1 и 2 классов зрелости и увеличением О 3 класса и инволюцирующих. Характерно, что в созревающих ЭОз и ЭОтШ1, ) сравнению с 3 днем, достоверно выше было число ядросодержащих эритро-щых клеток. Так, если у 3-дневных крысят количество ядросодержащих кле-1К в Э03 составляло 16,3±0,5, то у 10-дневных-26,9± 1,2 и у 15-дневных-1,0 ± 1,1 (Р<0,001 для обоих случаев); в инволюцирующих ЭО у крысят на 3 тки насчитывалось 5,3 ± 0,2 эритроидных клеток, а на 7 и 10 дни, соответст-!Ино, 7,6 ± 0,4 и 6,4 ± 0,4 (Р<0,05 для обоих случаев).

Окончательное становление эритропоэза в ЭО происходило на 3 и 4 неделях )стнатального развития, когда наблюдалась вторая, более мощная волна сти-уляции продукции эритроидных клеток. Так, среднедневной прирост количес-1а ЭО в это время составил 16,4 %, и к 30 суткам абсолютное их число дости-ю уровня взрослых животных - 339 тысяч на одну бедренную кость. Наряду с ¡менениями количества островков в них продолжалась качественная перест->йка состояния эритропоэза. Анализ числа ретикулоцитов в островках разных гассов зрелости у крысят показал, что по мере созревания эритроидных клеток ЭОз, реконструирующихся и инволюцирующих количество ретикулоцитов »зрастало в диапазоне от 0,1 ± 0,1 и 0,4 ±0,2 на 7 и 10 сутки до 1,6 ± 0,2 и 8 ± 0,5 в одном ЭО к 15 и 30 дню, что, однако, оставалось в 2 раза меньше в шнении со зрелыми особями. Вероятно, высокие потребности молодого орга-пма животных в переносчиках кислорода определяли ускоренный выход ггикулоцитов из "короны" макрофагов в кровь.Подгверждением этому служи> не только увеличение количества эритроцитов/ретикулоцитов в самом кост->м мозге (табл. 1), но прежде всего, увеличение числа эритроцитов у животных периферической крови с 2,91+0,04 до 4,63+0,18 х 1012/л с 15 к 30 дню постбального развития. Корреляционный анализ, проведенный по средним пока-телям, выявил тесную взаимосвязь между количеством ЭО костного мозга числом эритроцитов крови: коэффициент корреляции между ними составил 1,817 (Р<0,05), а также между числом островков и количеством ядросодер-шщх эритроидных клеток костного мозга (г= +0,759, Р<0,05), числом ЭО и личеством эритроцитов/ретикулоцитов в костном мозге (г= +0,741, Р<0,05). >следнее обстоятельство указывало на участие ЭО в формировании депо рети-лоцитов костного мозга в ходе раннего постнаталыгого онтогенеза крысят. И.Филимоновым (1974) было доказано, что в костном мозге молодых живот-« пул ретикулоцитов превышает их количество в периферической крови.

Таким образом, результаты исследований показали, что только становление мопоэтической функции ЭО костного мозга, заключающейся в поддержании юлиферации, дифференцировки и созревания эритроидных клеток, обеспе-вало развивающийся организм животных необходимым количеством эрит-цитов - переносчиков кислорода.

Характер изменений эритропоэза в эритробластических островках при

стимуляции эритропоэза на фоне кровопотери.

Простота технического исполнения и многоуровневый характер ответа сделали острую кровопотерю классической моделью изучения физиологических и патофизиологических механизмов регенерации крови и регуляции процессов кроветворения. Подробное изучение кровопотери проведено в лабораториях Р.А.Дымшица (1958), Я.Г.Ужанского (1968), Н.А.Федорова и М.Г.Кахетелидзе (1973), А.Ю.Тилиса (1976). В нашей лаборатории кровопотерю использовали в оценке межклеточных взаимодействий в ЭО костного мозга (Волков A.B., 1991; ПушкаревВ.П. исоавт., 1991;Крестьянинова О.Г., 1994; Тишевская Н.В.,1995) Анализ этих и собственных материалов показал, что при различных объемах кровопотери (1- 2 %) восстановление исходных показателей крови и гемопоэза происходит к 14 -15 суткам. Данный факт послужил посылкой для проведения фрагмента работы. Мы предположили, что если эффективно эритропоэз реали-руется через ЭО, то потеря крови различного объема вызовет пропорциональные сдвиги состояния эритропоэза в островках, и, напротив, активация эритропоэза минуя ЭО, снивелирует возможные различия. Сроки наблюдения составили 6 часов (1 % кровопогеря) и 1, 3, 7 и 14 суток.

Кровопотеря в объеме 1, 2 и 3 % массы тела приводила к однонаправленным сдвигам показателей периферической крови, выраженность которых носила до-зозависимый характер, особо подчеркнутый в первые сутки после воздействия. Исследования, проведенные при 1 % кровопотере, показали, что уже через 6 часов развиваются характерные признаки постгеморрагического состояния со сни жением гематокрита крови, ретикулоцитарным подъемом и лейкоцитозом. Через сутки при 1 % кровопотере гематокрит составил 36,0±1,0 х 10"2 л/л, а число ретикулоцитов-49,2+1,8 %0 против 44,2±1,2 х 10'2л/л и 34,9±2,8%0 в контроле. При 3 % кровопотере данные показатели соответствовали 23,6±0,4 х 10"2 л/л и 148,8±16,0 %0. Параметры крови животных с 2 % кровопотерей имели промежуточные значения. Несмотря на столь существенные "стартовые" различия, к 14 дню гематокрит крови у животных всех опытных групп был одинаков и не отличался от гематокрита крови контрольных крыс. К 3, 7 и 14 суткам средний прирост гематокрита составлял у крыс с 1 % кровопотерей: +6,+2,+2%, в группе с 2 % кровопотерей: +6,+6,+5 %, а в группе с 3 % кровопотерей:+7,+7,+6 %.

Исследование динамики костномозгового кроветворения у крыс с потере? крови 1 % массы тела выявило достоверное повышение числа эритроидных яд-росодержащих клеток, начиная с 24 часа наблюдений. Максимально высоким их количество отмечалось на 7 сутки: 36,6 ± 1,0 х 10б/ бедренную кость против 24,5±0,9 х 10б в контроле. Количество неэритроидных клеток, напротив, на протяжении первых трех суток было ниже контрольного уровня с минимумом на 6 час опыта. В парциальной эригрограмме достоверные признаки стимуляции эритропоэза были отмечены лишь через сутки после кровопотери: число митозов эритроидных клеток выросло с 0,7±0,5 до 2,8+0,4 % (Р<0,01), а содержание

га- и эритробластов-с 0,3+0,1 до 1,8+0,6 % (Р< 0,05). К 3 суткам наблюдалось ютоверное увеличение содержания базофильных и полихроматофильных нор-пластов, а на 7 и 14 сутки - оксифнльных нормоцитов и их "голых" ядер.

В ранние сроки после кровопотери было выявлено снижение абсолютного личества ЭО в костном мозге. Так, если у контрольных животных насчигава-сь 332,7±10,8 х 103 островков на 1 бедренную кость, то через 6 часов при 1 % овопотере их было 215,4± 5,7 х 103, а через 24 часа при 2 и 3 % кровопотере ответственно - 265,0±10,9 х 103 и 205,0+10,0 х 103 (табл.3).

Таблица 3. Динамика изменений абсолютного числа эритробластических островков, _а также "атипичных" и "суперостровков" при острой кровопотере._

сследуемый Контроль Объем 6 часов 1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки

эказатель (П) потери (10) (10+4+4) (9+4+4) (9+4+4) (10+4+4)

крови

Число ЭО, 332,7 1 % 215,4 * 305,7 386,3 * 474,1 * 312,6

103/бедро ±10,8 ± 5,7 ±16,9 ± 7,1 ±14,4 +24,2

2% - 265,0 * 405,0 * 484,0 * 335,0

±10,9 ±14,3 ± 8,4 + 6,7

3% - 205,0 * 483,5 * 465,8 * 295,5

±10,0 ±20,5 ± 7,1 + 2,1

Атипичные", 3,1 1 % 10,2* 5,7* 1,7 0,8* 1,1 *

на 100 ЭО ±0,7 +1,6 ±0,7 ±0,4 ±0,3 +0,5

'СуперЭО", 0,6 1% 0,0 0,0 2,1 * 6,3* 2,9 *

на 100 ЭО +0,3 ±0 ±0 ±0,5 ±1,1 ±0,8

Примечание. В таблицах в скобках указано число животных. Звездочками отмечены

достоверные различия при сравнении результатов с контролем. На 3 сутки количество ЭО у животных всех опытных групп становилось вы! контроля, причем наибольший подъем отмечался у крыс с 3 % кровопотерей. 17 и 14 сутки достоверных различий в числе ЭО у животных с кровопотерей отмечалось. Морфологический анализ островков показал, что в ранние сроки час и 1 сутки) на фоне падения относительного и более выраженного абсо-»тного количества инволюцирующих ЭО происходило достоверное увеличе-е относительного содержания и абсолютного количества ЭО 1 класса зрелос-, Так, при 1 % кровопотере через 6 часов число ЭО| повысилось с 13,0±1,5 до ,0±2,1 х 103/бедро, при 2 % кровопотре на 1 сутки - до 38,6+2,9, и при 3 % -37,2+5,6 х 103/бедро.Повышенным количество островков 1 класса оставалось и 2 % кровопотере до 3, а при 3 % - до 7 дня. К 14 суткам число ЭО 1 класса сех животных не отличалось от контроля. К 6 часу 1 % кровопотери количес-) реконструирующихся островков повысилось в 1,2 раза (Р<0,05) и остава-:ь выше контроля до 7 дня; при 2 и 3 % кровопотере число реконструирую-гхся островков высоким отмечалось на 3 и 7 сутки. Свидетельством эффектив-:ти прохождения волны амплификации эритроидных клеток в островках яви-;ь 2 - 3-кратное в сравнении с контролем повышение на 3 и 7 сутки абсолютно количества ЭО 3 класса при всех изученных объемах кровопотери. К 14 о созревание эритроидных клеток в ЭО сопровождалось увеличением коли-

чества инволюцирующих островков как в сравнении с 1 и 3 днями, так и в сравнении с контролем, что наряду с уменьшением уровня реконструирующихся ЭО указывало на торможение эритропоэза в костном мозге в конце периода наблюдений при острых кровопотерях разного объема.

Углубленный анализ состояния эритропоэза в ЭО показал, что при 1 % кро-вопотере достоверное повышение миготической активности эритроидных клеток наблюдалось лишь в реконструирующихся ЭО на 6 час и в 1 сутки. При 2 % кровопотере увеличение миготической активности клеток в ЭО 1 класса зрелости в первый день оказалось недостоверным, но в 3 - 4 раза была усилена мито-тическая активность эритроидныхи клеток ЭО 2, 3 классов зрелости и реконструирующихся. Однако лишь в последних усиленное деление клеток наблюдалось вплоть до 7 суток. Наибольший рост миготической активности в островках всех классов отмечался при 3 % кровопотере.В ЭО1 число митозов в 1день было 5,8±0,5 против 1,8±1,3 % в контроле, в Э02- 4,5±0,4 против 0,3±0,2 %, в Э03 -3,9±0,3 против0,4±0,2%и в ЭОреК -6,3+1,3 против 1,6+0,1 %. Повышенной митотическая активность в этих островках продолжала оставаться и на 3, и на 7 сутки. Неожиданное появление фигур митозов в инволюцирующих островках мы рассматриваем как следствие ускоренного созревания ЭО 3 класса с сохранней делящихся клеток в составе уже инволюцирующих островков.

Подсчет числа митозов эритроидных клеток, остановленных колхицином в островках разных классов зрелости при 2 % кровопотере (табл. 4), подтвердил общие закономерности активации клеточной пролиферации, обнаруженные при простом количественном анализе фигур миггозов. Так, наиболее высокой мито-Таблица 4. Статмокинетический индекс эритроидных клеток (%) эритробластических

островков разных классов зрелости при 2 % кровопотере.

