Автореферат и диссертация по медицине (14.00.16) на тему:Изменения эритропоэза в эритробластических островках при посттрансфузионной полицитемии и некоторые механизмы их развития

О® 9

Г Л ' ' *

„ -....., с:з

ИЗМЕНЕНИЯ ЭРИТРОПОЭЗА В ЭРИТРОБЛАСТИЧЕСКИХ ОСТРОВКАХ ПРИ ПОСТТРАНСФУЗИОННОЙ ПОЛИЦИТЕМИИ И НЕКОТОРЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИХ РАЗВИТИЯ

14.00.16 - патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск, 1999

Работа выполнена в Челябинской государственной медицинской академии

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор медицинских наук, профессор

Рассохин А.Г.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор медицинских наук, профессор Б.Г. Юшков

доктор медицинских наук, профессор С. А. Сторожок

ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ:

Институт фармакологии Томского научного центра РАМН

Защита состоится "17 "ноября" 1999г.в 10 часов на заседании Специализированного ученого совета Челябинской медицинской академии (454092, г. Челябинск, уд Воровского, 64)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской медицинской академии.

Автореферат разослан " 17" октября " 1999 г.

Ученый секретарь Специализированного ученого совета, доктор медицинских наук Л.В. Кривохижина

Актуальность проблемы.

Эритропоэз представляет собой процесс образования эритроцитов периферической крови. В организме существует динамическое равновесие между продукцией эритроцитов в костном мозге и их гибелью, преимущественно, в селезенке. Это равновесие регулируется воздействием на систему крови активирующих и ингибирующих молекулярных и клеточных факторов. Так, неопровержимо доказано участие в регуляции эри-тропоэза гормона эритропоэтина (Федоров H.A., Кахетелидзе М.Г., 1973; Erslev A.J., 1953; Goldwasser Е., 1975). Определена роль в модуляции эритропоэза других гормонов и цитокинов: интерлейкинов, колониестимулирующих факторов, гормона роста, инсулина, половых гормонов (Boissel J.-P. et al., 1994). В последние годы доказано участие в поддержании эритропоэза клеток стромы костного мозга, компонентов внеклеточного матрикса (Clark B.R., Keating А., 1995), подтверждена важная роль в обеспечении эритропоэза витаминов, железа и микроэлементов (Мосягина E.H. с соавт., 1976). Обобщающие сведения о роли этих факторов в регуляции и поддержании эритропоэза отражены в ряде обзоров (Захаров Ю.М. с соавт., 1994; Захаров Ю.М., 1998 б; Шкловская Е.В. с соавт., 1998).

Классическими приемами изучения эритропоэза в эксперименте являются его стимуляция при кровопотере и гемолитической, фенилгидразиновой анемии, или его подавление на фоне постгипоксической или посттрансфузионной поли-цитемии (Дымшиц P.A., 1958; Ужанский ЯГ., 1968; Моисеева О.И., 1985; Федоров H.A., 1977). Ранее было показано, что при посттрансфузионной полицитемии происходит торможение эритропоэза, включая уменьшение пролиферации и замедление созревания эритроидных клеток с уменьшением их количества в костном мозге, изменение стромаль-ного микроокружения с разрушением макрофагов костного мозга, уменьшением их количества и увеличением числа жировых клеток, замедление выхода ретикулоцитов

из костного мозга в циркуляцию со снижением их количества в периферической крови (Филимонов В.И., 1972; Гудим В.И., Москалева Г.П., 1976; Москалева Г.П. с соавт., 1976; Неустроев Г.В., 1977; Новиков Н.М., 1977; Моисеева О.И., 1985; Krzymow-ski T. et al., 1962, 1974; Croom A.C. et al., 1971; Przala J. et al., 1973; Chamberlain J.K., et al., 1975; Kotwica G. et al., 1978; Aoki M., Tavassoli M., 1981; Brookoff D., Weiss L., 1982). Механизмами развития этих изменений считают появление гуморальных ингибиторов эритропоэза - кейлонов (Филимонов В.И., 1972; Гудим В.И., Москалева Г.П., 1976; Krzymowski T. et al., 1962; Kivilaakso Е., Rytômaa T., 1971; Whitcomb W.H., 1971) и снижение титра эритропоэтина в плазме крови (Kilbridge et al., 1969; Whitcomb W.H., 1971; Alippi R M. et al., 1983; Bozzini C.E. et al., 1994). Однако, клеточно-клеточные механизмы регуляции эритропоэза при полицитемии оставались неизученными.

Новый этап в изучении эритропоэза начался после обнаружения в костном мозге больных железодефицитной анемией многоклеточных образований - эритробластических островков (ЭО), представляющих собой группу эритроидных клеток, окружающих центральную клетку моноцитарного ряда (Bessis M., Breton-Gorius J. 1956 a, 1956 б). Выявление ЭО в селезенке и печени эмбрионов, новорожденных и взрослых млекопитающих (Grasso J.A. et al., 1962; Orlic D. et al., 1965; Berman I., 1967), a также выделение ЭО из костного мозга доноров и больных людей (Коробкин А.В., 1989; Рассохин А.Г., 1997) доказало универсальный характер данной организации эритропоэза у млекопитающих и человека, и ЭО получили название функционально-анатомических единиц эритропоэза (Bessis M., 1958, 1976).

