Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение связывания пептидов, соответствующих области гомологии альфа2-интерферона и альфа1-тимозина, с рецепторами иммунокомпетентных клеток

ГосуДарствешъф комитет санитарно-эпидемиологического надзора ' Ь ^^ссиЗской Федерации

МоскоЕСюйГн^чно^исследсвательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского

Ка правах рукописи

ВОЛОДИНА Ева Юрьевна

ИЗУЧЕНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ ПЕПТИДОВ, С00ТВЕ1СТЕШЩ ОБЛАСТИ. ГОМОЛОГИИ. сХ^-ИНТЕЙЕРОНА И оС ^-ТИЖШНА. С ШЦЕИТОРАШ ШМУНСЕаШЕШТШ КЛЕТШ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

> '

^ : - / V

Москва 1994

Работа выполнена в Института иммунологии Российского Акт нерного Общества "Биопрепарат" ¿¡инистерства здравоохранения г медицинской промышленности Р£.

Научнне руководители:

доктор биологических наук, профессор, академик РЕЙ. В.П. Завьялов;

кандидат биологических наук, ст. научный сотрудник Е.В. Наволощая.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН A.A. Ярилин;

доктор биологических наук, профессор Л.З. Козлов

Ведущая организация - Научно-исследовательский институт канцерогенеза онкологического научного центра РАМН.

Защита состоится " Л Z" сг-НЛ&дЬч 1994 г. в_час.

на заседании специализированного учёного совета К 176 Ol CK при Московском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского по адресу: I252I2, Москва, ул. адмирала Макарова, д. 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МНИИЭМ им, Г.Н. Габричевского.

Автореферат разослан "_"___ 1994 г.

Учёный секретарь специализированного совета

кандидат медицинских наук О.В. Котелыш

0Б8АЯ ХАРАКТЕРИСТИК РАБОТЫ

Актуальность теяы. Изучение взаимосвязи между структурой и Функцией Селксв-иммунорегуляторов помимо обогащения Фундаментальных знания имеет большое прикладное значение -Синтетические пептиды, гомологичные активным центрам белков, способны проявлять самостоятельную биологическую активность. Химический синтез небольших пептидов несложен и экономичен. Это создает предпосылки для использования их в качестве лекарственных средств.

И,нтерфероны - белки, обладающие комплексом активностей: противовирусной, противоопухолевой, иммунорегуляторной. В соответствии' с антигенными, биологическими и химическими свойствами интерфероны подразделяются на четыре класса: ИФН-ы лейкоцитарный 1, ИФН-|*1 фибробластныя ), ИФН-у! иммунный 1 и ИФН-и. Завьяловым В.П. и Денесюком А.И. на основании теоретического конформационного анализа были предсказаны пространственные структуры а/р и у -интерферонов '1962 ) и локализованы последовательности, участвующие в образовании функциональных центров. Для одного из этих участков Наволейкой Е.В. была обнаружена гомология с с^-тимозином (гормоном тимуса). На этом основании было сделано предположение, что данная последовательность соответствует иммуноре-гулчторному центру интерферона. Дальнейшие исследования (1986! показали, что пептид ИФН-а (131 -138 ), соответствуешь области наибольшей гомологии ИФН-»а и тимоаина-с^, обладает иммунорегуляторной активностью. Одним из важнейших условии проявления биологической активности пептидов является их связывание с клеточными рецепторами. Это и определило цель и задачи настоящей диссертации.

Цель исследования. Исследовать связывание пептидов, соответствующих области гомологии <* -интерферона и о -тимоэмна, с рецепторами иммунокомпетенткых клеток.

Основные задачи исследования. 1

1. йаучуть связывание пептида !1ФН-а 1131-136) с рецеп-■оаыи иммунокомлет<?нтных клеток ¡тимоцитов, 3~клеток селе-

зенки и перитрнеальных макрофагов) мышея, определить параметры связывания.

