Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Кинетические характеристики эритропоэза в эритробластических островках костного мозга

МИННСШ'СПК) ЗДРЛИООХРЛИЕННЯ российской ФЕДЕРАЦИИ ЧЕЛЯБИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

МЕДЯИИК Борис Пикторович

КИНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭРИТРОПОЭЗА В ЭРИТЮГкЛЛСГИЧЕСКИХ ОСТРОВКАХ КОСТНОГО МОЗГА

14.(Х).16. - патологическая фитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Челябинск, 1ЭДЗ

Работа выполнена в Челябинском государственном медицинском институте

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ»: доктор медицинских наук, член-корреспондент АЕН РФ, профессор КХМ ЗАХАРОВ

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор С.Н.ТЕПЛ ОВА; доктор медицинских наук, профессор Б.Г.ЮЩКОВ

ВЕДУЩЕЕ УЧ РЕЖД ЕН И Е:

Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови, г.Санкт-Петербург

Защита состоится «_»_1993 г. в часов на заседание специализированного совета К 084Л4.02 при Челябинском государственном медицинском институте (адрес: 454042, Челябинск, Воровского 64) . .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинского медицинского института.

Автореферат разослан «_:_» _1-1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета.

доктор мед. наук

Л .В.КРИ ВОХ ИЖИ НА

Актуальность проблемы. Эффективность диагностики и лечения ■ематопогмческих заболеваний прямо зависит от достижений фундаментальных исследований в области кроветворения Одним из. направлений таких исследований является изучение красного кровяного юстка. В настоящее время установлено, что эритропоэз у млекопита-ощих протекает в эритробластических островках (ЭО) костного мозга Бесси М.,1967; ВевБ'к М. и др.1978). Уточнены их количественные тараметры в> единице массы гемопоэтической ткани у здоровых людей и животных, разработана формула эритробластических остров-(ов, позволяющая оценивать движение волны амплификации и соз-зевания эритробпастов в ЭО, а также описаны изменения этих параметров при стимуляции эритропоэза и его угнетении в эксперименте 1 при гематологических заболеваниях у человека (Захаров Ю.М, 19913а-иров Ю.М, Мельников ИЮ., 1987; Воргова Л В, Захаров Ю.М., 1990, эассохин АГ, 1990). Вместе с тем. остаются не изученными механизмы реконструкции эритропоэза в ЭО. влияние на эти процессы эрит- ' хэидной «короны» ЭО, отсутствуют оценки неэффективного эритро-юэза и ускоренного (терминального) эритропоэза, эффективного эрит-' юпоэза в ЭО как в норме, так и при различных экспериментальных :остояниях у животных Между тем, возможность оценки эффектив-юго и неэффективного эритропоэза, знание закономерностей его ре-юнструкции в ЭО в норме, условиях эри'тропоэтического стресса, при «генерации эритропоэза после кроволотери или на фоне экспериментальной депрессии эритропоэза во многом бы обогатила сущест-. ¡ующие представления об этих важнейших составляющих эритропо->за. способствовало расширению базы диагностических возможности при расшифровке патогенеза различных анемий.

Цель исследования. Избить состояние эффективного и неэффективного эритропоэза и условия его реконструкций в зритроблзс-■ических островках костного "мозга в норме и при экспериментальных состояниях.

Здпачи исследования.

1. Оценить в эритробластических островках эффективный эритро-поэз по уровню пропиферативной активности, л .статмокинетическому индексу.

2. Оценить зависимость реконструкции эритропоэза в эритроблзстических островках от эритроидного состава их «короны».

3. Определить величину неэффективного эритропоэза в эритроблзстических островках по подсчету: количества ШИК-лоложительных клеток в «короне» эритробластических . островков.

4. Оцейить насыщенность гемоглобином ретикулоцитов «короны» эритробластических островков и периферической крови путем определения их сухой массы в различные сроки эритропоэтического стресса.

5. Исследовать морфофункциональные характеристики, формулу и содержание эритробластических островков у эксперйментальных животных после введения эритропоэтина и после кровопотери.

Научная новизна. Впервые доказано, что реконструкция эритро п'оэза в ЭО может осуществляться как на базе инволюцирующих ЭО, тай и ЭО 3-го класса, что значительно увеличивает эритроидный «плацдарм» костного, мозга при эритропоотическом стрессе Впервые псказано, что. важным. условием для реконструкции эритропоэза в ЭО является уменьшение содержания- в их «короне» макроретикулоци-тов. Показано, что снижение, доли неэффективного эритропоэза в костном мозге под влиянием эритропоэтина и ее увеличение при кровопотере также характерно и для эритропоэза в-ЭО костного мозга.

Теоретическое значение работы. Исследование выявило новьм ранее не известные фундаментальные закономерности в формировании компенсационного эритропоэза с участием ЭО костного мозга. Показано," что участие эритролоэтически активных макрофагов кост--,кдго мезга значительно ускоряет увеличение массы эритроидной ткани

в костном мозла

- Апробация работы. Материалы диссертации доложены на - конференции молодых ученых Челябинского медицинского института «Актуальные вопросы теоретической и практической медицины» в 1993 г, на расширенном заседании кафедр патологической физиологии и нормальной физиологии Челябинского медицинского института в 1993 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 2 работы.

Положения, выносимые на защиту

1. Зависимость реконструкции эритропоэза от эритроидного состава «короны» 30.