Дальнейший прогресс в понимании механизмов регуляции эритропоэза в ЭО был достигнут при изучении количественных и качественных характеристик ЭО при острой кровопотере и фенилгидразиновой анемии (Мельников И.Ю., 1988; Каюмова А.Ф., 1990; Волков А.В., 1991; Пушкарев В.П. с соавт., 1991; Крестьянинова О.Г., 1994; Тишевская Н.В., 1995; Рассохин А.Г.,

1997). Однако, ингибиция эритропоэза в ЭО и механизмы ее развития оставались мало изученными. Так, об угнетении эритропоэза в ЭО судили по снижению их количества в костном мозге полицитемичных крыс, которое отмечалось с 4 суток после трансфузии избытка эритроцитов (Zakharov Y., Prenant M., 1982; Мельников И.Ю., 1988). Эти данные в дальнейшем послужили основанием для оценки распределения ЭО по классам зрелости и определения кинетических и цитохимических характеристик ЭО при посттрансфузионной полицитемии, начиная с 5 суток эксперимента (Мельников И.Ю., 1988; Волков А.В., 1991; Захаров Ю.М., Варыпаева Л.П., 1992; Тишевская Н.В., 1995; Рассохин А.Г., 1997). Однако, в ранние сроки посттрансфузионной полицитемии количественно-качественные изменения ЭО не изучали.

Показано, что при стимуляции и ингибиции эритропоэза в организме состояние эритропоэза в ЭО тесно связано с функциональной активностью их центральных макрофагов (Крашенинникова Е.А., 1987; Волков А.В., 1991; Крестьянинова О.Г., 1994; Захаров Ю.М. с соавт., 1991). Так, макрофаги ЭО, полученные от животных на 5 сутки полицитемии, выделяли в су-пернатант меньше эритропоэтинактивных соединений в сравнении с макрофагами ЭО контрольных животных (Zakharov Y., Prenant M., 1983). У полицитемичных крыс макрофаги ЭО слабее фагоцитировали частицы латекса in vitro (Захаров Ю.М., Варыпаева Л.П., 1992) и обладали сниженной способностью синтезировать гликозаминогликаны по сравнению с макрофагами островков интактных крыс (Харченко М.Ф. с соавт., 1995; Тишевская Н.В., 1995). Однако, исследование функциональной активности центральных макрофагов островков в динамике угнетения эритропоэза в ЭО при посттрансфузионной полицитемии не проводилось. Кроме того, неизученным оставался вопрос о взаимосвязи эритропоэтической и фагоцитарной и других функций центральных макрофагов ЭО, выполняемых в отношении созревающих эритровдных клеток.

Показано, что при стимуляции и ингибиции эритропоэза в организме происходят изменения как в распределении ЭО по классам зрелости, так и цитохимических характеристик ЭО (Кресть-янинова О.Г., 1994; Тишевская Н.В., 1995; Рассохин А.Г., 1997). Однако, вклад цитохимических параметров ЭО разных классов зрелости в общую картину цитохимических изменений эритропоэза в ЭО ранее не учитывали.

Показано, что макрофаги ЭО являются субпопуляцией клеток системы мононуклеарных фагоцитов (Рассохин А.Г., 1997; Rich J.N. et al., 1994). Известно, что функции мононуклеарных фагоцитов во многом определяются их взаимодействием с лимфоцитами, тучными клетками и эозинофилами (Шевак И., 1989; Ackerman S.J.,- 1996; Costa J.J., Galli S.J., 1996). В этой связи, можно было предположить, что функции центральных макрофагов ЭО зависят от их взаимодействия с клетками иных кроветворных линий. Ранее было показано, что ЭО контактируют с лимфоидными, тучными, эозинофильными клетками и нейтрофильными лейкоцитами (Коробкин А.В., 1989; Гольдберг Е.Д. с соавт., 1990; Тишевский И.А., 1996; Рассохин А.Г., 1997). Однако функциональная роль этих контактов осталась не расшифрована.

Цель исследования.

Целью работы явилось изучение характера изменений эритропоэза в эритробластических островках костного мозга при посттрансфузионной полицитемии и выявление механизмов их развития.

Задачи исследования.

1. Изучить количественные и качественные изменения ЭО костного мозга крыс в динамике посттрансфузионной полицитемии.

2. Исследовать состояние эритропоэза в ЭО при посттрансфузионной полицитемии.

3. Исследовать цитохимические показатели ЭО в динамике посттрансфузионной полицитемии.

4. Изучить фагоцитарную активность макрофагов ЭО при по-сттрансфузионной полицитемии и на фоне стимуляции эритро-поэза при гемолитической анемии.

5. Провести анализ межклеточных контактов ЭО при по-сттрансфузионной полицитемии и при кровопотере.

6. Разработать методику и определить количественные цитохимические показатели ЭО разных классов зрелости.

Научная новизна.