2. Изучить наличие рецепторов на поверхности иммунокомпетентных клеток для пептида ТМ-с^ (16-23 !. Проверить предположение о том, что «2~интерферон и с^-тимззин связываются одним1.! и теми же рецепторами (на примере тимоцитов).

3. Исследовать связывание .пептидов: И<?Н-с«2( 131-135 ), ИФН-а2! 131-135), ИФН-а,( 126-135), ИФН-а2!123-135), ТМ-а^П-20). ИФН-а2Суз( Аст)( 131-138), ИФН-а2(Суз( Аст)1131-13ъ ) ¡2 с клеточными рецепторами.

4. Кайти области прикладного использования изученных пептидов.

Научная новизна. В результате проведенных исследований обнаружено, что:

1 ) последовательность 131-133 о»2~интерферона человека ответственна за связывание с рецепторами иммунокомпетентных клеток мыши;

2) гомологичная ИФН-<»2( 131-138) последовательность в с^-тимозине-ТМ-с^(16-23 ) отвечает за связывание с^-тимозина с этими же рецепторами;

3) с«2-интерферрн и с^-тимозин конкурирует за общие рецепторы на поверхности иммунокомпетентных клеток;

4) с^-протиыоэин конкурирует с ИФН-с«2Н31-133) за связывание с рецепторами на тимоцитах.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Результаты, полученные при выполнении данной работы является свидетельством общности эволюционного происхождения с»-интерферонов и а-протимозина, а также функциональной взаимосвязи системы интерферонов и гормонов тимуса.

Высокое сродство пептида ИФН-а2<131-138) (авторское название - пептоферон) к клеточным рецепторам позволяет использовать.этот пептид в качестве адреса при создании гибридных молекул направленного действия. Здесь возможен ши-рокии диапазон его практического применения: пептоферон может служить проводником лекарственных веществ или в исследовательских целях в зависимости от назначения функциональной

части.

Пептсферон может быть использован для поиска рецепторов к о-'р-интерферонам и с^-тимсзину, т.к. синтез его достаточно прост, а он метится лучда интерферона.

Е силу СЕоеи бласт-траксформирусшея активности пептофе-рон мохет Сыть использован в качестве лекарственного средстса при нарушении дифференцировки Т-глеток из тимичес-ких предшественников.

Основные положения, выносимые на завиту.

1. Последовательность 131-136 «2-интерферона человека ответственна за связывание с рецепторами иммунекомпетентных 1 клеток мыши.

2. 5а взаимодействие с рецептором в с^-тимозине отвечает гомологичная ИФН-с»21131-138) последовательность -16-23. ог-интерферон и «^-тимозик конкурирует за обшие рецепторы на поверхности иммунскомпетентных клеток мыши.

Апробация диссертационного материала.

Основные материалы диссертации были доложены на Всесоюзном симпозиуме по химии пептидов /Рига, 1990/; Всесоюзном симпозиуме "Биохимия рецепторных систем" /Таллинн, 1990/; Всесоюзном симпозиуме с участием зарубежных ученых "Mononuclear phagocyte system lr. normal and pathological states" /Новосибирск, 1990/.

В завершенном виде работа была доложена на заседании научного семинара отдела инженерная иммунологии Института иммунологии FAO "Биопрепарат" 5 апреля 1994 года.

Публикации.

По теме" диссертации опубликовано 5 работ в отечественной к зарубежной печати.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 16 рисунков и 1 таблицу. Библиографический указатель содержит 102 источника литературы.

Г МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Синтетические пептиды. Пептида были еинтезирсааны во ВНИИ Особи Чистых Биопррг.аратоз (С-П&тербург !, (автора синтеза Кауров O.A..и Прусаков А.Н. !, твердофазным методом va синтезаторе "Applied BlOiystems", моделъ 430-А и очищены высокоэффективной жидкостной хроматографией высокого давления на хроматографе "Gllson".

1и80тные. В работе использовались линейные ныши СВА, 16-18 г.

