Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Участие продуктов генов гистосовместимости класса II в связывании нативных белковых антигенов вспомогательными клетками

РГ6 ив - 8 ОНТ 1996

На правах рукописи

АЛПАТОВА Наталья Александровна

УЧАСТИЕ ПРОДУКТОВ ГЕНОВ ГИСТОСОЕМЕСТШОСТИ КЛАССА 11 В СВЯЗЫВАНИИ НАТИВНЫХ БЕЛКОВЫХ АНТИГЕНОВ ВСПОМОГАТЕЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ

14.00. 36 - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МоскЕа 1996 г.

Работа выполнена в ГИСК им. Л. А. Тарасевича Госсанэпиднадзора России и Институте иммунологии Минздравмедпрома РФ

Научные руководители:

академик АЕН, доктор медицинских наук, профессор Е В. Медуницын

кандидат медицинских наук Ж. И. Авдеева Официальные оппоненты;

академик АЕН, доктор биологических наук, профессор К Я. Арион

академик АЕН, доктор медицинских наук, профессор А. Н. Чередеев

Ведущая организация - НИИ вакцин и сывороток им. И. 11 ¡Мечникова

Защита диссертации состоится "Ж> "(ЯШЛ!^ 199б*г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 074.09.01 при Институте иммунологии Минздравмедпрома РФ по адресу: 115478, Шсква, Каширское шоссе, д. 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии Минздравмедпрома РФ

Автореферат разослан "аМ " об^сКХ. 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Л. С. Сеславина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. Успехи фундаментальной иммунологии указывают на ведущую роль антигенов гистосовместимости класса II, (1а-антигенов), в молекулярных механизмах развития иммунного ответа и его регуляции (Петров Р.В., Хаитов P.M., и др., 1981; Алексеев Л.П., Хаитов P.M.,1996; Benacerraf В.,1981; Dasgupta J., Yunis Е., 1987). 1а-антигены (Ia-a) или la-белки необходимы на всех этапах иммунного ответа, они участвуют в антигенном распознавании, презентации антигена, клеточном взаимодействии, определяют генетическую рестрикцию и силу иммунной реакции (Медуницын Н.В., Алексеев Л.П., 1987; бгеуН.М., et.al., 1985; Buus S. 1994).

Многие вопросы проблемы антигенов гистосовместимости остаются слабо изученными. Это касается значения антигенов класса II в процессинге и презентации экзогенных антигенов, в образовании комплекса фрагмента антигена с 1а-а, механизмов интернализации и реэкспрессии антигенов класса II главного комплекса гистосовместимости (ГКГ). В последние годы достигнуты успехи в изучении взаимодействия очищенных la-молекул с пептидами (Adorini L., et.al-, 1991; Jensen P.E., 1991; Frumento G., et.al., 1994; Guery J-C., Adorini L., 1995), но остаются мало изученными процессы взаимодействия нативных белковых антигенов с поверхностью вспомогательных клеток, что имеет решающее значение для выяснения механизмов развития начальной стадии иммунного ответа.

Изучение роли антигенов класса II как рецепторов для нативных белковых растворимых антигенов имеет большое значение в решении проблем фундаментальной иммунологии, в выяснении роли антигенов класса II в регуляции иммунитета и механизмах развития отдельных заболеваний, в разработке методов и средств лечения различных форм иммунопатологии.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Цель настоящей работы заключалась в изучении способности вспомогательных клеток неиммунизированных мышей связывать растворимые нативные белковые антигены и определении роли 1а-белков в этом процессе.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Изучить способность различных фракций вспомогательных клеток неиммунизированных мышей связывать растворимые нативные белковые антигены.

2. Выяснить влияние препаратов, стимулирующих или подавляющих уровень экспрессии 1а-антигенов на клеточной поверхности, на связывающую способность вспомогательных клеток.

3. Изучить влияние уровня экспрессии антигенов гистосов-местимости класса II на поверхности вспомогательных клеток на развитие реакций клеточного иммунитета на белковые антигены.

4. Выяснить влияние синтетических полиэлектролитов на созревание эффекторных клеток, образующих фактор торможения миграции макрофагов (МИФ) при стимуляции синтетическим полипептидом (Т.Г)-А-Л вспомогательных клеток низкореагирующих мышей.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Представлены доказательства участия антигенов класса II ГКГ в связывании нативных белковых антигенов вспомогательными клетками неиммунизированных мышей.

При сочетанном использовании двух способов оценки связывания нативных белковых антигенов (по уровню радиоактивной и флюоресцентной метки) установлена зависимость между уровнем связывания нативного антигена и экспрессией продуктов генов гистосов-местимости класса II на поверхности вспомогательных клеток.

Показано, что способы, снижающие уровень экспрессии антигенов гистосовместимости класса II, подавляют степень связывания нативных белков вспомогательными клетками, а способы, стимулирующие экспрессию 1а-белков, усиливают связывающую способность этих

клеток.

Установлено, что фаза индукции созревания МИФ-продуцентов на яичный альбумин в условиях in vitro и эффекторная стадия их активации являются 1а-зависимыми процессами.

Установлено, что 1а-а, экспрессирующиеся на поверхности вспомогательных клеток, являются универсальными рецепторами для нативных белковых антигенов.

ПРАКБ1ЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. Изучение антигенов класса 11 ГКГ как рецепторов для нативных антигенов важно для выяснения механизмов развития начальной стадии иммунного ответа с целью разработки способов регуляции иммунного ответа, что имеет большое значение для подбора методов и средств лечения различных форм иммунопатологии. Изучение механизмов стимулирующего действия синтетических полиэлектролитов имеет важное значение для разработки искусственных вакцин нового типа, рассчитанных на создание клеточного иммунитета и поиска новых подходов к преодолению иммунологической толерантности.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Разные виды вспомогательных клеток связывают нативные белковые антигены с различной интенсивностью. Степень связывания нативных белков зависит от уровня экспрессии антигенов класса II на поверхности клеток.