В работе впервые изучена динамика количественно-качественных изменений эритробласгических островков костного мозга и состояние эритропоэза в ЭО при угнетении эри-тропоэза в организме, вызванного посттрансфузионной полици-темией.

Впервые исследованы количественные цитохимические показатели ЭО при посттрансфузионной полицитемии.

Впервые предложена оценка фагоцитарной активности центральных макрофагов ЭО по количеству фаголизосом с поглощенным биологическим субстратом - собственных поврежденных или гомологичных эритроцитов.

Получены доказательства независимости осуществления эритропоэтической и фагоцитарной функций макрофагов ЭО.

Впервые проведен сравнительный анализ межклеточных контактов ЭО в динамике посттрансфузионной полицитемии и кровопотери.

Впервые определены цитохимические параметры ЭО разных классов зрелости интактных животных.

Теоретическое и практическое значение работы.

Фундаментальное значение работы определяется раскрытием ранее неизвестной динамики и особенностей развития угнетения эритропоэза в ЭО костного мозга на модели посттрансфузионной полицитемии.

В работе впервые на примере изучения эритропоэтической и фагоцитарной функций центральных макрофагов ЭО показано, что макрофаги ЭО представляют особую субпопуляцию макро-

фагов костного мозга, выполняющих эритропоэтическую и фагоцитарную функции сопряженно, независимо одна от другой.

Впервые изученная динамика межклеточных контактов ЭО с эозинофилами и тучными клетками в норме, при стимуляции и угнетении эритропоэза в островках позволяет по-новому взглянуть на роль клеток различных гемопоэтических линий в модуляции эритропоэза в ЭО.

Впервые определенные нормы цитохимических показателей в ЭО разной степени зрелости дают возможность более точно определить вклад островков разных классов в общую картину изменений эритропоэза при его стимуляции и ингибиции.

Разработанные в эксперименте методики цитохимического анализа ЭО и оценки фагоцитарной активности центральных макрофагов позволяют применить их как дополнительные приемы изучения эритропоэза в ЭО.

Положения, выносимые на защиту.

1: Посттрансфузионная полицитемия приводит к снижению количества ЭО в костном мозге и угнетению эритропоэза в ЭО.

2. При посттрансфузионной полицитемии происходит функциональная перестройка центральных макрофагов островков с увеличением их фагоцитарной активности, изменением содержания нейтральных, кислых гликоконъюгатов, активности неспецифической эстеразы в ЭО.

3. Эритропоэтическая и фагоцитарная функции макрофагов ЭО в отношении эритроидных клеток осуществляются сопряженно и независимо друг от друга.

4. Посттрансфузионная полицитемия приводит к фазным изменениям межклеточных контактов ЭО с эозинофилами и тучными клетками.

5. В островках разных классов зрелости различны цитохимические параметры, что определяется состоянием эритропоэза в ЭО и функциональной активностью центральных макрофагов.

Внедрение результатов исследования в практику.

Диссертационная работа выполнялась в соответствии планами НИР Челябинской государственной медицинской академии. Номер государственной регистрации исследования 01.9.40 000012, тема утверждена на заседании Специализированного ученого совета Д-084.04.01 23 октября 1998 года (протокол заседания №2).

Исследования носили комплексный характер и проводились в рамках Программы научно-исследовательской работы ЮжноУральского научного центра РАМН по теме: "Молекулярные и клеточные механизмы регуляции кроветворения, функций клеток крови и иммунитета в норме, при патологии и при экстремальных влияниях среды", утвержденных Отделением медико-биологических наук РАМН 9 декабря 1998.

Результаты исследования используются в лекционном курсе "Физиология системы крови" кафедры нормальной физиологии человека Челябинской государственной медицинской академии. Разработанные методики цитохимического анализа ЭО и оценки фагоцитарной функции центральных макрофагов используются в практике работы проблемной научно-исследовательской лаборатории "Экспериментальной и экологической физиологии системы крови, иммунитета и цитогенетики" ЮУНЦ РАМН. Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 170 страницах машинописного текста и иллюстрирована 18 таблицами, 4 графиками и 8 микрофотографиями. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка использованной литературы, включающего 420 источников, в том числе 107 отечественных и 313 иностранных.

Апробация работы. Материалы работы доложены на II съезде физиологов Уральского региона "Физиологические механизмы адаптации человека и животных" (Свердловск, 1990), конференции "Механизмы адаптации организма" (Томск, 1996), конференции "Актуальные проблемы регуляции кроветворения и неоангиогенеза", посвя-

s

щенной 100 - летаю профессора P.A. Дымшица (Челябинск, 1998), на заседании Челябинского отделения всероссийского физиологического общества (Челябинск, 1999).

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

Материалы и методы исследования. В работе были использованы 170 беспородных крыс и крыс линии "Вистар" обоего пола: Как было предложено в работе (Zakharov Y., Prenant M., 1983) в качестве доноров эритроцитов использовали крупных крыс массой 300-350 г., а в качестве реципиентов - молодых крыс массой 80-100 г. В опытах с кровопотерей и фенилгидра-зиновой анемией использовали крыс массой 200-220 г.