Класс зрелости ЭО Интактные крысы (5): по 100 ЭО каждого класса Срок наблюдения после потери крови

1 день (5) 2 день (5) 3 день (5) 7 день (5) 14 день (5)

ЭО, 25,3+2,5 46,2+5,3 * 35,0+3,1 * 36,5+2,9 * 37,0±4,2 * 21,0+1,4

Э02 6,5±0,6 2б,3±2,8 * 12,4±1,2 * 12,4+1,1 * 12,2±1,5 * 5,8+1,4

ЭО., 4,5±0,5 20,0+2,3 * 10,5±0,7 * 9,8±0,7 * 10,7±2,2 * 2,4±1,9

эоК1 14,2±1,3 32,0+2,6 * 17,3±1,4 18,5±3,0 21,7±3,8 14,8±3,4

ЭО 0,0+0 0 0 0 0 0

тической активностью у контрольных и экспериментальных животных обладали клетки ЭО 1 класса зрелости и реконструирующихся, а в инволюцирующих островках митозов не встречалось. Кровопотеря вызывала стимуляцию деления клеток в островках всех классов зрелости, и ее можно было наблюдать до 7 суток. Остановка и накопление митозов за 4 часа действия препарата приводила к получению более высоких цифровых параметров митотической активности по сравнению с простым подсчетом фигур митозов. На эффективный характер стимуляции процессов деления указывало увеличение количества ядросоде-ржащих клеток и ретикулоцитов в ЭО разных классов зрелости (рис.2).

Число клеток/ЭО

Рис.2.Число ядросодержащих клеток в ЭО при острой кровопотере различного

объема.

К 1% 2% 3% ЭО 1

К 1% 2% 3% 30 2

В1 сутки ПЭ сутки Ш7 сутки Ш4 сутки

К 1% 2% 3% К

ЭО ЭО

3 рек.

1% 2% 3%

К 1% 2% 3% ЭО инв.

Наиболее выражению стимуляция эритропоэза проявила себя при 3 % крово-потере. Так, в ЭО 1 класса на 3 и 7 сутки повышение числа ядросодержащих клеток достигало 6,4+0,1 и 7,1+0,2 против 5,3±0,5 в контроле (Р<0,05), в ЭО 2 класса на 3,7, 14 сутки число клеток выросло до 13,1+0,3 - 13,6±0,5 против 11,0±0,5, в ЭО 3 класса на 3 и 7 сутки - с 18,9+0,8 до 22,4±0,2 и 23,1±0,7. В реконструирующихся и инволюцирующих островках на 3, 7 и 14 сутки рост клеточной массы происходил от 8,1+0,6 и 5,7±0,4 до 11,5±0,3 - 13,2±0,0,3 (Р<0,05) и 7,3±0,2 - 8,6±0,7 (Р<0,05). Сходные сдвиги при 2 % кровопотере оказались не на всех сроках статистически значимы. При 1 % кропотере наиболее убедитель ное увеличение числа клеток наблюдалось в реконструирующихся островках иг ранних сроках, начиная с 6 часа. Анализ числа ретикулоцитов в ЭО показал, что у контрольных крыс только ЭО 3 класса, реконструирующиеся и инволюц рующие имели их в своем составе в количестве от 5,0±0,6 до 5,9+0,3. При кро-вопотерях любого объема наблюдалась одна закономерность: в ранние сроки, начиная с 6 часа эксперимента, в этих островках происходило дозозависимое уменьшение количества ретикулоцитов, с минимумом на 3 сутки (2,3±0,6 -3,6±0,5; Р<0,05). Напротив, к 7 и 14 суткам созревание эритроидных клеток в островках сопровождалось ростом числа ретикулоцитов в ЭО 3 класса, реконструирующихся и инволюцирующих до 10,6+0,4 - 13,6+0,2. Этот прирост также оказался дозозависимым, наибольшее число ретикулоцитов в ЭО наблюдалось у животных с 3 % кровопотерей.

Расчет функциональных показателей эритропоэза показал, что достоверное дозозависимое увеличение числа КОЕэ, вступивших в дифференцировку в ЭО, отмечалось во всех случаях с 3 по 7 день. Так, при 3 % кровопотере этот показа тель был максимально высоким на 3 сутки- 590,2+27,5 против 404,5+21,3 х 103/ бедро в контроле, а при 1 и 2 % кровопотере - на 7-е. Показатель интенсивное« вовлечения КОЕэ в дифференцировку при 1% кровопотере был достоверно выше уже на 6 час наблюдения (101,9 ± 5,9 против 81,6 ± 4,6 х 103/бедро), а при 2 и 3 % кровопотере - на 3 день: 136,0 + 2,7 и 165,5 ± 17,2 х 103/бедро соответ-сгвенно.На этом фоне закономерно было уменьшение показателя длительности созревания ЭО на ранних сроках при кровопотерях разного объема с 1,61+0,07 в контроле до 0,54±0,05 (6 час 1 % кровопотери), 0,74±0,02 и 0,73+0,06 (1 супа 2 и 3 % кровопотери). Напротив, к 14 дню наблюдалось замедление созревания ЭО с увеличением в 1,5 раза показателя длительности созревания. Показатель повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз указывал на интенсивное рекрутирование костномозговых макрофагов в эритропоэз на ранних сроках крово потери разного объема. Так, к 3 суткам при 3 % кровопотере данный показател] оказался равен 1,33±0,18 против 0,44+0,02 в контроле (Р<0,05). В это же время при 1 и 2 % кровопотере показатель повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз был на уровне 0,75+0,04 - 0,77±0,02. На 14 сутки во всех случаях наблю далось почти 2-кратное, по сравнению с контролем, уменьшение повторного использования в эритропоэзе ЭО костномозговых макрофагов.

Рис.3. Показатели функционального состояния макрофагов ЭО при 1 % кровопотере.

—♦-Число лизосом

—♦—рНлизсом

—4— К.фосфатаза

—В— Нэстераза

- - Ж- - Кислые ПСК

-Нейтральные

ГКК О- ЭФПэо

Контроль 1 сутки 3 сутки 7 сутки

Срок наблюдения

14 сутки

{анные, представленные на рисунке 3, указывают на связь сдвигов функци-1ального состояния центральных макрофагов ЭО с изменениями эритропоэза ри острой кровопотере. Так, об активации лизосомально-пластинчатого комп-жеа цитоплазмы клеток через сутки после воздействия свидетельствовало уверение при сравнении с контролем числа лизосом с 4,45±0,08 до 5,03±0,20усл. I., снижение внутрилизосомального рН с 4,06±0,03 до 3,83±0,02 ед. и повыше-ае активности ферментов, кислой фосфатазы с 7,00±0,12 до 8,42±0,13 усл.ед., ^специфической эстеразы с 8,24±0,08 до 9,64 усл.ед. Одновременно в струкгу-IX ЭО на 1 и 3 сутки наблюдалось накопление кислых и, напротив, плавное леньшение нейтральных глюкоконъюгатов. Рост электрофоретической под-скности островков (ЭФП эо) с 1,27±0,01 в контроле до 1,36+0,02 и 1,48+0,03 км х см х с"1 х В"1 на 1 и 3 сутки указывал на изменение электрических свойств юточных мембран и/или межклеточного матрикса в ЭО. По мере компенсации утери крови показатели функционального состояния макрофагов либо возвра-ались к исходному уровню (рН лизосом, активность неспецифической эстера-л, ЭФП эо), либо снижались ниже исходного уровня, вероятно отражая инги-1Ю эритропоэза в островках (общее число лизосом, активность кислой фосфа-еы). Сложный характер происходящей на 14 сутки перестройки в ЭО подт-;рждало сохраняющееся повышенным количество кислых и нейтральных глю-

коконъюгатов, имеющих внутри- и внеклеточную локализацию в островках.

При определении классов зрелости островков, подсчете числа митозов, ядро-содержащих клеток и ретикулоцитов обращало на себя внимание присутствие в "короне" макрофагов ЭО клеток,относящихся к различным гемопоэтическим линиям. Данный феномен известен и описан в работе, в которой мы принимали участие (Гольдберг Е.Д. исоавт., 1990), но подробно не анализировался. Два типа клеток особенно часто встречались в ЭО - лимфоидные и эозинофильного ряда- на разные сроки после кровопотери.Подсчет числа островков, имеющих в своем составе клетки лимфоидного типа, показал, что у контрольных животных их содержание составляет 11,0±1,7 %, а островки, содержащие клетки эозинофильного ряда встречаются более часто - в 22,6±1,5 %. В первые сутки кровопо-тери число ЭО с клетками лимфоидного типа достоверно увеличилось при 1 % до 17,0+1,2, при 2% - до 35,3+2,0, а при 3% кровопотере - до 73,8±9,4 %. Уже на 3 сутки при 1 и 2 % кровопотере содержание островков с лимфоидными элементами не отличалось от контроля, а на 7 и 14 сутки было ниже 5 %. При 3 % кровопотере число ЭО с лимфоподобными клетками на 3 сутки составляло 72,5±2,5, а на 7 сутки - 36,0+2,0 %. Корреляционный анализ выявил тесную корреляционную связь между содержанием островков данного типа и абсолютным количеством ЭО] и ЭО^.. На 1 сутки у животных всех экспериментальных групп число островков,имеющих в своем составе эозинофильные клетки,снижалось до 18,3± 1,1 - 16,5+1,1 °/о, а на 7 и 14 сутки, напротив, повышалось до 26,0 +1,1-40,5±1,1 %. Содержание островков данного типа коррелировало с абсолютным количеством инволюцирующих ЭО.

Математическая проверка гипотезы участия ЭО в обеспечении эффективного эритропоэза показала, что в ранние сроки при 1 % кровопотере количество эритроидных клеток, находящихся вне островков, увеличивалось (табл.5).

Таблица 5. Расчетные показатели среднего числа эритроидных клеток, приходящихся

на один ЭО, вне ЭО, и объема внеостровкового эритропоэза при 1 % кровопотере.

Срок наблюдения Показатель Контроль (И) 6 час (Ю) 1 день (Ю) 3 день (9) 7 день (9) 14 день (10)

Среднее количество клеток на один ЭО: 73,7 116,5* 90,9* 86,8* 77,5 74,0

число эритроидных клеток ±1,1 ± 5,9 ±2,9 ±2,0 ±1,1 ±1,6

костного мозга / ЭО

Количество эритроидных клеток вне островка: среднее 9,7 52,5* 26,9* 22,8* 13,5 10,4

количество клеток ЭО минус ± 1,1 ±5,9 +2,9 ±2,1 +2,3 +1,6

64 клетки ,т.е. теоретически

возможное число клеток

Объем внеостровкового эритропоэза: соотношение 12,9 45,1* 29,6* 25,8* 16,8 13,6

числа клеток вне ЭО к их ±1,4 ±2,5 ±2,1 + 2,0 + 2,6 ±1,9

числу в ЭО, %

Учитывая снижение количества ЭО в костном мозге, выявляемое с 6 часа кро-

вопотери, и одновременное 3-кратное увеличение числа "атипичных" островков, можно уверждать, что в течение первых суток воздействия отмечалось нарушение комплементарное™ клеток ЭО и, как показывают расчеты, нарастание объема внеостровкового эритропоэза Напротив, активации эритропоэза, начиная с 3 суток кровопотери, с ростом абсолютного количества ЭО, числа "суперостровков" и эритроидных клеток в островках и костном мозге, сопутствовало снижение числа "атипичных" островков и эритроидных клеток вне ЭО. При этом закономерно снижался до контрольного уровня объем внеостровкового эритропоэза, и число эритроидных клеток, приходящихся на один ЭО, приближалось к 64 - теоретически возможному числу клеток в островках, учитывая шесть, а не пять, как считалось ранее, делений КОЕэ в ЭО.

Известно, что стимуляция эритропоэза и снижение объема неэффективного эритропоэза являются специфическими проявлениями действия гормона эрит-поэза - эритропоэтина. Проведенное биотестирование сыворотки крови крыс с

1 % кропотерей показало, что в наибольшей степени увеличивает число ретику-лоцитов крови у полицитемичных мышей - реципиентов сыворотка, полученная на 1 сутки опыта. По сравнению с материалом контрольных животных, прирост числа ретикулоцитов у мышей данной группы составил 489 % (Р<0,02); на

2 день этот прирост составлял 350 % (Р<005), на 3 день - 239 % (Р<0,05) и на 7 сутки - лишь 122 % (Р>0,5). Сравнение полученных результатов с калибровочной кривой, построенной по результатам тестирования стандарта эритропоэтина, позволило оценить подъем уровня эритропоэтина на 1 сутки после кровопотери в 1,5 МЕ/мл, что примерно соответствовало данным других авторов.