2 Состояние эффективного и неэффективного эритропоэза в «короне» ЭО при различных состояниях системы эритрона.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на страни-

цах машинописи, иллюстрирована таблицами и рисунками. Состоит из введения, обзора литературы, описания материалов, моделей и методов исследования, изложения результатов собственных исследований с обсуждением в 2-х главах, заключения и выводов .Список цитируемой литературы состоит из 227 названий, из них 151 иностранных

МАТЕРИАЛЫ, МОДЕЛИ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена на 495 лабораторных белых беспородных крысах-самках весом от 90 до 350 г. В качестве модели для угнетения эритропоэза выбрана, поспрзнсфузионная полицитемия. которая достигалась однократным • внутрибрюшинным ; введением эритроцитар-ной взвеси 7% от массы тела' Состояние стимулированного эритропоэза моделировалось путем однократного введения эритропоэтинсо-держащей плазмы полицитемичным животным, по 2 ЕД/100 г массы. Плазма получена из крови крыс анемизированных фенилгидразином и облучением (Взнер 3 и яр, 1984) и откалибрована на содержание эритрспоэтана (Гуцим ВЦ 1982: ErsJev AJ, 1986)'- по стандарту, по-.

лученному их мочи больных с эгоистической анемией в лаборатории Терри фокса (Ванконвер). Другой моделью активированного эритро-лоэза служила постгеморрагическая анемия; которая составляла 2% от массы тела. Показатели периферической крови: гематокрит (%). содержание ретикулоцитов (%0) с оценкой их по стадиям зрелости (%) определялись по общепринятым методикам (Абрамов М.Г., 1985 ). Уровень гемоглобинизации эритроцитов (пг) определялся методом интерферометрии (Гольдберг ЕД и др.. 1983). Исследование количества ЭО костного мозга проводилось подсчетом их содержания в бедренных костях (Захаров Ю.М. и др., 1984). Получение клеточных препаратов проводилось с использованием приемов цитоцентрифу-гирования (Рассохин АГ. и др, 1985). 30 классифицировались по классам зрелости (Захаров ЮМ. и др, 1990) с выделением ЭО 12.3 классов, ЭО инволюцирующих и ЭО реконструирующихся. Анализ изменений в качественном составе ЭО дополняли расчетные коэффициенты, включающие «Показатель вовлечения КОЕ-Э в эритроид-ную дйфференцировку», «Показатель повторного вовлечения центрального макрофага ЭО в эритропоэз» и «Показатель созревания» (Воргава Л.В.,Захаров ЮМ, 1990). Содержание гемоглобина ретику-лоцитами инволюцирующих и реконструирующихся ЭО (отн.ед.) определялось на окрашенных бензидином препаратах (реакция • 1ереИ-пе) (Хейхоу Ф-ХДж, Кваглино Д, 1983). Уровень пролиферативной активности эритробластов оценивался по статмокинетическому индексу (А$1акй, 1960). Гликоген исследовался в эритроидных клетках •«короны» ЭО по Мак-Манусу (1946)

Данные обрабатывались методом вариационной статистики. Достоверности различий между группами определялись -с помощью Т-критерия Стьюдента. Различия считались достоверными при р<0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние эритропоэтинсодвржащей плазмы на эритропозз в ЭО. костного мозга погшцитемичных животных Проведено исследование изменения содержания и состава ЭО в

костном мозге попицитемичных крыс в ответ на однократное подкожное введение эритролоэтинсодержащей плазмы в количестве 2 ЕД/100 г веса тела. Показатели эритрона исследовались через 12, 24. 36, 48 и 72 часа после' введения плазмы. У контрольных животных -полицитемичных крыс, которым вводился физиологический раствор в том же объеме, что и эритропоэтинактивная плазма, костный мозг исследовался на 24 и 48 часы после введения раствора. Воспроизведение посттрэнсфузионной полицитемии на 6-е" сутки приводило к почти полному • исчезновению ретикулоцитов из периферической крови, закономерному повышению гематокрита и уменьшению количества ЭО в костном мозге, которое сопровождалось характерными изменениями в формуле ЭО. которые проявлялись в уменьшении количества ЭО 1. 2, 3 и реконструирующегося классов за счет увеличения доли инволюцирующих ЭО.

Введение эритропоэтинактивной плазмы полицитемичным крысам приводило к ретикулоцитозу и массовому появлению в периферической крови макроретикулоцитов с повышенным содержанием гемоглобина с Зб-го часа исследования. Наибольшее увеличение уровня ретикулоцитов (40.6+6,0%о) и гемоглобина в эритроцитах (17,7+0,37 лг) от контроля (3,2+1,6% о и 11.4±0,5 пг) соответствовало 72-му часу наблюдений. Единичные макроретикулоциты регистрировались уже с 24-го часа эксперимента.'

Факт увеличения количества ретикулоцитов в периферической крови в ответ на эритропоэтиновый стимул является закономерной реакцией костномозгового кроветворения на воздействие гормона (Моисеева О.И., 1985; Гудим 8И, 1982; Ве5Я5 М. и др„ 1978). Появление в периферической крови макроретикулоцитов также является известным компонентом эритропоэтичёского стресса (Вез^э М.,Вгес-кег &, 1975; и^Ьа 1962) и объясняется подключением механизмов «терминального» (ускоренного) эритропоэза В качестве другого механизма образования макроретикулоцитов можно предположить

участие в их продукции особой популяции эритроидных клеток, что не исключается и другими исследователями (Вэрыпаева ПЛ.. 1985"; Захаров КМ, 1986; Рябов СИ, Шостка ГД, 1973)

• . Показатель гематокрита претерпел достоверное падение только на 72-й час исследования (58,6+2,5%) по сравнению с контролем (66,5±3,0%), что согласуется с данными, полученными ранее в нашей лаборатории (Мельников И.Ю., 1987).