Кровопотерю вызывали с помощью забора крови из хвостовых вен животных объемом 2 % от массы тела. Гемолитическую анемию создавали однократным подкожным введением раствора солянокислого фенилгидразина в дозе 60 мг/кг массы тела животного. Предварительно 0,6% раствор гемолитика нейтрализовали до pH = 7,0-7,2. Данные модели в экспериментальной гематологии традиционно используют для изучения механизмов стимуляции эритропоэза. Угнетение эритропоэза моделировали однократной внутрибрюшинной трансфузией 80% взвеси отмытых гомологичных эритроцитов объемом 7,5-8 мл на 100 грамм массы тела. Все болезненные манипуляции, включая забор крови, инъекции, гемотрансфузии, эвтаназию путем дислокации шейных позвонков выполняли под эфирным наркозом в отдельном от вивария помещении.

В работе применяли общепринятые методы определения количества эритроцитов, лейкоцитов, ретикулоцитов и показателя гематокрита периферической крови.

Подсчет абсолютного количества ЭО и их распределения по классам зрелости проводили по методу Ю.М. Захарова и соавторов (1984, 1990).

Интенсивность эритропоэза в островках оценивали путем подсчета количества митозов эритроидных клеток, числа ядро-сод ержащих эритроидных клеток и количества ретикулоцитов в короне макрофагов ЭО разных классов зрелости. О функциональном состоянии эритропоэза в островках судили с помощью определения расчетных функциональных показателей эритропоэза в ЭО (Воргова Л.В., Захаров Ю.М., 1990).

Выявление нейтральных гликоконъюгатов в ЭО проводили с помощью ШИК-реакции, кислых гликоконъюгатов - после окраски ЭО красителем альциановым синим (Пирс Э., 1962), активность неспецифической эстеразы определяли по методу Н.С. Кисляк и Р.В Ленской (1978). Количественную оценку цитохимических реакций проводили на микроскопе "ЛЮМАМ-ИЗ", используя фотометрическую систему с насадкой ФМЭЛ-1А и фотоэлектронный умножитель ФЭУ-79. Результаты измерений выражали в условных единицах.

При микрофлюориметрическом определении цитохимических показателей ЭО разных классов зрелости был разработан и использован новый методический прием. После получения препаратов ЭО, подвергнутых цитохимической обработке, осуществляли разметку полей зрения и их микрофотосъемку. Затем проводили микрофлюориметрию ЭО в данных полях зрения и окрашивали препараты по Романовскому-Гимзе. В последующем определяли классы зрелости ЭО и объединяли их цитохимические параметры в отдельные статистические группы.

Оценку фагоцитарной функции центральных макрофагов ЭО проводили с помощью оригинального методического подхода. Фаголизосомы макрофагов островков, образовавшиеся в результате поглощения и переваривания поврежденных или гомологичных эритроцитов, выявляли путем окраски витальных препаратов 0,03% раствором нейтрального красного. При этом считали, что фаголизосомы по своим размерам и форме соответствуют поглощенным эритроцитам.

Экспериментальные данные обрабатывали методами вариационной статистики. Достоверность различий между группами оценивали по t-критерию Стьюдента при уровне значимости р<0,05. О связи между отдельными показателями и явлениями судили по результатам корреляционного анализа.

Характер изменений эритропоэза в эритробластических островках костного мозга при постгрансфузионной полицитемии. Изменения периферической крови крыс при посттрансфузионной полицитемии соответствовали данным, полученными другими исследователями (Москалева Г.П. с соавт., 1976; Моисеева О.И., 1985; Мельников И.Ю., 1988; Croom A.C. et al., 1971). Так, в первые сутки эксперимента показатель гематокрита крови животных возрос до 65,5±5,8 л/л и на 68% превысил показатель гематокрита крови интактных животных (р<0,05). Повышенным гематокрит оставался в течении всего 10-дневного периода наблюдений. Гипертрансфузия эритроцитов вела к значительному снижению числа ретикулоцитов крови полицитемичных животных уже через 24 часа после инъекции с 45,2±4,8 %о до 8,0±1,2 %о (р<0,05).

Угнетение эритропоэза в организме при посттрансфузионной полицитемии проявилось в снижении абсолютного количества ЭО костного мозга (табл. 1).

Таблица 1. Абсолютное количество эритробластических

островков в костном мозге бедренных костей крыс

п ри посттрансфузионной полицитемии.

Группа крыс Показатель Интактные (5) 1 сутки (4) 3 сутки (3) 5 сутки (3) 10 сутки (3)

Количество ЭО, тыс./ бедр. кость 230,0 ¿23,0 227,8 ±14,7 225,0 ±1,7 51,13 ±12,8* 36,7* ±13,4

Звездочкой обозначены достоверные различия с интакгными животными.

При изучении формулы ЭО было обнаружено уменьшение содержания островков пролиферирующих классов (табл. 2). Так, содержание ЭО I класса зрелости снизилось уже в первые сутки, а содержание ЭО II, ЭО III классов зрелости и-реконструирующихся островков, начиная с 3 суток эксперимента. При этом доля инволюцирующих островков увеличивалась, начиная с 3 дня полицитемии.