2. Интенсивность клеточных реакций на белковые антигены in vitro (созревание и активация МИФ-продуцентов, антигенспецифи-ческая пролиферация Т-клеток) зависит от степени экспрессии антигенов класса II на поверхности вспомогательных клеток.

3. Синтетический полипептид (Т,Г)-А-Л при коньюгировании с синтетическим полиэлектролитом МБ приобретает способность вызывать формирование МИФ-продуцентов у мышей, низкоотвечающих на чистый (Т,Г)-А-Л.

4. Антигены класса II ГКГ, экспрессирующиеся на поверхности

вспомогательных клеток, являются универсальными рецепторами для нативных белковых антигенов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы доложены на конференции молодых ученых Института иммунологии Минздрава РФ (Москва 1990), на межлабораторной конференции Института иммунологии, на 1-м съезде Белорусского научного общества иммунологов "Экологическая иммунология" (г.Минск, 1990 г.), на Всесоюзном симпозиуме с международным участием "Система мононуклеарных фагоцитов в норме и при патологии" (г.Новосибирск, 1990 г.), на Первой международной конференции по иммунореабилитации (г. Сочи-Дагомыс, 1992 г.), на Международном симпозиуме по аллергологии и клинической иммунологии (г.Алма-Ата, 1992 г.).

Диссертация апробирована на заседании Ученого совета ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Москва, 1996г.).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 18 работ: журнальных статей - 3, статей в сборник - 3, тезисов - 12.

ОБЬЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на /3£? страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов исследования, главы собственных исследований, обсуждения и выводов. Указатель литературу включает источник, в том числе отечественных авторов и зарубежных. Диссертация иллюстрирована рисунками и # таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Исследована способность вспомогательных клеток неиммунизированных мышей связывать нативные растворимые белковые антигены.

Степень связывания меченных антигенов (АГ) с мембраной клетки оценивали по уровню радиоактивной и флуоресцентной метки. Ис-

пользование двух способов оценки связывания АГ позволило определить количество клеток, способных связывать АГ и оценить общий уровень экспрессии рецепторов, участвующих в связывании АГ, в исследуемых фракциях клеток.

В качестве антигенов использовали яичный альбумин (OVA) и лизоцим куриного яйца (LYS) отечественного производства. Анализ образца OVA в электрофорезе в полиакриамидном геле с додецилсуль-фатом натрия показал гомогенность данного препарата. Для экспериментальных исследований готовили препараты OVA, меченные FITC, тритием или 1251 и препараты LYS, меченные 1251.

Метку OVA препаратом FITC проводили по общепринятой методике. В исследуемых образцах препарата FITC-OVA концентрация белка составляла 6,4 мг/мл.

Метку OVA и LYS 125I проводили по обычной методике (Остер-ман, 1983). Приготовленные препараты имели различную удельную активность от 11 до 114 кБк/мкг белка.

Метку OVA тритием проводили по методу термической активации газообразного трития (Шишков A.B. и др., 1984). Удаление обме-носпособного трития проводили с использованием метода ультрафильтрации образца на мембране YM 10 (Amicon).

Для конкурентного связывания использовали лизоцим куриного яйца, бычий сывороточный альбумин, человеческий сывороточный альбумин, очищенный туберкулин отечественного производства. Клетки обрабатывали указанными препаратами до внесения меченного OVA.

Кроме того в работе использовали полипептид (Т,Г)-А-Л - синтетический разветвленный сополимер L-тирозина, L-глутаминовой кислоты, DL-аланина, L-лизина с мол. массой 282 КЦа; полизлектро-лит МБ - карбоксипроизводное гетероцепных полиаминов. Коньюгат (Т,Г)-А-Л * МБ получен методом ковалентного связывания (Т.Г)-А-Л с МБ при весовом соотношении 1:10 (любезно предоставленный Н.Г. Пучковой).

В работе использованы мыши линий СБА - 1890 штук, С57В1/6 -160 шт., Balb/c - 340 шт. Из селезенки мышей выделяли отдельные фракции иммунокомпетентных клеток - макрофаги, лимфоциты, Т- и В-обогащенные фракции, дендритные клетки.

Прилипающую к пластику фракцию клеток - макрофаги (Мф) и непршшпающую - лимфоциты (Лф) получали при 1-1,5 часовой инкубации спленоцитов на пластиковых чашках Петри в среде RFMI 1640 с 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТО) при 37° С в атмосфере 5% С0г-

Для получения фракции, обогащенной дендритными клетками прилипающие к пластику клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% FCS или сингенной сыворотки мышей, 2 мМ L-глютами-на, 5х10~5 М HEPES и антибиотиков в течение 18 часов при 37° С в COz инкубаторе. Через 18 часов собирали открепившиеся клетки. Эта фракция состояла на 45-50 % из дендритных клеток.

Клетки тимуса получали путем механического разрушения ткани тимуса мышей с последующим освобождением от прилипающих к пластику клеток культивированием их в чашках Петри в среде 199 с добавлением 10% FCS в течение 1-1,5 часов при 37° С в атмосфере 5% С02-

При исследовании способности клеток связывать нативный растворимый антиген, меченный FITC, к 50 мкл клеточной суспензии в концентрации 5 млн/мл, приготовленной на растворе Хенкса без ионов Са+ и Mg+ с 0,02% азида натрия, добавляли 50 мкл препарата FITC-0VA в соответствующем разведении и инкубировали в темноте при 4° С в течение 1 часа. Затем клетки отмывали раствором Хенкса и фиксировали 1% раствором параформальдегида в течение 15 минут при комнатной температуре. Результаты учитывали на цитофлюоримет-ре EPICS С, оценивая количество флюоресцирующих клеток в процентах и значения величины пикового канала.