Получение меченых лигандсв. Концентрация рецепторов в клетке крайне низка ((0.1-0,5 !х Ю-12 мол^я на ! мг. 'елка! и для выявления их радиолиганднчм .методом необходим лкгэнд с високоя удельной радиоактивностью. Поэтому для получения меченых лигандов мы выбрали иодирование с помощью хлорамина Т (Hunter, Greenwood, 1962).

Изучение связывания лигандоз с рецепторами. Для идентификации рецепторов к лигандаы мы применили традиционный з рецептологии радиореаепторныи (др. называемый радиолиганд-ным) метод (Ткачук, 1983) в модификации Berson и Yalow с применением анализа Скзтчарда iScatc'nard, 1S43>. Константу ингибирования связывания определяли согласно Chang, Prusoff (1973 ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ й ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение связывания пептида ИФК-a^i13'-133 ) с рецепторами иммунокомпетентных клеток мыдеи.

Поиск рецепторов к пептиду ИФН-а2(131-133! проводили на тимоцитах, B-клетках селезенки и перитонеальных макрофагах мышей.

Первые :»» эксперименты показали, что пептид хорошо связывается взятыми для исследовании клетками и это сзязыгание имеет специфических характер. Анализ результатов в координатах- Скзтчарда дал слодуьдуо картину.

Ни поверхности тимоиигов сункотвуят рецепторы с очень

зысок.им сродством к пептиду. Константа диссоциации комплекса ИСН-« (131-13Ö) с рецепторами тимсцитов-(4,2-0,1)х10~15 К. Прямая на графике Скэтчарда свидетельствует, что это гомогенные рецепторы, т.е. рецепторы одного класса. Плотность рецепторов невысокая - 700 связывающих мест на одну клетку (Рис. П.

Мембрана B-клеток селезенки содержит также гомогенные высокоаффинные рецепторы к ИФН-а2(331 -138). Сродство пептида к этим рецепторам немного ниже, чем к рецепторам тимоцитов. Kd комплекса пептид/рецептор р^вна (3,09-0,2)xl0-to М. Плотность низкая - 100 рецепторов на одну клетку.

Характер связывания ИМ-о2(131-138) перитонеальными макрофагами свидетельствует о двух типах рецепторов к пептиду на их поверхности. Рецепторы первого и второго типа несильно различается сродством к пептиду. Kd комплекса пептид/ рецептор I типа равна (3 ,4-0 ,1 )xlO~10 М. Kd комплекса пептид/рецептор II типа - (1,06^0,05)х10~9 М. Количество рецепторов существенно различно: на один макрофаг приходится ~30000 рецепторов I типа и только 3200 рецепторов II типа.

Видно, что параметры связывания пептида iKd и плотность рецепторов) - в диапазоне данных для ИФНов. Согласно литературным данным (Langer J.A., Pestka S., 19SS) характерной особенностью связывания всех интерферонов "Alpha" с рецепторами разнообразных типов клеток - является ¡как и у нас) высокое сродство (Kd от 1х10-3 до 1х10-1,М) и низкая плотность рецепторов (от 2x30z до Ю4). ■

Вывод напрашивался сам собою - мы обнаружили адресный Фрагмент е молекуле а2-интерферона. Однако, ыозкно допустить, что в организме функционирует пептид с такой зге (или близкой 1 послед.авгАтелькостьо аминокислот и мы нашли рецепторы к нему.

С помощью экспериментов по конкурентному связыванию пептид» и и2-интерферона мы получили ответ на данный еопрос. Пептид ИФН-а2активно конкурировали за одни и те же рецепторы на поверхности тимоцитов и перитонеальных макрофагов. Константа ингибирования пептидом связывания а2-интерфе-рона с рецепторами тимоцитов составила (?,9-0*,2 )х10 11 М. (РИС.2). _ ;

В /¥

/

Ка=4.2-1СГ1г М

Рис. I Анализ в координатах Скэтчарда специфического

связывания меченного пептида ИФН-с^2 (131-Г38) с тимоциташ мышеи.