Расчет абсолютного количества ЭО разных классов зрелости при посттрансфузионной полицитемии подтвердил выявленные закономерности в распределении ЭО по классам зрелости (табл. 2)-

Проявлением ингибиции эритропоэза в ЭО при полицитемии явилось снижение митотической активности эритроидных клеток островков (рис. 1). Так, число митозов эритроидных клеток, составлявшее 1,41±0,13 на 100 клеток ЭО у интактных животных, на 1 сутки полицитемии снизилось до 0,39±0,06 (р<0,001). Максимальное снижение митотической активности эритроидных клеток ЭО отмечено, на 5 сутки эксперимента.

Анализ числа митозов эритроидных клеток ЭО разных классов зрелости показал, что с первого дня полицитемии произошло снижение митотической активности эритроидных клеток пролиферирующих классов островков.

Закономерным следствием угнетения пролиферации эритроидных клеток ЭО при посттрансфузионной полицитемии явилось снижение их количества в эритробластических островках (рис. 1). Так, в первые сутки число клеток в ЭО в среднем снизилось с 8,65±0,21 до 7,74±0,24 (р<0,01).

В большей степени число эритроидных клеток снижалось в островках I и II классов зрелости, что указывает на большую чувствительность к действию гемопоэтических регуляторных факторов менее зрелых эритроидных клеток. Минимальное число эритроидных клеток в ЭО наблюдалось на 5 и 10 сутки.

Таблица 2. Абсолютное количество и формула ЭО - относительное содержание -эритробластических островков разных классов зрелости при посттрансфузионной полицитемии.

Срок наблюдения Класс ЭО ЭО I: х 103/ бедр. кость Интактные (5) 13,8±1,5 1 сутки (4) 6,1±0,8* 3 сутки (3) 9,0±4,5 5 сутки (3) 1,4±1,0* 10 сутки (3) 0,24±0,24

% 6,4±1,08 2,7±0,33* 4,0±2,0 2,3±1,3* 1,0±1,0*

ЭО II: X 103/ бедр. кость 30,5±4,1 22,7±5,0 14,6±1,0* 1,4±0,6* 0,25±0,25*

% 13,2±1,28 10,0±2,08 6,5±0,5* 2,3±0,7* 0,5±0,5*

ЭО III: х 103/ бедр. кость 24,3±7,7 28,4±1,7 6,8±4,6* 1,8±0,8* 0,25±0,25*

% 9,8±2,08 12,7±1,5 3,0±2,0* 2,3±0,7* 0,5±0,5*

ЭОинв: х 103/ бедр. кость 115,6±10,7 128,6±17,8 167,7±0,2* 43,0±9,8* 33,6±12,4*

% 50,6±2,54 56,0±4,5 74,5±0,5* 85,3±2,7* 91,5±0,5*

ЭОрек: х 103/ бедр. кость 45,8±5,1 41,9±2,2 27,1±2,5* 3,9±1,2* 2,3±0,7*

20,0±1,3 18,7±2,0 12,0±1,0* 7,7±0,9* 6,5±0,5*

Примечание. Звездочкой обозначены достоверные различия с группой интактных крыс. В скобках указано количество животных.

МИ и Ш:г, %о ЭК, число

И 1с Зс 5с Юс Рис. 1 Митотический индекс (МИ) эршроидных клеток (ЭК) в ЭО,

количество ЭК и число ретикулоцитов (Шг) в ЭО. Примечание. И- группа интактных крыс, 1 с, 3 с, 5 с, 10 с - сутки наблюдения. Звездочками обозначены достоверные отличия интактных и опытных животных.

Снижение митотической активности и уменьшение количества эритроидных клеток в ЭО в ранние сроки полицитемии вело к закономерному снижению продукции ретикулоцитов, что нашло свое отражение в уменьшении их количества в островках разных классов зрелости, начиная с 3 суток опыта (рис. 1).

Расчет функциональных показателей состояния эритропоэза в ЭО при посттрансфузионной полицитемии показал, что уже на первые сутки эксперимента отмечалось уменьшение интенсивности вовлечения КОЕэ в эритропоэз в ЭО (табл. 3). Увеличение показателя длительности созревания ЭО и уменьшение показателя повторного вовлечения макрофагов в эритропоэз в ЭО под подтверждали подавление эритропоэза в островках при посттрансфузионной полицитемии.

Таблица 3. Расчетные функциональные показатели эритропоэза в ЭО костного мозга животных при посттрансфузи-онной полшдатемии. _ _

Группа крыс Показатель Интактныс (5) 1 сутки (4) 3 сутки (3) 5 сутки (3) 10 сутки (3)

Общее число КОЕэ, вступивших в диффе-ренцировку, тыс./бедр. кость 275,8 ±27,4 269,7 ±13,2 252,1 ±4,2 55,5 ±14,0* 39,0 ±14,1*

Показатель интенсивности вовлечения КОЕэ в дифференци-ровку, тыс./бедр. кость 59,6 ±3,7 48,0* ±1,5 36,0* ±2,0 5,4* ±2,2 2,6* ±0,5

Показатель длительности созревания ЭО, отн. ед. 1,55 ±0,14 2,2 ±0,41 3,47* ±0,3 7,66* ±1,39 11,7* ±1,6

Таблица 4. Цитохимические показатели в ЭО костного мозга крыс при посггрансфузионной полицитемии.