Для изучения уровня связывания 0YA, меченного 1251 или три-

тиеы, в пластиковые пробирки, предварительно обработанные 5% гомологичной сывороткой мышей, вносили исследуемые клетки в концентрации™ 10 млн/мл в объеме 0,2 мл и добавляли соответствующее количество меченного препарата. Инкубировали в течение 1 часа при 4° С. Затем клетки отмывали от несвязавшегося АГ, ресуспендирова-ли в 0,2 мл среды и оценивали уровень радиоактивности, соответственно, на гамма-счетчике "Y-5500" или b-счетчике "Mark 3".

В экспериментах по изучению участия la-белков в процессе связывания нативных белковых антигенов с исследуемыми фракциями клеток проводили предварительную обработку клеток моноклональными антителами (МкАТ), специфичными к антигенам класса II ГКГ. Источником МкАТ служили супернатанты гибридом 10-2.16 (анти-1Ак) и 13/4 (анти-IEk); MK-D6 (анти-1А^) и 14-4-45 (анти-1Еа), 25-9-17SII (анти-1Аь), обладающие стабильной активностью в тестах иммунофлхгаресценции (в титрах не менее 1:20). Для блокады 1а-а использовали также Мк-анти-IAk- и анти-1Ек-АТ, аффинно-очищенные на колонке Сефарозы 4В, ко тегированной с кроличьими иммуноглобулинами, специфичными к Ig мыши.

В указанной серии экспериментов к 50 мкл клеточной суспензии добавляли препараты МкАТ и инкубировали 30-45 минут при 4° С, затем клетки отмывали и проводили их обработку препаратами меченных антигенов по описанному выше способу.

Одновременно с экспериментами по изучению связывания меченных препаратов вспомогательными клетками проводили исследования по определению уровня экспрессии антигенов класса II ГКГ на исследуемых фракциях клеток в реакции непрямой иммунофлюоресцен-ции с использованием МкАТ, специфичных к антигенам II класса, и F(ab)2-фрагментов IgG кролика против IgG мыши, меченных FITC. Результаты оценивали с помощью люминисцентного микроскопа и на ци-тофлюориметре EPICS С.

В работе использованы препараты Y-интерферона (активность

10000 МЕ/мл), приготовленные в Институте микробиологии и эпидемиологии им. Н.Ф. Гамалеи. Обработку клеток препаратами интерферона проводили путем инкубации клеток в среде RFMI 1640 с 10% ЭТС и соответствующими добавками в течение 36-48 часов при 37° С в атмосфере 5% СОг- Доза интерферона составляла 50 и 100 Ед/мл. клетки, преинкубированные с интерфероном, тестировали по уровню экспрессии антигенов II класса и способности связывать нативный растворимый антиген.

При изучении антиген-специфической Мф-зависимой пролиферации Т-клеток, лимфоциты селезенки мышей, иммунизированных OVA, выделенные на восьмые сутки после иммунизации, культивировали с Мф интактных мышей. Мф были предварительно обработаны OVA (доза 25 мкг/мл) в условиях in vitro. Клетки в соотношении: Лф - 400 тыс., Мф - 20 тыс. на лунку 9б-луночных планшетов культивировали в среде RPMI 1640 с соответствующими добавками в течение 72 часов при 37° С во влажной атмосфере, содержащей 5% C0¿. Затем в лунки добавляли 3Н-тимидин, культивировали в тех же условиях еще 16-20 часов и измеряли радиоактивность на b-счетчике. Контролем служили результаты экспериментов, в которых лимфоциты культивировали в среде без добавления макрофагов, обработанных антигеном.

При изучении участия la-белков вспомогательных клеток в реакции индукции созревания клеток, образующих МИФ на OVA, была использована модель индукции эффекторов ГЗТ в условиях in vitro. Спленоциты мышей разделяли на прилипающую (Мф) и неприлипающую (Лф) к пластику фракции клеток. инкубировали с АГ в течение 1,5 часов при 37° С, удаляли несвязавшийся АГ, добавляли Лф и смесь клеток культивировали в течение 5 суток. Далее определяли эффекторы ГЗТ по реакции торможения миграции Мф на присутствие МИФ-продуцентов.

Тестирование индуцированных в условиях in vitro МИФ-продуцентов выполняли с помощью прямого комбинированного капиллярного

теста. Клетками-индикаторами для МИФ и антигенпрезентирующими клетками служили клетки перитонеального экссудата интактных мышей сингенной линии. При постановке теста использовали капилляры отечественного производства с внутренним диаметром 0,4 мм, заполненных осадком КПЭ, содержащим 15% сенсибилизированных OVA в условиях in vitro лимфоцитов. Клетки культивировали 18-20 часов. Контролем служили результаты экспериментов, в которых клетки культивировали в среде без АГ. Зону миграции определяли путем измерения двух диаметров на микроскопе "Diavert-Leitz" с помощью оптического микрометра, рассчитывая площадь миграции клеток. Результаты оценивали по проценту миграции клеток по отношению к контролю.

Статистическая обработка данных проводилась на компьютере типа IBM PC/XT, с использованием программы "STATGRAPH" фирмы Microsolf v.2.1. Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали с помощью t - критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

фи анализе результатов проведенных исследований с помощью двух тестов установлено, что иммунокомпетентные клетки, выполняющие роль вспомогательных в развитии иммунного ответа, связывают растворимые нативные белковые АГ.

Препараты OVA, меченные изотопами, связываются исследуемыми фракциями клеток - Мф, Лф, дендритными клетками (ДК), Т- и В-обо-гащенными фракциями. Показано, что наибольшей способностью связывать OVA обладает фракция, обогащенная дендритными клетками, наименьшей - тимоциты. Средняя степень связывания меченых препаратов характерна для Мф и Лф (Рис.1).