Введение зритропоэтинактивной плазмы полицитемичным крысам резко активировало эритропоэз в ЭО. Через 36 часов после ее инъекции количество 30 на бедренную кость увеличивалось в 1.5 раза против контроля (р<0,05) и на 48-72 часы исследования продолжало оставаться недостоверно выше контрольных значений (табл.1). Такие результаты совпадают с предыдущими исследованиями (Мельников И.Ю., 1987) и объясняются сохранением в костном мозге поли-цитемичных животных популяции макрофагов (Рассохин АГ., 1990), способных к формированию новых ЭО под влиянием эритропоэтина.

Увеличение числа ЭО в бедренной кости в ответ на стимуляцию эритропоэзэ сопровождалось перераспределением ЭО по классам 'зрелости' (табл.1). На 12-24 часы эксперимента произошло закономерное увеличение числа реконструирующихся ЭО (ЭО рек) Одновременно выросли значения «Показателя вовлечения КОЕ-Э в дифференциацию в ЭО» (контроль . - .59,4(^7.68) и «Показателя повторного вовлечения макрофагов ЭО . в эритропоэз» (контроль - 0,26+0,03) и к 24-му часу исследования их величины составили 108,40+9.80 и • 0.77+0,02 соответственно (р<0,05). Субстратом для - образования ЭО рек., вероятно, послужили инволюцирующие островки(ЭО инв.), чис-леность которых уменьшалась синхронно росту количества ЭОрек. К 24-му часу после введения эритропоэтина произошло увеличение числа ЭО 3-го класса Пополнение состава этих X к 24-му часу исследований было синхронизировано лишь с увеличением абсолютного содержания. ЭОрек,-но не , было связано ни с опережающим, ни с

Таблица 3 А^- У^///1

Абсолютное количество 30 и их распределение по классам зрелости поело 2% кровопотери (М )

{ эо.га3 | Э01'Ю3 [ эо2.ю3 [ ЭОд.ГО3 |э0инв.*103 |Э0рек.»Ю3

Контроль <>?шЗ) 250,00^26,21 10,02^1,01 5,00±2,51 10,01+2,53 168,75±13,75 56,25+6,75

Опыт,12 чао (//» 3) 233,32^20,44 4,66±2,52 4,08±2,60 ?,00±3,1в 156,00*7,80 60,49^11,43

Опыт, 24 чао (/г- б) 186,74±25,22 2,9941,27® 3,36+1,09 8,59+3,27 Ю2,40£6,86* 66,61^5,79

Опыт, 36 чао -(>/*» 5) 257,33+24,23 24,70±3,51я 8,22+2,97 7,71±1,41 147,51±7,02 68,88±5,94

Опыт, 48 час (//- 5) 286,24±33,14 7,15+2,98 7,15*1,85 П,44±4,81 163,02^6,50 97,24+4,21*

Опыт, 72 чао 409,35±46,43 14,32±6,36 16,36+4,92* 22,49±5,52* 226,99±24,79?е 128,36±Ю,70Х " 5) • ■ •

параллельным ростом содержания ЭО 1-го и 2-го классов Возникает предположение, что увеличение ЭО 3-го класса на 24-й ' час после введения эритропоэтина связано с их образованием из числа ЭО рек В пользу этого вывода указывает способность эритропоэтина ускорять процессы созревания эритробластов почти в 2 раза (Козинец Г.И. и др, 1963; Hanna I.R и др., 1969) против физиологических условий. Увеличение количества ЭО инв к 36-му часу исследований с одновременным падением численности ЭО 3-го класса, вероятно, завершило волну амплификации: ЭО инв.-> ЭО рек~> ЭО 3-го класса.

К 36-му часу с момента активации эритропоэза. на фоне продолжения роста численности ЭО рек. и высоких значений «Показателя повторного вовлечения макрофагов в эритропозз» (0,67+0,03, р<0,05) происходило резкое увеличение абсолютного количества ЭО 1-го и 2-го классов и «Показателя вовлечения КОЕ-Э в эрит-роидную дифференцировку» (171,68±7,30,р<0,05). К 48-му часу следовал подъем численности ЭО 3-го класса, что. на наш взгляд, завершило прохождение волны амплификации эритробластов, начавшейся от сформировавшихся под влиянием эритропоэтина ЭО 1-го класса путем вовлечения в эритропозз макрофагов костного мозга, способных играть роль центральной клетки в ЭО. Данное предположение подтверждается фактом увеличения абсолютного количества ЭО в бедренной косш начиная с 24-го часа после активации эритропоэза, что, в свою очередь, и способствовало резкому. подъему численности ЭО 1-го и 2-го классов зрелости к 36-му часу эксперимента. Такое течение событий наводит на мысль, что под влиянием эритропоэтина новые волны деления эритробластов образуются .как в «короне» ЭО рек,'так и в «короне» впервые вовлекаемых в эритропозз. макрофагов костного мозга, что подтверждается достоверным увеличением абсолютного количества ЭО в бедренной кости к 36-му часу эксперимента