Группа крыс Показатель Интакт-ные (5) 1 сутки (4) 3 сутки (3) 5 сутки (3) 10 сутки (3)

Кислые глюкоконъюгаты 5,6 ±0,05 8,03* ±0,06 4,52* ±0,07 4,41* ±0,06 4,74* ±0,11

Нейтральные глю коконъюгаты 10,99 ±0,07 10,78* ±0,09 9,27* ±0,15 9,82* ±0,1 8,37* ±0,15

Неспецифическая эстераза 18,28 ±0,16 22,93* ±0,21 24,6* ±0,22 24,18* ±0,17 18,78 ±0,32

Примечание. Звездочками обозначены достоверные различия с интактными животными. В скобках указано число животных.

Исследование цитохимических параметров ЭО выявило их изменения, начиная с первых суток эксперимента (табл. 4). Так, содержание нейтральные гликоконъюгаты в ЭО закономерно снижалось с 1 по 10 сутки эксперимента, содержание кислых гликоконъюгатов в структурах ЭО после увеличения в первые сутки опыта снижались, начиная с 3 суток наблюдений.

Активность неспецифической эстеразы в ЭО костного мозга полицитемичных крыс оказалась повышенной с 1 по 5 сутки эксперимента по сравнению с интактными животными. К 10 суткам эксперимента активность неспецифической эстеразы снижалась и не отличалась от параметров интактных крыс.

Исследование фагоцитарной активности макрофагов ЭО костного мозга крыс при полицитемии показало, что макрофаги эстровков участвовали в утилизации избыточного количества гомологичных эритроцитов. Так, с первого дня эксперимента количество фаголизосом в цитоплазме центральных макрофагов увеличилось с 4,23±0,15 у интактных животных до 5,1 ±0,21 у полицитемичных крыс (р<0,001), а максимальная фагоцитарная наивность макрофагов ЭО наблюдалась на 5 и 10 сутки опыта, когда число фаголизосом центральных макрофагов составило соответственно 10,81±0,47и 10,53±0,59.

Анализ зависимости между числом фаголизосом в цитоплазме центральных макрофагов ЭО и количеством ретикулоцитов в этих же островках в динамике посттрансфузионной полицитемии выявил тесную корреляционную связь, коэффициент корреляции между этими показателями был равен г = - 0,96 'р<0,05). Учитывая, что количество ретикулоцитов в ЭО характеризует состояние эритропоэтической функции макрофагов эстровков, можно предположить, что, угнетение эритропоэза в 30 при посттрансфузионной полицитемии приводит разнона-1равленным изменениям сопряженно выполняемых эритропо-этической и фагоцитарной функций макрофагами ЭО.

Анализ межклеточных контактов ЭО в динамике посттрансфузионной полицитемии показал, что на первые сутки экспери-

мента количество ЭО, находящихся в контакте с эозинофилами увеличилось с 9,Ш,1% у интактных животных до 29,8±2,5°/с (р<0,05) у опытных крыс (табл. 5). В дальнейшем число ЭО. контактирующих с эозинофилами, опускалось ниже уровня интактных животных. Количество ЭО, находящихся в контакте с тучными клетками, увеличилось в 1 сутки полицитемии и возвращалось к исходным значениям, начиная с 3 дня опыта.

Таблица 5 Число контактов ЭО эозинофилами и тучными клетками при посттрансфузионной полицитемии

на 100 ост] ровков.

Группа крыс Показатель Интакг-ные (5) 1 сутки (4) 3 сутки (3) 5 сутки (3) 10 сутки (3)

ЭО в контакте с эозинофилами 9,1 ±1,1** 29,8 ±2,5* 1,25 ±0,9*''** 5,8 ±1,5*'** 5,25 ±1,3*'**

ЭО в контакте с тучными клетками 0,7 ±0,3** 3,17 ±0,98* 0,2 ±0,2** 0,67 ±0,49** 0,5 ±0,5**

Примечание. Одной звездочкой обозначены достоверные различия с интакт-

ными животными, двумя - с группой животных 1 суток эксперимента. В скобках указано число животных.

При исследовании межклеточных контактов ЭО разных классов зрелости при полицитемии было выявлено, что островки I класса зрелости интактных и экспериментальных крыс не вступали в контакт с эозинофилами и тучными клетками.

Некоторые механизмы изменений эритропоэза в

эритробластических островках.

Фагоцитарная активность центральных макрофагов эритробластических островков при фенил гидразиновой анемии. Изучение фагоцитарной активности макрофагов ЭО в

динамике фенилгидразиновой анемии выявило фазные изменения содержания фаголизосом в цитоплазме макрофагов островков (рис. 2). Так, на 3 час эксперимента произошло снижение количества фаголизосом в макрофагах с 2,19±0,13 у интактных животных до 1,2±0,7 у опытных крыс (р<0,05). Максимальная фагоцитарная активность макрофагов ЭО при гемолитической анемии отмечена на 48 час, когда среднее количество фаголизосом в цитоплазме макрофагов островков было 7,64±0,3. д Фл и Шг, число

8 -7 -6 -5 -4 3 2 -1 -

О

Сроки наблюдений

И Зч,, 6ч 12,ч 24ч 48ч 120ч Рис. 2. Количество фаголизосом (Фл) в цитоплазме макрофагов ЭО и число ретикулоцитов (Шз) в ЭО при фенилгидразиновой анемии. Примечание. Достоверные различия отмечены звездочками.