По оси абсцисс - концентрация специфически связанного меченого пептида (В); по осп ординат - отношение концентрации связанного и свободного меченого пептида (Е/?)-

Рис.2. Ингибирспание пептидом ИФН-е^ (131-138) специфического связывания меченного 1251 <*2-интерферона с тимоцита-ми мишея.

По оси абсцисс - концентрация пептида; по оси ординат -икгибироеание специфического связывания меченого ¡^-интерферона б %.

Таким образом, ми заключаем, что последовательность 131—133 рецепторныа участок а^-интерферона.

Одновременно с насими ' исследованиями проводились сравнительные исследования иммунорегуляторноа активности ИФН-а2 и пептида ИФН-о (131-136 ). Эти исследования показали, что пептид обладает иммунорегулирувл&л активностью. В реакции блйст-трансформации тимоцитов пептид на молярном уровне воспроизводит активность КМ-« (а при-концентрации Ю-11 М даже превышает ее) 1 Рис.3). Однако, по рясу других показателей клеточного и гуморального иммунитета активность пептида существенно ниже актизности с<2-интерферона.

На основании полученных .результатов был сделан вывод: последовательность 131-133 - только часть иммунорегу-ляторного сайта а,-интерферона, тем более, что гомология с«2-интерферона и с^-тимоэина наблюдается на протяжении всея последовательности с^-тимозина.

Эксперименты по связыванию с^-тимозина, с^-протимсзина и пептидов ТМ-ое^! 11-20) и ТМ-а1 (16-23) с рецепторами ■ тимоцитов мышей.

Естественно было предположить, что гомологичная ИФН-а2 (131-138) последовательность в с^-тимозине тоже ответственна за связывание с рецепторами.

И тогда скорее всего с^-тимозин связывается теми же, что к а-интерферон рецепторами для проявления биологическоя активности.

Лля проверки этих предположений мы провели серию экспериментов по конкурентному связыванию: 1 ) ^-тимозина и а2~интерферона;

2) а1-тимозина и пептида ИФН-г« (131-138);

3) ИФН-а.1131-136 ) и пептидов из тимозина: ТМ-а (11-20) и ТМ-а^16-23).

Константа ингибирования с^-тимозином связывания ¡^-интерферона с рецепторами тимоцитов мышей составила !2,65-0,22 1х10"7 М (Рис.4). Константы ингибирования а -тимианиоч связывания ИФН-« (131-138 I с рецепторами тимоцитов и Е-кле-ток селезенки мышеи составили (3-0,1 )х10~7М и ¡2,5-0,1 )х10~7

Рис. 3 Активация блесткой трансформации титанитов т.тшей

пептидом \т~а2 (131-138) (а) и¿^-интерфероном (б), индуцированная КснА.

По оси абсшсс - концентрации пептида (а) и

- интерферона (б); по оси ординат - количество /аЕ/ - тимидина, включенного тимопитами.

Контроль I - культуральпая среда, свободная от изуч&еуото образца,

контроль 2 - кулътуральнея среда +2,5 (тег/г/л Кон А, используемого как китогеп + образец.

-ГО-

Рас. 4. Интибированяе -тимозином специфического связывания меченного £ _ знтерферона с тк.гашгаами шлей.

По оси абсцисс - концентрация^ - тидазта; по оси ординат - ингибирование специфического связывания меченого с^ - интерферона в %.

М соответственно.

Пептид ТМ-в (16-23 ) воспроизводит область наибольшей го мологии ИФН-с* и о^-ти^озина и отличается от ИФН-<«2( 131-1381 только 3-мя С-концевыми аминокислотами (Таблица 11. Как мы и предполагали, ТМ-с^ (16-23) и И?Нгог(131-1381 активно конкурировали за рецептор. Константа ингибироваяия пептидом ТМ-с^ (16-23) связывания ИФН-о2(131-138) составила <4,5--0,2)х10""7 М (Рис.5!. та-<* 111-20 1 с КФН-в21131-133) за рецептор не конкурировал.

Аналогичные результаты были позже получены Наволоцкоа Е.В. на человеческих фибробластах.