Тестирование колониестимулирующей активности (КСА) сыворотки крови животных с кровопотерей в культуре миелокариоцитов продемонстрировало 3-кратное ее повышение на 1 и 2 сутки воздействия. Так, если при добавлении сыворотки контрольных животных число грануло-макрофагальных КОЕк на 7 день культивирования составило 4,3+0,3 на 105 клеток, то под действием сывороток, полученных на 1 и 2 день кровопотери,- соответственно 12,7±2,8 и 12,0± 1,2 на 105 миелокариоцитов (Р<0,05). К 5 суткам КСА возвращалась к контрольному уровню. Аналогичной направленности результаты были получены при тестировании КСА плазмы крови крыс с кровопотерей различного объема. Оказалось, что после введения плазмы анемичных животных у реципиентов появляется лейкоцитоз,наиболее стойкий и выраженный при испытании плазмы крови крыс с 3 % кровопотерей.Это доказывало комплексное участие цитокинов в регуляции восстановительных процессов после кровопотери.

При культивировании костного мозга крыс с 1% кровопотерей в плазменном сгустке в диффузионных камерах и in vitro была обнаружена стимуляция образования эритроидных колоний и кластеров с максимумом на 3 день; их прирост в сравнении с контролем составил 375-625 %. Эти исследования раскрывали цепь взаимосвязанных событий, происходящих в костном мозге при кровопоте-ре: повышение уровня гемопоэтинов стимулировало пролиферацию КОЕэ, активировало и увеличивало пул макрофагов и вело к увеличению числа ЭО.

Характер изменений эритропоэза в эритробластических островках при стимуляции эритропоэза на фоне гемолитической фенилгидразиновой анемии и механизмы комплементарности клеток в ЭО. Фенилгидразиновая анемия (ФГ анемия) наряду с кровопотерей считается классической моделью стимуляции эритропоэза (Козлов В.А. и соавт., 1982; Моисеева О.И., 1985; Макаров В.П. и соавт.,1992; Егеку А.З. а а1.,1980).Причи-ной повреждения и разрушения эритроцитов при ФГ анемии является генерация супероксиданионрадикалов, которые инициируют перекисное окисление фосфолипидов мембран эритроцитов, вызывают окисление БН-групп белков и ферментов, денатурируют гемоглобин. Существенными дополнительными факторами, способными оказать влияние на репаративные процессы в эритроне, могут быть повреждения ядросодержащих эритроидных клеток, изменения характера течения окислительного метаболизма, гликолиза, обмена железа, токсические повреждения почек и печени, блокада системы фагоцитирующих моно-нуклеаров. Сложный характер ответа эритрона на действие гемолитического яда проявился в снижении количества ЭО костного мозга на ранних сроках раз-тия ФГ анемии. Данный феномен, отмеченный в исследованиях ряда авторов (Мельников И.Ю., 1988; Каюмова А.Ф., 1990), явился отправной точкой наших экспериментов. В первой серии опытов было изучено влияние разных доз гемо-литика на некоторые показатели крови и число ЭО костного мозга (табл.6).

Таблица 6. Дозозависимые эффекты фенилгидразина на показатели эритрона _через 24 часа после введения геиолитика. __

Группа крыс Показатель Контроль (6) 15 мг/кг (6) 30 мг/кг (6) 60 мг/кг (6) 100 мг/кг (6)

Гематокрит,х 10"2 л/л 42,5±0,5 37,4+0,6 * 33,7±1,4 * 26,5±1,0 * 26,2+1,7*

Ретикулоциты, %0 21,5±2,1 59,8+5,5 * 82,0+2,6 * 85,0+4,8 * 74,0+3,0 *

ЭО, х 103/бедро 375,5±18,3 228,2±11,4* 155,5±8,1* 156,7±8,2* 170,5+6,7*

Дозозависимое снижение числа эритроцитов при ФГ анемии происходило в диапазоне доз 15-60 мг/кг, а увеличение количества ретикулоцитов крови и одновременное уменьшение количества ЭО - 15-30 мг/кг, указывая, что при разовом введении яда одномоментному лизису подвергается лишь около 40% эритроцитов, и лимитирующим фактором компенсаторного ретикулоцитарного от-ответа при ФГ анемии к 24 часу, вероятно, является, пул распадающихся ЭО.

В следующей серии экспериментов была изучена динамика изменений показателей крови, начиная с 3-6 часа и кончая 120 часом после однократного введения солянокислого фенилгидразина в дозе 60 мг/кг. Оказалось, что характерные для анемизации организма снижение показателя гематокрита и рост числа ретикулоцитов при ФГ анемии формируются уже к 3 часу наблюдений.Несмот-ря на раннее развитие анемии, признаки оживления эритропоэза проявили себя лишь с 48 часа эксперимента вторым, нарастающим ретикулоцитарным подъемом. Так, на 3 и 5 сутки количество ретикулоцитов превысило уровень 24 часа в 3,2 и 3,9 раза (Р<0,001 для обоих случаев), что сопровождалось достоверным

эвышением к 5 дню гематокрита крови на 12,4% по сравнению с 24 часом, ледует признать, что ни ретикулоцитарная реакция, ни темп восстановления )личества эритроцитов крови не соответствовали в полной мере глубине ане-ии, создавая впечатление о запаздывании или отсроченном развитиии восста-звительных процессов в кроветворной ткани. Анализ костномозгового крове-юрения показал, что к 24 часу воздействия снижалось до минимума как общее эличество миелокариоцитов: 54,2+3,4 против 89,8+5,3 х 106/бедро в контроле, ж и число неэритроидных и эритроидных клеток. Последних становилось 17,4 0,7 против 24,3±1,3 х 106/бедро в контроле (Р<0,001). Наряду с повреждением, 1белью и разрушением миелокариоцитов, свой вклад в уменьшение количества эитроидных элементов могло снести их ускоренное созревание. На поздних эоках (48-120 час) достоверных изменений интенсивности миелопоэза не про-сходило, и число неэритроидных ядросодрежащих клеток оставалось ниже энтроля на 37,6 - 42,8 %. Снижение лейко-эритроцитарного коэффициента на 4 час опыта, указывающее на относительное преобладание количества эритро-цных клеток в костном мозге, свидетельствовало о начале активации эритропо-т. С 48 часа стало неуклонно увеличиваться и абсолютное число эритроидных зросодержащих клеток. В итоге, к 5 суткам наблюдения количество эритро-иелокариоцитов в 1,5 раза превышало контрольный уровень (Р<0,05). Расши-яющийся плацдарм эритропоэза приводил к постепенному повышению общей неточности костного мозга. Имелись все основания считать, что изменения эстояния эритропоэза отражали характер сдвигов эритропоэза в ЭО (рис.4).

Рис.4.Динамика изменений абсолютного количества ЭО, атипичных и суперостровков при ФГ анемии.

Контроль 3-6 час 12 час 24 час 43 час 72 час 120 час

Срок наблюдения

Действительно, на протяжении первых суток воздействия наблюдалось выраженное падение абсолютного числа ЭО в костном мозге, достигшее к 24 часу 45,3 % контрольного уровня (Р<0,001). К этому времени в 4 раза возрастало содержание "атипичных" ЭО, что прямо указывало на нарушение комплементарное™ макрофагов и эритроидных клеток, и напротив, "суперостровки" на 36 и 12 час не выявлялись в костном мозге. Оживление эритропоэза со вторых суток вело к приросту числа ЭО более чем на 50 тысяч по сравнению с 24 часом (Р<0,01). На 3 и 5 дни абсолютное количество ЭО в костном мозге продолжало нарастать с одновременным уменьшением "атипичных" и ростом "суперос тровков". Кроме этих данных, о динамике изменений соотношения объемов ос-тровкого и внеостровкового эритропоэза при ФГ анемии свидетельствовали рас четные показатели числа и соотношения эритроидных клеток, приходящихся на один ЭО и вне ЭО (табл.7). Как и ожидалось, в течение первых суток происходило увеличение числа эритроидных клеток вне ЭО и объема внеостровкового эритропоэза и, напротив, оживление эритропоэза с 48 часа наблюдений вело к увеличению доли клеток, находящихся в ЭО и уменьшению объема внеостровкового эритропоэза.

Таблица 7. Расчетные показатели среднего числа эритроидных клеток, приходящихся

на один ЭО, вне ЭО, и объема внеостровкового эритропоэза

Срок наблюдения Конт- 3-6 12 24 48 72 120

роль час час час час час час

Показатель (Ю) (5) (3) (6) (4) (4) (4)

Среднее количество клеток

на один ЭО: 70,3 73,4 91,1" 111,7* 101,6* 61,9 60,1

число эритроидных клеток ±1,2 ±2,7 ±2,6 ±3,8 + 8,3 ±13,1 ±8,1

костного мозга / ЭО

Количество эритроидных

клеток вне островка: среднее 6,3 9,4 27,1* 47,7* 37,6* 9,1 4,1

количество клеток ЭО минус ±1,2 ±2,7 ±2,6 ±3,8 ±8,3 ±9,1 ±3,7

64 клетки ,т.е. теоретически

возможное число клеток

Объем внеостровкового

эритропоэза: соотношение 8,7 12,3 29,7* 42,4* 35,7* 9,1 5,3

числа клеток вне ЭО к их ±1,5 + 3,3 ±2,0 ±1,9 ±5,3 ±9,1 ±4,7

числу в ЭО, %

Примечание. Звездочками отмечены достоверные различия с контролем.

Формула ЭО не обнаружила выраженных сдвигов в распределении островков по классам зрелости в ранние сроки анемии, лишь уровень ЭО,,», достовернс уменьшался с 57,1 ±1,0 до 50,2+2,3 % к 24 часу (табл.8). При расчете абсолютного количества островков разных классов картина становилась более ясной. На ранних сроках (3-6 час) и в дальнейшем (12-24 час) наиболее существенно снижалось количество островков, содержащих зрелые эритроидные клетки: ин-волюцирующих ЭО, реконструирующихся и 3 класса зрелости, что указывало на их повышенную чувствительность к действию фенилгидразина. Повреждающий эффект в отношении классов пролиферирующих островков проявился В|

Таблица 8. Абсолютное количество и формула ЭО - относительное содержание - эритробластических островков разных классов зрелости в костном мозге крыс после однократного введения фенилгидразина в дозе 60 мг/кг.

! Срок после | КлассЧ. введения ! зрелости яда Контроль (10) 3 -6 час (5) 12 часов (3) 24 часа (6) 48 часов (4) 72 часа (4) 120 часов ! (4) |

:эог. X 103 /0едро1 % 3,3±0,4 10,5±1,б"' 3,8±0,4 4,2±1,3 * 2,0±0,6 7,8±1,41 4,8±0,7 Н,Р±4,4 5,0+1,7 41,8±10,8* 9,0±2,0 * 65,7±10,4* 1 11,0±1,5 * ! ]

1Э02: хЮ3 /бедро % 57,8±4,8 16,6+0,8 48,0±5,6 17,6±1,5 36,7±3,7 * 18,0±1,5 34,5±3,2 * 22,2±2,3 * 48,б£1,9 23,5±2,Г 94,8±8,7 * 20,8±1,5 * 100,9±8,7 * ; ; 17,0+1,1 | 1

х103/бедро! % . 20,2±2,4 • 5,7±0,5 16,8±4;0 6,0+1,1 4,3±0,9 ШШШё 3,7+1,1 ' 20,3±3,3 . 9,5±1,0* 35,3 412,5 7,8±2,7 . 97-2±7,2.Д 16,5±1,4 *

% ¥МШШ 17,3±0,6 16,4±0,8 11111 14,3±2,3 шиш 19,2±1,0 33,313,7* 15,8+0,9 20,4±1,2* , 94,2±14,1* 15,8±2,0

ШШ1 1 х;~103/бедро % 197>0±9>2 57,1±1,0 151,0*6,9* 56,2±1,4 124 0±4,1* 61,3±3,5 78,7±5,8*; 50,2±2,3 * : 96,?±3,0' 46,3±1,4* Р1ШШ1 42,3±6,1 * .233,5^18,2 .. 39,8+3,9 *

Примечание. Звездочками отмечены достоверные различия между контрольной и опытными группами.