К 72-му часу с момента стимуляции эритропоэза пул ЭО инв. продолжал увеличиваться на фоне снижения количества ЭО 1-го, 2-го и 3-го классов, которые созревая, пополняли состав ЭО инв Численность же ЭО рек. и к- 72-му часу не отличалась от уровня, отмеченного к исходу 2-х суток после введения зритропоэтина, о чем свидетельствуют высокие значения «Показателя вовлечения КОЕ-Э в эритроидную дифференцировку» (102,99±1,36,р<0,05). Это наблюдение может быть интерпретировано 8 свете данных (Захаров Ю.М., 1989; Zakharov Y., Prenant M., 1983), указывающих на повышение аффинитета макрофагов ЭО к эритроидным клеткам, возможно, в силу способности центрального макрофага ЭО аккумулировать эрит-ропоэтин или усиливать его образование при стимуляции эритропоэза В этом случае становится понятным продолжающееся формирование новых ЭО на основе макрофагов ЭО инв. и через 72 часа после введения зритропоэтина и отсутствие образования новых ЭО 1-го класса в эти сроки на основе макрофагов, ранее не участвовавших в формировании ЭО. .

Появлению в периферической крови макроретикулоцитов с повышенным содержанием гемоглобина к 36-му часу исследований предшествовало их обнаружение в «короне» ЭО инв.-'и ЭО рек. уже к 24-му часу с момента активации эритропоэза. Наряду с обнаружением таких ретикулоцитов в «короне» .ЭО были выявлены различия в характере гемоглобинизации- ЭО инв. и ЭО рек. на протяжении исследуемого периода. Так, в «короне» ЭО инв. это явление отмечается с 24-'о по 48-й час после введения зритропоэтина, и лишь кратковременно (до 24-го часа) наблюдается в «короне» ЭО рек. Образование в ЭО )ек. ретикулоцитов с повышенной гемоглобинизацией (р<0,05) к 24-лу часу от момента активации эритропоэза (181,5±4,14; контроль -[67,87+3,88 отнед), вероятно, объясняется стимуляцией эритропоэ-■ином вовлечений ранних эритрсидных клеток в контакт с макрофа-ами ЭО инв. Такие ЭО рек. несут в своем составе макроретикулоци-

ты, которые, судя по быстроте их появления, могли быть следствием терминального деления эритробпзстов, Сниженное же количество макроретикулоцитов в «короне» ЭО рек. с 24-го по 48-й часы после введения эритропоэтина заставляет думать о низком, по сравнению с ЭО ина аффинитете макроретикулоцитов к адгезивным для них участкам мембраны центрального макрофага ЭО рек., что обусловливает их быстрый выход в циркулирующую кровь. Существование «плато» повышенной гемоглобинизации мзкроретикулоцитов (р<0,05) у ЭО инв. с 24-го (184,40±5,б7) по 48-й час (181,60+2.61 ;контрсль -165,09±281), вероятно, обязано перходу в их состав ЭО 3-го класса зрелости, образующихся в ходе последовательной амплификации ЭО 1-го и 2-го классов зрелости и усиленному накоплению гемоглобина эритробластами их «короны». Это позволяет предполагать, что центральный макрофаг ЭО инв. обладает более значительной комплементарной связью с ретикулоцитами, и что, в свою очередь, способствует большему накоплению ими гемоглобина. Можно также предположить, что в образовании макроретикулоцитов ЭО инв.- после 24-го часа воздействия эритропоэтинсодержащей плазмы участвуют и иные ', чем терминальное деление, механизмы перестройки эритропоэза. .связанные с. формированием новой субпопуляции эритроцитов, отличающихся большим диаметром, объемом и большим содержанием гемоглобина подобно тому, как это происходит при адаптации эрит-рона к длительным тепловым .воздействиям (Варыпаева Л.П, 1985; Захаров ЮМ и др„ 1986). '

Обнаруженное различие в содержании макроретикулоцитов- в' «короне» ЭО инв. и ЭО рек. также позволяет высказать гипотезу о том. что для вовлечения ранних эритроидных клеток в контакт с макрофагами ЭО инв,возможно, важным является уменьшение в «короне» последних эритроидных клеток, в том числе. макроретикулоцитов. Возможно, что ЭО инв. присоединяют молодые эритроидные клетки, способные к . реконструкции эритропоэза,только после уменьшения

количества ретикулоцитов (или общей массы гемоглобина) в «короне» ЭО до определенной «критической» величины Очевидно также, что качественный состав клеток «короны» 30 1,2 и 3-го классов ограничивает присоединение новых родонзчальных. кроветворных клеток к этим ЭО. так как ни в физиологических условиях, ни при компенсаторной активации эритропоэза этого не наблюдалось в ЭО 1 и 2 классов, и лишь под воздействием эритропоэтинз реконструкция возникает в инволюцирующих ЭО 3-го класса Механизм взаимодействия эритроидной клетки-предшественницы с макрофагом не вполне ясен, однако, известно, что созревающие эритроидные клетки могут выделять вещества, тормозящие новообразование эритроидной ткани (Zakharov У.. Prenant M, 1983) С другой стороны допускается образование макрофагами развивающихся ЭО рестриктинов (Zipori D., 1989), препятствующих контакту с ЭО новых КОЕ-Э Поэтому существование ЭО рек. с мзкроретикулоцитэми в «короне", очевидно, обь-ясняется влиянием эритропоэтина как на вовлечение ранних эритро-идных клеток в эритропоэз, так и на повышение аффинитета центральных макрофагов созревающих ЭО 3-го и ЭО инв.. классов к ранним эритроидным клеткам-предшественницам.