Таким образом наши предположения подтвердились.

За взаимодействие с рецептором а ^-тимозине отвечает гомологичная ИФН-а2(131-138) последовательность: 16-23.

«„-интерферон и с^-тимоэин для выполнения своих биологических функций связываются одними и теми же рецепторами.

Анализ литературных данных показывает, что «^-тимоэин и иктерфероны обладают целым рядом сходных иммуиомодулируюших свойств. Гомология последовательностей, сходство свойств и общность рецепторов подтверждают друг друга и являются важными свидетельствами ■ общности эволюционного происхождения ИФН и а^-тимозина. По современным представлениям а^-тимоэнн является продуктом протеолиза Солее крупного белка, - секре--тируемого эпителием тимуса. (Доказательство получено на уровне м-РНК). Этот белок назван с^-протимоэином- а- проти-мозин выделен из многих видов организмов и предполагается, что этот белок есть в кадсдой соматической клетке (КагНоэ et а.1., 1985; Уаг+арег1ап et а!., 1992). Статистически значимая гомология е^-протимоэина и а-иктерфероиов - с 1 по 47 остаток -протимозцна и 116-165 остаток К5Н (Рис.5! ¡Завьялов, 1389). Биологическая активность «^-протимозина тысячекратно превышает активность ^-тмаоэина, что делает его ценным з практическом отношении.

Мы проЕели эксперименты по конкурентному связывании ИФН-о2(131-1331 и а -протимозина на тимоцитах мышея. Как сам далось, а -протиыозин активно конкурирует с ИФН-<»21131-1381 за связывание с рецептором. Константа ингибироваяия с^-про-тимозином связывания ИФН-«!131-138) ' ^ = 3 ,63» Ю_11М) значм-

Таблица 1

Параметры связывания с рецепторами тимоцитов сц-интерферона, о^-тм'мозина и пептидов, соответствующих их последовательности.

Происхождение пептида Последовательность пептида КсКМ)

ККМ)

ИФН-<»2

ИФН-а2(131-139) ИФН-^1131-138) ИФИ-о2( 131-135) ИФН-о2(126-135)

ИФН-в2 С12.Ч-135» ИФ||-а2Сув(Асга) (131-138) ИФН-а ((Сув(Аст) (131-138) 1

ТМ-а,

ТМ-а^ 16-23)

тм-^щ-го)

ифн-«2 2.5x10" -10 •в 8,6x10

ЫСЕККУЯРС 6,3x10 1

1ЖЕКК¥8Р -12 4,2x10 1

ЬКЕКК па* п!

ШТЬУЬКЕКК • • пЬ п1

УРОИТЬУЫСЕКК пЬ п!

СЬКЕККУЗР пЬ п1

СЬКЕККУЭР

СЬКЕККУЗР пЬ п1

ТМ-а1 П<] 3,0x10

ЬКЕККЕУУ па 4,5x10

ХТТКОЬКЕКК па п!

.-10

I

й I

Не опроделялась Не связывался

Рис. 5 Ингибировзние пептидом TfJ-oíj (16-23) специфического связывания меченного 1251 пептида ЖН- oM^I-ISS) с тимоштами мыпей.

Но оси абсцисс - концентрация пептида TM-c£¡- (16-23); по оси ординат - ингибирование специфического связывания меченого ИОН- C¿2 (131—138) в

120 130 140 150 160

8 1Ь АУ ШаЕЧ}!«1 т ЬКЕКК У8РСАИ ЕУУ АЕ 1М Я - А Е1М!18Р9Ь9Т N Ь- ОЕ

Протимозин-с^ 8 ОА АУ ВТЗЗЕХТ т ко ЬКЕКК ЕУУ ЕЕ АЕ N0 и 0 А РА^ЫАОНЕЕ N ОЕ ОЕ

. 10 20 30 40 '

Рис. 6. Статистически значимая гомология последовательностей а2~интерферона и о^-протимоэина.

л. I

. пьно 1 как и активность! преьыпает К1 для с^-тиыоэина.