уменьшении на 12 час количества ЭО1 и Э02 по сравнению с контрольными животными. Оживление эритропоэза со 2 суток эксперимента с увеличением количества ЭО 2 и 3 классов зрелости на 48 час по сравнению с 24 часом, с третьих суток переходило в выраженную активацию кроветворения с ростом количества ЭО 1, 2 классов и реконструирующихся. Анализ состояния эритропоэза в ЭО с определением числа митозов эритроидных клеток, самих клеток и ретикулоцитов показал, что в инволюцирующих, реконструирующихся и островках 3 класса зрелости с 3 по 48 час опыта в среднем вдвое сниженным было количество ретикулоцитов. Подсчет числа митозов эритроидных клеток выявил их увеличение в ЭО всех классов за исключением инволюцирующих, начиная с 24 часа наблюдений, при этом наибольший рост числа митозов наблюдался в островках 1 класса и реконструирующихся. К 48 часу в реконструирующихся ЭО, а с 72 часа - в ЭО 1 класса и инволюцирующих увеличивалось количество ядросодержащих эритроидных клеток. Повышенным оно оставалось и на 5 сутки. Созревание клеток к 120 часу привело к повышению количества ретикулоцитов в островках в среднем до 9,10+1,28 - 10,5±0,57, свидетельствуя об эффективности стимуляции эритропоэза в ЭО. Изучение функциональной активности макрофагов ЭО при ФГ анемии показало, что с 3 часа опыта на фоне небольшого увеличении числа лизосом и снижения их рН с 4,11+0,03 в контроле до3,92±0,03 (Р<0,05) происходило снижение активности ферментов, кислой фосфатазы и неспецифической эстеразы, с минимумом на 24 час. Одновременно структуры ЭО теряли кислые глюкоконъюгаты с 15,22±0,13 в контроле до 7,35± 0,26 усл.ед. на 24 час, а содержание ШИФ - позитивного материала в цитоплазме макрофагов, напротив, возрастало. Об ингибиции активности кислород-зависимых процессов в ЭО в первые сутки свидетельствовало снижение показателя НСТ-теста, а на потерю зарядов клеточными мембранами указывало уменьшение электрофоретической подвижности островков с 1,13+0,01 в контроле до до 1,03±0,02(Р<0,05). На 5 сутки эксперимента активация эритропоэза вЭО сопровождалась сдвигами исследованных показателей, свидетельствующими с повышении функциональной активности центральных макрофагов. На это указывали увеличенное число лизосом, повышенная активность ферментов, низкое внутрилизосомальное рН, накопление кислых и снижение (расходование) нейтральных глюкоконъюгатов, повышение показателя НСТ-теста и ЭФП эо.

Расчетные показатели состояния эритропоэза в ЭО подтверждали направленность изменений эритропоэза до 1 суток и в конце наблюдений. Так, общее число КОЕэ, вступивших в дифференцировку в ЭО на 24 час, составило 186,4+8,5, а на 120 час - 685,7±31Д х 103/бедро (в контроле - 357,3±17,8 х 103/бедро); интенсивность вовлечения КОЕэ в дифференцировку на 24 час снизилось до 37,5 ±2,1, ана5 сутки - повысилось до 159,9+23,2х Ю3/бедро (в контроле - 71,0±3,6 х103/бедро). На интенсивное созревание ЭО указывало снижение показателя длительности созревания, а на заинтересованность в активации эритропоэза макрофагов- рост с 24 часа показателя их повторного вовлечения в эритропоэз.

В следующей серии экспериментов была предпринята попытка раскрыть воз-ожные механизмы снижения содержания ЭО в костном мозге в ранние сроки Г анемии, исходя из представлений об изменении комплементарное™ кле->к в ЭО на фоне структурно - метаболических сдвигов функционального состо-шя центральных макрофагов. Их лизосомальные ферменты, в повышенном хличестве секретирующиеся во внеклеточную среду, могли, с нашей точки (ения, воздействовать на целостность межклеточного магрикса и привести к гссоциации клеток ЭО и уменьшению содержания островков в костном мозге, [оделирование эффектов лизосомальных гидролаз осуществляли in vitro, добав-1я в инкубационную взвесь с ЭО на 30 минут при 37°С известные и доступные ерменгные препараты: трипсин, химотрилсин и гиалуронидазу в конечной )нцентрации 0,02; 0,1; 0,5 и 2,5 %. Добавление физиологического раствора в качестве контроля не вело к достоверному уменьшению числа ЭО во взвеси, >гда как добавление препаратов существенным образом отражалось на коли-;стве ЭО: последовательное 5-кратное увеличение концентрации трипсина и шотрипсина в инкубационной среде сопровождалось столь же последователь-ям 2-кратным уменьшением числа ЭО (рис.5).

Рис.5. Содержание ЭО после инкубации с ферментами, % к исходному уровню.

2,50% ТРИПСИН

Примечание. Влияние ферментов во всех концентрациях, кроме влияния гиалуронидазы в концентрации 0,02 %, достоверно отличается от контроля - 95,8+1,1% (п=9).

Таким образом, деполимеризация и гидролиз молекулярной основы межклетного матрикса в ЭО под действием экзогенных ферментов приводили к дис-|циации клеток ЭО и уменьшению количества островков во взвеси. Морфоло-[я инкубированных ЭО демонстрировала дозозависимый эффект ферментов.

Полученные in vivo и in vitro результаты экспериментов явились основанием

для применения с целью изменения характера нарушений эритропоэза в ЭО при ФГ анемии противошокового препарата, ингибитора протеаз - контрикала. Оказалось, что в дозах 50 и 500 ЕД он оказывал отчетливый защитный эффект, препятствуя уменьшению количества ЭО в костном мозге животных при одновременном введении с гемолитиком (60 мг/кг): количество островков у "леченных" крыс через сутки было на 100 тысяч/ бедро больше по сравнению с контрольными - анемизированными.

В заключительной серии экспериментов было показано, что контрикал изменял течение процесса регенерации крови после инъекции гемолитического яда в дозе 30 мг/кг, способствуя более существенному росту количества ретикулоци-тов на 4 и 7 дни наблюдений и эффективному восстановлению показателя гематокрита, т.е. регенерация крови обеспечивалась кратковременным, но более выраженным повышением мощности эритропоэза.

Характер изменений эритропоэза в эритробластических островках при его

угнетении на фоне поспрансфузионной полишггемии и при последующем

введении эритропоэтина.

Посттрансфузионная полицитемия по праву считается классической моделью ингибиции эритропоэза, поскольку ее развитие не сопровождается, как при постгипоксической полиглобулии, предшествующей стимуляцией продукции эритропоэтина. Показано, что после однократной либо двукратной инъекции взвеси гомологичных эритроцитов полномасштабное угнетение эритроидного ростка, начинающееся сразу же после трансфузии, развертывается к 5 суткам и сохраняется вплоть до 9-12 дня (Волжская A.M., 1972; Моисеева О.И., 1985; Jacobson L.O. et al.,1960; Whitcomb W.H.,1971 и др.). В нашей лаборатории продемонстрировано, что при полицитемии, начиная с 5 дня, в гемопоэтической ткани отмечается минимальный уровень содержания ЭО - 64,6±8,3 тысяч на одну бедренную кость (Мельников И.Ю.,1988).

Экспериментальные исследования были выполнены на базе Гематологического научного центра (г.Москва)в лабораториях профессора Г.И.Козинца и доктора биологических наук В.И.Гудим. Как и ожидалось, создание поспрансфузионной полицитемии у животных на 5 сутки сопровождалось существенным ростом объема циркулирующих эритроцитов и угнетением эритропоэза: на первое указывал возросший в 1,6 раза показатель гематокрита, а на второе-сниженный более чем в 10 раз уровень ретикулоцитов крови. Введение эритропоэтина в дозе 15 ME на крысу не вело, в сравнении с контрольной группой полицитеми-чных животных, к достоверному изменению объема циркулирующих эритроцитов, и после инъекции эритропоэтина показатель гематокрита у животных оставался неизменным с 12 по 72 час наблюдений. Напротив, число ретикулоцитов крови менялось: к 12 часу их количество становилось несколько меньше контроля, а с 24 часа и до 3 суток отмечался ретикулоцитарный подъем с максимум на 2 сутки, что указывало на усиленное образование ретикулоцитов в кроветворных органах. Количественно - качественный анализ костного мозга

»наружил у полицитемичных животных по сравнению с интактными сущест-нное уменьшение как общего количества миелокариоцитов, так и неэритроид-.IX и, особенно, эритроидных ядросодержащих клеток. Лейко-эритроцитарный »эффициент, повышенный у полицитемичных крыс до 5,04±0,36 против 2,93± 17 у интакгных животных (Р<0,001), явно свидетельствовал на сдвиг гемопо-а в пользу неэритроидных ростков кроветворения. Введение эритропоэтина ! вело к восстановлению количества эритрокариоцитов до исходных 27,9±1,8 О6 на 1 бедренную кость, однако их число на 48 час наблюдения повышалось ) сравнению с контрольной группой на 2,5 х 106/ бедро. Эти сдвиги состояния итропоэза под влиянием эритропоэтина не вели к изменению лейко-эритроци-рного коэффициента, и отмечалась лишь тенденция к его уменьшению с 12 по I час опыта. Колебания числа неэритроидных клеток, как и общего коли-;ства миелокариоцитов, были недостоверными.

Угнетение эритропоэза при посттрансфузионной полицитемии сопровожда-юь выраженным уменьшением абсолютного количества ЭО в костном мозге: 15 сутки полиглобулии их было меньше по сравнению с контролем в 3,9 раза абл.9). При этом на фоне полного исчезновения "суперостровков" возрастало

Габлица 9. Абсолютное число эритробластических островков,"атипичных" и "супер-

островков" при полицитемии и при послед« гющем введении эритропоэтина.

Группа крыс Показатель Интактные (5) Контроль: полицитемии (4) Срок после введения гормона

12 час (3) 24 час (3) 48 час (3) 72 час(3)

ЭО, х103/бедро 383±21 97±10* 218+25*'" 313+18'" 319±24" 282±П*'"

"Атипичные", на 100 ЭО 9,8±1,9 20,0+1,8' 10,3+0,9" 6,9±1,2" 4,7+0,9*'" 11,7±1,8"

"СуперЭО", на 100 ЭО 0,8+0,3 о,о±о' 2,0±1,2 6,0+1,0'" -- 10,3+0,9'*' 10,0±2,б'

1Сло "атипичных" островков, лишившихся центральных макрофагов. Введение итропоэтина приводило уже на 12 час к увеличению в 2,2 раза числа ЭО в сгаом мозге со стабилизацией на уровне 313-318 тысяч/бедро на 24-48 час блюдений. Изменения в содержании "атипичных" и "суперостровков" имели знонаправленный характер: если масса "атипичных" ЭО планомерно умень-алась, то число "суперостровков" - увеличивалось с 12 по 48 час эксперимента, фактерно, что между данного типа островками на протяжении всего периода 1лицитемии отмечалось существование заметной обратной корреляционной язи (г=-0,644, Р<0,01). Вполне вероятно, что под влиянием эритропоэтина юисходило оживление локомоторных функций свободно лежащих и централь-IX макрофагов ЭО, активно захватывающих и присоединяющих к себе, как шо показано в культурах ЭО (Zakharov Y.M., Prenant M., 1982), отдельные итроидные клетки и/или группы этих клеток. Это могло привести к уменьшите числа "атипичных" островков и к увеличению количества "суперЭО".

Качественный анализ обычных ЭО у контрольных крыс при полицитемии выявил существенное перераспределение между островками разных классов зрелости. В сравнении с интактными животными, у полицитемичных происходило снижение содержания островков всех классов, за исключением инволтоци рующих, уровень которых, напротив, заметно повышался. Введение эритропоэ-тина изменяло качественный состав ЭО: на фоне резкого уменьшения содержания ЭОшт с 65,3+0,5 % у полицитемичных крыс до 16,7±0,7 % (Р<0,01), на 12 час наблюдений увеличивалось содержание ЭО 1, 3 классов зрелости и реконструирующихся. К 48 часу содержание ЭО| и ЭОрек. снижалось, указывая на кратковременный эффект гемопоэтического гормона. О значимости повышенш уровня ЭО 1 класса свидетельствовало достоверное увеличение содержания Э( 2 и 3 классов на более позднем сроке - 48 часе наблюдений. Переход ЭО 2 и 2 классов зрелости в разряд инволюцирующих сопровождался увеличением со держания последних на 3 сутки после введения эритропоэтина.

Картина развивающихся в ЭО событий становилась более ясной после расче та абсолютного количества ЭО разных классов при полицитемии и последую ющем введении эриропоэтина (рис.6).