В экспериментах с использованием препарата FITC-0VA отмечена зависимость эффекта связывания от дозы препарата как при оценке по числу флюоресцирующих клеток, так и по интенсивности их свечения. Установлено, что при насыщающих дозах АГ самое большое число

--го -

Рис.1 Связывание препарата 125^1-ОУА клетками мышей линии СБА

Фракции клеток

1 - Макрофага 4 - Т-лимфоциты

2 - Лимфоциты 5 - Дендритные клетки

3 - В-лимфоциты 6 - Тиыоциты

- и -

клеток, связавших FITC-OVA, также как и максимальная интенсивность. свечения, обнаруживалось во фракции дендритных клеток.

Выявленные различия в связывании одних и тех же доз АГ раз-лпчными фракциями клеток, вероятно, свидетельствуют о различной плотности экспрессии рецепторов, и о различном аффинитете рецепторов, обуславливающих связь препаратов OVA с поверхностной мембраной клеток.

Параллельно этим экспериментам проводили исследование уровня экспрессии АГ класса II на поверхности клеток исследуемых фракций. Оценивали уровень экспрессии продуктов генов двух субрайонов 1-области - I-A и 1-Е. Установлено, что макет1альное число клеток, экспрессирующих la-молекулы, определяется во фракции дендритных клеток (76,8±1,1% и 51,E±5,3S соответственно IA- и IE-положительные). Во фракции спленоцитарных Мф - 30,0±4,0% и 25.8±7,9% соответственно IA- и IЕ-положительные, во фракции Лф -31,9±3,5% и 31,6±5,3X. Во фракции тимоцитов выявлены единичные 1а-положительные клетки (Рис.2).

Таким образом, можно сделать вывод, что существует определенная корреляционная зависимость между уровнем связывания натив-ного АГ и количеством la-положительных клеток в исследуемых фракциях.

Это положение подтверждают и результаты экспериментов по изучен™ связывания нативного OYA фракциями Мф, ив которых удалены la-несущие клетки с помощью цитотоксического теста.

Показано, что после удаления IA- и IE-несущих клеток из исследуемых фракций Мф, уровень связывания OVA снижается в среднем на 66 % по сравнению с исходны),! уровнем связывания АГ.

Для доказательства участия la-белков в связывании нативных АГ тзкже проведены эксперименты по изучении зависимости между изменением уровня экспрессии АГ класса II на поверхности клеток и способностью этих клеток связывать АГ.

-и-

Рис.2. Н^овень экспрессии АГ класса П на клетках мышей линии СБА

Фракции клеток

1 - спленоциты 4- ~ тиыоциты

2 - макрофаги селезенки 5 - дендритные клетки

3 - лимфоциты селезенки

В своих экспериментах для повышения уровня экспрессии 1а-а на поверхности клеток мы использовали препараты Y-интерферона. При стимуляции Мф Y-интерфероном (50 Ед/мл) увеличивается уровень экспрессии 1а-а на их поверхности (1А-АГ с 30,0*4,0 до 68,2*5,6% и IE- с 25,8+7,9% до 66,б±4,8%) и возрастает степень связывания исследуемыми клетками препаратов 125I-0VA, тритий-OVA и Fí'TC-OYA.

Клетки макрофагальной клеточной линии P388D1 являются 1а-от-рицательными. Показано, что клетки данной линии практически не связывают 125I-0VA. Однако после стимуляции Y-интерфероном (50 Ед/мл и 100 Ед/мл), в результате которой клетки становятся la-положительными, они приобретают способность связывать нативный АГ. Стимулированные Y-интерфероном (100 ед/мл) клетки P388D1, связывают OVA на уровне Мф селезенки (Рис.3).

Таким образом, стимуляция Y-интерфероном увеличивает уровень экспрессии АГ класса II на поверхности клеток и повышает способность этих клеток связывать нативный АГ.

Для оценки участия 1а-а в связывании нативных белковых АГ и определения специфичности связывания проведены эксперименты с блокадой 1а-а клеточной поверхности соответствующими МкАТ. Снижение уровня связывания меченных АГ отмечено при предварительной обработке Мк-анти-1а-АТ всех исследуемых фракций клеток.

В экспериментах с использованием OVA, меченного изотопами, предварительная обработка Мф, Лф и ДК анти-IA- и анти-IE-AT приводила к подавлению уровня связывания OVA по сравнению с необработанными клетками. При обработке клеток смесью МкАТ отмечена большая степень подавления уровня связывания АГ (Табл.1).

- т -

|вооо-

<7000-§

^ 6000« 5000-

Рий.3 Влияние ИФ на уровень связывание 125Л1-0УА клетками линии Р388Ш и Мер

Юл'л*

3 4 5

Фракции клеток

1 - клетки линии Р380Б1

2 - клетки РЗШМ + У-ИФ (50 Ед/мл)

3 - клетки Р388М + У-ИФ (100 Ед/мл)

4 - макрофаги

5 - макрофаги + У-ИФ (50 Ед/мл)

6 - тимоциты

Таблица 1.

Влияние Мк-анти-1а-АТ на уровень связывания препаратов тритий-ОУА клетками различных фракций спленоцитов мышей

Индекс подавления связывания АГ (в %) Мк-анти-1а-АТ

Фракции ----------------------------------------------------

клеток анти-1Ак анти-1Ек анти-1Ак + анти-1Ек

Мф 46,5 ± 5,0 42,3 ± 4,9 51,7 ± 4,3

Лф 41,1 ± 4,7* 42,0 + 4,2* 61,4 + 5,2

дк 54,5 4,8 47,0 + 4,6* 60,1 ± 4,6

Примечание - 1) индекс подавления связывания АГ (в%) рассчитан по отношению к контролю (уровень связывания АГ клетками, необработанными МкАТ),

2) - а - величины, статистически значимо (р<0,05) отличающиеся от значений в группе с использованием смеси МкАТ.