Подсчет числа ретикулоцитов в ЭО при фенилгидразиновой анемии показал, что начиная с 3 часа эксперимента происходило снижение количества ретикулоцитов ЭО вплоть до 48 часа эпыта. В дальнейшем отмечалось повышение числа ретикулоцитов с 2,1±0,1 на 48 час наблюдений до, 2,7±0,1 на один ЭО к 120 часу эксперимента (р<0,05). Анализ зависимости между числом фаголизосом в цитоплазме центральных макрофагов ЭО л количеством ретикулоцитов в этих же островках в динамике

фенилгидразиновой анемии выявил тесную корреляционную ^вязь^ коэффициент корреляции между этими показателями бы равен г = - 0,55 (р<0,05).

Наличие отрицательной корреляционной связи мезкду фаго цитарной й эритропоэтической функциями макрофагов ЭО ка при угнетении эритропоэза в островках при посттрансфузион ной полицитемии, так и на фоне стимуляции эритропоэза в Э( при фенилгидразиновой анемии, свидетельствует, что макрофа ги ЭО выполняют фагоцитарную и эритропоэтическую функци] сопряженно и независимо одна от другой.

Межклеточные контакты в эритробластических остров ках при кровопотере. Исследование межклеточных контакта ЭО при кровопотере показало, что число ЭО, находящихся : контакте с эозинофилами, уменьшалось, начиная с 3 суток опы та с 26,0±3,6% у интактных животных до 12,7±4,1% у экспери ментальных крыс (табл. б). Анализ межклеточных контакто: ЭО разных классов зрелости обнаружил изменения взаимодей ствия островков с клетками других гемопоэтических линий уж( на 1 сутки эксперимента.

В первые сутки острой кровопотери было выявлено увеличе ние числа контактов ЭО с тучными клетками костного мозга < 8,5±0,6% у интактных животных до 20,7±3,5% по сравнению I экспериментальными (р<0,05). Начиная с третьих суток опыт; количество контактов ЭО с тучными клетками не отличалос] от показателей интактных животных.

При исследовании межклеточных контактов ЭО разньп классов зрелости при кровопотере было отмечено, что островк1 I класса зрелости интактных и экспериментальных крыс не кон тактируют с эозинофилами и тучными клетками. Нами было отмечено, что ряд изученных показателей ЭО ин тактных крыс разных экспериментальных серий, включая числс фаголизосом в цитоплазме макрофагов ЭО, количество ретию лоцитов в короне островков и число контактов ЭО с эозинофи лами и тучными клетками, различались между собой. Этот факт

Таблица 6. Число ЭО, находящихся в контакте с эозинофила-ми и тучными клетками при 2 % кровопотере на 100 островков.

Группа Интакт- 1 сутки 3 сутки 7 сутки 14 сутки

крыс ные

Класс ЭО (4) (3) (3) (3), . (3)

ЭО в кон- 27,3 26,0 12,7 12,3 10,0

такте с эо-зинофилами ±3,1 ±3,6 ±2,3*'**

ЭО в кон- 8,5 20,7 8,0 8,3 5,3

такте с тучными клет- ±0,6** ±3,5* ±1,2** ±2,7** ±2,9**

ками

Примечание. Одной звездочкой обозначены достоверные различия с интакт-ными животными, двумя звездочками - с группой животных 1 суток эксперимента. В скобках указано число животных.

иы объясняем различиями в массе и возрасте интактных и эпытных животных разных серий экспериментов. Так, при соз-;ании полицитемии использовали молодых животных массой Ю-100 г., а в других сериях - взрослых крыс массой 200-220 г.

Цитохимические показатели эритробластических ост->овков разных классов зрелости интактных крыс. Исследо-$ание ЭО костного мозга интактных крыс показало, что остров-си разных классов зрелости различаются по цитохимическим юказателям (табл. 7). Так, содержание ПШК-позитивного материала в ЭО соответствовало числу эритроидных клеток в ко-юне макрофагов островков: с увеличением количества клеток в Ю I, II, III классов в ЭО повышалось содержание нейтральных ликоконъюгатов, а с уменьшением числа клеток в инволюци-|ующих и реконструирующихся островках, по сравнению с ЭО II, было выявлено снижение содержание нейтральных глико-:онъюгатов в ЭО.

Таблица 7. Цитохимические характеристики ЭО разных

классов зрелости интактных к ¡)ЫС.