Рис. в. Абсолютное число ЭО разных классов при полицитемии и последующем введении эритропоэтина

о а

Ч ®

ю га

х у

к о 3 Н

400

350

300

250

200

150

100

50

ИЭОинв □ ЭОрек

■ ЭОЗ ПЭ02

■ ЭО 1

тЛЬп

1

Иитактные Контроль

12 час 24 час 48 час 72 час

Группа крыс

При общем уменьшении абсолютного числа ЭО при полицитемии почти в • раза, наиболее выраженно снижалось количество ЭО 1 класса и реконструирую щихся, и в меньшей степени, в 2,7 раза - число инволюцирующих ЭО. После инъекции эритропоэтина события развивались прямо противоположно. К 12 ча су опыта на фоне 2-кратного увеличения абсолютного количества ЭО отмечалс. подъем числа всех островков, за исключением инволюцирующих, которых, на против, становилось на 42 % меньше в сравнении с контролем (Р<0,001). Увеличение числа ЭО[ и 30^. после инъекции эригроэтина в ранние сроки по

щитемии указывало на сохранение в костном мозге необходимых для форми-1вания ЭО пулов резидентных макрофагов и КОЕэ. Прирост ЭО 1 класса и ре-нструирукнцихся свидетельствовал о мобилизации около 80 тысяч КОЕэ в итропоэз ЭО в костном мозге 1 бедренной кости. Рост количества ЭОг и ЭОз с : на 48 час воздействия эритропоэтина во многом определялся делением кле-к ЭО, и переход ЭО 3 класса в разряд инволюцирующих по мере созревания итроидных элементов приводил к росту абсолютного числа инволюцирую-их островков ко 2 и 3 суткам после введения эритропоэтина.

Прямые подтверждения усиления пролиферации клеток ЭО под действием итропоэтина были получены с помощью авторадиографии островков путем гределения индекса метки эритроидных клеток 3Н-тимидином, то естьпро-ита клеток, включивших метку от общего их числа в ЭО (табл. 10). При поли-

Таблица 10. Индекс метки эритроидных клеток ЭО при полицитемии и при ___последующем введении эритропоэтина (%).__

Группа крыс Класс зрелости Интактные (5) Контроль: поли-цитемия (4) Срок после введения гормона

12 час(3) 24 час(3) 48 час (3) 72 час (3)

Э01 42,0+3,2 14,3 ±3,8* 75,8+4,1*" 74,1+4,6'" 24,6±б,7* 7,9+3,9*

ЭО 2 9,6±0,7 2,4+0, б* 40,7±1,2*-" 26,2±1,3*'" 2,8±0,5* 0,5+0,3*-"

ЭОЗ 1,7+0,4 1,5+0,5 27,7+1,5*'" 21,2+1,8*-** 2,1+0^4 1,2+0,4

ЭО рек. 31,8+2,3 14,7+2,0' 49,1+1,9'" 39,3+2,1'-*' 21,0+2,8' 9,8+2,4'

Примечание. (*) - достоверные различия с интакгными, (**) - с контрольными крысами.

Среди инволюцирующих островков не обнаружено клеток, включивших 3Н-тнмидин. гтемии наибольшее подавление синтеза ДНК наблюдалось в ЭО 1, 2 классов елости и реконструирующихся. Многократное повышение числа клеток, всту-гвших в Б - период клеточного цикла, включая полихроматофилы ЭО 3 класса елости, явилось прямым доказательством специфической активации эритро-эза в островках под действием эритропоэтина, сопровождающейся ростом об-:го количества островков в костном мозге животных и оживлением эритропо-1 в организме в целом. На фоне полиглобулии эффект эритропоэтина оказался атковременным, но эффективным. На это указывало повышение числа ядро-держащих клеток в ЭО. Так, в ЭО 2 и 3 классов, по сравнению с контрольными полицитемичными животными, их стало больше с 10,6±0,3 и 20,5±0,4 до ,7+0,1 и 22,0+0,1 (Р<0,05) уже к 12 часу, а в 30,™. - с 3,9+0,1 до 5,2±0,2 к часу. В островках 1 класса количество клеток постепенно повысилось с 4,0± 1 до 6,9±0,1 к 72 часу, а в ЭО^ колебания числа клеток были недостоверны. Созревание ядросодержащих клеток ЭОуже к концу первых суток после здействия эритропоэтина приводило примерно к 2-кратному увеличению чис-ретикулоцитов в островках 3 класса, реконструирующихся и инволюцирую-IX. На 48 и 72 час опыта в ЭОз и ЭО,™ количество ретикулоцитов достигало )±0,6 - 9,9+1,1, что было выше даже в сравнении с показателями ЭО интакт-[X животных. Расчет числа клеток, приходящихся на один ЭО и вне ЭО, пока-

зал, что на 5 сутки полицитемии на 1 ЭО приходилось 112,7±10,4 эритроидных клеток, что было больше теоретически возможного (64) на 48,7+10,4; это составляло 42,0±4,7% от общего числа клеток и свидетельствовало о большом объ еме внеостровкового эритропоэза. Введение эритропоэтина с увеличением количества ЭО приводило к переходу клеток в их состав и снижало до нуля объел внеостровкового эритропоэза с 12 часа и до конца наблюдений.

Расчетные функциональные показатели состояния эритропоэза в ЭО подтверждали общую направленность изменений эритропоэза в ЭО при полицит емии и при последующем введении эритропоэтина. Так, если на 5 день полиглс булии общее количество КОЕэ, вступивших в дифференцировку, снижалось в * раза, в 8,5 раз падала интенсивность этого процесса и в 3 раза уменьшался показатель повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз, то уже через 12 часов после введения эритропоэтина общее число КОЕэ, вступивших в диффе ренцировку,увеличилось более чем в 3 раза как за счет интенсивного их вовлечения в эритропоэз, так и за счет повторного вовлечения в эритропоэз макрофагов ЭО. Таким образом, введение эритропоэтина на фоне посттрансфузион ной полицитемии сопровождалось выраженной активацией эритропоэза в ЭО костного мозга с усилением синтеза ДНК в эритроидных клетках, увеличение?» их массы как в ЭО, так и в костном мозге, с эффективным созреванием эритро идных клеток в ретикулоциты и выходом последних в кровь.

С целью изучения влияния эритропоэтина на морфо- функциональное состоя ние макрофагов ЭО была исследована динамика показателей интенсивности флюоресценции ЭО в диапазоне 530-550 нм (нуклеиновые кислоты) и 630-650 нм (лизосомы) через 30 и 60 минут после добавлении гормона, выделенного из мочи больного с апластической анемией, в дозе 1 ME (0,02 мл) /мл среды в инкубационную взвесь с ЭО.

Таблица 11. Влияние эритропоэтина на микрофлюориметрические показатели ЭО. Спектр ^ Инкубация 30 минут (5крыс) Инкубация 60 мннуг (5 крыс

флюоресценции Контроль Опыт___контроль . ', Опыт

630-650 им ' 1,'48±0,08 "Х<М±0,1й* 1,49±оТо7 l,45i0,08

530-550 нм_1,95+0,16_2,42i0,20_1,92±0,11 1,34±0,08 »

Примечание. Число ЭО в каждом случае - 110 Из данных табл. 11 следует, что под действием эритропоэтина за 30 минут иь кубации происходила активация лизосомального аппарата макрофагов ЭО с увеличением интенсивности флюоресценции в спектре 630-650 нм на 38 %. Через 60 минут интенсивность флюоресценции снижалась до контрольного уровня и становилась ниже показателя 30- минутной инкубации. В результате 60-минутной инкубации снижалась также интенсивность флюоресценции ЭО г спектре 530-550 нм, что, вероятнее всего, было связано с потерей островкам! ядросодержащих эритроидных клеток.Известно, что интернализация цитокино] и ростовых факторов приводит к активации лизосомально-пластинчатого аппа рата чувствительных к ним клеток, при этом закисление в лизосомах является необходимым условием для разобщения лигандов и рецепторов, сортировки

гандов и рециклирования рецепторов ( Мынкина Г.И., Короленко Т.А.,1992). ким образом, полученные данные прямо показали, что макрофаги ЭО облают чувствительностью к эритропоэтину, который влияет на характер течения утрилизосомальных процессов в данных клетках. В последующем это приво-т к изменениям состояния эритроидной " короны " макрофагов ЭО. Очевидно, n vivo, несмотря на подавление эритропоэза на фоне посттрансфузионной по-цитемии, эритропоэтин, введенный в повышенном количестве, способен ини-ировать пролиферацию и активность чувствительных к нему клеток, и мак-фагам ЭО принадлежит важная эффекторная роль в этих процессах. Характер эритропоэза в эритробластических островках при повреждающих воздействиях (термический ожог и радиационное облучение) и подходы к коррекции возникающих нарушений.

Анемии, являющиеся сиптомом различных органических поражений и забо-ваний, в последние годы стали предметом пристального внимания специалис-8 в области космонавтики, радиационной медицины, экологии, а также смеж-IX с гематологией дисциплин. Оказалось, что чувствительность эритрона поз-пяет выявить ранние и неблагоприятные последствия загрязнения окружа-цей среды, спрогнозировать течение и исход заболеваний и повреждений, ом числе термических ожогов и воздействий радиации (Акоев И.Г., Мотлох Н., 1984; Лифшиц Р.И.,1986; Груздев Г.П.,1988; Ястребов А.П. и соавт.,1988; шгушин И.И. и соавт., 1989; Жербин Е.А., Чухловин А.Б., 1989; Захаров В.Н. соавт., 1990; Муксинова К.Н., Мушкачева Г.С., 1990; Юшков Б.Г. и соавт., 94; КаюмоваА.Ф.,1996 и др.).

Известно, что анемия является одним из главных симптомов ожоговой болез-, но только в 1975 году И. Бернат впервые продемонстрировал вовлечение в гологический процесс ЭО костного мозга без описания их количественно-чественных характеристик. В нашей лаборатории мы предприняли углублен-е исследование ЭО костного мозга при ожоговой травме в эксперименте зместно с А.Г. Починским и О.Г. Крестьяниновой.

Характер изменений показателей периферической крови обожженных крыс ответствовал данным, полученным другими авторами ( Игнатов C.B., 1990; шов И.Г.,1990). Так, через 6 часов нанесения ожога вследствие плазмопотери едоров и соавт., 1985) возрастало количество эритроцитов, лейкоцитов и постель гематокрита, а к концу первых суток появились признаки анемизации, горую в рагшие сроки ожоговой травмы связывают с гемолизом эритроцитов rallner S.F. et al., 1987). Увеличение количества ретикулоцитов в 1,6 раза, по звнению с контрольными животными (Р<0,05), свидетельствовало о ком-нсаторной реакции со стороны костного мозга, как и лейкоцитоз, имеющий юрвые сутки перераспределительный характер (Попов И.Г.,1986). Стабильно вышенным количество ретикулоцитов оставалось в течение 7 суток наблю-гшй, но это не приводило к восстановлению гематокрита крови животных до Епролыюго уровня - 44,4±1,3 х 10"2 л/л. Вместе с тем, с 1 на 7 день наблюдал-

ся рост данного показателя с 37,5± 1,1 до 40,7± 0,7 х 10'2 л/л (Р<0,05). Последнее обстоятельство можно было бы считать проявлением адекватной реакции эритрона на предшествующее уменьшение в организме числа эритроцитов, если бы параллельно наблюдалось увеличение их количества в периферической крови, а оно с 1 по 7 сутки после ожога оставалось неизменным. Таким образом, повышение показателя гематокрита больше свидетельствовало о возможном увеличении объема эритроцитов на фоне нарушений водно-электролитного баланса при ожоговой травме, чем о возрастании их продукции в костном мозге. Вероятно, неизменяющийся повышенный ретикулоцитарный уровень явился проявлением замедленного созревания ретикулоцитов, выброшенных в кровь обожженных животных еще в первые сутки эксперимента. На перестройку ге-мопоэза также указывал стойкий лейкоцитоз во время всего двухнедельного периода наблюдений. Подсчет абсолютного числа миелокариоцитов, эритроид-ных ядросодержащих клеток и клеток неэригроидного ряда показал, что в первую неделю ожоговой травмы у животных существенно уменьшалось количество миелокариоцитов, в основном за счет неэритроидных элементов, а

Рис. 6. Показатели костномозгового кроветворения при ожоговой травме

100

о о.

ч

ш

£ X

с 2

■3 о

X

о.