Аналогичные результаты получены при изучении связывания препарата ПТС-ОУА. При оценке уровня связывания препарата дендритными клетками по величине пикового канала средний % подавления связывания составлял - 3б,8±3,5 и 37,9+5,8%. Следует отметить, что оценка уровня связывания ПТС-ОУА только по числу флюоресцирующих клеток не всегда позволяет выявить снижение уровня связывания меченного АГ, т.е. не во всех опытах значимо снижается общее количество клеток, способных связывать ПТС-ОУА. Более адекватной в таком случае оказалась оценка значений величины пикового канала. Снижение данного показателя свидетельствовало об уменьшении числа клеток с более интенсивной флюоресценцией, что в конечном итоге указывает на падение уровня связывания меченного АГ,

т.е. сокращение количества свободных незаблокированных структур, участвующих в связывании OVA, на отдельной клетке.

Уровень связывания препарата LYS, меченного изотопом 1251, снижается на 45,0+4,2% и 47,0+3,8%, соответственно, при предварительной обработке макрофагов анти-IA- и анти-1Е-АТ.

После обработки Мф, стимулированных Y-интерфероном, ан-ти-Ia-AT, отмечена большая степень подавления связывания OVA по сравнению с нестимулированными клетками. Средний процент подавления связывания при предварительной обработке анти-IA- и -IE-AT Мф, стимулированных Y-интерфероном, составляет 70,1±5,6% и б7,8±7,2%, соответственно. Для нестимулированных Мф средний процент подавления связывания составляет 52,3±6,5% и 48,8+5,8%,

С.'

соответственно (р<0,05).

Результаты этих экспериментов еще раз подтверждают, что в связывании нативных белковых АГ участвуют la-молекулы, экспрессия которых увеличивается на поверхностной мембране Мф под влиянием препаратов Y-интерферона, и которые оказываются заблокированными после обработки стимулированных клеток анти-1а-АТ.

При использовании для предварительной обработки Мф препаратов Мк-анти-IA-AT, очищенных аффинной хроматографией, отмечена большая степень подавления связывания препаратов 125I-0VA, чем при использовании супернатантов гибридом, содержащих МкАТ данной специфичности. Индекс подавления связывания OVA при использовании анти-IA-AT, очищенных аффинной хроматографией, составляет 71,1±8,1%, при использовании супернатантов гибридомы - 49,2+4,9%. (р<0,05).

Для подтверждения специфичности взаимодействия препаратов 125I-0VA с 1а-а поверхностной мембраны Мф, были использованы Мф мышей различных линий, имеющих разный гаплотип. Показано, что предварительная обработка анти-1Ак- и анти-1Ек-АТ Мф мышей линий С57В1/6 ("Ь" гаплотип ) и Balb/c ("d" гаплотип) не приводит к

- í? -

значительному подавлению уровня связывания этими клетками препаратов OVA. Индекс подавления связывания приведен в таблице 2.

Таблица 2.

Влияние анти-1Ак- и анти-1Ек-МкАТ на связывание 125I-0VA макрофагами мышей разных гаплотипов

Моноклональные антитела Супернатант Гомологичная

щ -------------------------- гибридомы сыворотка

мышей анти-1Ак анти-1Ек х-63 мышей (5£)

СВА

"к" гаплотип 45,2+6,7*,** 43,6+5,3*,** 21,2±4,0 20,0+4,2 Balb/c

"d" гаплотип 15,2±3,6 17,3+3,4 23,0±3,3 17,4+2,8 С57В1/6

"Ь" гаплотип 12,6+3,1 19,1+3,6 18,2+3,2 19,4±3,1

Примечание - 1) то же, что и в таблице 1.

2) - * - величины, статистически значимо (р<0,05) отличающиеся от значений в группе с использованием супернатантов гибридом другого гаплотипа, - ** - —"— супернатанта гибридомы х-63.

Как видно из таблицы 2, предварительная обработка вспомогательных клеток мышей разных гаплотипов МкАТ, специфичными к АГ гистосовместимости класса II гаплотипа "к" (анти-1Ак- и ан-ти-1Ек-АТ) подавляет связывание нативного белкового АГ клетками этого гаплотипа и не влияет на фиксацию АГ клетками гаплотипов "Ь" и "с!".

Таким образом, анализируя результаты экспериментов с исполь-

зованием МкАТ, специфичных к АГ класса II, можно сделать вывод что la-белки участвуют в связывании нативных белковых АГ.

Исследование конкурентного связывания меченного и немеченно-го препаратов OVA (в аналогичных концентрациях по белку) показало, что препарат, внесенный в среду с клетками до обработки меченным OVA, подавляет связывание на 40%. Ингибицию связывания, хотя и меньшей интенсивности, вызывали также лизоцим, бычий сывороточный альбумин, человеческий сывороточный альбумин и туберкулин.

Предполагается, что молекула 1а-а обладает групповой специфичностью и способна реагировать на несколько АГ. Предварительный контакт с одним АГ может тормозить связывание la-молекулы с другими АГ, чем, по-видимому, можно объяснить различный ингибирующий эффект, наблюдаемый нами при использовании различных немеченных АГ.

Можно предположить, что после взаимодействия 1а-а с нативным АГ на поверхности вспомогательных клеток, образующийся комплекс может или непосредственно представляться Т-клеткам, или подвергаться интернализации.

Результаты экспериментов по изучению интернализации свидетельствуют об образовании комплекса на поверхности вспомогательных клеток при первичном взаимодействии нативного АГ с la-молекулой с последующей его интернализацией. В наших экспериментах клетки после обычных условий обработки меченным АГ (45 мин при 4° С) инкубировали при 37° С в среде без добавления азида натрия. Установлено, что через 30 и 60 мин наблюдается уменьшение числа клеток, несущих на поверхности комплекс FITO-OVA в 1,7 и 2,6 раза, соответственно. Отмечено также снижение интенсивности флюоресценции поверхностной мембраны клеток и появление внутри клетки FITC-меченных гранул. Через 120 минут после начала инкубации наблюдается увеличение числа клеток, несущих FITC-0VA на поверхнос-

ти, что, вероятно, свидетельствует о реэкспрессии комплекса, состоящего из фрагмента OVA с красителем и 1а-молекулы на клеточную поверхность (Табл.3).