Нейтральные гликоконъюгатъ Э01 (23) 5,4 ±0,2 ЭО II (50) 7,0'-3 ±0,1 ЭО III (65) ±0,1 ЭОинв (116) 5;91,2,3,Р ±0,1 ЭОрек (57; 7,11,3'и ±0,1

Кислые гликоконъюгатъ ЭО I (23) 4,8 ±0.3 ЭОП (33) 5,4*р ±0,2 ЭОШ (27) 5,2й ±0,1 ЭОинв (149) 4,6 ±0,1 ЭОрек (85) 4,9 ±0,1

Неспецифическая эстераза ЭО I (28) 10,5 ±0,6 ЭО II (57) 18,6'-3-и ±0,5 ЭОШ (106) 24>5.,2,И,Р ±0,3 ЭОинв (196) 1481,2,З.Р ±0,3 ЭОрек (111 19>51.з,и ±0,5

Примечание. 1'2'з и,р обозначены достоверные различия с Э01, ЭОИ, ЭО III, ЭОинв и ЭОрск, соответственно. В скобках указано число ЭО.

Аналогичным образом изменялась активность неспецифиче ской эстеразы: по мере увеличения числа эритроидных клеток ЭО I, II и III классов зрелости активность фермента нарастала, по мере уменьшения количества ядросодержащих эритроидны клеток - в реконструирующихся и инволюцирующих островка в сравнении с ЭО III класса зрелости активность фермента па дала.

Количественный анализ содержания кислых гликоконъюга тов в структурах ЭО разных классов зрелости показал, что за кономерное снижение интенсивности окраски островков аль циановым синим, происходило в ряду ЭО II - ЭО III - реконст руирующихся и инволюцирующих островков.

ВЫВОДЫ.

1. Постгрансфузионная полицитемия приводит к угнетении эритропоэза в ЭО, что проявляется снижением абсолютного ко личества островков в костном мозге животных, начиная с 5 су-

ток эксперимента.

2. Отражением ингибиции эритропоэза в ЭО при посттранс-фузионной полицитемии является уменьшение содержания и количества в костном мозге животных островков пролифери-рующих классов, в том числе ЭО I, начиная с 1 суток, и ЭО II, ЭО III классов зрелости и реконструирующихся - с 3 суток, и нарастание количества инволюцирующнх островков - с 3 суток опыта. Одновременно с этим с первых суток полицитемии уменьшается показатель интенсивности вовлечения КОЕэ в дифференцировку, с 3 суток - увеличивается показатель длительности созревания ЭО, а с 5 суток - снижается общее число КОЕэ, вступивших в дифференцировку.

3. Ингибиция эритропоэза в ЭО проявляет себя снижением митотической активности ядросодержащих эритроидных клеток и уменьшением их числа в короне центральных макрофагов, начиная с I суток посттрансфузионной полицитемии, и снижением числа ретикулоцитов в ЭО - с 3 суток эксперимента.

4. При посттрансфузионной полицитемии происходят изменения цитохимических параметров ЭО. Так, содержание нейтральных гликоконъюгатов в ЭО снижается с 1 по 10 суток опыта, активность неспецифической эстеразы нарастает с 1 по 5 сутки и снижается к 10 суткам, повышенное содержание в ЭО кислых гликоконъюгатов на 1 сутки к 3 дню сменяется уменьшением их содержания в островках.

5. При посттрансфузионной полицитемии происходит увеличение фагоцитарной активности макрофагов ЭО на фоне поглощения гомологичных эритроцитов и снижение числа ретикулоцитов ЭО. При фенилгидразиновой анемии увеличение фагоцитарной активности происходит за счет утилизации собственных поврежденных эритроцитов с увеличением числа ретикулоцитов в ЭО на 5 сутки по сравнению с 48 часом наблюдений.

6. Эритропоэтическая функция макрофагов ЭО осуществляется независимо от их фагоцитарной функции.

7. Постгрансфузионная полицитемия ведет к увеличению контактов ЭО с эозинофилами и. тучными клетками на первые сутки эксперимента с последующим уменьшением числа контактов. При острой кровопотере число контактов ЭО с эозинофилами и тучными клетками снижается.

. 8. Островки разных классов зрелости различаются по цитохимическим показателям, что отражает интенсивность течения эритропоэза и функциональное состояние центральных макрофагов ЭО.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. рН лизосом макрофагов эритробластических островков костного мозга как показатель их функционального состояния // В кн.: Тез. докл. 44 итоговой научной студенческой конференции. - Челябинск, 1990. - С. 14.

2. Некоторые механизмы адаптивной перестройки эритропоэза при термическом воздействии // В кн.: Физиологические механизмы адаптации человека и животных. Тез. докл. II съезда физиологов Урала. - Свердловск, 1990. - С. 31-32. (Соавторы. Рассохин А Г., Крестьянинова О.Г., Ефименко Г.П., Починский А.Г.)

3. О некоторых механизмах комплементарное™ клеток б эритробластических островках костного мозга // Физиол. журн. СССР им. И.М. Сеченова. - 1991. - Т. 77, №1. - С. 62-67. (Соавторы: Рассохин А.Г., Захаров Ю.М., Крестьянинова О.Г., Потапов ШО.)

4. In différent erythron fonction states // In: Constituent Congress 1 International society of Pathophysiology I. Abstracts. - Moscow. 1991. - P. 133. (Соавторы: Zakharov Yu. M., Rassokhin A.G, Melnikov I.Yu.)