Митотическая активность эритроидных клеток исследовалась в «короне» ЭО разных классов зрелости. Однако, при идентификации ЭО рек в их «короне» часто обнаруживались остановленные колхицином митозы полихроматофильных клеток Данный факт можно объяснить присоединением КОЕ-Э к ■ ЭО 3-го класса в силу возросшего аффинитета между макрофагами этих ЭО и эритроидными предшественницами под влиянием высоких доз эритропоэтина. В «короне» отдельных ЭО 1-го класса также отмечались единичные случаи присутствия митозов клеток другой, более поздней генерации, что также можно объяснить активацией реконструкции эритропоэза на базе не созревших ЭО (ЭО 3-го класса), что приводит к одновременному присутствию в «короне» ЭО разных" волн созревания эритроидных.

Таблица 2

Митотическая активность еритроидшос клеток в 30 различных классов зрелости у полицитемичных крыс посла введения эритропоэтннактивной плазмы (И ±т )

"Т

Класо зрелости 90

Срок после кровопо-тери

I класс

Ш класс

митозы Тматозы молодой {преявду-генара- }ща4 гене шн на ¡рации 100 кле-{ / а у, ток

{йатоэы |Не способ- | }ва 100 }ше к дале-•I клеток клетки

I ОВОСОб-, /'СО е-^о — :НЫХ к а-

Заканчивающие соз-[рехште 80 Ш класса

¡Митозы" I

I_

Не способные к деле таи клетки

//ос

Реконс

т^рупци

еся

Матозы молодой гопера-шш т 100 клеток

Митозы предыдущей генерации

{ ЭуЬ?* /

Контроль ,24-48 чао (/?» 6)

Опыт, 24 чао </?- 5)

Опыт, 36 чао 5)

Опыт, 48 чао </?» 5)

Опыт, 72 чао </?« 5)

?.7± 1,2

70,%* 3,5

73.4/ 2,1

75,4/ 6,3

5,% 1.7

4,% 1,5

15,4± 1,4

75,%*,+ 7,%

1,2

2,3

10,% 2,9

77,4±* 2,4

70,%* 3,6

82,%* 0,8

76,%* 2,2

150,% 18,6

77,%* 8,2

101,%* 7,4

172,0+ 10,3

200,5/ 8,2

6,%

1.3

17,%*

2,5

21,%* 4,2

24,8/

1.4

36,7/ 1,2

93,51

1.3

83,%* 2,5

78,2+* 4,2

75,2±*

1.4

63,%* 1,2

5,% 1,0

72,%*

4.1

75,4+*

8.5

81,4/

3.6

86,0/

3.2

42,% 6,2

41,% 3,2

92,% 5,7

65,7* 5,1

* - р< 0,05 в сравнении с контролем; + - р<0,05 а сравнении с ЗОрвк.

. !Я

клеток. При идентификации ЭО инв. было обнаружено, что воздействие колхицином в некоторых случаях не позволяет завершить' полное формирование ЭО инвопюцирующего типа. Такие ЭО имели в своей «короне» менее 16 ядросодержащих клетсж, представленных полихроматофильными клетками с заблокированными митозами и не способными к делению поздними полихроматофильными и оксифильн-ыми нормобластами, а также- ретикулоцитами Такие ЭО объединялись в одну статистическую фуппу со сформировавшимися ЭО инв, которая также использовалась для изучения процессов созревания «короны» ЭО и была обозначена как «заканчивающие созревание ЭО 3-го класса»

Введение эритропоэтинэктиеной плазмы вызвало резкую активацию митотической активности эритроидных клеток (табл2), что является закономерной реакцией костного мозга на эритропоэтический стимул (Нефедов В.П, Гомзякова Н.В, 1968; Matoth I. 1962) Отсутствие снижения пролиферативной активности до конца тестируемого периода, соответствующего 3-м суткам от момента введения зритропоэтинактивной плазмы можно объяснить определяющей ролью центрального макрофага ЭО, способного регулировать эритропоэз с помощью выделяемых им веществ (БПА. ЭП) (Bessis M и др.,1978; Zak-harov Y, Prenant M, 1982,1983) и усиливать эффект эритропоэтина при небольших (ниже фармакологических) его концентрациях (Murphy М.1978; Zakharov Y.. Prenant M, 1983).

Сравнивая митотическую активность проэритробластов и базо-фильных эритробластов в «короне» ЭО 1-го и реконструирующегося . классов с полихроматофильными клетками «короны» ЭО 3-го класса как у контрольных, так и у экспериментальных, животных можно констатировать равно выраженную величину пролиферации эритроидных клеток разной степени зрелости при однократном введении эритропоэтина на протяжении тестируемого периода. _ Однако, при сравнении статмокинезов ранних эритроидных клеток в «короне» ЭО 1-го

и ЭО рек. классов после активации эритропоэза обнаружено преобладание количества митозов в «короне» 30 рек., приобретающее достоверные размеры к концу срока исследований. Такое' же распределение событий имеет место при сравнении митотической активности полихроматофильных клеток 30 3-го класса с молодыми клетками 30 рек. Таким образом, напрашивается вывод о более выраженной пролиферативной активности в «короне» 30 рек в сравнении с 30 1-го и 3-го классов зрелости.