Таблица 3.

Связывание препаратов FITC-OVA макрофагами селезенки при различных температурных условиях

Условия Данные микроскопии Данные цитометрии

инкубации Число Число интенсивность

клеток светящихся светящихся свечения

клеток (%) клеток (%) (усл.ед.)

А. Препарат F1TC-0VA (концентрация OVA 800 мкг/мл)

45 мин 4° С 20,2+2,3 21,5+2,9

- " - + 30 мин 37° С 12,6+1,3*,** 16,8+2,2**

- " - + 60 мин 37° С 10,9+1,8*,** 13,4+2,0*,**

- " - +120 мин 37° С 27,6+2,7 31,5+3,6

Б. Препарат FITC-0VA (концентрация OVA 400 мкг/мл)

45 мин 4° С 22,1±2,1 27,0+3,1 115,8±6,7

- " - + 30 МИН 37° С 12,9+2,4*,** 6,9+1,6*,** 74,4+5,3

- " - + 60 мин 37° С 8,4±2,0*,** 8,ltl,8*,** 78,7+3,7

- " - +120 мин 37° С 19,6+3,0 23,5±3,0

Примечание - - * - величины, статистически значимо (р<0,05) отличающиеся от значений в исходной группе (45 мин 4° С),

- ** — " — в группе (120 мин 37° С).

- го -

По-видимому, на поверхности вспомогательных клеток 1а-а взаимодействуют с OVA и данное взаимодействие является физиологическим сигналом для интернализации образованного комплекса FITC-OYA - 1а-а.

Экспериментальные доказательства, свидетельствующие о биологической активности комплекса, выявляемого на поверхности вспомогательных клеток, получены при оценке антигенпрезентирующей функции клеток по их влиянию на антигенспецифическую пролиферацию Т-клеток и созревание клеток-эффекторов ГЗТ в условиях in vitro.

Показано, что уровень пролиферативного ответа Т-лимфоцитов зависит от уровня экспрессии 1а-а на поверхности антигенпрезенти-рующих клеток. Предварительная обработка Мф неиммунизированных мышей линии Balb/c анти-IAd- и анти-IEd-AT приводила к снижению уровня пролиферации Т-клеток на OVA на 35,1±3,9% и 49,3+3,5%, соответственно (рис.4). При использовании для предварительной обработки антигенпрезентирующих клеток анти-IA-AT гаплотипа "к" уровень Т-клеточной пролиферации был снижен незначительно (6,3±2,1%).

Степень зависимости уровня пролиферации Т-клеток на OVA от уровня экспрессии АГ класса II на поверхности антигенпрезентирующих клеток показана также при использовании в качестве антигенпрезентирующих клеток макрофагальной клеточной линии P388D1. Клетки этой линии не экспрессируют 1а-а на своей поверхности и не презентируют АГ Т-клеткам. Стимуляция препаратами Y-ИФ приводит к появлению la-молекул на поверхности клеток, это обуславливает, как было отмечено выше, участие этих клеток в связывании нативных белков, а также проявление их антигенпрезентирующей функции. Обработка стимулированных ИФ клеток анти-IAd- и анти-IEd-AT приводит к снижению уровня пролиферативного ответа Т-клеток на OVA на 34,5+4,1 и 39,5+2,7%, соответственно (рис.4).

При изучении роли 1а-белков вспомогательных клеток в реакции

-гл-

РисД Влияние Мк-анши-1а-АТ на уровень Т-клеточной пролиферации на OVA

45000

2 3 4 5 6 7 8

Фракции агапигенпредставл яюодих клеток

1 - Макрофага

2 - Макрофаги + анти-1А-АТ

3 - Макрофаги + анти-1Е-АТ

4 - клетки Р388Б1

5 - клетки Р388Б1, стимулированные 1®-У

6 - клетки РЗВЙМ, стимулированные НФ-У + анти-1А-АТ

7 - клетки Р388Ш., стимулированные НФ-У + анти-1Е-АТ 0,9 - контроль

- zz -

индукции созревания клеток, образующих МИФ, на OVA была использована модель индукции эффекторов ГЗТ в условиях in vitro. Культивирование неприлипающих Лф на монослое прилипающих Мф, предварительно обработанных АГ, позволяет разграничить этап переработки АГ в прилипающих клетках от этапа представления АГ неприлипающим Лф и изучить роль 1а-а в формировании МИФ-продуцентов и в проявлении их активности. Изучена динамика образования МИФ-продуцентов на OVA, изучено влияние дозы АГ, используемой для обработки прилипающих клеток, а также влияние анти-1а-АТ на процесс формирования МИФ-продуцентов.

Обработка Мф анти-IAk и анти-1Ек-АТ до обработки клеток OVA подавляет индукцию созревания МИФ-продуцентов. Процент миграции составляет 101,7+7,2 и 104,2±4,6, соответственно. Культивирование Мф с OVA без обработки клеток МкАТ, приводит к формированию МИФ-продуцентов, в этом случае процент миграции составляет -66,3+3,2%. В качестве контроля для МкАТ использован супернатант клеточной линии х-63. Обработка Мф супернатантом указанной линии не подавляет образование МИФ-продуцентов, процент миграции составляет 63,4+4,1%.

При добавлении супернатанта, содержащего анти-1Ак- и анти-1Ек-АТ в среду с АГ для тестирования МИФ-продукции отмечено подавление активности МИФ-продуцентов, процент миграции составил 98,2±7,2% и 105,2+9,1%, соответственно.

Таким образом, процесс индукции созревания МИФ-продуцентов и продукция фактора сенсибилизированными Лф, происходят с участием АГ класса II ГКГ. Мк-анти-Iа-АТ, по-видимому, вызывают блокаду связывания la-молекул с АГ на поверхности вспомогательных клеток, это обуславливает образование недостаточного количества иммуно-генных комплексов для индукции созревания эффекторных клеток ГЗТ.