(О ж

о §

3 Неэритроидные клетки (Эритроидные клетки

Контроль

1 сутки

3 сутки

7 сутки

14 сутки

на 7 и 14 сутки снижение количества эритроидных клеток указывало на развивающуюся ингибицию эритропоэза. Характерно, что в костном мозге к 14 дню наблюдалась активация продукции неэритроидных элементов с увеличением их абсолютного количества. Показано, что при ожоге в костном мозге расширяется плацдарм грануло-макрофагального ростка (Попов И.Г.,1990; Починский А.Г., 1990). Если в парциальной эригрограмме на ингибицию эритропоэза при ожоге указывало лишь снижение к 7 суткам содержания про-, эритробластов и базо-фильных нормобластов, то падение абсолютного количества ЭО до 298,7±14,4 против контрольных 368,2±13,8 х 103/на бедро свидетельствовало об этом уже

) часа наблюдений (не указано в графике). В последующие сроки число ЭО одолжало уменьшаться и достигало минимума на 7 сутки, когда ингибиция итропоэза проявила себя в снижении количества эритрокариоцитов. Матема-ческий расчет среднего числа клеток на один ЭО, вне ЭО и объема внеостров-вого эритропоэза показал, что если у контрольных животных вне ЭО было ,1±6,2 % всех клеток эритроидного ряда, то к первым суткам их становилось ,1±1,2% (Р<0,001).С 3 суток число клеток вне островков начинало снижаться яа 14 достигало контрольных значений. Следовательно, ингибиция эритро-эза при ожоговой травме вначале затрагивала эритроидные клетки, потеряв-яе связь с центральными макрофагами ЭО, в уменьшешюм объеме эритропо-замыкался в островках. В этой связи особый интерес представлял анализ ка-ственного состава ЭО, проведенный с учетом представлений о функциональ-IX различиях центральной, осевой зоны костного мозга бедренных костей и рковой, субэндостальной зоны, известных как зона созревания и генеративная на (Хрущов Н.Г. и соавт.,1988; Ргазвош Р. е1 а1.,1982). При качественном ана-зе ЭО, выделенных из этих разных отделов костного мозга, были обнаружены фаженные различия в распределении островков по классам зрелости (рис. 7).

К 6 24 7 14 25 К 6 24 7 14 25

час день час день

А Б

Рис. 7. Распределение ЭО разных классов зрелости в центральной (А) и корковой (Б) зонах костного мозга бедренных костей в динамике термического ожога.

Так, в центральной зоне созревания вокруг центрального синуса у контроль-IX крыс преобладали инволюцирующие ЭО, содержание которых составля-62,2+2,6 против 24,6±4,7% в корковой зоне (достоверные различия на рисун-

ке выделены цифрами), и напротив, островки, содержащие в своем составе способные к пролиферации эритровдные клетки, ЭОь ЭО2, ЭОз и реконструирующиеся, преобладали в генеративной корковой зоне. Эти данные подтвердили представления о различиях в микроархитектонике костного мозга трубчатых костей крыс. На 6 час после ожога наибольшие изменения качественного состава ЭО отмечались в центральной зоне: снижение содержания ЭОШ1Е в 2,3 раза в сравнении с контролем вело к повышению содержания ЭО других классов. К 24 часу число инволюцирующих островков в зоне созревания уменьшилось еще вдвое, указывая, с нашей точки зрения, на их распад, и это определило падение общего числа ЭО в первые сутки ожоговой травмы. Ингибиция эритропоэза, выявленная на 7 сутки по снижению абсолютного числа эритрокариоцитов, сопровождалась нарастанием содержания инволюцирующих островков не только в зоне созревания, но и в генеративной зоне. На 14 сутки различия в содержании ЭО,™. между зонами нивелировались: и в зоне созревания, и в генеративной зоне более 60 % ЭО становились инволюцирующими. Однако первые признаки подавления эритропоэза в корковой зоне проявили себя еще на 24 час опыта в достоверном снижении содержания реконструирующихся ЭО, к которому на 7 сутки добавилось уменьшение содержания ЭО 1 и 2 классов зрелости. Полномасштабное подавление эритропоэза в ЭО развивалось к 14 суткам опыта. Расчет функциональных показателей, характеризующих состояние эритропоэза в островках, подтверждал снижение интенсивности эритропоэза у обожженных животных.На первые сутки об этом свидетельствовало уменьшение числа КОЕэ, вступивших в дифференцировку, а на 7 и 14 сутки - дополнительно снижение показателя интенсивности данного процесса и показателя повторного вовлечения в эригропоэз макрофагов ЭО. Уменьшение числа лизосом, повышение их рН, снижение активности лизосомальных ферментов, уменьшение количества кислых и увеличение количества нейтральных глюкоконъюгатов на разных сроках наблюдения у обожженных животных указывало на подавление функциональной активности центральных макрофагов ЭО. Об изменении зарядов клеточных мембран можно было судить по увеличению электрофоретической подвижности ЭО. Наиболее реальными причинами снижения интенсивности эритропоэза в ЭО и в костном мозге, функциональной активности макрофагов ЭО при ожоговой травме явились изменения в цитокиновой регуляторной сети. Известно, что ожоговая травма, протекающая по близким к воспалению патофизиологическим механизмам, сопровождается мощной стимуляцией гранулоци-тарного и макрофагального ростков кроветворения, и ростовые факторы последних, продуцируемые этими же клетками либо другими, оказываются ингибиторами эритропоэза (Фрейдлин И.С., 1995; БашакЫ., ^тапр., 1991; Напёгсу 1, Мктапп V/., 1991). Появление ингибирующей эритропоэз активности плазмы крови у экспериментальных животных, начиная с первого дня опыта, доказывало очевидную правомерность таких выводов. Наибольшей способностью угнетать эригропоэз у интактным мышей - реципиентов обладала плазма, полученная от обожженных животных на 7 и 14 сутки.

Изменения в эритроне при общем облучении организма носили сложный ха-ктер и определялись несколькими факторами: 1)дозой облучения, 2) сроком блюдения, 3)регенеративными возможностями костного мозга и, в частности, итробластических островков.

Ранним проявлением влияния радиации явилось уменьшение количества ЭО состном мозге животных в первые сутки после действии доз облучения в диа-зоне 100 - 900 сГр (рис. 8). Действие меньших доз, 25 и 50 сГр, не влияло на личество ЭО в первый день, но на фоне умеренной анемизации организма на

а 7 сутки приводило к увеличение количества ЭО в костном мозге. При дейст-и доз 100 и 200 сГр на 7, 14 и 25-30 сутки число ЭО у животных превысило нтрольный уровень. При действии доз 300 и 600 сГр на 7 сутки и 600 сГр . 14 сутки число островков продолжало снижаться и восстанавливалось до нтрольного уровня лишь в конце периода наблюдений к 25 - 30 дню. Под иянием дозы 900 сГр количество ЭО в костном мозге животных снижалось > минимального уровня первого дня наблюдений- 67,4±6,0 х 103/бедро (нет на афике) против 268,3±10,4 х 103/бедро в контроле. Снижение количества мие-кариоцитов в первый день после облучения было сходно с изменениями в со-ржании ЭО, а в дальнейшем отражало регенеративный потенциал костного »зга. Определение ЭФПэо обнаружило ее снижение, независимое от дозы, в рвые и третьи сутки после облучения. К 7 суткам ЭФПэо повышалась во ех случаях, достигая контрольного уровня. Изменениям подвижности остров-в в электромагнитном поле соответствовали сдвиги в содержании кислых юкоконъюгатов в структурах ЭО.

Использованные в работе белковые препараты, церулоплазмин или БИТО, вводимые внутривенно через 30 - 60 минут и повторно через сутки после нанесения ожога или общего облучения организма крыс в дозе 750 сГр, меняли характер сдвигов в эритроне, вызванных этими повреждающими воздействиями. Так, протективный эффект церулоплазмина (15мг/крысу) особенно отчетливо проявился на 1 и 3 сутки ожоговой травмы как в отношении циркулирующих эритроцитов, так и по отношению к ЭО. У животных, получивших препарат, по сравнению с контрольной группой нелеченных животных, достоверно выше было содержание эритроцитов, гемоглобина и показатель гематокрита крови, а количество ЭО в костном мозге на первые сутки превышало показатель контрольной группы крыс на 67 тысяч/бедро (Р<0,05) и на 3 сутки - на 143 тысячи/ бедро (Р<0,05). Аналогичный защитный эффект оказывал препарат БИТО, который вводили 2 раза по 2 мл как при ожоге, так и при облучении. На первые и третьи сутки наблюдения у обожженных и леченных крыс содержание ЭО оказалось выше контрольных показателей в 1,5 раза, хотя динамика снижения количества ЭО, характерная для ожоговой травмы, сохранялась. При радиационном облучении защитный эффект БИТО в отношении ЭО костного мозга прослеживался на протяжении всего периода наблюдений, т.е. в течении 1 недели. Полученные данные доказали возможность предотвращения развития неблагоприятного для организма разрушения ЭО костного мозга при ожоговой травме и радиационном облучении с помощью применения белковых препаратов.

Характер изменений эритробластических островков костного мозга при

модуляции эритропоэтической функции центральных макрофагов.

Все примененные для стимуляции функционального состояния макрофагов модели: однократная и трехкратная иммунизация организма тимусзависимым ангигеном - эритроцитами барана, введение известных иммуномодуляторов -цистеина, унитиола, БЦЖ, преднизолона и нейтрофилокинов, демонстрировали снижение способности макрофагов ЭО поддерживать эритропоэз с первых же суток воздействия, либо на 2 или 3 день. Сопоставленные с классическими моделями стимуляции эритропоэза, эти эксперименты показали, что для усиления эритроноэтических функций макрофагам ЭО требуется повышенный уровень эритропоэтина, а тестирование in vitro выявило активацию лизосомального аппарата клеток под действием гормона. Микрофлюориметричсскис исследования подтвердили, что макрофаги ЭО отличаются от других макрофагов костного мозга наличием в цитоплазме фагоцитированного материала, сконцентрированного в лизосомах, и образуют свою популяцию. Однако результаты экспериментов с модуляцией функций макрофагов ЭО доказали, что они не являются обособленной популяцией в системе мононуклеарных фагоцитов и способны принимать участие в реакциях иммунолог ической направленности. По-видимому, данная феноменология лежит в основе известных представлений о реципрокных отношениях иммуногенеза и эритропоэза и раскрывает один из возможных механизмов развития анемий при инфекционной патологии и медикаментозном лечении ряда заболеваний.

Результаты клинических наблюдений.

У 31 больного выделение, количественный и качественный анализ ЭО кост->го мозга осуществляли с помощью оригинального метода собственной разра-пгки. На основе диагноза, с учетом особенностей клинического течения болез-1 и состояния эритропоэза были выделены 2 группы больных. В первую груп-' вошли больные,страдающие различными гематологическими заболеваниями (растеризующимися активацией эритропоэза: остеомиелофиброзом в эритре-«еской фазе, эритремией, врожденной гемолитической анемией.Вторую груп-г составили больные, также страдающие заболеваниями крови, но протекаю-ими с угнетением эритропоэза: острым малопроцентным лейкозом, хроничес-1м лимфолейкозом, хроническим миелолейкозом, миеломной болезнью. В эту с группу вошли больные, имеющие анемию на фоне хронического гепатита, в 1М числе с явлениями гиперспленизма. Из данных, приведенных в таблице 12, [едует, что отражением усиленной миелопролиферации в эритремической фа-остеомиелофиброза явились высокие величины клеточности костного мозга и »держания в нем ЭО, число которых в препаратах достигало 137. У больных с Габдица 12. Клеточность и содержание ЭО трепанобиоптатах костного мозга больных.

Заболевание (число больных) Индекс клеточности: число миелокариоцитов в мг ткани Число ЭО в препаратах

)стеомиелофиброз (4) >ритремия (7) 1 рождетгая гемолитическая анемия (2) )стрый малопроцентный лейкоз (5) фонический лимфо- и миелолейкоз (10) (торичная анемия (3) 117870 + 39588 47539 ± 10303 39364 ±16055 16400 ± 3462 75244 ±31821 57726 ± 13481 74,8 ±23,0 17,8 ±5,0 49,0 ±23,0 4,7 ±4,7 9,3± 5,9 6,3 ± 1,2

южденной гемолитической анемией число ЭО также было повышено. Признаки активации эритропоэза служило наличие среди ЭО реконструирующихся, )исутствие в "короне" ЭО от 34 до 37 ядрососодержащих клеток, указывающих 1 прохождение КОЕэ 6 последовательных делений, усиленный фагоцитоз (ер нормобластов, число которых в цитоплазме макрофагов ЭО достигало 7, 1гоцитов эритроцитов и присутствие в ядрах эригробластов и макрофагов от до 4 четко различимых ядрышек. У больных с эритремией содержание ЭО бы> в 4,2 раза меньше по сравнению с больными остеомиелофиброзом; при ка-¡ственном анализе островков у 3 из 7 больных были обнаружены классические Э, а у других - "атипичные", без центрального макрофага. Более выраженное нетение эритропоэза в ЭО отмечалось при хроническом лимфо- и миелолей-»зе, остром малопроцентном лейкозе. У 6 больных из 9 ЭО вообще не были об-(ружены в трепанобиоптатах. Морфология найденных ЭО демонстрировала ¡правильную форму клеток и их ядер, частичный плазмолиз, кариопикноз и [риорсксис. У больных с хроническим гепатитом и признаками гиперенлениз-1 содержание ЭО в костном мозге было низким с преобладанием "атипичных" тровков. Таким образом, ЭО костного мозга больных отражали состояние итропоэза в организме и имели особенности, связанные с течением болезни.