По-видимому, ген ИС-Н-м является продуктом слияния двух генов-предшественников: хена с^-протимозина и гена более древнего противовирусного белка (Завьялов, 1909).

Эксперименты по связызр-кип пептидов соответствующих области гомологии аг-иктерферона и о1~тимозина: ИФН-аг( 131-1 39). ИФН-а2П31-135>, ИФК-«2 (126-135 ), ИФН-о., <123-135) и ИФН-а2С_уа(Аст)(131-13б1, с рецепторами тимоцитов' мышея.

'Исходя из того, что <* -интерферон и его фрагмент ИФН-<* ( 131-138) обладают одинаково высоким сродством к рецепторам мы предположили следующее:

1) ИФК-а,'131-138I точно соответствует рецепторному участку а,-интерферона;

2) ИФН-а (131-136 ) заклочает в себе адресный участок;

3 ) рецепторкыа участок о>2~интерферона не ограничивается последовательностью 131-138, может быть частично смеыек в ту или другую сторону.

По кашей просьбе были синтезированы следующие ' пептиды: ИФН-с-2 (131 -139 ), ИФН-«2( 131-135), ИФН-аг(12Б-135 ). ИФН-с»г ' !123-135 ). Пептиды (кроме ИФЯ-а2(131-135 ) ) были иодированы и на тимсцитах мышей мы с ними провели эксперименты по связыванию. ИФН-с*2 (131-135 ) из-за отсутствия тирозина не был иодирован нами. Он исследовался в эксперименте по конкурентному связыванию с ИФН-а (131-136).

Результаты экспериментов приведены в сводной таблице (стр. И).

Общей для всех пептидов последовательностью является последовательность ШГКК. Согласно полученным результатам пептид КФН-в 1131-135 ) не ингибирует связывание ИФН-«2(131-138) с рецептораыи тимоцитов. Следовательно, - рецепторный участок а --интерферона последовательностью 1.КЕКК не ограничивается. Далее, удлинение фрагмента 1.КЕКК с К-конца на несколько аминокислотных остатков не приводит к появлению • у пептидов связывающей способности. •

При удлинении же этой последовательности с С-конца на

три аминокислотных остатка получаем пептид ИФН-а21131-138),-изначально выбранный нами для исследования. Сродство ИФН-а2 (131-1381 к рецепторам, тиыоцитое значительно превышает сродство любого из исследованных нами пептидов и сравнимо лишь с саыии интерфероном. Следовательно, последовательность YSP играет немаловажную роль во взаимодействии с клеточным рецептором. Удлинение активной последовательности LKEKKYSP еще на одну аминокислоту приводит к резкому снижению связывавшей способности. Аффинитет ИФН-<*2{131-139) на 4-ре порядка ниже, чем у ИФН-а2(131-138).

Помимо перечисленных пептидов мы исследовали аналоги ИФН-а2(131 -138 1: MH-«2Cys(Acm)(131-136 1 и №K-a2tCys(Acm) (131-138) J2.

ИФН-c^CystAcm)! 131-138J был синтезирован с целью создать гибрид на основе ИФН-о2(131-13б), присоединив через цистеин функциональную часть (см.стр-íí). Но Эксперименты

показали, что присоединение цистеина к ИФН-<*2( 131-138) с N-конца лишло пептид связывающей способности.

По всей видимости, Leu 131 играет существенную роль во взаимодействии ИФН-<*2( 131-138 ) с рецепторами.- ( -

Аминокислотные остатки начиная с Cys 139, по всеЯ'види-ыости, для взаимодействия с рецептором не существенны.

Senda Т.et al. (1990).сделавшие рентгено-структурныи -анализ р-ИФН и Fish E.N. (1992) (итоговая публикация серии работ) указывают три пространственно сближенных петлевых района в а/р-ИФН, наиболее вероятно отвечающих за связывание с рецептором: 30-40, 70-80 (Fish: 78-95) и 120-140.