Изначальное угнетение эритропоэза приводит к накоплению в «короне» заканчивающих созревание 30 3-го класса поздних, не способных к делению эритроидных клеток. Этот факт, объясняет сниженное количество статмокинезов в «короне» заканчивающих созревание 30 3-го класса у контрольных животных по сравнению с экс-

I

периментальными. Зритропоэтиновая стимуляция сдвигает эту пропорцию в сторону более молодых, делящихся эритроидных клеток, активируя переход поздних эритроидных клеток в стадию безъядерного ретикулоцита.

Регистрацию в «короне» 30 рек. остановленных митозов клеток поздней генерации можно объяснить присоединением родоначаль-ных эритроидных клеток к «короне» 30 3-го класса в силу повышения аффинитета между макрофагами этих 30 и эритроидными клетками-предшественницами под влиянием высоких доз эритропоэтина. Регистрация макроретикулоцитов в «короне» 30 рек. только на фоне повышенных доз эритропоэтина подтверждает данное • предположение. :

Введение активатора эритропоэза полицитемичным крысам повлияло на размерь! неэффективного эритропоэза. К 48-му часу исследований доля неполноценных эритроидных предшественниц от общего числа адросодержащих клеток, входящих* в состав 30 всех классов зрелости, снизилась по сравнению с контролем (3,3+0,3%) в три раза (1,0±Р,0). К 72-му часу эксперимента число ШИК-позитивных

клеток несколько увеличилось (2.0¿0,4%), оставаясь при этом ниже контрольного уровня Уменьшение доли ШИК-позитивных клеток в «короне» ЭО у экспериментальных животных является закономерным и объясняется влиянием- эритропоэтина на неэффективный эритро-поэз (Павлов АД, 1987).

При подсчете ШИК-позитивных клеток на 100 30 (без учета общего числа ядросодержащих клеток, входящих в состав ЭО) было обнаруженное что несмотря на увеличение клеточности ЭО за счет увеличения доли ЭО 1-го. 3-го и реконструирующегося классов под влиянием эритропоэтина имеет место уменьшение числа ЩИК-по-зитивных клеток и к 48-му часу отличается от контроля (6,0+1,0%) в 2 раза (3.0+0.0%) К 72-му часу их число возвращается к контрольному уровню (б,0±0,4%), что можно объяснить увеличением к этому моменту после стимуляции эритропоэза клеточности ЭО за счет по--вышения числа ЭО 1-го, 3-го и реконструирующегося классов, состоящих из активно размножающихся клеток.

Влияние острой кровопотери на эритропоэз в ЭО костного ■ мозга интзктнш животных Для выяснения поведения показателей эритрона в условиях острой постгеморрагической анемии у животных осуществлялась крозо-потеря в объеме 2%' от массы тела. Группу экспериментальных животных составили беспородные лабораторные крысы-самки весом 170— 200 г. Состояние эритропоэза оценивалось через 12. 24, 36, 48 и 72 часа с момента кровопотери. С этой целью исследовались показатели периферической крови и костного мозга. Исследуемые показатели периферической крови оценивались также в момент кровопотери и служили в качестве фона. Для сравнения динамики изменений параметров костномозгового эритропоэза у' анемизированных животных в эксперимент была введена группа интактных крыс •

Постгеморрагическая • анемия сопровождалась, подъемом уровня ретикулоцитов в периферической крови (40,7+2,8 %с. р<0.05) по срав-

нению с контролем (262+3,3 %-) уже к первому сроку исследований (12 час) и падением показателя гематокрита до 27.8+5,6 % (р<0,05) (контроль - 43.5+1,0%) с последующим, его увеличением к 72-му часу до 35,2+4,8% (р<0,05)' К концу эксперимента (72 час) ретикуло-цитоз периферической крови составлял 148,2+36%.. (р<0,05). Подобные изменения показателей периферической крови являются закономерной реакцией на кровопотерю (Моисеева ОИ. 1985, Рябов С.И., Шсстка ГД, 1973). К 24-му часу после кровопотери произошло падение абсолютного количества ЭО (таблЗ), что является закономерной реакцией костномозгового кроветворения (Мельников И Ю„ 1987,Волков А.В, 1991) и объясняется перестройкой гуморальной регуляции эритропоэзз (Павлов АД. Морщакова ЕФ. 1987), сопровождающейся повышением уровня эритропоэтина К Зб-му часу наблюдений количество ЭО увеличилось до нормальных значений и . продолжало рости. превысив контрольные значения к концу тестируемого периода в 1,6 раза, что несомненно является реакцией костномозгового кроветворения на эритропоэтин.

Постгеморрагическая анемия повлекла за собой перераспределение ЭО по классам зрелости (таблЗ) Наблюдаемое к 24-му часу падение абсолютного количества ЭО 1-го и инволюцирующего .классов, очевидно, отразило резкое ускорение процессов созревания эрит-роидных .элементов ккороны» ЭО. с последующим их выходом в периферическое русло, что. в свою очередь, подтверждается повышенным ретикулоцитозом крови. ' Регистрируемое к этому часу увеличение <р<0,05) «Показателя повторного вовлечения макрофагов ЭО в зрит--ропоэз» (0,65+0,09; контроль - 0,34+0,11) .по-видимому, связано с тенденцией к увеличению ЭО рек Дальнейшее увеличение числа ЭО

1-го и реконструирующегося классов и вслед за ним увеличение ЭО

2-гс.З-го я инволюцирующего классов нэ фоне- высоких (р<0,05) значений «Показателя вовлечения КОЕ-Э в эритроидную дифферен-цироЕлу» и «Показателя • повторного вовлечения макрофагов ЭО в