выводы

1. Эффективный эритропоэз у человека и млекопитающих протекает в эритробластических островках костного мозга Образование и функционирование эритробластических островков базируется на комплементарное™ и лиганд-рецепторном взаимодействии клеток моноцитарного ряда, эритроидных коло-ниеобразующих клеток и клеток эритроидного ряда, при этом моноцитарные элементы играют активную структурообразующую роль, занимая центральное морфологическое и функциональное положение в островках.

2. Вновь разработанные или модифицированные в лаборатории культур тканей костного мозга ЧМА методы исследования эритробластических островков костного мозга позволяют проводить их репрезентативный количественный и качественный анализ у человека и животных.

3. Количество эритроидных клеток и их качественный состав позволяют де лить эритробластические островки на классы зрелости: 1,2, 3 , инволюцирую щие и реконструирующиеся. Эритробластические островки 1 класса зрелости состоят из про-, эритробластов и базофильных нормобластов в количестве дс 8 клеток, 2 класса - из базофильных и полихроматофильных нормобластов в ко личестве от 9 до 16, 3 класса - из полихроматофильных нормобластов, окси' фильных нормоцитов и ретикулоцитов в количестве более 16;инволюцирующие островки представлены исключительно оксифильными нормоцитами и ретику-лоцитами, а реконструирующиеся островки имеют признак присоединения к ин волюцирующему островку новой эритроидной колониеобразующей клетки: наряду с оксифильными нормоцитами и ретикулоцитами в островке присутству ют про-, эритробласты и/ или базофильные нормобласты.

4. Наиболее важными характеристиками состояния эритропоэза в эритробластических островках служат число митозов, число ядросодержащих эригро идных клеток и количество ретикулоцитов в эритроидной "короне". Островки различаются между собой пролиферативным потенциалом клеток, выявляемым по включению 3Н-тимидина и по статмокинегаческому индексу.

5. По количеству и качественному составу эритробластических островков и состоянию эритропоэза в них можно рано, точно, полно и достоверно в сравнении с традиционными гематологическими методами исследования крови и костного мозга сделать вывод о состоянии эритропоэза в организме, сдвигах и нарушениях эритропоэза, перспективах их компенсации и устранения, либо, на против, об их усугублении.

6. Формирование эритроидной"короны"це1ггралышх макрофагов эритроблас тических осгровков может происходить в ходе шести, а не только пяти, как сч! талось ранее, последовательных делений эритроидной колониеобразующей клетки, что приводит к образованию в итоге 64 ретикулоцигов/эригроцито! Прямым доказательством этому служит присутствие среди островков особо* группы - "суперостровков" - с числом ядросодержащих клеток более 32, наход! щихся на одной стадии развития.

7. Эритробластические островки распределены в костном мозге трубчатых >стей животных неравномерно: в осевом компартменте вокруг центрального шуса преобладают инволюцирующие островки, а в корковом - островки 1, 2, классов зрелости и реконструирующиеся, что подтверждает наличие особой якроархитектоншси костного мозга с выделением функциональных зон генера-т (корковая) и созревания (осевая) гемопоэтических клеток.

8. Во время раннего постнатального развития на фоне затухания эритропоэза печени и селезенке новорожденных животных только функционирование штробластических островков костного мозга обеспечивает потребности расту-,его организма в необходимом числе эритроцитов. Становление гемопоэтичес-)й функции костного мозга животных наблюдается в первые 7 дней постна-шьного развития через последовательно сменяющие друг друга стадии недиф-гренцируемых гемопоэтических островков в первые сутки и смешанных гемо-отических островков на третьи сутки. Окончательное формирование эритро->эза в ЭО происходит к концу первого месяца жизни животного.

9. На интенсивный эритропоэз в эритробластических островках у молодых ивотных в сравнении со взрослыми указывает высокое содержание островков класса зрелости и низкое содержание инволюцирующих островков. У крысят личительной особенностью островков 3 класса зрелости, реконструирующих-

1 и инволюцирующих является сниженное в 2 раза количество ретикулоцитов, »идетельствующее об их ускоренном выходе из эритроидной "короны" и формовании депо ретикулоцитов в костном мозге.

10. Стимуляция эритропоэза в организме сопровождается увеличением в кос-юм мозге абсолютного количества эритробластических островков, островков

2 классов зрелости и реконструирующихся с одновременным уменьшением шичества инволюцирующих островков. Отражением стимуляции эритропоэза островках служит повышение функциональной активности центральных мак-)фагов, числа митозов и количества эритровдных клеток на ранних сроках 1блюдсния и числа ретикулоцитов на поздних сроках. Ингибиция эритропоэза организме сопровождается снижением в костном мозге абсолютного количес-.а эритробластических островков, островков 1, 2 классов зрелости и реконстру-)ующихся с одновременным увеличением количества островков 3 класса и ин-(люцирующих.

11. На модели острой кровопотери раскрыта цепь взаимосвязанных событий, 1влскающих эритробластические островки в компенсаторный эритропоэз: по-.ппение титра эритропоэтина и КСФ-ГМ в первые сутки стимулирует проливанию чувствителыгах к ним колониеобразующих клеток, активирует макроимя и приводит в последующем к повышению абсолютного количества эритро-[астических островков в костном мозге. Па ранних сроках кровопотери повы-ена комплементарность остронков с лимфоидными элементами, а на поздних оках - с эозинофильными.

12. Отражением прямого специфического стимулирующего действия эритро-»этина на эритропоэз в островках при его введении полицигемичным живот-

ным является на ранних сроках увеличение абсолютного числа островков в костном мозге, повышение числа ДНК- синтезирующих клеток, усиление пролиферации и увеличение количества ядросодержащих эритроидных клеток в островках разных классов зрелости, а на 2 - 3 сутки - повышение количес тва ретикулоцигов. Центральные макрофаги эритробластических островко! обладают чувствительностью к эригропоэтину, который способен быстро изменять их функциональное состояние.

13. Действие возмущающих либо повреждающих факторов ведетксниже нию комплементарное™ клеток эритробластических островков, нарушению нормальных взаимоотношений клеток монощггарного и эритроидного ряда i их разобщению с увеличением количества "атипичных" островков - без цент ральных макрофагов,и числа эритроидных клеток вне островков, с нарастание\ объема внеостровкового эритропоэза уже с первых часов воздействия на фон« изменения состояния лизосомально-пластинчатого комплекса центральных мак рофагов. Участие лизосомального аппарата в диссоциации клеток островков доказывается моделированием in vitro ферментативного гидролиза межклеточ ного матрикса, приводящего к распаду эритробластических островков. Протекторный эффект в отношении эритробластических островков при фенилгид разиновой анемии, термическом ожоге, общем радиационном облучении организма оказывают контр икал, церулоплазмин и БИТО.

14. Проявлением повреждающего действия однократного общего радиацион ного облучения (100 - 900 сГр) является уменьшение количества эритробластических островков в костном мозге и независимое от дозы снижение их элект рофоретической подвижности в первые 3 суток воздействия. Повреждающий эффект радиации в отношении островков обратим, сроки восстановления показателей эритрона определяются объемом сохраненного островкового эритропоэза.

15. Иммуномодуляторы, нейтрофшюкины, антигенная нагрузка изменяют гемопоэтическую функцию центральных макрофагов эритробластических островков и демонстрируют, что данная популяция макрофаг ов является функционально зависимой частью системы монопуклеарных фагоцитов.

16. Эритробластическис островки костного мозга человека отражают сохраи ность или отклонения от правильной организации эритропоэза у больного. 1 Ipi усилении эритропоэза в ткани костного мозга отмечено высокое количеств! эритробластичсских островков, нарастание среди них островков 1 класса зре лости и реконструирующихся. Напротив, при сниженной интенсивности эритропоэза отмечено низкое количество эритробластических островков, преоблада ние среди них ннволюцнрующих и "атипичных". При лейкозах патологический клон клеток вытесняет эритробластические островки из гемопоэтического прос транства костного мозга.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Захаров Ю.М., Мельников И.Ю., Рассохин А.Г. Исследование эритропоэза щифицированным методом выделения эритробластических островков костно-мозга // Гематология и трансфузиология.- 1984,- Т.29, № 4,- С.52 - 54.

2. Рассохин А.Г., Мельников И.Ю. Центрифужная камера для осаждения и нссирования эритробластических островков костного мозга // Лаб. дело.-»85.- № 2,- С.77 - 78.

3. Рассохин А.Г. Регенерация красной крови как показатель адаптированнос-[ организма к тепловому фактору// Актуальные вопросы теоретической и инической медицины: Тез. докл. конф,- Тюмень, 1985.- С. 19.

4. Долгушин И.И., Крашенинникова Е.А., Рассохин А.Г, Изменение функци-[альной активности фагоцитов крови и некоторых параметров гемопоэза под иянием продуктов активированных нейтрофилов // Кроветворные клетки -1едшественники в механизмах повреждения и компенсации системы крови »и действии на организм экстремальных факторов: Тез. докл. к симпоз.-¡лябинск, 1986,- С. 18-19.

5. Захаров Ю.М., Мельников И.Ю., Рассохин А.Г. Классификация эритро-астических островков костного мозга с учетом эволюционных изменений их еточного состава // Там же,- С.20 - 21.

6. Рассохин А.Г., Рассохина Л.М. Модуляция гемопоэтической функции жрофагов эритробластических островков костного мозга // Там же.-23-24.

7. Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., Марков P.M., Мельников И.Ю, Значение »рфо-функционалыюй перестройки центральных макрофагов эритробласти-ских островков в становлении процессов адаптации // Механизмы физиоло-ческих функций: Тез. докл. к I съезду физиологов Уральского региона. -К 1986,- С.51-53.

8. Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., Синицын П.Д., Волкова В.П. Новый метод следования эритробластических островков человека // Второй Всероссийский езд гематологов и трансфузиологов: Тез. докл.- Челябинск, 1986,- С.240 - 241.

9. Синицын П.Д., Волкова В.П., Захаров Ю.М., Рассохин А.Г. Изменения нгробластических островков в оценке состояния эритропоэза у больных с зличной патологией системы крови // Там же.- С.241 - 242.

10. Рассохин А.Г., Захаров Ю.М., Синицын П.Д., Волкова В.П. Некоторые уфологические особенности эритробластических островков костного мозга патологических больных // Там же,- С. 243.

11. Рассохин А.Г.,Захаров Ю.М. Механизмы конкурентных взаимоотношений итропоэза и иммуногенеза //Факторы клеточного и гуморального иммунитета и различных физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. к VITI жинститут. науч. конф,-Челябинск, 1986.-С. 129-130.

12. Рассохин А.Г., Мельников И.Ю. Гуморалыю - клеточные механизмы аптации эритрона при тепловых воздействиях // I Республиканская конфе-

ренция "Молекулярные и клеточные механизмы адаптации в норме и патологии": Сб. науч. тр.-М., 1986.- С. 107-109.-Дел. в ВИНИТИ № 7223 - В86.

13. Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., СиницынП.Д., Волкова В.П. Метод выделения эритробластических островков из костного мозга человека // Лаб. дело.- 1988,-№ 5,- С.20- 21.

14. Рассохин А.Г., Захаров ГО.М. Микрофлюориметрия макрофагов и эритробластических островков костного мозга // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. к IX межинститут, науч. конф,-Челябинск, 1988.- С. 105.

15. Рассохин А.Г.Комплементарность клеток в эритробластических островка) костного мозга и ее механизмы // Патология дыхания, крови и регулирующих систем организма и принципы коррекции нарушений: Тез. докл. конф,- Ижевск,

1989,- С.90-91.

16. Рассохин А.Г., Крашенинникова Е.А. Методические подходы к изучение функционального состояния макрофагов эритробластических островков костного мозга / Ред. журн. "Лаб. дело",- М„ 1988,- 13 е.- Деп. в ВИНИТИ 01.12.88, № В -8467.