В следующей серии экспериментов основное внимание было уделено изучению возможности получения в условиях in vitro эффектор-

пых клеток, образующих МИФ, при стимуляции вспомогательных клеток синтетическим полипептидом (Т,Г)-А-Л, полиэлектролитом МБ и выяснению роли вспомогательных клеток в этом процессе.

Возможность получения клеток-эффекторов ГЗТ к (Т.Г)-А-Л была изучена на клетках мышей линии СВА, которые являются слабоотвеча-ющими на (Т.Г)-А-Л. При использовании в качестве АГ чистого (Т,Г)-А-Л образования МИФ-продуцентов в условиях in vitro на клетках мышей линии СВА не наблюдалось. Процент миграции составлял 115,1±10,2, а в отдельных случаях отмечено усиление миграции Мф - 163,4+7,5%.

Коньюгат (Т.Г)-А-Л * МБ вызывает индукцию созревания МИФ-продуцентов. Отмечена выраженная реакция торможения миграции Мф при условии, если этот коньюгат был использован для тестирования МИФ-продуцентов, процент миграции составляет 63,2±4,8. Простая смесь (Т,Г)-А-Л + МБ, также как и полиэлектролит МБ не индуцировали образование МИФ-продуцентов. Торможения миграции не наблюдали при использовании в реакции в качестве тест-антигенов (Т.Г)-А-Л и МБ (Рис.5).

Таким образом, полипептид (Т,Г)-А-Л при коньюгировании с синтетическим полиэлектролитом МБ приобретает способность вызывать формирование МИФ-продуцентов в условиях in vitro при использовании клеток мышей линии СВА, низкореагирующей на чистый (Т.Г)-А-Л. В наших экспериментах образование МИФ-продуцентов под влиянием коныогата происходит из нормальных неприлипающих клеток при их культивировании с вспомогательными клетками, предварительно обработанными АГ. Вероятно, вспомогательные клетки играют важную роль в механизме стимулирующего действия полиэлектролита. Можно предположить, что МБ способствует связыванию полипептида с мембраной вспомогательных клеток, последующей его интернализации, расщеплению и представлению Т-клеткам. Это может происходить как на стадии формирования Т-зффекторов, так и на стадии их актива-

-Ib-

Puc.5 .Тестирование МИФ—продуй,! дотированных (T.rj-A-TI, МБ, кон

,ентов, ин коньюгатом

2 3 4567В 9 10

Препараты для индующи МИФ-продуиентов

1-3 - (Т,Г)-А-Л 4-8 - коныагат (Т,Г)-А-Л * МБ 9,10 - смесь (Т.Г)-А-Л + ЫБ 11 - полиэлектролит МБ

U

ции.

Тагам образом, на основании результатов исследований можно сделать вывод, что вспомогательные клетки способны связывать на-тивные белковые АГ и уровень связывания нативных АГ зависит от уровня экспрессии la-молекул на мембране клеток. Способы, усиливающие или снижающие уровень экспрессии 1а-а на поверхности клеток приводят, соответственно, к повышению или уменьшению степени связывания нативных АГ этими клетками. Функциональное значение комплекса OVA-1а-молекула, выявляемого на поверхности вспомогательных клеток, показано в реакциях Т-клеточной пролиферации и созревания эффекторов ГЗТ в условиях in vitro. Нативный антиген, входящий в состав образующегося комплекса, может подвергаться последующему ферментативному расщеплению. Сохраняются только пептиды, соединенные с 1а-а, которые предохраняют эти пептиды от распада. В этом случае 1а-а являются хранителями антигенной информации. Можно считать, что 1а-а на поверхности вспомогательных клеток выполняют функцию универсальных рецепторов, способных связывать не только пептиды, но и нативные белковые АГ. Такое связывание происходит в самом начале взаимодействия антигена с иммуно-компетентными клетками и имеет решающее значение в запуске иммунного ответа.

ВЫВОДЫ.

1. Вспомогательные клетки неиммунизированных мышей (макрофаги, дендритные клетки), обладают способностью связывать нативные растворимые белковые антигены. Уровень связывания нативных белков вспомогательными клетками коррелирует с уровнем экспрессии антигенов гистосовместимости класса II на их поверхности. Наиболее выраженной связывающей способностью обладают дендритные клетки, имеющие более выраженную плотность экспрессии антигенов класса

II. Средняя степень связывания нативных белков характерна для макрофагов и лимфоцитов.

2. Предварительная обработка вспомогательных клеток мышей разных гаплотипов ыоноклональными антителами, специфичными к антигенам гистосовместимости класса II гаплотипа "к" (анти-1Ак и анти-1Ек), подавляет связывание нативных белковых антигенов клетками этого гаплотипа и не влияет на фиксацию антигена клетками гаплотипов "Ь" и "сГ.

3.Освобождение исследуемых фракций макрофагов от клеток, несущих продукты генов гистосовместимости класса II, приводит к снижению уровня связывания меченного антигена клетками этих фракций. Такой же эффект наблюдается при условии предварительной обработки клеток немеченным препаратом и другими белковыми антигенами.

4. Уровень связывания нативного белкового антигена повышается при стимуляции вспомогательных клеток препаратами гамма-интерферона, что коррелирует с повышением уровня экспрессии антигенов класса II на поверхности исследуемых клеток.

5. Стимуляция клеток макрофагальной клеточной линии Р38801 препаратами интерферона, индуцирующая экспрессию антигенов класса II на их поверхности, обеспечивает участие этих клеток в связывании нативного белкового антигена и в развитии Т-клеточной пролиферации на тот же антиген.

6. Фаза индукции созревания МИФ-продуцентов и эффекторная стадия их активации, являются 1а-зависимыми процессами.

7. Синтетический полипептид (Т,Г)-А-Л при коньюгировании с синтетическим полиэлектролитом МБ приобретает способность вызывать формирование МИФ-продуцентов у мышей, низкоотвечающих на чистый (Т,Г)-А-Л.