Таблица i /а&З*/? Абсолютноэ количество 30 и их распределение по классам зрелости после введения эритропоэтинактиваой плазмы на фоне полииитемии (М ± т)

10

•_| ЗО'Ю3 | Э01'Ю3 | З02.103 | г03-Ю3 ¡ЭОинв.-Ю3 | ЗОрек. •

Контроль, 240,83±40,43 14,85±3,20 3,21±р,80 4,01+2,61 174,ГО±Н,Э7 44,55±12,37

84-48 чао . . 6)

ОПЫТ,12 чао 200,67±33,04 6,62±1,49* - 3,41+1,47 127,24±5,62 60,52±5,38 (Лт 5)

Опит,24 час 279,99±30,90 2,00±7,80 9,60+2,98® 47,60±15,62Й 114,40+65,36* 88,40^11,79® (У7» 5)

Опыт,36 час 378,67±44,975 48,60^,32* II,36*2,5Э2 П,36±3,79 184,30±13,90 . 123,08±6,28я (/7- 5) »

Опыт,48 чао 289,33*21,37 6,51*3,13 3,38*1,44 16,28*4,54* 180,81+7,40 81,73*7,20* (/7а 5)

ОПИТ,72 час 327,99*23,91 2,95*1,65ц 1,64*0,88 16,73±5,88 206,64*17,85 ТОО,04*10,63й С"« 5)

к - р < 0,05 в сравнении о контролем.

эритропоэз», к. 72-му часу эксперимента достигших 143.02+14.48 и 0,60+0,01- соответственно, можно. объяснить активацией дифферен-цировки ранних эритроидных клеток, вовлечением их как в реконструкцию эритропоэза, так и в контакт с впервые вовлекаемыми в эритропоэз макрофагами и последующим продвижением по пути созревания вновь образованной, более широкой волны эритропоэза.

Характер процессов гемоглобинизации ЭО инв. и ЭО рек проявился в увеличении содержания гемоглобина ретикулоцитами их «короны», что объясняется влиянием высоких доз эритропоэтина (ВеББй М. Вгескег £,1975; Ь^Иа 1_, 1962) При этом были выявлены различия в характере гемоглобинизации этих ЭО. проявившиеся в увеличении (р<0,05) уровня гемоглобинизации «короны» ЭО инв. на протяжении всего исследуемого периода (I74.75i2.75 - к 12-му часу, 157,8+3,40 - к 72-му часу,контроль - 130,67+3,10 услед) и временным его падением- на 24-й час в «короне» ЭО рек Так, к 12-му часу уровень гемоглобина в ретикулоцитах данных ЭО составлял/70,80+3,03, (р<0,05); к 24-му - 140,10+4.30; к 72-му - 148.00±4.40 (р<0,05* контроль - 132,30±3,90. Этот факт можно объяснить низким по сравнению с ЭО инв аффинитетом макроретикулоцитов к макрофагу 'ЭО рек, что обусловливает их выход в циркулирующую кровь. Образование ЭО рек с макроретикулоцитами в «короне» можно объяснить стимуляцией эритропоэтином' вовлечения ранних «красных» клеток в контакт с макрофагами заканчивающих созревание ЭО, несущими в своей «короне» макроретикулоциты. Существование «плато» повы-шеной. гемоглобинизации макроретикулоцитов в «короне» ЭО инв. на протяжении всего экспериментального периода, вероятно, отразило усиленное накопление гемоглобина эритроидными клетками в усло-. виях эритролоэтического стресса (Ве^е М, Вгескег (1 1975).

Усиление пролиферативной активности эритробластов в ответ на крововопотерю отражает реакцию красного кровяного ростка на гипоксию, вызванную потерей циркулирующих эритроцитов (Канаев С.В,

1968, Павлов АД Морщзкова ЕФ„ 1987; Рябов С.И., 1971), что в наших опытах выразилось в увеличении статмокинезов проэритроб-ластов и базофильных эритробластов «короны» ЭО 1-го и. 30 рек. классов, а также попихроматофильных клеток в «короне» ЭО 3-го класса (табл4) Повышение количества статмокинезов клеток поздней генерации по отношению к неспособным к делению ядросодер-жащим клеткам в «короне» заканчивающих созревание ЭО 3-го класса, очевидно, отражает увеличение скорости созревания клеток последних стадий зрелости, или же подключение механизмов терминального деления (ускоренный эритропоэз) с образованием ретику-лоцитов на стадии попихроматофильных клеток, что в обоих случаях приводит к быстрому освобождению зрелых клеток из «короны» ЭО.

Увеличение числа статмокинезов клеток поздней генерации в «короне» ЭО рек. можно объяснить присоединением под воздействи-' ем высокой концентрации эритропоэтина клеток-предшественниц эритролоэза к ЭО 3-го класса, несущим в своей' «короне» еще способные к делению поздние эритроидные клетки. Более высокая ми-тотическая активность молодых эритробластов в «короне» ЭО рек, чем в «короне» ЭО 1-го и 3-го классов, наблюдаемая при реакции красного кровяного ростка на кровопотерю, очевидно, объясняется более высоким эритропоэтическим, энергетическим - и строительным потенциалом центрального макрофага ЭО' рек. в сравнении с другими ЭО.