Последовательность 13.1-138 входит в один из районов, указанных Senda и Fish. Полученные нами результаты вполне согласуются с результатами, которые позже получены другими исследователями (Fish, I932; Senda et al., 1990; Barasoaln et al., 1989; Danllkovlch et al., 1991).

Эксперименты с мелиттином.

т

Пептид ИФН-а2(131-138! был назван нами пептофероном.

Одним из современных направлений поиска новых лекарственных препаратов является создание гибридных структур из

зух белксвил или пептидных молекул -адресной и функциокаль-эи. Адресная часть гибрида при:-вака обеспечить его взаиио-г-йствир с нудаым типом клеток. Функциональная - Сиологичее-ия эффект ! шпотокеическиа, н^мунорегуляторный... ) - Высокое родстрр пепто'геро^а к рецепторам иумунокомпетентных клеток авело нас на мьсль о возможном исполъоорании этого пептида качестве адреса. Р мч^с.чве функциональной части нами бал ыбран мелиттин.

Мелиттин - 26-членнпЯ лкта~гския пептид из пчелиного да, способный спонтак.чо встраиваться в природные и модель-ые мембраны и в мипрс»оляркых концентрациях П0_6-!0 9 М) азруиать клетки (неспецифическое взаимодействие с ыембрана-I.

По нашей просьбе был синтезирован гибрид мелиттин-ФН-» (131- 138< и мы провели эксперименты по конкурентному вяэыванио этого гибрида и пептоферона на тимоиитах мышея, ибрид оказался конкурентноспоссбным (Рис.7). Константа нгибирования гибридом мелиттин-пептоферон связывания пепто-■ерона с рецепторами тимоцитов - составила ( 3 ,4-0 ,2 )х 10" 9М. .нелогичные результаты были позже получены Наволоцкои Е.Е. а человеческих фибробластах. Далькеигае исследования, розеденные к.б.н. Костржевской Е.Г. (Институт биохимии име-:и Палладина УАН, Киев) показали, что мелиттин з составе сбрила сохранил способность встраиваться в мембрану и сеои мтотоксические свойства. Это создает возможность применения ■ибрида мелитткн-пептоьерон для элиминации антигенспецифи-гаских клеток при аутоиммунных заболеваниях и пересадке фганов и тканей.

Гюзднс-е генно-инженерными методами был получен искусст-(енныи белок а-пептофгрон-альбебетин, обладавший компакт-юстыс и стабильность» глобулярных белков и имевший 1ространстзенную структуру, Олизкуо к первоначально заданной :труктуре альбебетина (Долгих и др.. 1593). /-пептоферон-альбебетин о'ладал способностью с высоким :родством связываться с рецепторами тимоцитов мыши и актировать Кон А индуцированную бласт-трансформации тимоцнтов :ри концентрациях порядка Ю"11 М (т.е. обладал активностью тептоф-;роча !•.

loci

К,-=3-4* 10 9Ы

Рис. 7 Ингибирование пептидом мелит тин - ИФН -а^ (I3I-I38)

125т

ИФН-о^

специфического связывания меченного. СI3I-I38) с тимоцитами мышей. По оси абсцисс - концентрация мелиттив - ИФН-д'р (131—138)т

по оси ординат - ингибирование специфического связывания меченото ИФН-сй, (I3I-I33) в %. Последовательность пептида мелиттин - ЙОН-д^ (131-Г

н-giy Лг-^аиш ¿ии^шлк^чъ

(jly Лил- ßto OUa, CUa- Luir Mc ^¡n-Ttp Ue X Jap Cfüc lyi ¿tjt Tip- Sin ßio - OH

выводи

1. Последовательность 131-136 «^-интерферона человека зхолит в область ^-интерферона отвечающую за связывание с рецепторами клеток.

2. Пептид ИФН-а2(131 -13& I с высоким сродством связывается с рецепторами тимоцитов, B-клеток селезенки и перито-.чеалъных'1 макрофагов иншей (СВА) и конкурирует с с»2-интерф>е-ронон за ?ти рецепторы.