8. Антигены гистосовместимости класса II выполняют роль универсальных рецепторов для нативных белковых антигенов, что имеет важное значение в развитии иммунного ответа.

- 2Р-

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Formation of effector cells of delayed type hypersensibility in vitro. Sixth international congress of immunol. 1986, 6-11 July. Toronto, Canada. Abst./poster N 2.44.32. (сравт. Medunitsin N. V., KrylovO.R., Avdeyeva J.I.).

2. Моделирование клеточных реакций замедленной гиперчувствительности in vitro. YI респ.научно-практ.конференция "Актуальные вопросы клинич.и экспер.аллергол.и иммунол.". Каунас, 29-30 мая 1986, с.23-24. (соавт.Медуницын Н.В., Крылов О.Р., Авдеева Ж.И.).

3. Образование эффекторных клеток замедленной гиперчувствительности к синтетическим антигенам in vitro. Иммунология, 1986, 1, с. 43-46. (соавт. Медуницын Н.В., Крылов О.Р., Пучкова Н.Г.).

4. Моделирование реакций повышенной чувствительности замедленного типа in vitro."Проблемы и перспективы современной иммунологии. Методологический анализ", Новосибирск,1988, с.108-123. (соавт. Медуницын Н.В., Крылов О.Р., Авдеева Ж.И.).

5. Exspression of МНС class II antigens on immunocompetent cells and its importance for immune response development. IX Europran Immnology Meeting, Roma-Italy-Pallazzo dei Congressi, September 14-16, 1988. Poster W3-21, p.35. (соавт. Medunitsin N.V., AvdeevaJ.I., Krylov O.R., Karaseva V. I., Kremlev S.Q.).

6. Связывание растворимого антигена вспомогательными клетками и роль la-белков в этом процессе. Иммунология, 1988, 6, с.29-31. (соавт. Медуницын Н.В., Крылов О.Р., Авдеева Ж.И., Мер-кушов А.В.).

7. Ia-белки как универсальные рецепторы антигенов. В сб.материалов 1-го съезда Белорусского научного общества иммунологов "Экологическая иммунология", г.Минск, 19-21 ноября 1990 г., с. 14. (соавт. Медуницын Н.В., Крылов 0.Р., Авдеева Ж.И., Воскресенский А.Н., Степанов О.Г.).

8. Рецепторная функция антигенов главного комплекса гисто-

совместимости (ГКГ) класса II. В сб. материалов 1-го советско-болгарского симпозиума по вирусным инфекциям и 5-ой национальной конференции по бактериальным инфекциям и иммунологии, г. Варна 8-10 октября 1990 г. с.180.(соавт. Медуницын Н.В., Крылов О.Р., Авдеева Ж.И., Воскресенский А.Н.).

9. Антигены гистосовместимости макрофагов как универсальные рецепторы для нативных антигенов. В сб. материалов Всесоюзного симпозиума с международным участием "Система мононуклеарных фагоцитов в норме и при патологии", г. Новосибирск, 6-8 сентября 1990г. (соавт. Медуницын Н.В., Крылов 0.Р., Воскресенский А.Н., Карасева В.И.).

10. Allergic reaction and class 11 antigens (AG) of major histocompatibility complex (MHC). First Internation Confe- rence on Immunorehabilitation, Sochi-Dagomys, July 1-5, 1992 г. (соавт. Medunitsin N.V., Avdeeva J. I.).

11. Продукты генов главного комплекса гистосовместимости класса II как универсальные рецепторы нативного антигена и хранители антигенной информации. В сб. материалов Международного симпозиума по аллергологии и клинической иммунологии. Алма-Ата, 28 сентября-1 октября, 1992 г. Раздел 11. Клиническая иммунология, с. 200. (соавт. Медуницын Н.В., Авдеева Ж.И.).

12. Участие la-молекул вспомогательных клеток в процессе связывания нативного антигена. "Иммунология", 1992, 3, с. 18-21. (соавт. Медуницын Н.В., Крылов О.Р., Авдеева Ж.И., Степанов О.Г.).

13. Иммунокорригирующие препараты в терапии хронических заболеваний легких (ХЗЛ). В сб.Международной научно-практ. конференции "Оптимальные средства и методы иммунокорригирующей, противовоспалительной и противомикробной терапии". 10-12 октября, 1993, Харьков, (соавт. Медведева М.И., Авдеева Ж.И., Медуницын Н.В.).

14. Антигены гистосовместимости класса II и аллергия. Мат.

симпозиума "Аллергия и продукты моря". 11-15 мая 1993 г., Владивосток. е.- (соавт. Медуницын Н.В., Авдеева Ж.И., Медведева М.И., Лукманова Д.Ш.).

15. Новые подходы к оценке иммунного статуса при респираторных заболеваниях. Мат. научно-практ. конф. "Актуальные проблемы инфекционной патологии". 25-27 мая 1993 г., С.-Петербург, с. -(соавт. Медуницын Н.В., Медведева М.И., Авдеева Ж.И.).

16. Allergy and class II histocomhatibility antigens. Annual Meeting of the European Academy of Allergology and Clin. Immunology. Rotterdam, 12-15 September, 1993, p.- (соавт. Medunitsin N.V., Avdeeva J.I., Medvedeva M.I.).

17. Allergy and antigen (AS) binding by la-molecules. The XY International Congress of Aller. and Clinic. Immunol. Stocholm, Sweden, June 26-July 1 1994 c.924. (соавт. Medynitsin N.V., Avdeeva J. I.).

18. Антигены класса II главного комплекса гистосовместимости при повышенной чувствительности немедленного и замедленного типов. "Актуальные проблемы практической аллергологии и клинической иммунологии". Тезисы докладов I симпозиума МААКИ. Москва, 1995 г. с.45-46.(соавт. Медуницын Н.В., Авдеева Ж.И., Лукманова Д.Ш.).