Глубокие изменения метаболизма, возникающие в гемопоэтичес-кой ткани после кровопотери (Захаров Ю.М., Якушев В.С.,1976; Ястребов АП. и др. 1988.) повлияли на размеры неэффективного эритролоэза в «короне» ЭО. Так, если у интактных животных его величина составляла 5,2+0,4%, то уже к '12-му часу эксперимента доля ШИК-позитивных эритроидных клеток достоверно увеличилась (10,4+1,0%) и продолжала оставаться вышё контроля до конца исследуемого периода, к 72-му часу составляя 8,3+0,5% (р<0,05) При подсчете ШИК-

Таблица

Матотичаская активность эрятроидннх клеток в 30 различных классов зрелостиу крыс после 7% щювопотери (М ±/п )

~г.-

! I класо

Заканчивавдиа соз-[реконс

Класс зрелости ЭО

Срок

после кро-вопотери

{Матозя ;Митозы молодой предаду-} генерацией гана-|шш на {рации

Ш класс

{резание 20 Ш клас-|са

100 клеток

¡Млтозн ¡Не способ-}ва 100 {ныа к дела-)клзток {кил кяет-I способ-} ш//ер

¡НИХ К (¿^А^х-^

} ¡Не способ-•I Митозы ¡нке к двле-\/,сс> ¡нив клетки

! !

I

Т^ирущи!

еся

{Ыатозы !Митозы молодой преднду-, генерацией ге-

Iгттгст «п |нерр"™

на (норации клоток {(

Контроль (я- 3) . 31,• 5,8 2,7± 0,9 42,5± 6,6 93,7* 4,0 15,0± 1,7 85,0± 1,7 39»^ 2,6 12,0+ 1,1

Опыт, 12 час (л - 5) 57,4+* 1,3 9,8+* 2,5. 0 1005« 32,2±к 3,4 67,8+к 3,4 77,8±* 2,0 31,0+5 5,1

Опыт, 24 чао 5) 63,6+*»+ 3,9 II, 4±К 2,4 80,6±й 1,6 . 104,44; 7,2 30,8+й 3,8 69,1+й 3,8 84,0±* 2,4 52,0+* 5,8

Опыт, 36 чао (>1-5) 57,8± 6,1 15,6+к 2,4 6% 4,9 96,6± 9,2 29,8д 2,5 70,2± 2,5 85,0+ 4,2 " 52,6±* 3,3

Опыт, 48 час (Я» 8) 54,2±*'+ 9,6 4,% 2,7 59,4± 16,0 92,4± 16,7 29,6+х 3,4 " 70,4+* 3,4 " 79,6±* 2,1 60,2±* 4,8

Опыт, 72 час 5) 39,8±+ 3,9 10, 1,6- 49,6+ 3,7 ~ Н5,8*й 7,3 22,8±* 2,6 77,2+н 2,6 " 58,2±* 4,9 20,0±* 2,0

* р< 0,05 в сравнении с контролем; ♦ - р < 0,05 в сравнении о ЭОрек.

позитивных клеток, в «короне» 100 ЭО (без учета Общего числа' ядро-• содержащих клеток) отмечалась сходная картина изменения .продукции ШИК-положительного материалам всех этапах исследования

*

превышавшее контрольные значения. Эти результаты совпадают с наблюдениями АФКаюмовой (1990), отметившей увеличение неэффективного эритропоэза у крыс с фенилгидразиновой анемией на фоне высокого содержания эритролоэтина в крови животных

ВЫВОДЫ

1. Высокие концентрации эритролоэтина повышают аффинитет центрального макрофага ЭО к эритроидным клеткам-предшественницам, делая возможной реконструкцию эритропоэза как в «короне» инволюцирующих ЭО, так и ЭО 3-го класса. Важным условием для возможности реконструкции эритропоэза в ЭО является уменьшение в их «короне» макроретикулоцитов.

2. Возможности вариантов реконструкции эритропоэза:

ЭО инв-> ЭО рек.-> ЭО 3-го класса и ЭО 3-го класса -> ЭО рек значительно повышают долю участия центральных макрофагов ЭО в увеличении эритроидного «плацдарма» при эритропоэтическом стрес-.се.

3. На фоне высокого титра эритролоэтина как у полицитемичных, так и у анемизированных крыс- наибольшая митотическая активность эритробластов регистрируется • в «короне» реконструирующихся 'ЭО.

4. Эритропоэтический. стресс приводит к повышению степени ге-моглобинизации ретикулоцитов' и росту их диаметра в «короне» ЭО и периферической крови. • Ретикулоциты более быстро высвобождаются из «короны» реконструирующихся ЭО, чем от связи с макрофагами инволюцирующих ЭО.

■•• 5. Под влиянием' эритролоэтина снижается величина неэффективного эритропоэза в «короне» ЭО у полицитемичных животных. Напротив, кровопотеря вызывает увеличение образования функцио-. нально неполноценных клеток в «короне» ЭО.

Список работ, опубликованных иш теме диссертации

1 О влиянии ингибируххцюс ж стимулирующих эритролоэз факторов на эритробластический- осцхяящ/// Актуальные . вопросы теоретической и практической медицины: НИатконф- Челябинск. 1993-С.77-78.

2 О связи пропиферативной апиакости и обмена гликозаминог-лнкзнов в эритробластических ощрашах после острой кровопотери/ / Актуальные вопросы теоретической ш практической медицины. Матхонф,- Челябинск. 199Я - СЙ5-Й86 ((соавт Корнилова НВ)

ЗадизЕсавэ ж взчатв 24.09.93. 5*д?в8Тб<|Ш84 1/16. Печ. д. '1,5. Уд.-эзд. л. 1,25. Тграк ШО зд?-о2ав8з;1Э4. ТОН издательства.