17. Рассохин А.Г. Ранняя реакция эритробластических островков костного мозга на возмущающие воздействия // Нарушения механизмов регуляции и их коррекция: Тез. докл.IV Всесоюз.съезда патофизиологов.-М., 1989.-Т.З,- С. 1266

18. Рассохин А.Г., Захаров Ю.М., Синицын П.Д., Волкова В.П. Морфология эритробластических островков костного мозга гематологических больных// Арх. патологии,- 1989.- № 9.- С.61 - 67.

19. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Захаров Ю.М., Захарова О.Ю., Рассохин А.Г Шахов В.П. Методы выделения гемопоэтических островков костного мозга // Гематология и трансфузиология,- 1990.- Т.35, № 3.-С.20 - 22.

20. Захаров Ю.М., Мельников И.Ю., Рассохин А.Г. Классификация эритробластических островков костного мозга с учетом изменений их клеточного состава // Арх. анатомии, гистологии и эмбриологии,- 1990.- № 5,- С.38 - 42.

21. Крестъянинова О.Г., Рассохин А.Г.06 участии макрофагов костного мозг в изменении гемопоэза при ожоге и облучении организма в эксперименте // Факторы клеточного и гуморального иммунитета при физиологических и патологических состояниях: Тез. докл. к X межинститут, науч. конф. - Челябинск,

1990,- С.75 - 76.

22. Рассохин А.Г. О влиянии эритропоэтипа па состояние эритропоэза в эритробластических островках костного мозга при полицитемии // Физиологические механизмы адаптации человека и животных: Тез. докл. 2-го съезда физиологов Уральского региона. - Свердловск, 1990.-С.29 - 31.

23. Рассохин А.Г., Крестьянинова О.Г., КругловД.Г., Ефименко Г.11., Починский А.Г. Некоторые механизмы адаптивной перестройки эритропоэза при термическом воздействии // Там же . - С.31 - 32.

24. Рассохин А.1'., Крестьянинова О.Г., Захаров Ю.М. Методы оценки функционального состояния макрофагов и эритропоэза в эритробластических

стровках // Матер, конф. по итогам науч. исследований в XII пятилетке/ Челяб. [ед. ин-т. - Челябинск, 1990,- С.87 - 89.

25. Рассохин А.Г.., Крестьянинова О.Г. Эритробластические островки кост-ого мозга линейных и беспородных крыс в биологической характеристике ритрона // Лабораторные животные для медико-биологических и биотехноло-ических исследований: Тез. конф. - Москва, 1990,- С.29.

26. Yu.M. Zakharov, A.G. Rassokin, I.Yu.Melnikov, A.V.Korobkin, L.V.Vorgova Jew Techique of Study of Erythropoiesis // Comptes rendus. Reunion commune, association des physiologistes.- Praha, 1990,- P. 182.

27.3ахаров Ю.М., Рассохин А.Г., Крестьянинова О.Г.Об участии макрофагов ритробластических островков в реализации эффектов эритропоэтина // Систем-:ые и клеточные механизмы адаптации организма к действию повреждающих »акторов: Тез. докл. конф. патофизиологов Урала.-Челябинск, 1991.-С. 45- 46.

28. Рассохин А.Г. Значение микрофлюориметрического исследования эритро-ластических островков и макрофагов костного мозга в оценке состояния эрит-опоэза // Там же,- С.60 -61.

29. Рассохин А.Г., Крестьянинова О.Г., Починский А.Г., Иванов В.В., 1орытный B.C. Реакция эритроидной ткани на действие ионизирующего излу-ения в эксперименте // Там же,- С. 142 - 144.

30. Рассохин А.Г., Захаров Ю.М., Крестьянинова О.Г., КругловД.Г., 1отаповП.Ю. О некоторых механизмах комплементарности клеток в эритро-ластических островках костного мозга // Физиол. журн. СССР им. И.И. Сече-ова .- 1991.- Т.77, №1.-С.62-67.

31. Гольдберг А.Д., ДыгайА.М., Захаров Ю.М., Захарова О.Ю., Рассохин 1.Г., Шахов В.П. К вопросу о специфичности механизмов регуляции крове-ворения при различных экстремальных воздействиях // Патол. физиология и ксперим. терапия,-1991.-№ 3,- С.7 -10.

32. Рассохин А.Г., Починский А.Г., Попов Г.К., Захаров Ю.М. Эритро-ластические островки костного мозга при ожоге // Там же.- С.25 - 27.

33. Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., Крестьянинова О.Г., ЕфименкоГ.П.

) роли макрофагов костного мозга в регуляции эритропоэза при различных остояниях эритрона //Там же.- С.36 -38.

34. Zakharov Yu. M., Rassokhin A.G., Melnikov 1.Yu. et al. In different erythron Mictional states // Constituent Congress 1 International Soviety of Patophysiology.-ioscow, 1991.-P.133.

35. Рассохин А.Г., Рассохина JIM. Эритробластические осгровки костного ;озга в диагностике поражения плацдарма нормального кроветворения при гмобластозах // III Всесоюзный съезд гематологов и трансфузиологов: Тез. отел. - М., 1991. -Т.1. -С. 168- 169.

36. Пушкарев В.П., Захаров Ю.М., Рассохин А.Г. Об изменении эритропоэза эритробласгических островках костного мозга крыс после однократной крово-отери// Физиол. журн. СССР im. И.И. Сеченова,- 1991,- Т. 77, №4. - С.16-23.

37. Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., Мельников И.Ю. Количественная и качест-

венная оценка эритропоэза с помощью определения эритробластических островков костного мозга // Информационное письмо.- Челябинск, 1991 .-18 с.

38. Рассохин А.Г., Починский А.Г., Лянной К.В., Овчинников Г.А. Микро-флюориметрическое исследование эритробластических островков и макрофалн костного мозга//Бюл. эксперим. биологии и медицины,- 1992,-Т. 114, № 10.-С.347 - 351.

39. Kalaidjíeva V., Zakharov Yu.M., Rassokhin A.Q. Humoral and Short Cell-Cel Interaction In the Regulation of Erythropoiesis // 32 Congress of the International Union of the Physiological Sciences.- Glasgow, 1993,- P. 100.

40. Kayumova A.F., Kamilov F.Kh., Zakharov Yu.M., Rassokhin A.G. Effect of Dioxin Derivatives on Erythropoiesis in Erythroblastic Islands of Bone Marrow //14 International Symposium on Chlorinated Dioxins, Japan.-Kyoto.-1994.- V.21.-P.291.

41. Корнилова H.B., Захаров Ю.М., Рассохин А.Г. О возможной роли гликозаминогликанов в поддержании эритропоэза в эритробластических островках костного мозга // Физиол. журн. СССР им. И.М. Сеченова.- 1994.-Т.80, № 3. - С. 83-87.

42. Захаров Ю.М., Рассохин А.Г., КалайджиеваВ., Каюмова А.Ф. Новые методические приемы оценки состояния эритропоэза с помощью изучения эритробластических островков костного мозга // Актуальные вопросы гематол* гии и трансфузиолопш: Тез. докл. Ш-го Всероссийского съезда гематологов и трансфузиологов. - Санкт-Петербург, 1996,- С. 13.

43. Рассохин А.Г. Становление гемопоэтической функции эритробластических островков в раннем постнатальном периоде // Там же.-С. 15.

44. Рассохин А.Г., КалайджиеваВ., Каюмова А.Ф., Мельников И.Ю., Заха ров Ю.М. Новые подходы к оценке эритропоэза с помощью изучения эритро бластических островков костного мозга человека и животных // Новые технолс гии в медицине:Тр. науч. конф. - Трехгорный, 1996.- С.93 - 95.

45. Каюмова А.Ф., Рассохин А.Г., Захаров Ю.М. О резервных возможностях костного мозга у крыс, подвергнутых интоксикации аминной солью 2,4-ДА И Научный вестник Тюменского государственного университета: Сб. статей, сер. "Биология". - Тюмень, 1996. -T.I, № 1. - С.61 - 67.

46. Рассохин А.Г., Мельников И.Ю., Круглое Д.Г. Механизмы компенсатор но - приспособительных реакций кроветворной системы на однократную крово потерю различного объема // Механизмы адаптации организма: Матер, конф. -Томск, 1996.-С.36-38.

47. Калайджиева В., Рассохин А.Г., Захаров Ю.М. Проследяване на еритро-поетичния отговор на организма след еднократна крывозагуба у пльхове // Болгарска медицина,- 1996,- Т. IV, бр. 1-2. - С. 42 - 45.

48. Каюмова А.Ф., Рассохин А.Г., Захаров Ю.М. О патогенезе анемии, вызванной интоксикацией экспериментальных животных гербицидом 2,4 - ДА // Научный вестник Тюменского государственного университета: Сб. статей, сер. "Биология". - Тюмень, 1997.-Т.2, № 1. - с.73 - 78.

ормативные количественно - качественные характеристики эритробласти-ческих островков и эритропооза в них, сводные данные шггактных крыс 1. Абсолютное число ЭО в костном мозге бедренных костей крысят.

Возраст ЭО, х103/бедро

1 день не определяются

3 день 7,2 ±2,0

7 день 43,3±3,8

10 день 68,6+5,9

15 день 92,6±4,7

30 день 339,0±36,1

2. Количество ЭО в костном мозге у разных лабораторных крыс.

Линии животных Размах колебаннй.хЮ'/бедро ЭО, хЮ'/бедро Беспородные самки 82 -33 234+39

Вистар самки 240 - 410 323+14

Августсамки 150-300 221+17

Беспородные самцы 280 - 460 375+28

Вистар самцы 317-440 377±12

Зона костного мозга ЭО 1 ЭО 2 ЭОЗ ЭОрек ЭО инв

Центральная 1,6+0,3 10,6±1,2 11,6±1,2 14,0±1,1 62,2±2,6

Териферическая 3,4+0,2* 19,2±1,9* 27,2±3,7* 25,6+2,9* 24,6+4,7*

4. Характеристики эритроидной "короны" ЭО разных классов зрелости

Токазатель Э01 ЭО 2 ЭОЗ ЭОрек ЭОинв

лдекс метки 3Н-тимидин), % 42,0+3,2 9,6±0,7 1,7±0,4 31,8±2,3 0

татмокинетический ндекс- (С-митозы, % 25,3+2,5 6,5+0,4 4,5±0,5 14,2±1,3 0

'итотический вдекс, % 2,2+0,3 0,б±0,2 0,2+0,1 2,0±0,3 0

ритроидные клетки,п 5,2+0,14 12,2±0,06 20,1±0,10 8,3+0,09 6,8±0,23

гтикулоциты.п 0 0 4,2+0,3 5,2±0,3 5,5±0,3

люоресценция Е530 0,64+0,06 0,41±0,01 0,39±0,04 0,60±0,03 0,45±0,01

5. Морфо-функциональные характеристики макрофагов ЭО

Э01 ЭО 2 ЭОЗ ЭО рек

Число лщосом-ЕИ0 1,72+0,19 2,32+0,09 3,49±0,29 1,76±0,08 . рН лизосом,среднее,ед. 4,12±0,01

Активность кислой фосфатазы, усл.ед. 7,10±0,01

Активность неспецифической эстеразы,усл.ед. 8,40+0,03 . НСТ-тест, усл.ед. 1,00+0,03

Нейтральные глюкоконъюгаты, усл.ед. 3,30+0,01

Кислые глюкоконъюгаты, усл. ед. 16,0+0,5

ЭФП эо, мкм х см х с"1 х В"' 1,30+0,01

6. Соотношение островкового и внеостровкового эритрошша

. Среднее число ядросодержащих клеток на I ЭО от 70,3± 1,2 до73,7±1,1 Среднее число ядросодержащих клеток вне ЭО/1ЭО от 6,3±1,2 до 9,7±1,1 .Объем внеостровкового эритролоэза, % от 8,7+1,5 до 12,9+1,4

ЭО инв 1,55±0,04

Микрофотографии эритробластических островков

1 — ЭО 1 класса зрелости крысы.

2 — ЭО 1 класса зрелости человека, эритремия.

3 — Суперостровок, число нормобластов — 34, остеомиелофиброз,

эритремическая фаза.

4 — Реконструирующийся ЭО, гемолитическая анемия.

5 — Атипичный ЭО, хронический гепатит.

6 — Смешанный островок, крысята 3-х дневного возраста.

7 — Крупные фаголизосомы в цитоплазме центрального макрофага Э<

при фенилгидразиновой анемии.

8 — Активация лизосомально—пластинчатого комплекса центральног

макрофага ЭО через 30 минут после инкубации с эритропоэтино!