3. Гомологичная ИФН-о,!131-138> последовательность в а,-тимоэине - ТМ-<* П6-23) отвечает за связывание о^-тимози-на с рецепторами клеток.

4. о^-.чнтерферон и с^-тимоэин для выполнения своих биологических функций связываются одними и теми же рецепторами. Oj-тимозин конкурирует с аг-интерфероном и пептидом ИФН-с<2 !131-136> за рецепторы тимоцитов и B-клеток селезенки мышея. Пептиды ТМ-а1 (16-23) и ИФН-а2(131-138) тоже конкурируют между собой за связывание с рецептором.

5. и^—претимозин активно конкурирует с пептидом ИФН-а.,; 131-138) эа рецепторы тимоцитов мышей.

G. Пептид ИФН-а2( 131-138) может быть использован в качестве адреса при создании гибридных молекул направленного действия. Гибрид мелиттин-ИФН-а2(131-138) хороио конкурирует с ИФН-с<2 (131-136) за связывание с рецепторами тимоцитов

мышея.

Список работ, опуОликованных по теме диссертации.

1. Завьялов Б-П., Денесск А.И., Эйхман Э., Галактионов В.Г., Исаев И.С., Кауров O.A., Кожич А.Т., Майоров В.А., Наволоц-кая Е.В., Нолль Ф., Прусаков А.Н., Шнайдер Ф., Василенко Р.Н., Володина Е.Ю. Изучение взаимосвязи между структурой и функцией интерф&роков с помощь» синтетических пептидов // Тез. докл. Всесоюа. симпоз. по химии пептидов, 10-12 апреля. 1930, Юрмала. - Рига, 1390. - С.5.

2. Исаев И.С., Казаков Г.П., Прусаков А.Н., Марченко А.Ф., Наволоцкая Е.В., Кауров O.A., Володина Е.Ю. Синтез и радио-' реиепторныи анализ гомологичных пептидов с»2-интерферона и

<*t-тимезмна // Тез. докл. Всесоюз. симпоз. по химии пелти-

10-12 апреля, 1990, Юрмала. - Рига, 1990. - С.95.

.3. Завьялов В.П., Наволоцкая Е.В. , Володина Е.Ю., Расиленко Р.Н., Кауров O.A., Прусаков А.Н., Майоров В.А. , Кожич А,Т.,

Исаев И.С., Галактионов В.Г. с^-тимозин и «2-интерферон

конкурирует за обгае высокоаффинные рецепторы на поверхности / иымунокомпетентных, клеток // Тез. докл. Всесоюз. симпоз. "Биохимия рецепторных систем",.29 октября - 1 ноября, 1990.

- Таллинн, 1990. - С.22.

• 4. Navolotskaya E.V., Vasllenko R.N., Volodlna E.Yu., Isaev I.S., Abrarov V.M., Kaurov O.A., Pru.;akov A.N., Zav'yalov V.P, Study of lmmunostinsulatlng and receptor-binding properties of the synthetic peptides Interacting with a-interferon receptors on macrophages and thymocytes // Abstr. of the All Union Symposium With the participation of foreign . scientists "Mononuclear phagocyte system in normal and pathological st ates", 6-6 September, 199C/Ed. by V.A. Kozlov. - Novosibirsk,'1590Г - Pl94.

5. Zav'yalov V.P.,Navolotskaya E.V., Abramov V.M..Galaktlo-■' nov V.G., Isaev I.S., Kaurov O.A., Koahlch А.Т., Malorov V.A., Prusakov A.N., Vasllenko R.N., Volodina E.Yu. The _ ..oetapeptlde corresponding to the region of the highest homology "betusen a-lnterferon and thymosln-o^ effectively

competes with both cytokines for common hlgh-affinixy receptors on murine thymocytes // FEBS Lett. - 1991. - V. 27S.

- Ho. 2. - P.187-169.

25.05.94 г. Зак.6105Р. Тир.100 экз. Уч. изд.л. 1,0

Отпечатано на ротапринте в СНТИ ПНЦ РАН